UNIVERZITET U TUZLIFARMACEUTSKI FAKULTET

Aldin M.

KULTURA BILJAKA I ĆELIJA

Seminarski rad iz ,,Botanike”

TUZLA, 2012.

SADRŽAJ:UVOD……..…………………………………………………………………………………….…3

Serilizacija biljnog materijala……………………………………………………………………...4

Faze mikropropagancije……………………………………………………………………….......5

Organogeneza……………………………………………………………………………………...8

Indirektna i direknta organogeneza……………………………………………………………......8

Kultura kalusa………………………………………………………………………….…………..8

Embriokultura……………………………………………………………………………………...9

Mehanizam embriokulture…………………………………………………………………9

Kultura meristema………………………………………………………………………………10

ZAKLJUČAK…………………………………………………………………………………….12

LITERATURA:…………………………………………………………………………………..13

UVOD:

2

U ranom periodu tehnike culture ćelija uglavnom se radilo na iznalaženju načina prevazilaženja problema kontaminacije ćelijskih kultura (razvoj antibiotika). U novije vrijeme glavno obilježje razvoja ovetehnike culture ćelija je njena komercijalizacija. Tehnikom kulture ćelija se kultiviraju pojedinaĉne ćelije ĉije su veze sa okolnim ćelijama pokidane. Kultiviranje tkiva oznaĉava se pojmom kultura tkiva. Tehnika kultiviranja cijelih organa s ciljem praćenja njihove kontinuirane funkcije ili razvoja zove sekultura organa.

Prema vrsti upotrijebljenog materijala, odnosno segmenta biljnog tkiva za regeneraciju, danas je prihvaćena podjela kulture biljnih tkiva na pet grupa:

kultura ćelija kultura kalusa kultura meristema kultura organa kultura protoplasta

Slika 1. Tipovi eksplantata koji se koriste za pokretanje in vitro kultura.

Svi ovi tipovi kulture biljnih tkiva izvode se na relativno maloj površini, gdje se uslovi sredine optimiziraju u odnosu na fizičke, hranidbene i hormonalne činioce i gdje se isključuju svimikroorganizmi (gljivice, bakterije, vi rusi) kao i druge štetočine (insekti i nematode).

