Kultivaní metody v potravináské -...

Kultivační metody v potravinářské mikrobiologii

Sabina Purkrtová

Mikrobiologické metody

Analyt – měřená komponenta vzorku

Přítomnost nebo nepřítomnost analytuv určitém množství vzorku

Kvalitativní metody

Množství analytu Měřené přímo či nepřímo v určitém množství vzorku

Kvantitativní metody

Analyty v mikrobiologii

mikroorganismy jako mikrobiální buňky

části mikroorganismů – např. DNA, proteiny

produkty mikroorganismů – např. enterotoxiny S. aureus

Množství: dle legislativy EU obvykle 25 g (příp. příležitostně 10 g)

Množství: dle legislativy EU obvykle 10 g

Typy metod

1. Mezinárodní, regionální či národní standardy

• převzaté od mezinárodně, regionálně či národně uznávaných

autorit pro vývoj a validaci metod

• ISO, International Dairy Foods Association (IDFA), FDA (Food

and Drug Administration), AIJN (European Fruit Juice

Association), SZÚ (Státní zdravotní ústav, ČR)

2. Metody vyvinuté v laboratoři

• Metody (obvykle in vitro diagnostické testy) navržené,

vyráběné a užívané v určité laboratoři

3. Nestandardní metody

• Převzaté z jiných zdrojů než z obecně uznávaných autorit pro

vývoj a validaci metod

• Např. metody publikované v odborné vědecké literatuře,

nepublikované laboratorní metody

We're ISO, the International Organization for Standardization. We develop and publish International Standards.

Kultivační metodyKlasické kultivační mikrobiologické metody studují mikroorganismy nikoliv jako jednotlivé buňky, ale jako populaci dceřiných buněk vzniklých dělením jedné buňky mateřské.

4

Příklad: Přírůstek množství bakterií v exponenciální fázi (generační doba: 0.5 h)

Hod

Log 1

0(p

oče

t b

un

ěk)

http://www.cs.montana.edu/webworks/projects/stevesbook/artifacts/images/chapter_002/section002/typical_growth_curve_002.jpg

Kultivační metody

http://ibis.inrialpes.fr/rubrique51.html

Růst kolonie z jedné mateřské buňky (teoreticky)

5

Tato populace mikroorganismů („masa buněk“) je viditelná na ztuženém médiu jako kolonie

Tato populace mikroorganismů je viditelná v tekutém médiu (bujón)

Tato populace mikroorganismů je schopná dát detekovatelný signál v biochemických testech

http://accounts.smccd.edu/case/biol240/images/nutrientbroth2.jpg

Dobře izolovaná kolonie rostoucí z jedné původní mateřské buňky – ideální stav, ale pouze teoreticky (některé MO buňky v shlucích). Počet kolonií není proto označován jako odpovídající počtu buněk, ale jako odpovídající počtu kolonií tvořících jednotek (KTJ)

Video:https://www.youtube.com/watch?v=zrx7Xg0gkQ4

Kultivační metody

6

Schopnost mikroorganismů přežít a množit se (tj. být kultivovány, „růst“) za danýchenvironmentálních podmínek závisí na kompatibilitě mezi těmito podmínkami afyziologickými a biochemickými vlastnostmi mikroorganismů.

Fyzikální faktory• teplota*• pH*• osmotický tlak*• atmosféra*• tlak• záření (UV, γ...)

Biologické faktory• Vliv ostatních

mikroorganismů (synergismus –vzájemná podpora růstu, kompetice, antagonismus, symbióza, mutualismus…)

Fyziologický stav („fitness“)*• Kultivovatelné buňky

• v dobrém stavu• poškozené či

suprimované vnějšími podmínkami

• nekultivovatelné buňky

Chemické faktory• Nároky na výživu*

• Zdroj energie• Zdroj C, N• Zdroje dalších látek

• Antimikrobiální (bakteriocidní/bakteriostatické) a další chemické látky*

*...Faktory běžně užívané nebo uvažované v kultivačních metodách potravinářské mikrobiologie

VOLBOU KULTIVAČNÍCH PODMÍNEK LZE SELEKTIVNĚ VYBRAT SPEKTRUM MIKROORGANISMŮ, K JEJICHŽ PŘEDNOSTNÍMU POMNOŽENÍ BUDE DOCHÁZET

obligate anaerobes: oxygen is toxic for them

https://o.quizlet.com/CXi.qp97gMpOFIXSYF0skA.png

Kultivační metody

Salvadó Z et al. Appl. Environ. Microbiol. 2011;77:2292-2302

Teplotní rozsah růstu 27 kvasinek. Optimální růstová teplota je označena kolečkem. S., SaccharomycesSc, S. cerevisiae;Sp, S. paradoxus;Smik, S. mikatae;Sarb, S.arboricolus;Scar, S.cariocanus;Su, S. bayanus var. uvarum;Sk, S. kudriavzevii;Km, Kluyveromyces marxianus;Pf, Pichia fermentans;Td,Torulaspora delbrueckii;Cs, Candida stellata;Hu, Hanseniaspora uvarum.

Kultivační metody

9

Bacteria Tmin (°C) Topt (°C) Tmax (°C)

Listeria monocytogenes 1 30-37 45

Vibrio marinus 4 15 30

Pseudomonas maltophilia 4 35 41

Thiobacillus novellus 5 25-30 42

Staphylococcus aureus 10 30-37 45

Escherichia coli 10 37 45

Clostridium kluyveri 19 35 37

Streptococcus pyogenes 20 37 40

Streptococcus pneumoniae

25 37 42

Bacillus flavothermus 30 60 72

Thermus aquaticus 40 70-72 79

Archaebacteria Tmin (°C) Topt (°C) Tmax (°C)

Methanococcus jannaschii

60 85 90

Sulfolobus acidocaldarius 70 75-85 90

Pyrobacterium brockii 80 102-105 115

Kultivační teplota pro kvasinky: 25 °C.

Kultivační metody

http://image.slidesharecdn.com/microbiologyunit2-3-150710082502-lva1-app6892/95/microbiology-unit-23-bacteria-36-638.jpg?cb=1436518851

Kultivační metody

http://agrosum14.weebly.com/uploads/4/4/9/5/44958631/4965520_orig.jpg

Kultivační metody

http://image.slidesharecdn.com/microbiologicalprinciples-110819155057-phpapp01/95/food-microbiological-principles-fst-241-32-728.jpg?cb=1313769603

Kultivační metody

http://aqualab.decagon.com.br/assets/Article-Graphics/Key-concepts-in-water-activity-Table-1.JPG

http://image.slidesharecdn.com/factorsaffectingthegrowthandsurvivalofmicro-organismsinfoods-150306050511-conversion-gate01/95/factors-affecting-the-growth-and-survival-of-micro-organisms-in-foods-30-638.jpg?cb=1425640055

Kultivační metody

14

http://www.easynotecards.com/uploads/929/65/_4a88b4c5_140c98ff4b1__8000_00008247.png

Kultivační metody

http://www.oxfordscholarship.com/doc/10.1093/acprof:oso/9780199586936.001.0001/acprof_9780199586936_graphic_012.gif

Většina bakterií významných v klinické a potravinářské mikrobiologii, všechny kvasinky a plísně jsou chemoheteroorganotrofní: zdrojem uhlíku a energie a redoxních sloučenin jsou organické sloučeniny.

Kultivační média

15

Dělení dle konzistence:➢ Tekutá média (bujóny) – buňka absorbuje živiny celým povrchem, lepší distribuce živin➢ Tuhá média – např. brambor, mrkve – kultivace některých plísní➢ Média ztužená

➢ agarem (polysacharid - agarosa – 70 % + agaropektin – 30 %, není hydrolyzován většinou bakterií)

➢ želatinou (hydrolyzát kolagenu)➢ ztužená agarová média: 1-3 % agaru – vznik jednotlivých kolonií➢ poloztužená agarová média: 0,2-0,5 % - sledování motility ➢ média ztužená želatinou: test na ztekucování želatiny (např. Clostridium

perfringens)

Dělení dle složení:➢ Média pro chemoheteroorgantrofní organismy musí obsahovat: zdroj uhlíku a energie

(totožný), dusíku, u auxotrofů (nejsou schopni syntetizovat některé potřebné sloučeniny) též vitamíny a stopové prvky

➢ Syntetická (chemicky definovaná) – je známo přesné chemické složení – připravena z čistých chemikálií

➢ Komplexní média – připravena z různých chemicky nepřesně definovaných materiálů a některých jednoduchých čistých chemikálií

Dělení dle účelu kultivace

Kultivační médiaRůzné mikroorganismy se v nárocích na výživu velice liší

16

http://classes.midlandstech.edu/carterp/courses/bio225/chap06/06-T02_MediumChemo.jpg

http://classes.midlandstech.edu/carterp/courses/bio225/chap06/06-T03_MediumFastid.jpg

Výživově nenáročné mikroorganismy Např. E. coli – snadno kultivovatelná

Výživově náročné mikroorganismy (ang. fastidious): náročné na výživové podmínky

Kultivační médiaKomplexní média – základní složkyRůzné přírodní materiály (=přesné chemické složení se liší v jednotlivých šaržích dle výrobcea způsobu přípravy) + některé jednoduché čisté chemikálie

17

Kvasničný extrakt, extrakt z masa...Zdroj zvláště vitamínů a růstových faktorů (kvasničný extrakt – B vitamíny) Zdroj energie a uhlíku, minoritně dusíku

http://images.slideplayer.com/20/5940717/slides/slide_8.jpg

Produkty hydrolýzy různých druhů proteinů(maso, sója, želatina, kasein, rostlinná pletiva...)proteolytickými enzymy: pepsin (peptony),trypsin (tryptony), papain, pankreatin(pankreatická natrávenina...)= hlavní zdroj dusíku (též energie a uhlíku, aleutilizace je pomalejší)

Jednoduché sacharidy (glukóza, laktóza,maltóza...) – zdroj uhlíku a energie

Další růstové faktory pro náročnémikroorganismy:Beraní/koňská krev, NADH+

Minerální soli:NaCl – vhodné osmotické prostředí ( 0,85-0,90 % NaCl fyziologický roztok)Hydrogenfosforečnany a dihydrogenfosforečnany – pufrovací systém –udržování stabilního pH v průběhu kultivaceSO4

-2, Ca2+, Mg2+, Fe2+,3+, Mn2+ aj. – podpora růstu mikroorganismů

18

Dehydratedmixture preparedby the producer

Mixed from single parts

Ready-to-use

Kultivační média

Kultivační média

19

Univerzální kultivační média• Vhodná pro růst všech mikroorganismů, kterým vyhovuje jejich nutriční

složení (neobsahují žádná selektivní činidla) • Selekce růstu mikroorganismů částečně volbou kultivační teploty, příp.

atmosféru➢ PCA (Plate Count Agar) – pepton z kaseinu, masový extrakt, glukóza, agar-

agar; pH: 7.0 ± 0.2 při 25°C➢ živný agar (Nutrient agar) – pepton z masa, masový extrakt, agar-agar; pH:

7.0 ± 0.2 při 25°C➢ trypton-sójový agar (Tryptic soy agar) – pepton z kaseinu, pepton ze sójové

drtě, NaCl, agar-agar; pH: 7.3 ± 0.2 při 25°C➢ trypton-sójový bujón (Tryptic soy broth) - pepton z kaseinu, pepton ze

sójové drtě, glukóza, K2HPO4 (pufrovací aktivita v průběhu růstu), NaCl; pH: 7.3 ± 0.2 při 25°C

➢ pufrovaná peptonová voda (Buffered Peptone water) - pepton z kaseinu, glukóza, Na2HPO4.12 H2O, KH2PO4 (pufrovací aktivita v průběhu růstu), NaCl; pH: 7.0 ± 0.2 při 25°C

20

Živný agar (Nutrient Agar)

Kultivační média

21

Obohacená univerzální kultivační média• Obohacená některými dalšími živiny (krev, extrakty...) pro

podporu růstu mikroorganismů, včetně výživově náročnějších➢ Columbia agar – pepton z kaseinu, pepton z masa, srdcový

extrakt, kvasničný extrakt, škrob, NaCl, agar-agar; pH: 7.3 ± 0.2 při 25°C➢ Columbia agar s 5 % beraní krve – k základu po ochlazení na

45 °C přidána beraní krev (např. 95 ml + 5 ml) – možnost sledování hemolýzy též

➢ Čokoládový agar – k základu po ochlazení na 45 °C přidána beraní krev a směs povařena 10 min při 80 °C do zhnědnutí (např. 90 ml + 10 ml)

➢ Mozko-srdcová infúze (BHI) – mozko-srdcový extrakt, pepton, glukóza, NaCl, Na2HPO4; pH: 7.4 ± 0.2 při 25°C

Columbia Agar s 5 % beraní krve

Escherichia coli

Streptococcus pyogenes

http://www.eolabs.com/columbia-agar-sheep-blood.html

Brain Heart Infusion Broth

Kultivační média

24

Selektivní kultivační média• Cíl: Selektivní kultivace pouze vybrané skupiny mikroorganismů• Růst ostatních nežádoucích skupin mikroorganismů je potlačen přídavkem selektivních

činidel, případně složení média, ph a volbou kultivačních podmínek, která jsou pro tyto nežádoucí skupiny letální

• Selektivní činidla: • Povrchově aktivní látky: žluč a žlučové soli, lauryl suflát sodný, tergitol • Antibiotika: výběr závisí na nežádoucí skupině mikroorganismů• Anorganické soli: chlorid lithný (inhibuji G- a enterokoky), tetrathionát (inhibuje G+

a koliformní bakterie), azid sodný (inhibuje G-)• Barviva: krystalová violeť , briliantová zeleň, malachitová zeleň....

Pomnožovací média: Navržena pro zvýšení počtu mikroorganismů na detekovatelnou úroveň• Neselektivní• Selektivní

Kultivační média

25

Diferenciační (diagnostická) média• Cíl: Odlišit kolonie cílové skupiny mikroorganismů od ostatních na základě

některé typické biochemické reakce• Např.

• A) fermentace cukrů za vzniku kyseliny (změna pH) a/nebo plynu (Durhamova plynovka)

• B) degradace některých sloučenin (např. dekarboxylace) – obvykle změna pH

• C) tvorba určitých sloučenin za vzniku precipitátu (např. tvorba sirovodíku)• D) změna barvy nebo fluorescence kolonií vzhledem k degradaci

chromogenních nebo fluorogenních substrátů – přímá detekce enzymu• Typickým detekčním systémem je použití acidobazických indikátorů – změna

barvy kolonií v závislosti na pH média.

Selektivně – diferenciační (diagnostická) média• Potlačují růst nežádoucích skupin mikroorganismů• Umožňují selektivní růst cílového mikroorganismu a zároveň souběžně s

vizuálním odlišením jeho kolonie

Acidobazické indikátory

http://image.slidesharecdn.com/lab17-141201085153-conversion-gate01/95/-10-638.jpg?cb=1417424219

Chemické sloučeniny měnící barvu dle pH

http://mslavenda.com/images/bromocresol_purple_chart.jpg

http://mslavenda.com/images/bromothymol_chart.jpg

http://2.bp.blogspot.com/-XaGKyJzCBPk/UgS8FU96L3I/AAAAAAAAAt8/7B6bSjxLjjI/s1600/lol.PNG

http://www.dlt.ncssm.edu/tiger/diagrams/acid-base/WeakAcidTitration-General.gif

Selektivně-diagnostická kultivační média

MacConkey Agar Agar pro selektivní izolaci a odlišení laktózu fermentujících

a nefermentujících Enterobacteriaceae = selektivně-

diagnostické médium pro koliformní bakterie

Složení (g/l)

Pepton (z masa a kaseinu) 3.0

Pankreatická natrávenina želatiny 17.0

NaCl 5.000

Žlučové sole 1.5

Krystalová violeť 0.001

Laktóza monohydrát 10.0

Neutrální červeň 0.030

Agar 13.500

pH po sterilizaci (při 25°C) 7.1±0.2

Pepton (z masa a kaseinu)

Pankreatická natrávenina želatiny:

Zdroj dusíku a vitamínů

NaCl: osmotická rovnováha

Selektivní působení krystalové

violeti a žlučových solí inhibuje

růst většiny druhů G+ bakterií

(např.

S. aureus – neroste)

G- bakterie, zvláště

enterobakterie (žijící v

zažívacím traktu) rostou dobře.

Selektivně-diagnostická kultivační média

Diagnostická složka: fermentace laktózy za vzniku

kyseliny vede k poklesu pH a změně acidobazického

indikátoru (neutrální červeň) při pH nižším než 6.8 ze

žluté na červenou

Složení (g/l)

Pepton (z masa a kaseinu) 3.0

Pankreatická natrávenina želatiny

17.0

NaCl 5.000

Žlučové sole 1.5

Krystalová violeť 0.001

Laktóza monohydrát 10.0

Neutrální červeň 0.030

Agar 13.500

MacConkey Agar Kmeny fermentující laktózu

(koliformní bakterie)

rostou červeně nebo růžově, s

možnou zónou precipitované žluči

Kmeny nefermentující laktózu

(Shigella, Salmonella, Proteus...)

jsou bezbarvé a typicky

neodlišitelné vzhledem od média

http://2.bp.blogspot.com/-XaGKyJzCBPk/UgS8FU96L3I/AAAAAAAAAt8/7B6bSjxLjjI/s1600/lol.PNG

pH po sterilizaci (při 25°C) 7.1±0.2

Chromogenní kultivační média• Obsahují jeden nebo více chromogenních substrátů

(substrát pro specifický enzym s připojeným

chromoforem)

• Umožňují detekci specifických enzymů, schopných

odštěpit z chromogenního substrátu chromofor

(změna barvy)

CHROMOGENNÍ MÉDIUM (Colilert): Koliformní bakterie mají enzym β-galactosidasu a jsou schopny z ONPG odštěpit chromofor (o-nitrofenol) – změna barvy na žlutou z bezbarvé.

https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQp0jRYnmkNvmAadTkSzSsNYUpHuBzWmdbKoWQ79qbh3nLIhZ18ww

Koliformní bakterie (MPN metoda)

Fluorogenní kultivační média• Obsahují jeden nebo více fluorogenních substrátů

(substrát pro specifický enzym s připojenýmfluoroforem)

• Umožňují detekci specifických enzymů, schopnýchodštěpit z fluorogenního substrátu fluorofor(fluorescence po ozáření UV)

FLUOROGENIC MEDIUM (Colilert): E. coli (96-97 % kmenů mimo některé patogenní sérotypy) má enzym β-D-glucuronidasu, který je schopen rozštěpit MUG a vykazovat tak fluorescenci (UV 360 nm).

http://ga.water.usgs.gov/projects/bacteria/pictures/summaryanalysisecoli.jpg

E. coli (MPN metoda)

ProduktivitaProduktivita (PR – productivity ratio)

• vyjadřuje schopnost růstu

mikroorganismu v testovaném médiu ve

srovnání se schopností růstu na

referenčním médiu

•Pro kvantitativní vyjádření je definována

následně:

PR =NS / NO

NS - celkový počet KTJ na testovaném

médiu

NO – celkový počet KTJ na příslušném

referenčním médiu (min. 100 KTJ)

Hodnoty PR

• neselektivní média…..min. 0,7

• selektivní média……min. 0,1

Správný počet buněk (0.2 ml)

0.2 ml

Neselektivní médium (referenční)

Selektivní médium

Selektivita

Selektivita (SF)

• demonstruje, že

médium je schopno

potlačit růst nežádoucích

mikroorganismů

Správný počet buněk (0.2 ml)

0.2 ml

Neselektivní médium

Selektivní médium

Nejsou necílové

mikroorganismy

(doprovodná

mikroflóra) schopny

též růstu ?

Specifita

Specificita (fyziologická charakteristika)

Specifita kultivačního média označuje jeho schopnost rozlišit příbuzné

organismy na základ přítomnosti/nepřítomnosti nebo míry biochemické

odpovědi a velikosti kolonií a jejich morfologii.

Cílový mikroorganismus roste na daném médiu ve shodě se specifikací.

Jednotlivé kmeny stejné skupiny se mohou lišit – testováno proto více kmenů

dané skupiny.

Bude mít vždy cílový mikroorganismu pozitivní reakci ?

Cílový mikroorganismusDává očekávanou reakci

Plotnové metody a MPN (tekuté a tuhé vzorky) Tuhé vzorky - resuspenze vzorku ve vhodném dilučním roztoku (1:10) desítkové ředění

Filtrace (tekuté vzorky) Filtrace vzorku, příp. po vhodném naředění

❖ZPRACOVÁNÍ VZORKU

Mikrobiální kultury rostoucí na selektivních médií nejsou vhodné pro biochemické testování – selektivní médiu snižuje „fitness“ i cílových bakterií a jejich fenotypové vlastnosti, což interferuje s přesností a spolehlivostí testů

Kultivační metody stanovení počtu MO

Plotnové metody - výsev roztěrem či přelivem MPN – inokulace tekutého média Filtrace – přenos filtru na povrch ztuženého média

❖IZOLACE NA SELEKTIVNÍ/NESELEKTIVNÍ MÉDIA

❖SUB-IZOLACE PRESUMPTIVNÍCH KOLONIÍ ZE SELEKTIVNÍCH NA NESELEKTIVNÍ MÉDIA

❖KONFIRMACE/IDENTIFIKACE PRESUMPTIVNÍCH KOLONIÍ

DESÍTKOVÉ ŘEDĚNÍ

VZOREK

IZOLACE

KULTIVACE

POČÍTÁNÍ KOLONIÍ

SUB-IZOLACE PRESUPMTIVNÍCH

KOLONIÍ

VÝSLEDEK

VZOREK: obvykle 10 g nebo 10 ml (1X)DILUČNÍ MÉDIUM: • např. fyziologický roztok s peptonem, pufrovaná peptonová

voda (prostředí neovlivňující počet MO)• Ředěno 1:9• 1. ředění – sterilní sáček (10 g/ml + 90 ml; 1X + 9X),

resuspenze/smíšení• Následující ředění – zkumavky (1 ml suspenze + 9 ml

dilučního média)

KULTIVACE A KONFIRMAČNÍ

TESTY

1:10 1:10000001:100 1:1000 1:10000 1:100000



VZOREK

IZOLACE

KULTIVACE



KOLONIÍ

VÝSLEDEKKULTIVACE A

KONFIRMAČNÍ TESTY


1:100 1:1000 1:10000 1:100000 1:1000000

Izolace = inokulace vybraných ředění (výběr dle limitu výskytu MO v potravině) + kultivaceo Roztěrem na povrch média v Petriho misce (obvykle 0.1 nebo

0.2 ml) o Přeliv suspenze v prázdné Petriho misce sterilním rozehřátým

ztuženým médiem při teplotě 45 °C (obvykle 1 ml)

Inokulační metody

http://classes.midlandstech.com/carterp/Courses/bio225/chap06/Microbial%20Growth%20ss5.htm

Metoda přelivu dává lepší výsledky pro fakultativně anaerobní mikroorganismy než metoda roztěru

Metoda roztěru užívána pro aerobní mikroorganismy

Izolace čárkováním

http://department.monm.edu/chemistry/chemistry330/fall2004/abickert/images/streak.gif


VZOREK

IZOLACE

KULTIVACE



KOLONIÍ

VÝSLEDEKKULTIVACE A

KONFIRMAČNÍ TESTY

Kultivační metody stanovení počtu MOKultivace: čas a teplota závisí na MO a metoděPočítání kolonií: limit KTJ – obvykle 10-300 pro stanovení počtu všech mikroorganismů (neselektivní média), 10-150 pro stanovení počtu presumptivních/typických/atypických kolonií (selektivní média)Konfirmace: • výběr až 5 presumptivních/typických/atypických kolonií,

pokud přítomny, z každé plotny použité k výpočtu • Konfirmace biochemickými testy (viz selektivita a specifita

média) Výsledek: A.B x 10c KTJ/g, ml (např. 5.2 x 104 KTJ/g, ml)

http://www.studyblue.com/notes/note/n/lab-practical-exam-review-1/deck/6074578(ADAPTED S.P.)

http://www.studyblue.com/notes/note/n/lab-practical-exam-review-1/deck/6074578

Čeleď Enterobacteriaceae

Gramnegativní fakultativně anaerobní rovné tyčinky,

některé z nich pohyblivé

Většina rodů roste dobře při 37°C,

ačkoliv některé rostou lépe při 25 - 30°C

Fermentují glukózu, oxidáza negativní

Schopny růst v přítomnosti žlučových solí

Koliformní bakterie

Fermentují laktózu (přítomnost enzymu

β-galaktosidáza)

Escherichia coli

Většina kmenů (mimo některé patogenní

kmeny – cca 3-4 %) produkuje enzym

β-D-glukuronidázu

Tvorba indolu z tryptofanu

Enterobacteriaceae

TBX

VČŽG (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Glukóza) Agar

VČŽL (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Laktóza) Agar

Agar dle MacConkey, ENDO agar, Chromocult Coliform agar

VČŽG

Escherichia coli ATCC 8739

Shigella flexneri ATCC 29903

Vzhled kolonií MikroorganismyČervené, obklopené načervenalou precipitační zónou či bez zóny

Enterobacteriaceae a jiné

Bezbarvé Žádné Enterobacteriaceae nejsou přítomné

Typické složení (l): pepton 7 g; kvasničný extrakt 3 g, chlorid sodný 5 g; D(+) glukosa 10 g; směs žlučových solí 1,5 g; methylčerveň 0,03 g; krystalová violeť 0,002 g; agar-agar 13 g. Selektivní složkaKrystalová violeť inhibuje růst doprovodné grampozitivní bakteriální flóry ze vzorku. Žlučové kyseliny inhibují růst doprovodné mikroflóry a selektivně podporují růst EnterobacteriaceaeDiagnostická složkaFermentace glukosy – produkce kyselin je indikována změnou barvy přidaného acidobazického indikátoru methylčerveně. Půda není pro Enterobacteriaceae zcela specifická – stejný vzhled mohou vykazovat např. aeromonády.

VČŽG (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Glukosa) Agar půda s krystalovou violetí, violetovou červení, žlučí a glukózouSelektivní půda pro Enterobacteriaceae

EnterobacteriaceaeČSN ISO 21528-2 (560096) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metody pro průkaz a stanovení

počtu bakterií čeledi Enterobacteriaceae - Část 2: Technika počítání kolonií

*Minimálně minimálně dvě po sobě jdoucí ředění vysetá v paralele

**ŘR..ředící roztok – PPV

***1 ml testované suspenze přelít půdou VČŽG temperovanou na 44 °C – 47 °C, doba od zaočkování inokula a přelití

inokula půdou nesmí přesáhnout 15 minut. Nejdříve asi 10 ml, po úplném ztuhnutí půdy převrstvit dalšími 15 ml –

vytvoření semi anaerobního prostředí.

Biochemické testy: test na oxidázu, fermentace glukózy - glukózový agar

(37 °C, 24 h)

Vzorek

0. ředění

VČŽG

Vyhodnocení biochemických testů

Výpočet a vyjádření výsledku

1. den

2. den

3. den

4. denVyhodnocení testů

10 g vzorku

+ 90 ml ŘR**

- 1. ředění

1 ml (-1. ředění)

+ 9 ml ŘR**

- 2. ředění

1 ml (-(X+1). ředění

+ 9 ml ŘR**

- X. ředění

….

VČŽG VČŽGVČŽG VČŽG VČŽG VČŽG

VČŽG

Příprava vzorku

a desítkové

ředění*

Kultivace: 37 °C, 24 h±2 h

Výběr typických (příp. atypických) kolonií pro konfirmaci

Přeočkování až 5 náhodně vybraných typických (příp. atypických) kolonií

živný agar, 37˚C, 24±3 h

Izolace na

selektivní ztužená

média

Přeočkování na

neselektivní agar

Konfirmační

testy

Přeliv 1 ml půdou VČŽG***

Průkaz oxidázyPrůkaz cytochromoxidáza/oxidázaPrůkaz enzymů, který se podílí na oxidativních procesech v bakteriální buňce, přítomny u všech aerofilních bakterií s respiračním metabolismem. Podstata testu je reakce derivátů p-fenylendiaminu se železem obsaženým v cytochromových respiračních komlexech. Přítomnost cytochromoxidázy je detekována barevnými reakcemi pomocí příslušných činidel.

Postupkultura je přenesena na plochu navhlčenou činidlem pomocí platinové či plastové kličky (nikoliv železné ! –možná falešně pozitivní reakce), produkce oxidázy dojde ke vzniku sytě fialové až modré barvy do cca 20-30 s – v závislosti na formátu testu

Oxidáza pozitivní G- bakterie (OXI +)Pseudomonas sp., Aeromonas sp.Oxidáza negativní G- bakterie (OXI -)Čeleď Enterobacteriaceae, Acinetobacter sp.

Enterobacteriaceae ČSN ISO 21528-2 –konfirmace a výpočty

Typický vzhled (červené kolonie, obklopené načervenalou precipitační zónou či bez

zóny) mohou mít na této půdě (OXI...test na oxidasu, GLU...fermentace glukózy)

• nejenom Enterobacteriaceae (OXI -, GLU +)

• ale i další G- bakterie fermentující glukózu např. Aeromonas (OXI +, GLU +)

• příp. i G- bakterie, které glukózu oxidují např. Strenotrophomonas sp. (OXI -, GLU -)

Konfirmace

• potvrzení schopnosti fermentovat glukózu (anaerobní podmínky – vpich do

glukózového agaru) (GLU +)

• nepřítomnost oxidasy (OXI -)

Konfirmace se provádí vždy pouze u reprezentativního počtu 5 kolonií (pokud

kolonií méně než 5, konfirmace se provádí u všech) z každé plotny použité k

výpočtu.