Sterilizacija biljnog materijala

3

Kada se izabere početni biljni materijal pristupa se pripremi za dalji rad. Najprije treba izvršiti sterilizaciju i izolaciju, a potom inokulaciju i subkulturu tj. dalje razmnožavanje. Za uspješan rad veoma je bitno da biljni materijal prije njegove izolacije in vitro bude dobro sterilisan. Prije početka sterilizacije svaki ostatak pre ostalog zemljišta ili mrtvih djelova biljke treba ukloniti. Ako je spoljašnja kontaminacija vrlo uočljiva i velika najbolje je da se djelovi biljaka speru u vodi. U određenim slučajevima može se vršiti i ljuštenje ili guljenje pojedinih djelova biljke, štonije dobro jer ono dovodi do gubitka najvećeg dijela spoljašnjih slojeva kao npr. pokožice i dr. Nakon toga vrši se sterilizacija na sledeći način. Biljni organ se prvo potapa u 70% alkohol u toku nekoliko sekundi da se odstrane mjehurići vazduha čime se osigurava da sterilišuća tečnost ima veći pristup biljnom materijalu. Potapanje se ne vrši u 96% alkoholu jer je on suviše jak i izaziva izuzetno veliku dehidrataciju. Sterilizacija se nastavlja 10-30’ u 1% natrijum hipohloritu (NaClO) kome se dodaje nekoliko kapi Tween-a 20 ili 80. DodavanjemTween-a (vlažećeg agensa) smanjuje se površinska tenzija, čimese dopušta jači površinski kontakt. Posle ovoga vrši se ispiranje u vodi sa česme obično tri puta utoku 2,5 odnosno 15’. Ako su biljke osjetljive na bijeljenje onda se umjesto Na-hipohlorita može koristiti Ca-hipohlorit, koji u biljna tkiva ulazi sporije. Jedna od mana Ca-hipohlorita je to što se može čuvatisamo ograničeno vrijeme jer je higroskopan.Izbor vremena sterilizacije i koncentracije bjelila zavisi prvenstveno od toga da li površinskislojevi koji se sterilišu treba da ostanu (blaga sterilizacija) ili treba da budu sasječeni prijeinokulacije (jaka sterilizacija). Ponekad je moguće da se sterilizacija postigne samo pet minuta poslije tretiranja na Na-hipohloritom, a u drugim slučajevima potrebno je i 30’. Duža sterilizacija može imati štetne uticaje na eksplantat, pa pravilno određivanje vremena ikoncentracije bijeljenja treba podesiti za svaki pojedinačni materijal. Uprkos dobroj hemijskoj sterilizaciji početnog biljnog materijala do infekcije može doći i kasnije, a uzroci za to su:- tzv. unutrašnje infekcije. One mogu biti veoma ozbiljan problem, jer su prouzrokovane mikroorganizmima koji su u samoj biljci i ne mogu se eliminisati spoljnom sterilizacijom. U principu postoje dva načina za savladavanje ovog problema: kultura meristema (većina mikroorganizama ne naseljava meristem), ili dodavanje antibiotika hranljivoj podlozi. Pošto je kultura meristema veoma složena a dodavanje antibiotika podlogama u najvećem broju slučajeva neefikasno (može usporiti rast biljke i voditi selekciji otpornog mikroorganizma), najbolje je rješenje da se koriste internosterilne biljke.-neprecizan rad (neoprane ruke, nesterilisana površina stola, nesterilisane pincete ili skalpeli,nedovoljno sterilisane čaše, papir ili hranljiva podloga itd.). Upotreba maski preko lica, pokrivanjekose i upotreba sterilnih rukavica mogu doprinijeti smanjenju broja infekcija.-neispravna laminarna komora. Treba da se kontroliše svake godine od strane proizvođača, ačeoni filtri da se povremeno obnavljaju.- zaprljan alkohol u koji se umaču instrumenti pred opaljivanje, tako da ga treba obnavljati upravilnim intervalima.-nesterilni kontejneri po spoljnjoj površini, u kojima se nalaze hranljive podloge. - prljavi podovi koji se ne peru redovno i ne vrše dezinfekciju. Kada se ulazi u inokulacionu prostoriju preko cipela treba imati plastični pokrivač ili stopala treba da se potope u sterilišuću tečnost. U inokilacionu prostoriju ne treba puštati ni mnogo nepotrebnih posjetilaca. -insekti (grinje) koje prenose naročito gljivične infekcije, a koji se javljaju ako se prostorija ukojoj se vrši kultura tkiva ne održava čisto. Pošto ovi prenosioci mogu lako proći proz pamučne zatvarače i plastični film, ozbiljnost ovog načina infekcije ne smije se zanemariti. -

4

nesterilna prostorija u kojoj je laminarna komora. Ovo se može izbjeći uduvavanjemsterilnog vazduha i izračivanjem UV svjetlom u toku noći. -infekcije koje se često događaju prilikom izolovanja vrhova biljnih izdanaka, jer se oni teško sterilišu. Da bi se ovo izbjeglo izdanci se često sterilišu postupno tj. u više faza. Izdanak senajprije opere, speriliše, ukloni nekoliko listova, ponovo steriliše itd. Šanse za infekciju vrhova izdanaka su manje ako se oni izoluju dok su mali.

Faze mikropropagacije.

Postoje četiri osnovne faze mikropropagacije: Faza I - uspostavljanje eksplantata u kulturi Faza II - umnožavanje Faza III - regeneracija korjena Faza IV – aklimatizacija