Pro výpočet se vybírají plotny obsahující méně než 150 charakteristických (typických)

kolonií a méně než 300 kolonií celkem. Mezní limit pro nízké počty je roven 15.

Vzhledem k tomu, že některé Enterobacteriaceae mohou způsobovat odbarvení kolonií

nebo půdy, vybere se pět bělavých kolonií pro konfirmaci, i v případě, že nejsou

přítomny žádné charakteristické kolonie.

43

• Stanovit koeficient „konfirmovanosti“ pro typické a atypické kolonie

• Konfirmovaná kolonie = OXI -, GLUKÓZA +

𝑘𝑡𝑦𝑝𝑖𝑐𝑘é =𝑏𝑡𝑦𝑝𝑖𝑐𝑘é

𝐴𝑡𝑦𝑝𝑖𝑐𝑘é𝑘𝑎𝑡𝑦𝑝𝑖𝑐𝑘é =

𝑏𝑎𝑡𝑦𝑝𝑖𝑐𝑘é

𝐴𝑎𝑡𝑦𝑝𝑖𝑐𝑘é

Př. Na plotně 50 typických kolonií (ctypické) a 4 atypické kolonie (catypické).Na konfirmaci vzato 5 typických kolonií. Čtyři z nich byly OXI – a GLU +.Na konfirmaci vzaty 4 atypické kolonie. Žádná nebyla OXI – a GLU +.

𝑘𝑡𝑦𝑝𝑖𝑐𝑘é =4

5=0,8 𝑘𝑎𝑡𝑦𝑝𝑖𝑐𝑘é =

0

4=0

Enterobacteriaceae- výpočet

A..počet typických (či atypických) kolonií vzatých na konfirmacib...počet konfirmovaných typických (či atypických) kolonií

a = (ktypické)*(ctypické) + (katypické)*(catypické) = 0,8*50 + 0*4 = 40

Na dané plotně je tedy celkem 40 KTJ potvrzených (konfirmovaných) typických a atypických kolonií. Tento počet se poté používá ve vzorcích uvedených viz Escherichia coli ČSN ISO 16649-2 – výpočty.

44

VČŽL

Vzhled kolonií MikroorganismyČervené, obklopené načervenalouprecipitační zónou či bez zóny

koliformní bakterie

Malé červené kolonie („tečky“) Příležitostně enterokokyBezbarvé laktóza negativní

enterobakterie a jiné

Typické složení (l): pepton 7 g; kvasničný extrakt 3 g, chlorid sodný 5 g; D(+) glukosa 10 g; směs žlučových solí 1,5 g; methylčerveň 0,03 g; krystalová violeť 0,002 g; agar-agar 13 g. Selektivní složkaKrystalová violeť inhibuje růst doprovodné grampozitivní bakteriální flóry ze vzorku. Žlučové kyseliny inhibují růst doprovodné mikroflóry a selektivně podporují růst EnterobacteriaceaeDiagnostická složkaFermentace laktózy – produkce kyselin je indikována změnou barvy přidaného acidobazického indikátoru methylčerveně.

VČŽG (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Glukosa) Agar půda s violetovou červení, žlučí a glukózouSelektivní půda pro Enterobacteriaceae a odlišení koliformních


Escherichia coliATCC 25922

Salmonella gallinarumNCTC 9240

Endo AgarSložení (l): Peptická natrávenina zvířecí tkáně 10.0 g , Laktóza 10.0, Hydrogenfosforečnan draselný 3,5 , Siřičitan sodný 2.5 , Základní fuchsin 0.5 , Agar 15.0, pH 7,4 ± 0,2 Selektivně-diagnostické médium pro izolaci a rozlišení druhů Enterobacteriaceae a dalších gramnegativních tyček z klinických vzorků či vyšetření potravin.

46

Selektivní složka:siřičitan sodný a základní fuchsin (částečné potlačení Gram pozitivních mikroorganismů)

Shigella flexneri ATCC 12022

Diagnostická složka:Koliformní bakterie – fermentace laktózy - tmavě růžové až středně červené kolonie s měňavým nazelenalým kovovým leskem a podobným zabarvením média. E. coli – dochází ke krystalizaci fuchsinu – nazelenalý metalický lesk.Kolonie organismů, které nefermentují, jsou na světle růžovém pozadí média bezbarvé až narůžovělé.

Endo

Agar

ChromoCult®Coliform Agar

Citrobacter freundii ATCC 8090


Selektivní agar pro simultánní detekci koliformů a E. coli v pitné

vodě a potravinách

Typical Composition (g/litre)

Peptone 3.0; sodium chloride 5.0; sodium dihydrogen phosphate 2.2; di-sodium

hydrogen phosphate 2.7; sodium pyruvate 1.0; tryptophan 1.0; agar-agar 10.0;

Sorbitol 1.0; Tergitol® 7 0.15; 6-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside 0.2; 5-

bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid 0.1; isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside 0.1. pH: 6.8 ± 0.2 at 25°C.

Identifikace koliformů

Salmon-GAL – štěpen β-D-galactosidasou – charakteristický

pro koliformy – lososové až červené kolonie

Identifikace E. coli

X-glucuronide – štepen β-D-glucuronidasou – charakteristické

pro E. coli. E. coli též štěpí Salmon-GAL – tmavěmodré až

fialové kolonie.

TBXChromocult® TBX agar (trypton bile X-glucuronid)=chromogenní půda

Složení (l): pepton 20 g; žlučové soli No. 3 1,5 g; X-ß-D-glukuronid 0,075 g; agar-agar 15 g.Selektivně-diagnostické chromogenní médium pro β-D-glukuronidáza pozitivní kmeny E. coliInhibiční složka:Růst doprovodné mikroflóry je inhibován přídavkem žlučových solí a kultivační teplotou 44 °C (E. coli schopna růst, ostatní Enterobacteriaceae obvykle nikoliv).Diagnostická (chromogenní složka)E. coli se odlišuje od ostatních koliformních bakterií syntézou enzymu β-D-glukuronidázy, který je schopen štěpit chromogenní substrát 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-glukuronid (X-ß-D-glukuronid). Dochází ke štěpení vazby mezi chromoforem 5-bromo-4-chloro-3-indolyl a D-glukuronidem, odštěpení chromoforu vede k modrozelenému zbarvení kolonií E. coli.

Vzhled kolonií Mikroorganismymodrozelené –indikace přítomnosti β-D-glukuronidázy

E. coli

Bezbarvé glukuronidáza negativní E. coli (3-4 % kmenů) schopné růstu při 44 °C (např. E. coli O157) (další glukuronidázanegativní E. coli jako E. coli O157:H7 při 44 °C nejsou schopny růst)


Escherichia coli DSMZ 502

Escherichia coliČSN ISO 16649-2 (560079) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu beta-

glukuronidázopozitivních Escherichia coli - Část 2: Technika počítání kolonií vykultivovaných při 44 °C

s použitím 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glukuronidu



***1 ml testované suspenze přelít asi 15 ml půdy TBX temperované na 44 °C – 47 °C.

Vzorek

0. ředění

TBX

Odečet typických kolonií (biochemická reakce, která je základem vzhledu

kolonií, je považována za natolik specifickou, že není prováděna

konfirmace)


1. den

2. denVyhodnocení

10 g vzorku

+ 90 ml ŘR**

- 1. ředění


+ 9 ml ŘR**

- 2. ředění


+ 9 ml ŘR**

- X. ředění

….

TBX TBXTBX TBX TBX TBX

TBX

Příprava vzorku

a desítkové

ředění*

Kultivace: 44 °C, 18-24 hodin

Izolace na


média

Přeliv 1 ml půdou TBX***

Escherichia coli ČSN ISO 16649-2 - výpočtyPředpoklad: Modrozelený vzhled kolonií je důsledek aktivity β-D-glukuronidázy – z mikroorganismů

schopných růstu za daných kultivačních podmínek pouze E. coli má tento enzym (další např. rody Clostridium,

Peptostreptococcus či Staphylococcus)

= VŠECHNY MODROZELENÉ KOLONIE JSOU UVAŽOVÁNY JAKO KOLONIE E. COLI

MAXIMUM POČITATELNÝCH KOLONIÍ = 150 KTJ/PLOTNA

B) Plotny dvou po sobě jdoucích ředění v paralele

< 150 typických kolonií na každé plotně

> 15 typických kolonií alespoň na jedné plotně

dnnV

aN

).1,0( 21

Σa..součet typických kolonií ze všech ploten zvolených k výpočtu

V..objem inokula v ml očkovaného na každou z ploten

n1 …počet ploten zvolených k výpočtu z prvního (nižšího) vybraného ředění

n2 …počet ploten zvolených k výpočtu z druhého (vyššího) vybraného ředění

d….ředící faktor odpovídající prvnímu vybranému ředění ( nižší ředění s vyššíkoncentrací KTJ) , které bylo vybráno k výpočtu

(např. v případě použití 1. a 2. ředění se d=10-1)

A) > 150 typických kolonií na všech inokulovaných plotnách

Více než 150/(d x V) β-glukuronidázapozitivních E. coli v mililitru nebo gramu

d….ředící faktor nejvyššího inokulovaného ředění, V – objem inokula

(pro –X. ředění : d=10-X, pokud použit i přímo vzorek – např. tekuté výrobky –d=100=1

KTJ/ml, g

Příklad

Ředění Počet typických KTJ (modrozelené)

1. > 150, > 150 > 150, > 150

2. > 150, > 150 110, 100

3. > 150, > 150 14, 19

4. > 150, > 150 1, 3

Výsledek Více než 150/(10-4 x 1) = více než 1,5*106

KTJ/ml= 1,1*104 KTJ/ml

10*2*1,02*12

1921100110

51

Celkový počet mikroorganismůČSN EN ISO 4833 (560083) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda pro stanovení

celkového počtu mikroorganismů - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C

*Minimálně minimálně dvě po sobě jdoucí ředění vysetá v paralele. je-li to vhodné a možné, zvolí se takový stupeň ředění,

která poskytnou počty kolonií mezi 15 a 300 na misku.


***1 ml testované suspenze přelít asi 12-15 ml půdy PCA temperovanou na 44 °C – 47 °C, doba od zaočkování inokula po

přelití inokula půdou nesmí přesáhnout 45 minut. Pouze v případě očekává-li se výskyt mikroorganismů, jejichž kolonie

přerůstají povrch půdy, přelije se ztuhlá vrstva dalšími 4 ml půdy pro převrstvení.

Vzorek

0. ředění

PCA

Odečet kolonií


1. den

4. denVyhodnocení

10 g vzorku

+ 90 ml ŘR**

- 1. ředění


+ 9 ml ŘR**

- 2. ředění


+ 9 ml ŘR**

- X. ředění

….

PCA PCAPCA PCA PCA PCA

PCA

Příprava vzorku

a desítkové

ředění*

Kultivace: 30 °C, 72 h±3 h

Izolace na

neselektivní

ztužená média

Přeliv 1 ml půdou PCA***

PCA

53

➢ Univerzální kultivační média ➢ PCA (Plate Count Agar) –

pepton z kaseinu, kvasničný extrakt, glukóza, agar-agar; pH: 7.0 ± 0.2 při 25°C

➢ (agar s kaseinem, kvasničným extraktem a glukózou)

➢ (agar pro počítání kolonií kultivovaných při 30 °C)

B. subtilis

CPM: ČSN EN ISO 4833 - výpočtyMAXIMUM POČITATELNÝCH KOLONIÍ = 300 KTJ/PLOTNA (NÍZKÉ POČTY: MÉNĚ NEŽ 15 KTJ)

B) Plotny dvou po sobě jdoucích ředění v paralele

< 300 kolonií na každé plotně

> 15 kolonií alespoň na jedné plotnědnnV

aN

).1,0( 21

Σa..součet typických kolonií ze všech ploten zvolených k výpočtu


n1 …počet ploten zvolených k výpočtu z prvního (nižšího) vybraného ředění

n2 …počet ploten zvolených k výpočtu z druhého (vyššího) vybraného ředění

d….ředící faktor odpovídající prvnímu vybranému ředění ( nižší ředění s vyšší koncentrací KTJ) , které bylo vybráno k výpočtu

(např. v případě použití 1. a 2. ředění se d=10-1)

A) > 300 typických kolonií na všech inokulovaných plotnách

Více než 300/(d x V) mikroorganismů kultivovaných při 30 °C v mililitru nebo gramu

d….ředící faktor nejvyššího inokulovaného ředění, V – objem inokula

(pro –X. ředění : d=10-X, pokud použit i přímo vzorek – např. tekuté výrobky – d=100=1

KTJ/ml, g

54

C) Méně než 15 kolonií na obou plotnách nejnižšího použitého ředění = odhad nízkých počtů

dnV

C

EN

KTJ/ml, gΣa..součet typických kolonií ze všech ploten zvolených k výpočtu


n…počet ploten zvolených k výpočtu z nejnižšího vybraného ředění

d….ředící faktor odpovídající nejnižšímu vybranému

d….ředící faktor nejnižšího (tj. nejvíce koncentrovaného) použitého ředění


D) žádné kolonie na žádných plotnách

Méně než 1/(d x V) mikroorganismů kultivovaných při 30 °C v mililitru nebo gramu

3M Petrifilm™ Count Plates

an all-in-one plating system made by the Food Safety Division of the 3M Corporation

cost-effectiveness, simplicity, convenience, and ease of use

3M Petrifilm™ Count Plates - principle3M Petrifilm™ Count Plates:Coating technology

1. Top FilmPlastic Film coated withadhesive, indicator and cold water soluble gel.

2. Bottom FilmPlastic coated paper printed with a grid, adhesive standard methods nutrients, cold water soluble gel.

3M Petrifilm™ Coliform Count Plates

Koliformní bakterie – fermentace laktózy za vzniku kyseliny a plynuVČŽL dehydratované médium• Červeně až fialově zbarvené

kolonie• Umožněna však též detekce

tvorby plynu (plyn je zachycen vrchním filmem)

• Vyšší specifita stanovení

Stanovení počtu metodou filtrace1. KROK FILTRACE TEKUTINY (OBVYKLE 100 ML)

3. KROK KONFIRMACE TYPICKÝCH KOLONIÍ

2. KROK PŘENOS FILTRU SE ZACHYCENÝMI MIKROORGANISMY NA SELEKTIVNÍ MÉDIUM

59

TTC – ze spodu

Zvrchu

Reálný vzorek

Laktózový

TTC agar s tergitolem

Stanovení počtu metodou MPN1. KROK PŘÍPRAVA VÝCHOZÍ SUSPENZE TESTOVANÉ POTRAVINY A DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ

2. KROK INOKULACE VÝCHOZÍ SUSPENZE A JEDNOTLIVÝCH ŘEDĚNÍ DO SÉRIE PO 3, 5, 10 ČI 15 ZKUMAVKÁCH SE SELEKTIVNÍ POMNOŽOVACÍ PŮDOU (SPP)

3. KROK KONFIRMACE ZKUMAVEK SE ZÍSKANOU POZITIVNÍ REAKCÍ

10 g vzorku + 90 ml diluentu10 ml 2X SPP + 10 ml výchozí suspenze = 1 g/ zkumavka (2x – dvojnásobná koncentrace média z důvodu vysokého ředění vzorkem)10 ml 1X SPP + 1 ml výchozí suspenze=0.1 g/ zkumavka10 ml 1X SPP + 1 ml 2.ředění výchozí suspenze =0.01 g/ zkumavka10 ml 1X SPP + 1 ml 3.ředění výchozí suspenze=0.001 g/zkumavka etc.

o Jaká je pravděpodobnost, že při X KTJ/ml suspenze, bude v A případech odebrána alespoň jedna buňka v daném objemu (poz.) a v B případech naopak žádná (neg.) = odhad počtu bakterií na základě statistiky

o Zde pro vyhodnocení získán číselný kód 4-2-1

Předpoklad: o v tekutém médiu je distribuce buněk uniformní,

nejsou spojeny ve shluky, k detekovatelnému růstu (=projevuje se pozitivní reakcí) dochází i kdyby pouze jedna životaschopná buňka byla ve zkumavce)

Metoda nedává příliš přesné výsledky, avšak umožňuje i rozbor tuhých nebo nefiltrovatelných vzorků s nízkým obsahem mikroorganismů (< 10 CFU/g).

Stanovení počtu metodou MPN

Vv1• ve vzorku o objemu V je 1 částice (buňka) –

pravděpodobnost, že se tato částice (buňka) nebude vyskytovat ve vzorku o objemu ν

bs Vvp 1

• ve vzorku o objemu V je b částic (buněk) –pravděpodobnost, že se žádná částice (buňka) nebude vyskytovat ve vzorku o objemu ν

V

vbps exp• pokud ν/V je malé, lze aproximovat• b/V je densita (koncentrace) - δ

vp s exp

vp f exp1ve vzorku o objemu V je b částic (buněk) –pravděpodobnost, že se bude alespoň jedna částice (buňka) vyskytovat ve vzorku o objemu ν

odběr n vzorků o objemu ν ze vzorku o celkovém objemu V a densitě (koncentraci) δ – pravděpodobnost , že s vzorků z n vzorků bude obsahovat alespň alespoň jednu částici (pozitivní reakce)

sns

sn

f

s

f

vvsns

n

ppsns

nsf

expexp1)!(!

!

1)!(!

!|

0exp1

)exp(

exp1log)!(!

!log

vsnv

vvs

l

vsnvssns

nl

MPN – hledání denzity (koncetrace) δ, při které je výše uvedená pravděpodobnost nejvyšší

nv

v

sv

exp1

Výpočet SE a další materiály – viz www.unc.edu/depts/case/.../MPNcalculator/MPNequations.doc

m

i

sns iii vvL1

expexp1

Spojená pravděpodobnost pozorování výskytu alespoň jedné částice v si v ředění m při objemu vzorku νi a ni vzorcích

m

i

ii

m

i i

ii vnv

vs

11 exp1 MPN – hledání denzity (koncetrace) δ, při které je výše uvedená pravděpodobnost nejvyšší

Odhad nejvýše pravděpodobného počtu 1) Výpočet dle vzorce –IS0 7218:2007 10.5.6.12) Software programy3) Použití MPN tabulekB.5 ISO 7218:2007MPN indexy pro 3 následující ředění se 3 zkumavkami, kdy první zkumavka obsahuje 1 g vzorku (43 možností) B.7 ISO 7218:2007/ Tabulka A.1 ISO 7251:2005(E) MPN index pro 3 následující ředění s 5 zkumavkami, kdy první zkumavka obsahuje 1 g vzorku (63 možností).)

Počet pozitivních výsledků

Index MPN

Kategorie Hranice spolehlivosti (95%)

Dolnílimit

Horní limit

2 0 0 0.92 1 0.15 3.5

2 0 1 1.4 2 0.4 3.5

2 0 2 2.0 0 0.5 3.8

2 2 1 2.8 3 0.9 9.4

Kategorie:Pokud je analýza provedena přesně, poté 95 % kombinací spadá do kategorie 1; 1.4% do kategorie 2; 0.9 % do kategorie 3 and 0.1 % do kategorie 0.


Výběr série zkumavek pro výpočet

Vzorek

Tekutý vzorek10 ml

1 ml 10-1 ml 10-2 ml 10-3 ml MPN

Ostatní vzorky1 g

10-1 g 10-2 g 10-3 g 10-4 g Tek. vzorek(ml-1 )

Ost. vzorky(g -1 )

1 3 3 2 1 0 1.1x101 1.1x102

Dolní limit 0.2x101 0.2x102

Horní limit 4.0x101 4.0x102

Pokud x gramů vzorku v první zkumavce, násobit výsledek 1/x) – např. pro 10 g – násobit 0.1, pro 0.1 g = násobit 10

Počet pozitivníchvýsledků

Index MPN

Kategorie

Hranice spolehlivosti (95%)

Dolní limit Horní limit

3 3 2 110 1 20 400

3 2 1 1.4 2 0.4 3.5

2 1 0 1.5 1 0.4 3.8

1 – lepší kategorie3-3-2: vyšší celkový počet pozitivních zkumavek


Horizontální metoda průkazuPrůkaz přítomnosti či nepřítomnosti byť jen jediné životaschopné buňky cílového mikroorganismu v testované potravině, obvykle 25 g (dáno Nařízením č. 2073/2005)Kultivační metoda stanovení: Získání cílového mikroorganismu jako jednotlivě rostoucích kolonií, které lze dále identifikovat

Primární pomnožení: X g, ml potraviny + 9X ml pomnožovacího média resuscitace a opatrné pomnožení stresovaných mikroorganismů (nižší nebo žádná koncentrace selektivních činidel, přídavek složek pro potlačení toxicity selektivních činidel)

Sekundární pomnožení: přenos 0,1-10 ml z primárně pomnožené suspenze do selektivního méda - intenzivní pomnožení cílového mikroorganismu na koncentraci detekovatelnou v izolačním kroku

1. KROK POMNOŽENÍ CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU V POTRAVINĚ V TEKUTÉM MÉDIU

2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z POMNOŽOVACÍHO MÉDIA NA ZTUŽENÉ MÉDIUM

Vyočkování z pomnožovacího média na selektivní nebo selektivně-diagnostické půdy(obvykle jedno povinné dle ISO, druhé volitelné – diverzita MO v rámci cílové skupiny) Nárůst cílového mikroorganismu v jednotlivých typických koloniích

Vyočkování typických kolonií na neselektivní kultivační médium a provedení příslušných biochemických testůPřímé provedení biochemických testů nemusí poskytovat spolehlivé reakce

3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ

Listeria monocytogenesČSN EN ISO 11290-1: Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes – Část

1: Metoda průkazu (aktuální znění ČSN EN ISO 11290-1/Amd 1:2004).

* ALOA – povinný selektivní agar, **Oxford – volitelný selektivní agar

***Vyočkovat z každé plotny nejméně jednu kolonii považovanou za typickou nebo suspektní na živný agar. Další čtyři

kolonie se vyberou až poté, je-li první kolonie negativní. (Pro epidemiologické studie: konfirmace nejméně pěti kolonií. Pokud typických

kolonií méně než pět na misce, vyberou se všechny typické nebo suspektní ke konfirmaci.)

zaočkujeme 0,1 ml

25g vzorku + 225 ml ½ Fraser (poloviční Fraser)

kultivace 30 ˚C, 24 h

10 ml plný Fraser

kultivace 37 ˚C, 24 h

Sterilní očkovací kličky s očkem o objemu

10 µl

ALOA*

37˚C, 24±3 h

Oxford**

37˚C, 24±3 h

Výběr typických (příp. atypických)

kolonií pro konfirmaci***

Biochemické testy (37 °C, 24 h)

ALOA*

37˚C, 24±3 hOxford**

37˚C, 24±3 h

TSYEA

37˚C, 24±3 hTSYEA

37˚C, 24±3 h

TSYEA

37˚C, 24±3 h

TSYEA

37˚C, 24±3 h

Vyhodnocení biochemických

testů

1. den

2. den

3. den

4. den

5. den

6. den

Výběr typických (příp. atypických)

kolonií pro konfirmaci***Sterilní očkovací kličky s očkem o objemu 10 µl

Biochemické testy (37 °C, 24 h)

Vyhodnocení biochemických

testů

Selektivní

předpomnožení

(pre-enrichment)

Selektivní

pomnožení

(enrichment)

Izolace na


média

Přeočkování na

neselektivní agar

Konfirmační testy

Vyhodnocení testů

Selektivní

předpomnožení

(pre-

enrichment)

Izolace na

selektivní

ztužená média

Přeočkování

na

neselektivní

agar

Konfirmační

testy

Vyhodnocení

testů

Horizontální metoda průkazu

Primární pomnožení: X g, ml potraviny + 9X mlpomnožovacího média POLOVIČNÍ BUJÓN DLE FRASER (poloviční koncentrace inhibujících složek- akriflavin, kyselina nalidixová - opatrné pomnožení stresovaných mikroorganismůKultivace: 30 °C, 24 h ±3 hodiny

Sekundární pomnožení: přenos 0,1 ml z primárně pomnožené suspenze do 10 ml plného Fraserova bujónu (plná koncentrace inhibujících látek)Kultivace: 35/37 °C, 48 ±3 hodiny

1. KROK POMNOŽENÍ LISTERIA MONOCYTOGENES PŘÍTOMNÉ V POTRAVINĚ V TEKUTÉM MÉDIU

2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z POMNOŽOVACÍHO MÉDIA NA ZTUŽENÉ MÉDIU

Vyočkování z obou pomnožovacích médií na plotnu dvou selektivních ztužených půd - povinná půda ALOA (kultivace: 37 °C, 24 ±24 hodiny)+ druhá volitelná půda (Oxford agar, Palcam agar)

Příklad: ISO 11290-1:1996: Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes - Část 1: Metoda průkazu

L. monocytogenes – bujón dle FraseraPomnožovací médium: bujón podle FraseraSložení (g/l):Proteose peptone 5.0; pepton z kaseinu 5.0; kvasničný extrakt 5.0; masový exktrakt 5.0; NaCl 20.0; hydrogenfosforečnan disodný 9.6; dihydrogenfosforečnan draselný 1.35; eskulin 1.0; chlorid lithný 3.0. pH: 7.2 ± 0.2 at 25°C.Suplementy: Suplement citrát amonno-železitý: 500 mg/l pro poloviční Fraserův bujón Selective Supplement:akriflavin 12.5 mg; kyselina nalidixová 10 mg /l pro poloviční Fraserův bujón

Vysoký obsah živinPufrovací systém - udržování stálého pH, které se měnívlivem biochemické činnosti rostoucích mikroorganismůInhibiční látky inhibice doprovodné mikroflóry aněkterých druhů listeriíDetekce β-D-glukosidázy rodu Listeria:Glukóza eskulin je štěpen na eskuletin, který s železitýmkationtem tvoří komplex – v průběhu růstu L.monocytogenes dochází ke zčernání média

http://www.solabia.fr/solabia/produitsDiagnostic.nsf/SW_PROD/B65A7945AE2BC87AC12574C6002FD7BD?opendocument&LG=EN&

L. monocytogenes – ALOA agarALOA agar (agar pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho) – složení báze g/l agar-agar 13.0

Pepton z masa 18.0 Pepton z kaseinu 6.0 Kvasničný extrakt 10.0

Pyruvát sodný 2.0 Glycerofosforečnan hořečnatý 1.0

glukóza 2.0

Ochrana přes letálním účinkem inhibičních látek bohaté na živiny

NaCl 5.0 Hydrogenfosforečnandisodný 2.5

pufrovací systém

chlorid lithný 10.0 Síran hořečnatý 0.5 inhibice doprovodné mikroflóry

Selektivní suplement (mg/l): Amphotericin B 10 mg; Ceftazidim 20 mg; Sodná sůl kyseliny nalidixové 20 mg; Polymyxin B síran 76700 U.

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranosid 0.05; Chromogenní substrát – detekce β-D-glukosidázové aktivityRod Listeria má β-D-glukosidázovou aktivitu – tvorba modrozelených kolonií

Detekční systém

Obohacovací suplement (g/l): L-α-fosfatidylinositol 2 gDetekce enzymu fosfatidylinositol fosfolipázy C (PI-PLC) - virulenčního faktoru L. monocytogenes Fosfolipázová aktivita L. monocytogenes – průhledná haló zóna kolem kolonií (pro L. ivanovii tvorba zpožděná)

ALOA agar – L. monocytogenesALOA agar (agar pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho)

Růst Vzhled

L. monocytogenes Výborný Modrozelené kolonie Haló zóna

L. ivanovii Výborný Pokud haló zóna, tak po 48 hodinách

L. inocua Zpomalený Bez haló zóny

L. seeligeri inhibovaný Bez haló zóny

Listeria monocytogenes ATCC 13932 Listeria innocua ATCC 33090

Typické kolonie branépro další konfirmaci:Modrozelené kolonie s haló zónou – nutno potvrdit (mohou být L. monocytogenes, L. ivanovii či některé bacily)

L. monocytogenes - Oxford agar Oxford agar – složení báze g/l agar-agar 13.0

Pepton 23.0 škrob 1.0 méně výživný agar

NaCl 5.0

Chlorid lithný 10.0 inhibice doprovodné mikroflóry a některých druhů listerií

Selektivní suplement (mg/l): Cycloheximid 200.0 mg, kolistin sulfát 10.0 mgAcriflavin 2.5 mg, Cefotetan 1.0 mg, Fosfomycin 5.0 mg

eskulin 1.0; citrát amonno-železitý 0.5 L. monocytogenes hydrolyzuje eskulin na eskuletin, který tvoří černý komplex s železitými kationty – tvoří hnědo-zelené kolonie s haló efektem

Detekční systém

Listeria monocytogenes ATCC 19118

Listeria innocua ATCC 33090

L. monocytogenes - PALCAM agar Oxford agar – složení báze g/l agar-agar 13.0

Pepton 23.0; glucose 0.5; starch 1.0 živiny

Kvasničný extrakt 3.0; NaCl 5.0

lithium chloride 10.0 inhibice doprovodné mikroflóry a některých druhů listerií

Selektivní suplement (mg/l): Polymyxin B sulfate 5.0 mg, Ceftacidime 12.0 mgAcriflavine 2.5 mg

eskulin 1.0; citrát amonno-železitý 0.5 L. monocytogenes hydrolyzuje eskulin na eskuletin, který tvoří černý komplex s železitými kationty – hnědo-zelené kolonie s černou haló zónou