Faza I. U ovoj fazi se prethodno sterilisani i obrađeni pupoljci uvode u kulturu. Nakon sterilizacije i ispiranja može se započeti izolacija tj. sječenje biljnih komadića u sterilnim uslovima (laminarna komora) i uz upotrebu strilnih instrumenata. Eksplantati se pažljivo prihvataju pincetom i prenose na hranljivu podlogu razlivenu u malim epruvetama. Smještaj ovih primarnih eksplantata je pojedinačan, odnosno u jednu epruveticu se stavlja jedan pupoljak. U ovoj fazi eksplantati se mogu razvijati bilo u pojedinačne izdanke ili u masu umnoženihizdanaka, pa čak i u ožiljene biljke. Prva dva slučaja se koriste u mikropropagaciji dok se u treće mslučaju, regeneraciji u jednom koraku, obično daje prednost pri stvaranju bez virusnih biljaka putem kulture meristema.Rastenje apikalnog meristema odnosno rastenje i grananje izdanaka uslovljeno je odgovarajućim odnosom auksina i citokinina u hranljivoj podlozi. Koncentracije regulatora rasta zavise od biljne vrste koja se gaji, od faze u kojoj se biljke nalaze i drugih činilaca. Kod masline se odsječe vršni dio grančice dužine oko 20 cm. Odstrane se listovi sa dijelom peteljke. Eksplantati su djelovi vršnih grančica dužine 1,5 – 2 cm sa vršnim ili bočnim pupoljcima koji se prije postavljanja na hranljivu podlogu sterilišu 70% etanolom ili Na hipohloritu. Eksplantati tkiva se ne smiju direktno dotaći rukom već pincetom ili drugim priborom koji je prethodno sterilisan potapanjem u 96% alkohol, a potom opaljivanjem tj. provlačenjem kroz plamen. Eksplantati u principu mogu biti isijecani na dva načina: na staklenoj ploči (podlozi) sterilsanoj sa 96% alkoholom (ovdje se kao problem javlja brzo tupljenje noževa), ili između sterilnog filter papira (noževi ostaju duže oštri). Veoma je lako raditi sa dva tabaka filter papira: jedan se koristi u isijecanju eksplantata (redovno se zamjenjuje), a jedan za postavljanje sterilnih instrumenata (na njemu ili između). Kada se eksplantat postavi pomoću sterilnih pinceta na filter papir ili staklenu ploču pristupase siječenju. Ako su površine siječenja bile u dodiru sa bjelilom, ovi djelovi se uklanjaju pomoću sterilisanog skalpela. Sterilisana sjemena (ako ne treba izolovati klicu) mogu se direktno inokulisati bez ikakvog dodatnog tretmana.

Faza II – Umnožavanje. Glavni cilj ove faze je da se proizvede maksimalan broj jedinica za umnožavanje. Kada se apikalni meristem organizuje u lisnu rozetu ili izduženi izdanak subkultivira se na hranljivu podlogu za umnožavanje. Iz aksilarnih pupoljaka lisne rozete

5

formiraju se novi izdanci. Od formiranog izduženog izdanka izoluju se nodalni segmenti i gaje na podlozi za umnožavanje. Stopa umnožavanja u ovoj fazi je različita za različite biljne vrste i sa svakom narednom subkulturom broj aksilarnih izdanaka se povećava logaritamski. Tako se u toku godine broj izdanaka može povećati do milionskih cifara. U fazi umnožavanja citokinin se koristi da bi se savladala apikalna dominacija izdanaka i da bi se povećalo grananje lateralnih pupoljaka iz lisnih pazuha. Tokom 4-8-12 nedjelja prati se rastenje kulture u epruvetama i vrši umnožavanje. U fazi umnožavanja, materijal dobijen postavljanjem kulture se presađuje na svježu hranljivu podloguonoliko puta koliko je potrebno da bi se dobio željeni broj izdanaka.