Detekční systém

D(-)mannitol 10.0; phenol red 0.08.Odlišení manitol pozitivních G+ bakterií (např. stafylokoky, enterokoky) –žlutý nárůst

Listeria monocytogenes ATCC 19118

Listeria innocua ATCC 33090

Horizontální metoda průkazuPříklad: ISO 11290-1:1996: Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes - Část 1: Metoda průkazu

3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ

Vyočkování 1-5 typických kolonií na neselektivní kultivační ztužené médium TSYEA (Agar s tryptonem, sójovým peptonem a kvasničným extraktem) Z každé plotny selektivního agaru vzít jednu a při negativním potvrzení až do pěti typických koloniíKultivace: 37 °C, 24 ±3 hodinya provedení příslušných biochemických testůBiochemické testy pro potvrzení rodu ListeriaGramovo barvení: G+ štíhlé, krátké tyčinkyKataláza pozitivníMotilita – Listeria spp. jsou pohyblivé při 25 °C

Biochemické testy pro potvrzení druhu Listeria monocytogenes

KTJ

Hemolýza Produkce kyseliny z CAMP test

Druh Rhamnózy Xylózy S. aureus R. equi

L. monocytogenes + + - + -

Konfirmace rodu ListeriaVýběr pro konfirmaci:Z každé plotny selektivního agaru vzít jednu a při negativním potvrzení až do pěti typických koloniíKonfirmační biochemické testy nutno provádět s kulturami narostlými za optimálních, nezátěžových podmínekINKUBACE NA SELEKTIVNÍCH PŮDÁCH ZATĚŽUJE I CÍLOVÉ MIKROORGANISMY, PROVÁDĚNÉ TESTY MOHOU POSKYTOVAT NESPOLEHLIVÉ REAKCE

Inokulace na TSYEA (trypton-sójový agar s kvasničnímextraktem)

Živiny (g/l): trypton 17.0, pepton ze sóji 3.0, kvasničný extrakt 6.0, glukóza monohydrát 2.5, Osmotický a pufrovací systém: hydrogenfosforečnan disodný 2.5, NaCl 5.0, Bakteriologický agar 15.0, (g/l)Inkubace: 35 °C nebo 37 °C, 18-24 h či déle, až je nárůst dostatečný

KTJ

TSYEA/TSA

74

Univerzální kultivační média ➢ trypton-sójový agar s kvasničným

extraktem (Tryptone Soya Yeast Extract Agar) - pepton z kaseinu, pepton ze sójové drtě, kvasničný extrakt, NaCl, hydrogenfosforečnan draselný, glukóza, agar-agar: glukóza, Na2HPO4.12 H2O, KH2PO4 (pufrovací aktivita v průběhu růstu), NaCl; pH: 7.3 ± 0.2 při 25°C

➢ trypton-sójový agar (Tryptic soy agar) –TSA: pepton z kaseinu, pepton ze sójové drtě, NaCl, agar-agar; pH: 7.3 ± 0.2 při 25°C

S. aureushttp://learn.chm.msu.edu/vibl/content/differential/

E. coli

Rodová konfirmaceGramovo barvení: G+ štíhlé, krátké tyčinkyKataláza pozitivníKataláza: enzym, který katalyzuje rozklad toxického peroxidu vodíku na vodu a kyslík

Konfirmace rodu Listeria

2 H2O + O22 H2O2

katalázabubliny

Průkaz katalázy – do kapky 3%peroxidu vodíku přeneseme kličkou vyšetřovanou kolonii. V pozitivním případě se uvolňují bublinky kyslíku.

Motilita – Listeria spp. jsou pohyblivé při 25 °CPřímý test za použití mikroskopie1 kolonie suspendována ve zkumavce s trypton-sójovým bujónem skvasničným extraktem a inkubována při 25 °C, 8 - 24 h - pohyb jesledován po nakápnutí kultury na podložní sklíčkoAgar pro motilituInokulace vpichem, inkubace 48 h (až pět dnů, pokud není růstdostatečný) při 25 °C – typický nárůst podél vpichu ve tvaru„deštníku“ – důsledek motility

Konfirmace L. monocytogenesHemo

lýzaPozn.

Druh

L. monocytogenes + úzké, jasné, světlé zóny β-hemolýzy

L. innocua - bez hemolýzy

L. ivanovii + široká, neohraničená zóna β-hemolýzy

L. seeligeri + slabá zóna β-hemolýzy

L. welshimerii (+) hemolýza: degradace hemoglobinu či lýze erytrocytů přidaných do půdy (hemolýza) :α- hemolýza - viridace - tvoří se meziprodukty (zelenohnědé zbarvení)/β- hemolýza - projasnění půdy způsobené difúzí uvolněného hemoglobinu do okolí/γ - negativní hemolýza -barva půdy beze změny

L. grayi subsp.grayi

-

L. grayi subsp.marrayi

-

Inokulace na krevní agar společně s pozitivní (L. monocytogenes) a negativní (L. innocua) kontrolou, inkubace při 35 nebo 37 °C, 24±2 h

V: variabilní reakce, (+): slabá reakce, +: > 90 % kmenů pozitivní reakce, -: žádná reakce

Poznámka : Vzácně existují kmeny L. monocytogenes, které nevykazují β-hemolýzu anebo pozitivní reakci CAMP testu za podmínek daných normou ISO 11290.

Konfirmace L. monocytogenes

L. monocytogenes

Staphylococcus aureus

L. inocua

L. ivanovii

Testovaný izolát (L. inocua)

Rhodococus equi

Krevní agar

1-2 mm

1 cm

Test dle Christie-Atkins-Munch-Peterson = (CAMP) test β-hemolytický Staphylococcus aureus (úplná hemolýza) a nehemolytický Rhodococcus equiInkubace při 35° C, 24-48 hL. monocytogenes (listeriolysin O způsobuje hemolýzu erythrocytes) a hemolytické reakce L. seeligeri jsou slabě zvýrazněny v zóně v blízkosti S. aureus čáry, zatímco hemolytická reakce L. ivanovii je silně zvýšena v zóně R. equi.Ostatní druhy netvoří hemolýzu anebo pouze slabou hemolýzu bez synergestického efektu (L. welshimerii).

Konfirmace L. monocytogenesHemolýza Produkce kyseliny z CAMP test

Druh Rhamnózy Xylózy S. aureus R. equi

L. monocytogenes + + - + -

L. innocua - V - - -

L. ivanovii + - + - +

L. seeligeri + - + (+) -

L. welshimerii (+) V + - -

L. grayi subsp.grayi

- - - - -

L. grayi subsp.marrayi

- V - - -

V: variabilní reakce, (+): slabá reakce, +: > 90 % kmenů pozitivní reakce, -: žádná reakce

Poznámka : Vzácně existují kmeny L. monocytogenes, které nevykazují β-hemolýzu anebo pozitivní reakci CAMP testu za podmínek daných normou ISO 11290.

Produkce kyseliny z cukrů: L-rhamnóza, D-xylóza

Inokulace do média s jednotlivými cukry, inkubace při 35 °C nebo 37 °C až 5 dnů

Média obsahují acidobazický indikátor – pozitivní reakce (tvorba kyseliny) je indikována změnou barvy z fialové na žlutou, obvykle během 24 až 48 hodin

Konfirmace L. monocytogenesAPI Listeria – 24 hodinová identifikace všech druhů Listeria sp.Výrobce Biomérieux – patentované biochemické testy (DIM)Miniaturizované biochemické testy jsou zaočkovány inokulem o nízké bakteriální koncentraci (0,5 McFarland)

SinglePath L.Mono

Příklad LFA (lateral flow assay) – imunochemická metodadetekce Listeria monocytogenes po pomnožení veFraserově bujónu aneb BLEB bujónu

SalmonellaČSN EN ISO 6579 Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu bakterií rodu Salmonella

* XLD – povinný selektivní agar, **BGA – volitelný selektivní agar

***Vyočkovat z každé plotny nejméně jednu kolonii považovanou za typickou nebo suspektní na živný agar. Další čtyři

kolonie se vyberou až poté, je-li první kolonie negativní. (Pro epidemiologické studie: konfirmace nejméně pěti kolonií. Pokud typických

kolonií méně než pět na misce, vyberou se všechny typické nebo suspektní ke konfirmaci.)

zaočkujeme 0,1 ml

25g vzorku + 225 ml PPV (pufrovaná peptonová voda)

kultivace 37 ˚C, 18±2 h

zaočkujeme 1 ml

10 ml Müller - Kauffman

kutivace 37 ˚C, 24±3 h

10 ml Rappaport - Vasilliadis

kultivace 41˚C, 24±3 h

Sterilní očkovací kličky s očkem o objemu 10 µl

XLD*

37˚C, 24±3 hBGA**

37˚C, 24±3 h

Výběr typických (příp. atypických) kolonií pro konfirmaci***

Biochemické testy (37 °C, 24 h), sérologická konfirmace, sérotypizace

Neselektivní

pomnožení

(pre-enrichment)

Selektivní

pomnožení

(enrichment)

XLD*

37˚C, 24±3 hBGA**

37˚C, 24±3 h

Izolace na


média

živný agar

37˚C, 24±3 h

Přeočkování na

neselektivní agar

Konfirmační testy

živný agar

37˚C, 24±3 h

živný agar

37˚C, 24±3 hživný agar

37˚C, 24±3 h

1. den

2. den

3. den

4. den

Vyhodnocení biochemických testů

5. den

Vyhodnocení testů 6. den

SalmonellaPufrovaná peptonová vodaSložení (l) : pepton 10 g; NaCl 5 g; dodekahydrát hydrogenfosforečnanu disodného 9 g; dihydrogenfosforečnan draselný 1,5 g.Pepton bohatý na obsah živin umožňuje resuscitaci buněk, subletálně poškozených či oslabených vlivem zacházení s potravinou či přídavkem konzervačních látek.Fosfátový pufrovací systém chrání bakterie před změnami pH v médiu v důsledku metabolismu , které by jinak nastaly v důsledku metabolismu rostoucích buněk.

RAPPAPORT a VASSILIADIS (RVS Broth) obohacené bujóny pro salmonely Složení (l): pepton ze soji 4,5 g, hexahydrát chloridu hořečnatého 29 g; NaCl 8 g; hydrogenfosforečnandidraselný 0,4 g; dihydrogenfosforečnan draselný 0,6; malachitová zeleň 0,036 g.pH: 5.2 ± 0.2 at 25°C, kultivace 41˚C, 24±3 hSelektivní podmínky pro růst salmonel v přítomnosti doprovodné bakteriální mikroflóry, zvláště Enterobacteriaceae) - vyšší rezistence k malachitové zeleni a vyššímu osmotickému tlaku (přídavek chloridu hořečnatého), nízkému pH, vyšší teplotě a nižším nároku na živiny (pepton ze sóji). Fosfátový pufrovací systém. RVS bujón není vhodný pro selektivní pomnožení S. typhi and S. paratyphi A.

MULLER-KAUFFMANN (MK) bujón s tetrathionanemSložení média (l): masový extrakt 0,9 g; pepton z masa 4,5 g; kvasničný extrakt 1,8 g; NaCl 4,5 g; uhličitanvápenatý 25,0; thiosíran sodný 40,7 g; volská žluč 4,75 g. Přidává se jodid draselný 5 g; jód 4 g abriliantová zeleň 0,01 g.pH: 7.6 ± 0.2 at 25 °C, kultivace 37 ˚C, 24±3 hInhibice doprovodné mikroflóry: žluč, briliantová zeleň – G+ bakterie, tetrathionan (tvořen z thiosíranupřídavkem jódu) –koliformní a dalších enterobakterie. Salmonella, Proteus a další druhy redukujítetrathionan za vzniku kyseliny sírové (následně pufrována uhličitanem vápenatým).

Pufrovaná peptonová voda

pH: 7.0 ± 0.2 at 25 °C.

Pufrovaná peptonová vodaSložení (l) : pepton 10 g; NaCl 5 g; dodekahydrát hydrogenfosforečnanu disodného 9 g; dihydrogenfosforečnan draselný 1,5 g.Pepton bohatý na obsah živin umožňuje resuscitaci buněk, subletálně poškozených či oslabených vlivem zacházení s potravinou či přídavkem konzervačních látek.Fosfátový pufrovací systém chrání bakterie před změnami pH v médiu v důsledku metabolismu , které by jinak nastaly v důsledku metabolismu rostoucích buněk.

Rappaport-Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth

http://www.kisanbio.com/shopimages/kisanbiotech/0390100000492.jpg

RAPPAPORT a VASSILIADIS (RVS Broth)

obohacené bujóny pro salmonely

Složení (l): pepton ze soji 4,5 g, hexahydrát

chloridu hořečnatého 29 g; NaCl 8 g;

hydrogenfosforečnan didraselný 0,4 g;

dihydrogenfosforečnan draselný 0,6; malachitová

zeleň 0,036 g.

pH: 5.2 ± 0.2 při 25°C, kultivace 41˚C, 24±3 h

Selektivní podmínky pro růst salmonel v přítomnosti doprovodné bakteriální

mikroflóry, zvláště Enterobacteriaceae vyšší rezistence k malachitové zeleni a

vyššímu osmotickému tlaku (přídavek chloridu hořečnatého) nízkému pH, vyšší

teplotě a nižším nároku na živiny (pepton ze sóji). Fosfátový pufrovací systém. RVS

bujón není vhodný pro selektivní pomnožení S. typhi and S. paratyphi A.

MULLER-KAUFFMANN (MK) bujón s tetrathionanemSložení média (l): masový extrakt 0,9 g; pepton zmasa 4,5 g; kvasničný extrakt 1,8 g; NaCl 4,5 g;uhličitan vápenatý 25,0; thiosíran sodný 40,7 g;volská žluč 4,75 g. Přidává se jodid draselný 5 g; jód 4g a briliantová zeleň 0,01 g.pH: 7.6 ± 0.2 at 25 °C, kultivace 37 ˚C, 24±3 hInhibice doprovodné mikroflóry: žluč, briliantovázeleň – G+ bakterie, tetrathionan (tvořen z thiosíranupřídavkem jódu) –koliformní a dalších enterobakterie.Salmonella, Proteus a další druhy redukujítetrathionan za vzniku kyseliny sírové (následněpufrována uhličitanem vápenatým).

Muller-Kauffmann Tetrathionate-Novobiocin Broth (MKTTn)

1. Salmonella (turbidity and

decoloration)

2. Shigella (turbidity and

turquois)

3. Other Enterobacteriaceae

(without turbidity)

http://www.medioscultivo.com/tetrathionate-broth-mueller-kauffman-verde-brillante-base/

1. 2. 3.