Faza III- Regeneracija korjena. Cilj ove faze je da novo regeneracija adventivnih korenova iz izdanaka dobijenih u fazi II ili u nekim slučajevima u fazi I i formiranje kompletnih biljaka. Obično in vitro dobijeni izdanci od 10mm ili duži se sijeku i koriste za ožiljavanje. Za ožiljavanje izdanaka ne mora uvijek da se primjenjuje in vitro metoda. Umjesto rastvora auksina koji se koriste in vitro mogu se koristiti i komercijalno pripremljeni hormoni za ožiljavanje potapanjem ili uranjanjem osnove izdanka prije sadnje. Postoje tri faze uključene u rizogenezu: a) indukcija, b) inicijacija i c) elongacija korjena. S obzirom da je teško izdvojiti fazu indukcije u mnogim eksperimentima ova faza se uključuje u fazu inicijacije. Odavno je poznato da je novo inicijacija korjena zavisi od odnosa visoke koncentracije auksina i niske koncentracije citokinina. Pošto u izdancima iz faze II ima dosta rezidualnih citokinina potrebno je malo ili uopšto nije potrebno dodati citokinin u medijum faze III. Negdje je dovoljno redukovati samo citokinine ili pak sve hormone, a negdje je ta redukcija radikalnija i ide do smanjenja i mikro i makroelemenata. Nasuprot citokininima, auksini su esencijalni za inicijaciju korena. Najčešće se koriste auksini kao što su NAA, 1BA, IAA i 2,4-D. Kod mnogih vrsta auksin nije potrebno dodavati u medijum faze III, jer su mladi izdanci bogati auksinom.Kada je koncentracija auksina suviše visoka, u bazalnom dijelu izdanka formira se kalus koji inhibira normalan razvoj korena. Visoka koncentracija auksina inhibira elongaciju korena. Da bi se ovo izbjeglo, izdanci se prvo gaje na podlozi sa auksinom 4-8 dana da bi se inicirao korjen a zatim subkultivišu na podlogu bez auksina da bi on porastao. U literaturi postoje različita mišljenja u vezi uticaja giberelina na ožiljavanje i njihove upotrebe u ovoj fazi, ali se može reći da se oni veoma rijetko koriste za ožiljavanje izdanaka. Ožiljavanje traje u prosjeku 4 nedjelje s tim što se inicijale korjenova zapažaju 4-14 dana nakon postavljanja na podlogu za ožiljavanje. Brzina rasta i eventualno grananje korjenova su varijabilni i zavise od same biljne vrste kao i od metodike i uslova ožiljavanja. 

Faza IV – Aklimatizacija. Nakon ožiljavanja, in vitro regenerisane biljke se prenose iz aseptičnih kontejnera u saksijeradi aklimatizacije. Prije same sadnje u staklari korjenov sistem se vodom ispira od zaostalih čestica agara, a cijela biljka se potapa u rastvor nekog fungicida na bazi kaptana.Faktori koji utiču na presađivanje su infekcija i desikacija. Ozbiljni problemi infekcije mogu se eliminisati sterilizacijom zemljišne mješavine, a da bi se novo presađene biljke adaptirale naspoljne uslove potreban je period humidne aklimatizacije, zato što je odmah nakon presađivanja ustanovljen pretjerano visok gubitak vode iz listova biljaka. Visok nivo gubitka vode pripisuje se redukovanoj količini epikutikulamog voska, visokom volumenu intercelularnih prostora u mezofilu i usporenoj reakciji stoma na vodni stres. Tokom aklimatizacije, vlažnost se

6

postepeno redukuje u periodu od 2-3 nedjelje. U međuvremenu, biljke podliježu morfološkim i fiziološkim adaptacijama koje im omogućuju darazviju normalan vodni režim. Adaptacija razvijenih biljaka. Biljke koje se obrazuju u in vitro uslovima razlikuju se u mnogim aspektima od biljaka nastalih u in vivo uslovima. Zato posebnu pažnju na kraju treba posvetiti njihovoj adaptaciji tj. prenošenju sa hranljive podloge u zemljište. Kod biljaka gajenih u in vitro uslovima kutikula (voštani sloj) je često slabo razvijena, jer jerelativna vlažnost u kontejnerima 90 -100%. Ovo vodi izuzetno velikim gubicima vode preko kutikularnog isparavanja, kada se biljka presađuje u polje, pošto je vlažnost vazduha u in vivo uslovima mnogo niža. Listovi jedne in vitro biljke često tanki, mekani i ograničene fotosintetske aktivnosti nisu dobro prilagođeni za in vivo klimat. Biljke iz in vitro kulture imaju manje i sitnije palisadne ćelije za efikasno korišćenje svjetlosti. One posjeduju i veći vazdušni prostor u mezofilu. Kod biljaka iz in vitro uslova ne funkcionišu dobro ni stome. Otvorene stome kod ovih biljaka prouzrokuju najjači vodeni stres u prvih nekoliko časova aklimatizacije. Kod ovih biljaka oskudne vaskularne veze između izdanaka i korjena mogu umanjiti provođenje vode. Takođe, mora se imati na umu da je biljka iz in vitro uslova nastala kao heterotrof, dok u in vivo uslovima ona mora bitiautotrofna. Aklimatizacija se može izvršiti dopuštanjem biljkama in vitro da se postupno prilagođavaju nižoj relativnoj vlažnosti, kao u slučaju gajenja in vivo. Razviće mehanizma za zatvaranje stoma je takođe važna komponenta aklimatizacije. Dokazano je da smanjenje relativne vlažnosti in vitro vodi boljem obrazovanju voska na kutikularnom sloju, što sve doprinosi smanjenju kutikularnog isparavanja. Direktna aklimatizacija poslije in vitro faze može se postići održavanjem relativnovisoke vlažnosti in vivo, kao i održavanjem niske osvijetljenosti i temperature. Drugi metod aklimatizacije je da se otvoreni kontejner (epruveta, boca isl.) ostavi u sterilnoj sredini na nekoliko dana, radi prilagođavanja uslovima in vivo. Takođe, moguće je da se prskanjem biljaka sa anti-transpirantima smanji isparavanje in vivo, mada ovo često može imati i negativnih posledica. Slično listovima korjenovi koji su obrazovani u in vitro uslovima izgledaju ranjivi i ne funkcionišu dobro u in vivo. Naime, oni imaju mali ili ni malo dlačica, brzo odumiru i moraju sezamijeniti novoobrazovanim podzemnim korjenovima. Razvoj korjenovih dlačica in vitro može se ponekad stimulisati dopuštanjem razvoja korjena u tečnim podlogama. Slabo razvijen korjenov sistem veoma mnogo otežava rast takvih biljaka in vivo, posebno tamo gdje je veliko isparavanje. Ovdje je bitno da biljka in vitro izgubi što manje vode u in vivo uslovima. Tokom aklimatizacije, vlažnost se postepeno redukuje u periodu od 2-3 nedjelje. U međuvremenu, biljke podliježu morfološkim i fiziološkim adaptacijama koje im omogućuju da razviju normalan vodni režim. Sposobnost aklimatizacije biljaka može se utvrditi njihovim direktnim izlaganjem uslovima niske relativne vlažnosti vazduha. Kada se biljke dobro aklimatizuju na uslove staklare, iznose se u spoljne uslove gdje se dalje gaje radi proučavanja njihove sposobnosti rastenja na sopstvenom korjenu, produktivnosti i kvaliteta plodova. Postoje i novija dostignuća u oblasti kulture biljnih tkiva koja se odnose na presađivanjebiljaka iz kontejnera u zemljište.

Organogeneza

Organogeneza u najosnovnijem obliku značenja predstavlja proces obrazovanja jedinki. U in vitro uslovima kontrolisanje organogeneze se vrši dodavanje određenih komponenti, a najbitnije među komponentama jesu FITOHORMONI. Skoog i Miller hipoteza (1957), Balans

7

citokinina i auksina reguliše organogenezu kalusa. Ova hipoteza govori o odnosu koncentracija auksina i citokinina u hranljivom medijumu i kako zapravo date koncentracije utiču na morfogenezu u uslovima in vitro. Dokazi Milerove hipoteze su: ako se kalusno tkivo prenese na hranljivu podlogu koja sadrži veću koncentraciju auksina negocitokinina, pojaviće se korjenovi. Ako je koncentracija citokinina veća od koncentracije auksina, pojaviće se pupoljci.