A sediment of calciumcarbonate appears in the turbid broth at the bottom of the tubes

Salmonella – XLD agar

Vzhled kolonií Mikroorganismy

Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné se

zónami precipitace

Escherichia coli, Enterobacter,

Aeromonas

Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné, na

povrchu slizké se zónami precipitace

Klebsiella

Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné,

mohou mít černý střed

Citrobacter

(laktosa-positivní kmeny)

Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné Serratia, Hafnia

Žluté, obklopené žlutými zónami, průsvitné s

černými středem

Proteus vulgaris,

nejčastěji Proteus mirabilis

Kolonie mající stejnou barvu jako agarové médiem,

průsvitné

Shigella, Providencia,

Pseudomonas

Kolonie mající stejnou barvu jako agarové

médiem, průsvitné, s černým středem

Typické kolonie Salmonella

H2S+, XYL -, LAC -, SAC -

Oranžové, lehce neprůsvitné Salmonella Typhi

(xylóza-pozitivní kmeny)

Růžové kolonie s tmavším růžovým středem Sulfan neprodukující salmonely

(S. Paratyphi A)

Žluté kolonie, které mají nebo nemají černý střed Laktóza pozitivní salmonely

Xylóza Lysin Deoxycholát Agar (XLD)Složení média (l): kvasničný extrakt 3 g; NaCl 5 g; D(+) xylóza 3,75 g; laktóza 7,5 g;sacharóza 7,5 g; L(+) lysin 5 g; deoxycholát sodný 1 g; thiosíran sodný 6,8 g; citrátželezitoamonný 0,8 g; fenolová červeň 0,08 g; agar-agar 14,5 g.Zkvašování cukrů (xylóza, laktóza a sacharóza) za vzniku kyselin = zežloutnutíacidobazického indikátor fenolová červen. Produkce sulfanu v přítomnosti thiosíranusodného a železitých solí - tvorba precipitátu černého sulfidu železitého ve středukolonií. Dekarboxylace lysinu na kadaverin – zvýšení pH vede ke vzniku fialovéhozabarvení kolem kolonií (acidobazický indikátor).

Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

Salmonella enteritidis NCTC 5188



Světle růžové, průsvitné, obklopené červenými zónami

Laktóza-negativní:

Salmonella, výjimečně

Proteus a Citrobacter

Žlutozelené, neprůsvitné,

obklopené žlutozelenými

zónami

Laktóza-pozitivní:

E. coli, Enterobacter,

Klebsiella. Ostatní jsou

převážně inhibovány.

Brilliant-green agar BGA (Agar s briliantovou zelení, fenolovou červení a laktózou) Složení média (l): pepton z masa 7 g; NaCl 5 g; laktóza 15 g; fenolová červeň 0,04 g; brilliantová zeleň 0,005 g; agar-agar 13 g. Inhibiční systém: briliantová zeleň – G+ bakterie, též Salmonella Typhi a rod Shigella, 0,2 % deoxycholátu sodného – inhibice plazivosti kolonií rodu ProteusDiagnostický systém:zkvašování laktózy je indikováno zežloutnutím acidobazického indikátoru fenolové červeně z červené na žlutou (v alkalickém prostředí tmavě červený)

Salmonella typhimurium ATCC 14028

Salmonella – BG agar

Salmonella – XLD agar


Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné se zónami

precipitace

Escherichia coli, Enterobacter,

Aeromonas

Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné, na povrchu

slizké se zónami precipitace

Klebsiella

Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné, mohou mít

černý střed

Citrobacter

(laktosa-positivní kmeny)

Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné Serratia, Hafnia

Žluté, obklopené žlutými zónami, průsvitné s černými

středem

Proteus vulgaris,

nejčastěji Proteus mirabilis


průsvitné

Shigella, Providencia,

Pseudomonas


průsvitné, s černým středem

Typické kolonie Salmonella

H2S+, XYL -, LAC -, SAC -

Oranžové, lehce neprůsvitné Salmonella Typhi

(xylóza-pozitivní kmeny)

Růžové kolonie s tmavším růžovým středem Sulfan neprodukující salmonely

(S. Paratyphi A)

Žluté kolonie, které mají nebo nemají černý střed Laktóza pozitivní salmonely

Xylóza Lysin Deoxycholát Agar (XLD)Složení média (l): kvasničný extrakt 3 g; NaCl 5 g; D(+) xylóza 3,75 g; laktóza 7,5 g;sacharóza 7,5 g; L(+) lysin 5 g; deoxycholát sodný 1 g; thiosíran sodný 6,8 g;citrát železitoamonný 0,8 g; fenolová červeň 0,08 g; agar-agar 14,5 g.• Zkvašování cukrů (xylóza, laktóza a sacharóza) za vzniku kyselin• = pokles pH - acidobazický indikátor fenolová červeň bude žlutý.• Produkce sulfanu v přítomnosti thiosíranu sodného a železitých solí –tvorba precipitátu černého sulfidu železitého ve středu kolonií.• Bakterie, které provádějí dekarboxylace lysinu na kadaverin – zvýšení pH –fialové zabarvení kolem kolonií (acidobazický indikátor).• Deoxycholát sodný - inhibice plazivosti kolonií rodu Proteus

Klebsiella pneumoniae ATCC 13883


87

Salmonella – BG agar

88

Rapid´ Salmonella agar

89

Složení média (l) (výrobce – bioRad - blíže nespecifikuje): Živná směs – 14,5 g, Selektivní činidla – 14 gChromogenní směs – 2,3 g, Agar 12,7 gpH 7,2±0,2

Způsob aplikace:➢ Jako druhé (volitelné) médium vedle XLD

(inkubace: 37 °C, 24±2 hod) – dle ISO 6579➢ Jako alternativní metoda (validováno NordVAl) k

EN ISO 6579 dle ISO 16140 ➢ Rapid´ Salmonella metoda: dvoustupňové

pomnožení➢ 25 g + 225 PPV, 37 ±1 °C, 18 ±2 hod➢ 0,5 ml do 10 ml RVS bujónu, 41, 5 ±1 °C, 6

hod až 26 hod (podle typu produktu)➢ Izolace na Rapid´Salmonella agar 37 °C, 24±2

hod➢ Rapid´ Salmonella metoda: krátký protokol➢ do PPV přidány Rapid´Salmonella kapsule➢ 25 g + 225 PPV, 37 ±1 °C, 18 ±2 hod➢ Izolace přímo přímo na Rapid´Salmonella agar

– bez dvojstupňového pomnožení, 37 °C, 24±2 hod

Salmonella spp. – fialové (magenta) kolonie, ostatní Enterobacteriaceae - zelené

Kmeny Salmonella spp.

S. Typhi S. Parathypi A S. Parathypi B S. Parathypi C Ostatní kmeny

reakce % poz. reakce





TSI: tvorba kyseliny z glukózy

+ 100 + 100 + + + 100

TSI: tvorba plynu z glukózy

- 0 + 100 + + + 92

TSI: tvorby kyseliny z laktózy

- 2 - 100 - - - 1

TSI: tvorba kyseliny ze sacharózy

- 0 - 0 - - - 1

TSI: tvorba sirovodíku

+ 97 - 10 + + + 92

Štěpení močoviny - 0 - 0 - - - 1

Dekarboxylace lyzinu

+ 98 - 0 + + + 95

Tvorba β-galaktozidázy

- 0 - 0 - - - 2

Voges-Proskauerovareakce

- 0 - 0 - - - 0

Tvorba indolu - 0 - 0 - - - 1

Biochemická konfirmace Salmonella spp.

• Izolace charakteristických kolonií na neselektivní média – živný agar (37±°C, 24± 3h)

• Konfirmace:

• Biochemická (37±°C, 24± 3h)

• TSI

• Urea agar (Christensen)

• L-lysin dekarboxylasa

• β-galaktosidasa (ONPG)

• VP test

• Indol test

• Motile (semi-solid nutrient agar)

• Sérologická (37±°C, 24± 3h)

• O antigeny (somatické)

• H antigeny (flagelární)

• Vi antigeny (kapsulární)

• fáze I

• fáze IIhttp://www.keydiagnostics.com.au/images/stories/virtuemart/product/microgen-salmonella-latex-kit.jpg

https://classconnection.s3.amazonaws.com/74/flashcards/1275074/jpg/biochemical_test_results-_shigella1332821047536.jpg


Biochemická konfirmace Salmonella spp.• TSI Triple Sugar Iron Agar – agar s glukózou, laktózou, sacharózou a citranem železitým

- detekce fermentace glukózy, sacharózy a/nebo laktózy s produkcí či bez produkce plynu, detekcetvorby sulfanu z thiosíranu v kyselém prostředí

Složení / litrEnzymatická trávenina kaseinu...5 gEnzymatická trávenina zvířecí tkáně.... 5 gPepton s kvasničným extraktem..... 10 gDextróza ...... 1 gLaktóza..... 10 gSacharóza..... 10 gCitran železito-amonný... 0.2 gChlorid sodný...... 5 gThiosíran sodný............ 0.3 gFenolová červeň....... 0.025 gAgar ....... 13.5 gVýsledné pH: 7.3 ± 0.2 při 25 °C

Inokulace sloupce vpichemInokulace na povrch• Fermentace dextrózy (glukózy)

na kyselinu• anaerobně – pokles pH = žlutý

sloupec• Aerobně – vznik produktů, které

jsou na vzduchu dále oxidovány a pH zůstává zásadité = červený povrch

• Fermentace glukózy na plyn(anaerobně – ve vpichu)Trhliny, bublinky ve sloupci v místě vpichu a kolem• Tvorba sulfanu (H2S) – reakce se síranem želzitým a thiosíranem sodným – vznik černého precipitátu ve sloupci • Fermentace laktózy a/nebo sacharózyAerobně i anaerobně - Tvorba kyseliny – žlutý sloupec i povrch

Bakterie fermentující laktózu a/nebo sacharózu jsou schopny fermentovat též glukózu

Fenolová červeňAlkalické prostředí = červená, kyselé prostředí = žlutá

• TSI Triple Sugar Iron Agar – agar s glukózou, laktózou, sacharózou a citranem železitým

- detekce fermentace glukózy, sacharózy a/nebo laktózy s produkcí či bez produkce plynu, detekcetvorby sulfanu z thiosíranu v kyselém prostředí


Agar s močovinou (Christensenův agar)- detekce štěpení močoviny ureázou za vzniku amoniaku a oxid

uhličitého


http://image.slidesharecdn.com/helicobacterpylori-copy-110516201901-phpapp01/95/campylobacter-jejunihelicobacter-pylori-39-728.jpg?cb=1305577391

Fenolová červeň:

Kyselé prostředí - žluté

(pH 6.8±0.2)

Zásaditá reakce v důsledku hydrolýzy močoviny –růžová barva

Složení g/l

Pepton ze zvířecí tkáně 1.000

Dextróza 1.000

Chlorid sodný 5.000

Hydrogenfosforečna disodný

1.200

Dihydrogenfosforečnan draselný

0.800

Fenolová červeň 0.012

Agar 15.000

Výsledné pH (25°C) 6.8±0.2

35-37 °C


• Test na tvorbu indolu- detekce štěpení tryptofanu na indol

Složení g/l Trypton 10.00 L-Tryptofan 1.00 Chlorid sodný 5.00 Výsledné pH 7.5 ± 0.1 (25 °C)

http://www.microbiologyinfo.com/indole-test-principle-reagents-procedure-result-interpretation-and-limitations/

Tvorba indolu z tryptofanu

Inokulace tekutého média pro detekci tvorby indolu

Produkce indolu je detekována Kovacsovým činidlem

Kovácsovo činidlo

p-dimethylaminobenzaldehyd 50.0 gm

HCl, 37% 250.0 ml

amylalkohol 750.0 ml


• L-lysin dekarboxyláza

- Detekce dekarboxylace lysinu na kadaverin (anaerobně – po inokulace do tekutého média je překry

sterilní parafínovým olejem)

http://fce-study.netdna-ssl.com/images/upload-flashcards/1029530/2332621_m.jpg

+ CO2 + OH-

Bujón pro L-lysin dekarboxylázuTypical Composition (g/litre)Pepton ze zvířecí tkáně 5.000;Kvasničný extrakt 3.000;Dextróza1.000 (glukóza připravená ze škrobu, chemickyekvivalentní glukóze); L-Lysin hydrochlorid 5.000; bromokresolová červeň 0.020Výsledné pH (25 °C) 6.8±0.2

Dvoustupňová detekce:1. stupeňDextróza je fermentována za vzniku kyseliny – v kyselém prostředí bromokresolová červeň zežloutně –teprve v kyselém prostředí dochází k aktivaci lysindekarboxylázy 2. stepL-lysin je dekarboxylován za vzniku OH- - v alkalickém prostředí bromokresolová červeň mění svou barvu zpět do fialovo-červené Za předpokladu viditelného nárůstu kultury je výsledná fialovo-červená barva bujónu důkaz pozitivní reakce, žlutá barva bujónu důkaz negativní reakce


• β-galactosidáza (ONPG) (use a 1 μl loop full)- stanovení přítomnosti ß-galaktosidázy za využití o-nitrofenyl-beta-D-galactopyranosidu (ONPG).- ONPG je hydrolyzováno na žlutý o-nitrofenol a galaktózu

ONPG je strukturně podobný laktóze, ONPG je bezbarvá sloučenina, O-nitrofenol je žlutý – vizualizace hydrolýzy

Laktózu fermentující bakterie (ONPG positive):Dva enzymyPermeáza – přenos molekul laktózy do buňkyβ-galactosidáza – štěpení galaktosidové vazby za vzniku glukózy a galaktózy, indukovatelný enzym, tvořený pouze v přítomnosti laktózyKoliformní bakterie jako E.coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp.

hydrolysis

Bakterie se zpožděnou fermentací laktózyPermeáza – není přítomnaβ-galactosidase – přítomnaONPG test je pozitivní, ale pozitivní reakce je zpožděnáCitrobacter spp., Arizona spp,

Laktózu nefermentující bakterie (ONPG Negative):Permeáza – není přítomnaβ-galactosidáza– není přítomnaSalmonella spp; Shigella spp; Proteus spp;Providencia spp., Morganella spp. a další

supenze ve fyz. roztoku + toluen + substrát ONPG


http://i0.wp.com/microbeonline.com/wp-content/uploads/2015/02/ONPG-test-results.png

• Voges–Proskauerův (VP) test

Detekce produkce acetylmethylkarbinolu (acetoinu) při fermentaci glukózy

Detekce acetoinu: acetoin je přeměněn na diacetyl v přítomnost in the ∝-

naphthol (VP činidlo I – nutno přidat jako první), silné zásady (VP činidlo II -40% KOH) a kyslíku. Diacetyl a sloučeniny obsahující guanidin, které se vyskytují vpeptonech, poté kondenzují za vzniku růžovo-červeného polymeru.