Indirektna i direktna Organogeneza

Indirektna Organogeneza je proces u kome se pupoljci regenerišu iz ćelija kalusa. Eksplantat indukuje nediferenciranu masu kalusnog tkiva, u kojoj se javljaju meristemski centri, ili meristemoidi. Meristemoid se sastoji iz grupe ćelija i predstavlja inicijalni centar koji se lako uočava, jer se udaljavanjem od njega u ćelijama značajno smanjuje mitotski indeks. Meristemoidi postaju ilicentri za proliferaciju kalusnog tkiva, ili se transformišu u nodule iz kojih će se javiti apikalni meristemi ili korenske primordije. Direktna Organogeneza (a-d) posle faze indukcije nema fazu proliferacije ćelije kalusa. Direktno na eksplantatu dolazi do regeneracije pupoljaka iz epidermalnih ili subepidermalnih ćelija. 

Kultura kalusa

Kultura tkiva odnosno kultura kalusa je tehnika kojom se tkivo može održavati u nediferenciranom stanju neograničeno dugo (Slika 2). Kalus je neorganizovana masa diferenciranih biljnih ćelija. On može nastatii nakon povrede nekog biljnog organa kao što je stablo ili koren. Kultura kalusa se može dobiti iz bilo kog vegetativnog tkiva diferencijacijom, tako da kalusna tkiva najčešće nisu fotosintetička. Kalusi se često gaje u mraku jer svetlost može podstaći diferencijaciju. Kalusi se, generalno, mogu podeliti na dva tipa: kompaktne i rastresite. Najveći značaj kalusa je u tome što ima sposobnost da se iz njega začne pupoljak, korijen ili embrion. Inicijacija i rast kalusa zavisi od biljne vrste (genotipa), vrste i koncentracije hormona i nekih organskih supstanci kao i od uslova kulture. Prilikom inokulacije podloge bitno je da inokulum ne bude isuviše mali, jer je tada i slab rast kalusa. Najbolja veličina inokuluma je 5-10 mm u prećniku ili 20-100 mg (Street, 1969). Znatno je lakše raditi subkulturu sa kompaktnim kalusom, jer se on lako seče na manje dolove, dok se rastresit kalus raspada i mora se direktno prebaciti na novu podlogu.

8

Slika 2. Organogeneza iz kalusa.

Embriokultura

Embriokultura je postupak gajenja embriona ili njegovih pojedinih djelova na vještačkoj hranljivj podlozi pod aseptičnim uslovima. Ova metoda se može primijeniti u svim onim situacijama kada dođe do oplodne ali embrion počne da degeneriše tj. abortira u određenom stadijumu razvitka prije pune zrelosti. Degeneracija embriona nastupa zbog nesposobnosti endosperma da odigra svoju normalnu ulogu u snabdijevanju embriona hranivima ili zbog antagonizma materinskog tkiva prema embrionu. Embrion obično abortira 5 do 35 dana nakon oplodnje, što najčešće zavisi od vrsta koje se međusobno ukrštaju. U principu postoje dvije vrste embriokulture: kultura nezrelih embriona porijeklom iznedozrelih sjemena i kultura zrelih embriona porijeklom iz zrelih sjemena. Kultura nezrelih embriona uglavnom se koristi da bi se izbjegla rana smrt klice (abortus), sa ciljem da se razvije normalna biljka. Ovaj tip kulture je izuzetno težak ne samo zbog zamorne disekcije klice već i zato što je neophodna složena hranljiva podloga. Kultura zrelih embriona je relativno laka i koristi se da bi se eliminisala apsolutna inhibicija klijanja sjemena. Za ovaj tip kulture u većini slučajeva dovoljno je korišćenje jednostavne hranljive podlogesa agarom, šećerom i mineralima.

Mehanizam embriokulture

Kada se pripremi odgovarajuća hranljiva podloga pristupa se njenom razlivanju u epruvete dovisine od 2-3 cm. Zatim se epruvete zatvore zapušačima i stave u autoklav radi sterilizacije u vremenu 20-35’, a pod pritiskom 1,5-2,0 atm i temperature od 100 stepeni celzijusa. Poslije završene strilizacije epruvete sa hranljivom podlogom se vade iz autoklava i drže na sobnoj temperaturi do vremena njihove upotrebe, ali najbolje je odmah čim se ohlade obaviti ubacivanje sjemena za naklijavanje embriona. Na hranljivu podlogu sem čitave sjemenke mogu se nanositi sjemenka bez sjemenjače, sjemenka kojoj je odstranjen vrh i kotiledoni biljke. Pri nanošenju čitave sjemenke u epruvete, površina sjemenke se mora prethodno sterilisati, a

9

zatim isprati destilovanom vodom. Takođe, treba sterilisati pincete i otvor epruvete njihovim prevlačenjem preko plamena špiritusne lampe. Poslije toga sjemenka se nanosi u epruvetu tako što joj se vrh zaroni nekoliko mm u hranljivu podlogu zbog geotropizma sjemena. Epruveta se nekoliko puta ponovo prevuče preko plamena špiritusne lampe i na kraju se zatvara spremljenim zatvaračem. Ovako pripremljene epruvete stavljaju se u frižider na temperaturiod 2-5 stepeni do pojave korjenka. U tom periodu vrši se proces jarovizacije. Kada se korjenak embriona pojavi kultura se može sa hladnog prenijeti u klima komoru radi klijanja na temperaturi 22-25 stepeni sa režimom osvjetljenja od 16h svjetlosti (intenziteta 3000 luxa) i 8h mraka. U ovim uslovima kultura ostaje nekoliko nedjelja nakon čega se može izvršiti brojanje isklijalih embriona. Na osnovu različitog stepena razvijenosti embriona pri klijanju dobijeni sejanci kod Prunus-amogu se svrstati u 6 klasa:

Nulta klasa - embrion uginjava I klasa - nema rasta korjena i stabla, ali je embrion živ II klasa - korjen se razvija ali ne i stablo III klasa - razvijaju se i korjen i stablo, ali je stablo malo formisano IV klasa - razvijaju se i korjen i stablo, ali je stablo rozetasto V klasa - normalan razvitak korjena i stabla.

Sijanci III, IV i V klase smatraju se isklijalim. Kada sejanci razviju 4-6 listova iznose se u uslove staklare gdje se presađuju u supstrat kojise najčešće sastoji od pijeska, treseta i perlita u različitim odnosima. Prije presađivanja sa korjena se moraju dobro sprati sve čestice hranljivog medijuma jer njihovo prisustvo povećava rizik od gljivičnih infekcija. Ustanovljeno je da najkritičniji momenat u kulturi embriona predstavlja upravo prebacivanje biljaka sa podloge i sterilnih uslova u zemljište tj. nesterilne uslove. U tom periodu propadne najveći broj biljaka. Osnovni uzrok propadanja je veliki gubitak vode koji je prouzrokovan smanjenom debljinom voštane prevlake, visokom zapreminom intercelularnih prostora i usporenim reagovanjem stominog aparata na stresne uslove. Zato je neophodno mlade biljčice držati izvjestan period u uslovima visokerelativne vlažnosti vazduha (95-99%), što se postiže stalnim orošavanjem ‘mist’ sistemom. Pošto takvi uslovi pogoduju razvitku gljivičnih bolesti u ovom periodu neophodno je obezbijediti i dopunsko tretiranje fungicidima. Biljke pod ‘mistom’ ostaju oko dvije nedjelje, a poslije toga se mogu iznijeti u spoljne uslove i dalje gajiti.

Kultura meristema

Eliminacija virusnih oboljenja kulturom meristema je jedna od mnogih interesantnih primjena kulture tkiva. U suštini postoje dva tipa meristemskog eksplantata: apikalni meristem izdanka, nediferencirano tkivo, locirano unutar apeksa izdanka, koji se pojavljuje kao sjajna pupolika struktura distalno u odnosu na najmlađu lisnu primordiju, veličinemanje od 0,1 mm u dužini, apeks izdanka - struktura koja se sastoji od apikalnog meristema izdanka i jedne do nekoliko lisnih primordija, obično veličine od 0,1-1 mm u dužinu. U slučaju da je u apeks uključeno više odraslih listova struktura može iznositi i do nekoliko centimetara u dužini. Ako se koristi eksplantat veći od 0,1 mm dužine šanse za rast i razvoj u kulturi in vitro su veće. Lokacija meristema. Kod biljaka su razlikuju meristemi koji se nalaze u vršnim i aksilarnim pupoljcima.