MRVP bujón (pH 6.9)pepton = 7.0 g/lglukóza = 5.0 g/lhydrogenfosforečnan draselný = 5.0 g/l

Voges-Proskauer činidlo I(Barrittovo činidlo A)

Alfa-Nafthol, 5% 50 gm

Absolutní ethanol1000

ml

Voges-Proskauer činidlo II (Barrittovo činidlo B)

Hydroxid draselný 400 gm

Deionizovaná voda 1000 ml

Postup VP Testu

1.Inokulace čerstvé kultury

do MRVP bujónu.

2.Inkubace: 37 °C, 24 hod.

3. Přidat 6 kapek činidla VP I

a dobře promíchat (aerace).

4.Přidat 6 kapek činidla VPII

a dobře promíchat (aerace).

5.Pro pozitivní reakci tvorba

červeného zabarvení v

průběhu 30 minut.

Pozitivní reakce:Růžovo-červená zbarveníNapř. : viridantní streptokoky (except Streptococcus vestibularis), Listeria, Enterobacter, Klebsiella, Serratia marcescens, Hafnia alvei, Vibrio eltor, Vibrio alginolyticus, etc.Negativní reakce:Bez růžovo-červeného zbarveníNapř. : Streptococcus mitis, Citrobacter sp., Shigella, Yersinia, Edwardsiella, Salmonella, Vibrio furnissii, Vibrio fluvialis, Vibrio vulnificus, and Vibrio parahaemolyticus etc.A copper color should be considered negative. A rust color is a weak positive reaction.Kontrola kvalityVP positivní: Enterobacter aerogenes (ATCC13048)VP negativní: Escherichia coli (ATCC25922)

+ -


Konfirmace rodu Salmonella (ISO 6579)






Štěpení močoviny




Tvorba indolu

• Dle ISO 6579 jsou testy prováděny ve zkumavkách s příslušnými médii (kultivace po

zaočkování: 37±°C for 24± 3h)

Agar s

glukózou,

laktózou,

sacharózou

a citranem

železitým

(TSI agar –

triple sugar

agar)

• Očkuje se na povrch šikmého agaru a poté vpichem pH indikátor – fenolová červeň

• Tvorba kyseliny z glukózy anaerobně – žluté dno (vpich), produkty aerobní oxidace na povrchu nevedou ke změně pH

• Tvorba plynu z glukózy anaerobně – potrhání agaru kolem vpichu

• Tvorba kyseliny z laktózy a/nebo sacharózy (až po fermentaci glukózy) – žluté dno i sloupec

• Tvorba sulfanu – černý precipitát

(v dalších aplikacích lze odečítat i deaminace a dekarboxylaci aminokyselin z peptonu či záměrně přidaných)

Konfirmace rodu Salmonella (ISO 6579)• Dle ISO 6579 jsou testy prováděny ve zkumavkách s příslušnými médii (kultivace po











Tvorba indolu


http://image.slidesharecdn.com/helicobacterpylori-copy-110516201901-phpapp01/95/campylobacter-jejunihelicobacter-pylori-39-728.jpg?cb=1305577391

pH indikátor: Fenolová červeň

+ CO2 + OH-

pH indikátor: bromokresolová červeň Tvorba kyseliny z glukózy – v kyselém pH se L-lysin dekarboxyláza aktivuje – dekarboxylací opět vzrůst pH – pozitivní reakce: stejná barva média, avšak s viditelným růstem

Konfirmace rodu Salmonella (ISO 6579)• Dle ISO 6579 jsou testy prováděny ve zkumavkách s příslušnými médii (kultivace po











Tvorba indolu Produkce indolu z tryptofanu –detekce indolu Kovacsovým činidlem

O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) – analog laktózy

Fermentace laktózy (koliformní bakterie): permeáza + β-D-galaktosidáza (štěpí laktózu na galaktózu a glukózu, tvorba enzymu se indukuje pouze v přítomnosti laktózy a nedostatku glukózy – lac operon) – rody koliformních bakterií: Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Escherichia.Pokud však chybí permeáza je fermentace laktózy je opožděná (koliformní bakterie: Citrobacter sp.)

Voges-Proskauerova reakce: tvorba acetoinu – je detekován přidáním dvou činidel (VPTI, VPTII – pořadí nelze zaměnit) – pozitivní reakce : červená

http://i0.wp.com/microbeonline.com/wp-content/uploads/2015/02/ONPG-test-results.png

• Miniaturizované komerční soupravy

• API 20E - souprava 20 biochemických reakcí pro identifikace Enterobacteriaceae adalších nenáročných gramnegativních tyčinek (BioMerieux)

http://www.retroscope.eu/wordpress/wpcontent/uploads/2010/10/SalmonellaAPI20E.jpg

• Miniaturizované komerční soupravy

• EnteroTest 24 (Erba Lachema, ČR) –

souprava 24 biochemických reakcí pro

rutinní identifikaci významných druhůstřevních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae

ENTEROTEST 24Souprava ENTEROtest 24 je určena pro rutinní identifikaci významných druhů střevních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae pomocí 24 biochemických testů.

Pro přípravu testu: zákalu, který odpovídá stupni 1 McFarlandovy zákalovéstupnice, tj. cca 3 x 108 buněk Enterobacteriaceae v ml (zákal stupně 1 je definovánzákalem, který vytvoří sraženina BaSO4 při smíchání 0,1 ml roztoku 1 % bezvodéhoBaCl2 a 9,9 ml1 % H2SO4)

ENTEROTEST 24

Zkvašování cukrů

Zkvašování cukrů

dekarboxylace

deaminace

Hydrolýza eskulinu

Schopnost růst na citrátu jako jediném zdroji C (půda: Simonsův citrát)utilizace malonátu

Sérologická konfirmace Salmonella spp.Sérotypizace - Kaufmann-Whiteovo schéma➢ salmonely rozděluje podle antigenních vlastností a jejich kombinací, čímž je pro každý sérotyp vytvořena

specifická antigenní formule.➢ Antigeny se nacházejí v buněčné stěně (somatické O-Antigeny), v bičících (flagelární H-antigeny) a

v kapsulích (Vi Antigeny). ➢ Somatické O-Antigeny jsou endotoxickou součástí lipopolysacharidových struktur, které se nachází na vnější

straně buněčné stěny. Vyvolávají specifickou imunitní reakci systému a zároveň jsou faktory patogenity, neboť chrání bakterie před bakteriolytickým účinkem komplementu. Podjednotky O-antigenu jsou tvořeny několika sacharidovými zbytky, jejich pořadí pak určuje variabilnost O-antigenu. Jeho variabilita nám umožňuje rozlišovat až 67 séroskupin, které značíme písmeny nebo číslicemi.

➢ Bičíkové H-antigeny se vyskytují u pohybu schopných salmonel, tento antigen je tvořen z bílkovin, převážně flagelinem. Bičíkové H-antigeny mají dvě rozdílné antigenní fáze (první specifická fáze H1 a druhá nespecifická fáze H2). Odlišují se primární strukturou, která je způsobena střídavou expresí jednotlivých genů řídících tvorbu bičíků. Můžeme se setkat i s monofázními izoláty, u nichž se vyskytuje pouze jeden typ bičíkového H-antigenu. Rozlišujeme celkem 89 typů H-antigenu.

➢ Kapsulární Vi antigeny jsou složeny z pouzderných povrchových polysacharidů a jsou zodpovědné za virulenci. Jsou charakteristické pro sérovary S. Typhi, S. Dublin a S. Hirschfeldii.

Sérologická konfirmace Salmonella spp.

Sklíčková aglutinace:Někteří bakteriální původci infekčních chorob uvolňují při svém množení v tekutém prostředí nadbytek svých pouzderných antigenů. Antigeny lze prokazovat např. pomocí latexových mikročástic pokrytých protilátkou proti příslušnému antigenu -částice výrazně aglutinují. Některé kmeny jsou schopny autoaglutinace – k aglutinaci dochází i bez přítomnosti antisér (protilátek) – aglutinaci s jednotlivými antiséry poté není možno stanovit.

➢ určení poddruhu (biochemické testy – kmeny různých podruhů mohou mít stejné antigeny)

➢ rozlišení O, H a Vi antigenů aglutinačními testy za použití antisér➢ Rozlišení izolátů s jednou antigenní H fází a s dvěma fázemi – inokulace na

médium, které obsahuje antisérum k určitému H-antigenu. Výsledkem je, že bakterie, které mají pouze tento určitý H-antigen, budou imobilizované antisérem, kdežto bakterie syntetizující také druhý H-antigen, budou pohybu schopné a tak porostou v celém médiu.

Identifikace na základě aglutinace s omnivalentními, polyvalentními, monovalentní O , H a Vi antiséry.

SALMONELLA LATEX TEST• Test Latex (FT0204) latexové částice senzitivizované polyvalentními

protilátkami k Salmonella (králičí IgG). Control Latex (FT0205) latexové částice senzitivizované normálními králičími globuliny.

• Positive Control Suspension (FT0206) suspenze neživotaschopné Salmonella sp. konzervované s 1 % formalinu

107

Postup1. Reagenci při pokojové teplotě, promísit. 2. Nanést jednu kapku (volně padající) Test Latex na

jeden kruh testovací karty a Control Latex na druhý kruh.

3. Kolonii kultury čerstvě narostlé na neselektivním agaru smísit s Test Latex, druhou kolonii s Control Latex. Pokračovat v míxání po 10-15 sekund.

4. Jemně pohybovat kartou kruhovým pohybem po 2 minuty a pozorovat aglutinaci.

Pozitivní reakce: Aglutinace s Test Latex a žádná aglutinace s Control Latex.Negativní reakce: Žádná aglutinace ani s Test Latex, ani s Control Latex.Neinterpretovatelná reakce: Aglutinace s Test Latex a Control Latex (případně opakovat s nově narostlou kulturou). http://www.cram.com/flashcards/laboratory-

immunological-techniques-3381766

Koagulázapozitivní stafylokokyČSN EN ISO 6888-1 (560092) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovenípočtu koagulázapozitivních stafylokoků (Staphylococcus aureus a další druhy)-Část 1: Technika spoužitím agarové půdy podle Baird-Parkera

Ředící médium: pufrovaná peptonová voda

1. KROK PŘÍPRAVA SÉRIE DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ TESTOVANÉ POTRAVINY

2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z JEDNOTLIVÝCH DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ

0,2 ml testované suspenze rozetřít na plotnu Baird-Parkerova agaru, po rozetření se inokulum nechá vsáknout 15 minut

Kultivace: 37 °C, 48 hodin

Vybrat plotny z dvou po sobě jdoucích ředění vhodné k výpočtu a z nich náhodně vybrat 5 kolonií pro konfirmaci a přeočkovat na a) krevní agar kultivace: 30 °C, 24 hodin - průkaz β hemolýzyb) BHI (brain-heart infusion, mozkosrdcová infúze) kultivace: 37 °C, 24 hodin - průkaz přítomnosti plazmakoagulázy

3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ, STANOVENÍ POČTU KTJ A VÝPOČET KTJ/G NEBO KTJ/ML

BAIRD-PARKER AGAR (BP)Složení (l):Základní půda (l):Pepton z kaseinu 10.0; masový extrakt 5.0; kvasničný extrakt 1.0; pyruvát sodný 10.0; glycin 12.0; chlorid lithný 5.0; agar-agar 15.0.SuplementEmulze vaječného žloutku s teluričitanem Egg-yolk tellurite emulsion 50 ml; pokud požadováno, sulfamethazin 0.05 g/l

Živiny: pepton, masový extrakt, kvasničný extraktInhibice doprovodné mikroflóry: chlorid lithný, terluričitandraselnýResuscitace oslabených buněk: glycin, pyruvát sodnýDiagnostické složky:Lipolýza a proteolýza vaječného žloutku – tvorba projasněných zón (přítomnost lecitinázy, lipázy atd. - typické pro S. aureus)Redukce teluričitanu draselného na telur – vznik černých kolonií

Tvorba projasněných zón kolem černých kolonií je obvykle v souvislosti s pozitivním testem na koagulázu (koagulázapozitivní stafylokoky – S. aureus a další druhy)

Staphylococcus aureus ATCC 25923

http://www.bacteriainphotos.com/photo%20gallery/staphylococcus%20aureus%20baird%20parker.jpg

BAIRD-PARKER AGAR (BP)Staphylococcus aureus ATCC 25923Vzhled kolonií Mikroorganismus

Typické kolonie: Černé nebo šedé, lesklé, vypouklé, 1-5 mm v průměru, obklopené zónou projasnění 2-5 mm širokou, která může být zčásti matná, po nejméně 24 hod inkubace se může v těsné blízkosti kolonií objevit opalescentníprstenec. Atypické kolonie:Šedé kolonie bez zóny projasnění, nebo černé kolonie s úzkým bílým okrajem nebo bez něj, zóna projasnění chybí nebo je sotva viditelná. Atypické kolonie vytvářejí hlavně kmeny koagulázapozitivníchstafylokoků izolovaných z mléčných výrobků, mořských plodů a drobů.

Staphylococcus aureus (nebo další koagulázapozitivnístafylokoky)

Černé, lesklé kolonie, nepravidelného tvaru. Matné zóny se vyvíjejí kolem kolonií po 24 hodinách.

Staphylococcusepidermidis

Občasný růst: velmi malé kolonie, hnědé až černé, bez projasněné zóny

mikrokoky

Tmavě hnědé, zmatnělé zóny se často objevují po 48 hodinách

Bacillus sp.

Bílé, bez projasněných zón Kvasinky

110

http://www.bacteriainphotos.com/photo%20gallery/staphylococcus%20aureus%20baird%20parker.jpg

redukce telluričitanu na tellur

lecitináza

lipáza

Maximální počitatelný počet:

➢ 150 typických a/nebo atypických KTJ/plotna (počet

všech kolonií na misce je přednostně 300)

➢ Pokud nepočitatelné počty, též odebrat typické/atypické

kolonie k testování – zohlednění při výpočtu

Vybrat počitatelná ředění

➢ spočítat typické a atypické kolonie

➢ z jedné plotny vybrat 2 typické a 2

atypické (pokud přítomny)

➢ pokud nejsou žádné plotny počitatelné,

vybrat kolonie z nepočitatelných ploten

➢ inokulace části kolonie do BHI (5 ml)

➢ inokulace části kolonie na Columbia

agar s 5 % beraní krve

BAIRD-PARKER AGAR (BP)


Vzhled kolonií Mikroorganismus

Typické kolonie: Černé nebo šedé, lesklé, vypouklé, 1-5 mm vprůměru, obklopené zónou projasnění 2-5 mm širokou, která může být zčásti matná, po nejméně 24 hod inkubace se může v těsné blízkosti kolonií objevit opalescentní prstenec. Atypické kolonie:Šedé kolonie bez zóny projasnění, nebo černé kolonie s úzkým bílým okrajem nebo bez něj, zóna projasnění chybí nebo je sotva viditelná. Atypické kolonie vytvářejí hlavně kmeny koagulázapozitivních stafylokoků izolovaných z mléčných výrobků, mořských plodů a drobů.