10

Eksplantati uzeti sa vrha izdanka nalaze se u mlađem razvojnom stadijumu nego oni iz bazalnog dijela. Zaregeneraciju izdanka optimalan je mlađi razvojni stadijum eksplantata. Terminalni pupoljci imaju jači potencijal rasta nego lateralni. Zato je, kod većine biljnih vrsta, bolje koristiti terminalne eksplantate. Ukoliko ima samo jedan terminalni pupoljak po izdanku, mogu se koristiti i aksilarni.

ZAKLJUČAK:

Metoda kulture biljnih stanica i tkiva podrazumijeva laboratorijski uzgoj stanica, tkiva, organa i kompletnih organizama na umjetnim hranidbenim podlogama i u aseptičnim uvjetima.

11

Ta je tehnika postala nezaobilazna u primjeni genetičkog inženjerstva na biljkama te kao metoda alternativna kemijskim metodama u svrhu dobivanja bioloških vrijednih spojeva koji se koriste u npr. farmaciji i medicini. Metoda kulture biljnog tkiva danas je vrlo važna u brojnim istraživanjima biljnih organizama (fiziološkim, genetičkim, molekularnim, biokemijskim) te ima vrlo raširenu primjenu u vegetatitvnom razmnožavanju brojnih agronomskih, hortilkulturnih i šumskih vsta. Njenom primjenom moguće je dobivanje biljaka bez patogenih klica (posebno biljnih virusa), što je danas u monokulturnim stakleničkim uvjetima uzgoja gdje se bolesti šire izuzetno brzo, jako bitno. Metoda se koristi i za očuvanje zdravih biljaka ("germplasm collections"). Namjena kulture određuje sastav hranidbene podloge.Hranidbena podloga treba sadržavati mikro- i makroelemente, šečer kao izvor energije, vitamine, hormone rasta, nekada pojedine aminokiseline i često agar kao inertni materijal za potporu tkiva eksplantata (dijelovi tkiva ili stanice). Eksplantati se mogu uzgajati u različitim okolišnim uvjetima (ritam svjetlo-tama, temperatura), no to nije uvijek važno s obzirom da se, u stvari, uzgajaju u zatvorenim sustavima (tikvica, epruveta i sl.). Upravo u toj izoliranosti od raznih klica iz atmosfere leži i glavni ključ uspješnosti pojedine kulture. Naime, održavanje sterilnosti ili aseptičnosti je neophodno u svim fazama (sav korišteni pribor, posude za kulturu, hranjiva podloga, biljni materijal).

Tu je i najveća potencijalna poteškoća pri uspostavi određene kulture u školskom laboratoriju. I dok se sterilizacija posuđa i hranjive podloge može napraviti i u pretis loncu, a u novije vrijeme se radi i s mikrovalnim pećnicama, problem sterilizacije biljnog materijala je teže riješiti. Naime ukoliko u kulturu uvedete biljni materijal s nekom klicom, ona će se vrlo uspješno razviti u uvjetima kulture "in vitro" gdje je pristup drugih konkurentnih patogena spriječen. Postoji mogućnost da pokušate sterilizirati sjemenke pomoću razrijeđenog kalcij-hipoklorida (npr. sredstvo za čišćenje "Domestos" ili neko slično). Ako ćete koristiti dijelove biljke odaberite neku kod koje je prisutno vegetativno razmnožavanje (npr. jagoda). Posude u kojima se kultura razvija (npr. tikvice ili epruvete) trebaju biti zatvorene čepovima od vate koji omogućuju dovoljnu izmjenu plinova a spriječavaju ulazak raznih klica. Možete koristiti osvjetljavanje fluorescentnim lampama, ali i danje svijetlo no u tom slučaju treba izbjegavati direktnu sunčevu svjetlost.

LITERATURA:

Marić, Miodrag, Kultura biljnih tkiva, 1995. Hulina, Nada, Više biljke stablašice, Golden marketing, 2011.

12

Dubravec, Regula, Fiziologija bilja, Zagreb, 1995. Jančić, R: Lekovite biljke sa ključem za određivanje, Naučna knjiga, Beograd, 1990.

13