Staphylococcus aureus

Černé, lesklé kolonie, nepravidelného tvaru. Matné zóny se vyvíjejí kolem kolonií po 24 hodinách.

Staphylococcus epidermidis

Občasný růst: velmi malé kolonie, hnědé až černé, bez projasněné zóny

mikrokoky

Tmavě hnědé, zmatnělé zóny se často objevují po 48 hodinách

Bacillus sp.

Bílé, bez projasněných zón Kvasinky

KOAGULÁZOVÝ TEST

http://faculty.mc3.edu/jearl/ML/coagulase.jpg

http://www.mgm.ufl.edu/~gulig/mmid/mmid-lab/images/coag-ex.jpg

Test na produkci koagulázy (enzym schopný koagulovat plazmu) odlišení Staphylococcus aureus (tvorba enterotoxinů, podmíněně patogenní, zdravotní riziko) od méně či zdravotně nezávadných, běžně rozšířených druhů stafylokoků (S. epidermidis, S. saprophyticus), výskyt ostatních koagulázapozitivních stafylokoků (S. schleiferi, S. intermedius) není tak běžný, produkce koagulázy obvykle koreluje s patogenitouS. aureus produkuje dva typy koagulázy

•vázaná koaguláza (též aglutinační faktor) zůstává přichycená k buněčné stěné•volná koaguláza - extracelulární enzym produkovaný při kultivaci v bujónu

Sklíčkový testsmísení husté suspenzeve FR s králičí plazmou„shlukování“ – detekcepouze vázané koagulázy

Zkumavkový test• inkubace kultury (narostlé v BHI, několika kolonií) společně s králičí plazmou• detekce volné i vázané koagulázy

• volná koaguláza reaguje s plazmatickým faktorem za vzniku tzv. stafylotrombinu• stafylotrombin katalyzuje přeměnu fibrinogenu na fibrin (tvorba chuchvalců, sraženin či

úplné ztuhnutí plazmy ve zkumavce)

Presumptivní Bacillus cereusČSN EN ISO 7932 Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu presumptivního

Bacillus cereus - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C



*** ČR – 0,2 ml , jinak 0,1 ml nebo 1 ml na celkem tři malé agarové plotny nebo na povrch větších

Vzorek

0. ředění

MYP

Vyhodnocení biochemických testů – hemolýza (možné přídatné testy: G+ tyčinky s

endosporami kataláza pozitivní)


1. den

2. den

3. den

4. denVyhodnocení testů

10 g vzorku

+ 90 ml ŘR**

- 1. ředění


+ 9 ml ŘR**

- 2. ředění


+ 9 ml ŘR**

- X. ředění

….

MYP MYPMYP MYP MYP MYP

MYP

Příprava vzorku

a desítkové

ředění*

Kultivace: 30 °C, 18±4 hodin, případně až 48 hodin,

pokud nejsou kolonie viditelné

Výběr typických kolonií pro konfirmaci

Přeočkování až 5 náhodně vybraných typických (příp. atypických) kolonií

na agar s ovčí krví – průkaz hemolýzy, 30 ˚C, 24±3 hPokud souvislý nárůst a typické kolonie nejsou dobře izolované- nejdříve je subkultivovat na

plotně kompletního agaru (18-24 h) a teprve poté konfirmovat dobře izolované kolonie.

Izolace na


média

Přeočkování na

neselektivní agar

Konfirmační

testy

Roztěr 0,1 ml na MYP***

Presumptivní= touto metodou nelze odlišit B. cereus a další blízce příbuzné, ale řidčeji sevyskytující druhy náležející do Bacillus cereus group (druhové skupiny) (B. anthracis, B.thuringensis, B. weihenstephanensis, B. mycoides)

113

MYP (mannitol, egg yolk, polymyxine agar)Složení média (l): masový extrakt 1 g, pepton 10 g, D-mannitol 10g, chlorid sodný 10 g, fenolová červeň 0,025 g.Přidává se emulze polymyxinu a žloutková emulze.Polymyxin inhibuje růst doprovodné mikroflóry.B. cereus je manitol-negativní (manitol-pozitivní doprovodnámikroflóra se zbarví žlutě díky indikátoru fenolová červeň) a tvořílecitinázu (zóna precipitace).Typické kolonie B. cereus – velké růžové obvykle se zónouprecipitace (některé kmeny mohou vytvářet lecitinázy málo čivůbec).

Bacillus cereus ATCC 11778


Bacillus cereus – MYP agar

114

Krevní agar, Columbia agar

115

Columbia agar s 5 % beraní krveSložení (l)Pankreatická natrávenina kaseinu 12,0 g , Peptická natrávenina zvířecí tkáně 5.0Kvasničný výtažek 3.0 , Hovězí výtažek 3.0 , Kukuřičný škrob 1.0 , Chlorid sodný 5.0 , Agar 13.5 ,Defibrinovaná ovčí krev 5 % , pH 7,3 ± 0,2vysoce výživné medium pro všeobecné použití určené k izolaci a kultivaci nenáročných anáročných mikroorganismů z klinických vzorků (kolonie větší a růst bujnější)dva peptony a kvasničný extrakt - podpora růstakukuřičný škrob – absorbuje toxické vedlejší produkty obsažené ve vzorku a slouží jako zdrojenergie pro organismy obsahující alfa amylázyovčí krev - zjištění hemolytických reakcí, faktor X (hem) potřebný pro růst mnoha patogenníchdruhův mnoha evropských zemích se toto medium stalo nejčastěji používaným primárním izolačnímmédiem pro klinické vzorky.

Blood Agar Base No. 2 – základ pro krevní agar č. 2Složení (g/l): živné substráty – 23,0 (kvasničný extrakt – 5,0; proteose pepton nebo ekvivalentní pepton – 15,0; hydrolyzát jater - 2,5)chlorid sodný 5,0; agar-agar 12,0. Po zklávování a zchlazení na 44-47 °C je přidáno 5-8% ovčí nebo koňské defibrinované krve (v závislosti na účelu). Pro ČSN EN ISO 7932 : 5-7 ml na 1000 ml základní půdy.

K výpočtu se vyberou plotny, na nichž vyrostlo méně než 300 kolonií celkem a méně

než 150 presumptivních kolonií. Mezní limit pro nízké počty je roven 10 (dle ČSN EN

ISO 7218).

Ke konfirmaci se vybírá pět presumptivních kolonií z každé misky použité k výpočtu.

Konfirmace:

• β-hemolýza (úplná hemolýza – projasnění kolem kolonií)

• (možné doplňkové testy: G+ tyčinky s endosporami kataláza pozitivní)

Presumptivní Bacillus cereusČSN EN ISO 7932 Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu presumptivního

Bacillus cereus - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C

116

Kvasinky a plísněČSN ISO 21527-1 (560650) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu

kvasinek a plísní - Část 1: Technika počítání kolonií u výrobků s aktivitou vody vyšší než 0,95

*Minimálně dvě po sobě jdoucí ředění vysetá v paralele.

**ŘR..ředící roztok – pufrovaná peptonová voda (PPV) (dle ISO 21527-1: 0,1% (hmotnostní) peptonová voda – fyziologický

roztok s 0,1 % peptonem)

***(příp. lze v případě nízkých počtů očkovat až tři plotny po 0,3 ml)

****Kultivace ploten v otevřeném plastovém sáčku-zabránění kontaminace termostatu v případě úniku spór plísní z misek.

Vzorek

0. ředění

DRBC

Odečet kolonií


1. den

6. denVyhodnocení

10 g vzorku

+ 90 ml ŘR**

- 1. ředění


+ 9 ml ŘR**

- 2. ředění


+ 9 ml ŘR**

- X. ředění

….

DRBC DRBCDRBC DRBC DRBC DRBC

DRBC

Příprava vzorku

a desítkové

ředění*

Kultivace: 25 °C, 5 dní (a příp. 1-2 dny na rozp. světle), víčkem nahoru****

Izolace na


média

117

Roztěr 0,1 ml na DRBC***

118

Kvasinka: mezofilní aerobní mikroorganismus, který při 25 °C na mykologickém agarovém médiu vytváří matné nebo lesklé okrouhlé kolonie obvykle s pravidelným okrajem a více či méně vypouklým povrchem.

Plíseň: mezofilní aerobní vláknitý mikroorganismums, který při 25 °C na mykologickém agarovém médiu vytváří ploché nebo chmýřovité propagule/zárodky (živá jednotka schopná růstu v živném médiu) nebo kolonie často se zbarvenými plodícími nebo sporulujícími strukturami.

Kvasinky a plísně

DRBCDRBC – chloramfenikolový agar s dichloranem a bengálskou červeníSložení (l): Pepton 5.0; glukóza 10.0; dihydrogenfosforečnan draselný 1.0; dichloran0.002; síran hořečnatý 0.5; bengálská červeň 0.025; chloramfenicol 0.1; agar-agar 15.0. pH: 5.6 ± 0.2Nízké pH a chloramfenikol potlačují růst většiny bakterií. Bengálská červeň, která intracelulárně proniká do mikromycet, vede ke zmenšení velikosti kolonií a zabraňuje rozrůstání plísní (prevence jejich přerůstu přes pomalu rostoucí druhy). Dichloranmá stejnou funkci – zlepšení počítání kolonií. Volitelné přidání: chlortetracyklin hydrochlorid(vyšší inhibice bakterií při předpokládaném přerůstání např. syrové maso), stopové prvky (pro plný vývin morfologie zvláště pigmentace plísní).Zabránit expozici světla – cytotoxické produkty rozkladu mohou snižovat množství mykoflory.

Mucor racemosus ATCC 42647

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763

120

Kvasinky a plísněČSN ISO 21527-1 (560650) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda

stanovení počtu kvasinek a plísní - Část 1: Technika počítání kolonií u výrobků

s aktivitou vody vyšší než 0,95

=DRBC agar

ČSN ISO 21527-1 (560650) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda

stanovení počtu kvasinek a plísní - Část 1: Technika počítání kolonií u výrobků

s aktivitou vody nižší nebo rovnou 0,95

=DG18 agar (agar s dichloranem a glycerolem)Složení (g/l)

Živiny: Pepton 5.0; glukóza 10.0; Pufrovací systém: dihydrogenfosforečnan draselný 1.0;

Inhibice rozrůstání kolonií: dichloran 0.002; Stopové prvky: síran hořečnatý 0.5;

Inhibice: grampozitivních a gramnegativních bakterií - chloramphenicol 0.1; agar-agar 15.0.

pH:5.6 ± 0.2 at 25°C.

Přídavek glycerolu (175 ml na 1 l média – 18 %): snížení vodní aktivity na 0,95 – prostředí pro xerofilní plísně

a osmofilní kvasinky

Eurotium rubrumWallemia sebi

GKCHYGC Agar (Yeast Extract GlucoseChloramphenicol Agar) - GKCHSložení (g/l): Kvasničný extrakt 5.0; glukóza 20.0; chloramfenicol 0.1; agar-agar 15.0.pH: 6.6 ± 0.2Chloramfenikol potlačuje růst většiny bakterií a je plně autoklávovatelný.

Aspergillus niger ATCC 16404

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9080 ČSN ISO 21527-1 a ČSN ISO 21527-2 platné od roku 2008, v dřívějších ISO normách pro stanovení kvasinek a plísní se používalo GKCH

IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮIdentifikace na základě fenotypu:Fyziologické + biochemické znakya) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barvení, tvar)b) požadavky na teplotu, atmosféru, živné látkyc) základní biochemické testy: oxidáza, kataláza, fermentace/oxidace glukózy, hemolýzy

apod.d) Biochemické testy specifické pro určitou skupinu mikrorganismů testů

Např. Bacillus cereusG+ tyčka tvořící endospóry, vlhké, snadno rostoucí kolonie při 37 °Ckataláza pozitivní, β-hemolýza, nefermentuje manitol + enzym lecitináza: na půdě MYProste v růžových koloniích se zónou precipitace

http://www.foodhaccp.com/memberonly/newsletter164.html

http://www.napavalley.edu/people/srose/PublishingImages/Bacillus%20cereus%202(Gram%20stain).jpg

Souprava biochemickýchtestů Microgen Bacillus ID(doba stanovení: 48 hodin)

122

Identifikace bakterií

123

Získání čisté kultury z jediné kolonie-samostatnou dobře ohraničenou kolonii přeočkovat na neselektivní médium pro získání čisté kultury (biochemické identifikační testy nelze provádět spolehlivě s kulturou získanou izolací na selektivním médiu)1. Zařazení do některé širší skupiny bakterií na mikroskopických a fyziologických znaků a základních biochemických vlastností a) Makroskopické znaky – pouze orientační, nutno vždy ověřit Gramovým barvením a mikroskopiíBarva, tvar, okraj, průřez, povrch a konzistence koloniíb) Mikroskopické znakyGramovo barvení a tvar buněk, přítomnost endospor c) Fyziologické znakyNároky na atmosféru a teplotu kultivaced) Biochemické vlastnostiOxidáza, kataláza, hemolýza, fermentace/oxidaca glukózy aj.Zařazení do širší skupiny bakterií je usnadněno v případě izolace na selektivních médiích či selektivně-diagnostických médií, která ale nemusí a nejsou být zcela selektivní či selektivně-diagnostická – nutno ověřit, které skupiny mikroorganismů na těchto médiích mohou růst, nutná kontrola kvality připravených médií (selektivita, specifita)2. Určení v rámci zjištěné skupiny bakterií na základě dalších testůNapř. ENTEROtest 24 – sada 24 biochemických reakcí pro Enterobacteriaceae, nelze provádět bez předchozího kroku ad 1, tj. zařazení do této čeledi

G- bakterie

tyčinkykoky

snadno rostoucí

obtížně rostoucí

Haemophilus

Legionella

Bordetella

Campylobacter

Brucella

oxidáza

pozitivní

Neisseria

Moraxella

oxidáza

pozitivníoxidáza

negativní

fermentace

glukózyfermentace

glukózy

Aeromonas

Vibrio

bez utilizace

glukózy

Alcaligenes

oxidace

glukózy

Pseudomonas

oxidace

glukózy

AcinetobacterEnterobacteriaceae

fermentující laktózu

koliformní bakterie

Escherichia, Citrobacter

Enterobacter, Cronobacter

Hafnia, Klebsiella

nefermentující laktózu

Salmonella

Shigella

Yersinia

ureáza pozitivní ureáza negativní

Proteus

Identifikace gramnegativních bakterií

Obr. 2 Zjednodušené schéma

rozdělení některých

významných gramnegativních

bakterií izolovaných z potravin

a klinických vzorků (autor SP)

124

Průkaz oxidázyPrůkaz přítomnosti cytochromoxidasy c katalyzují transport elektronů z NADH na jejich akceptor kyslík- oxidasa pozitivní bakterie jsou aerobní- oxidasa negativní bakterie mohou být anaerobní,

fakultativně anaerobní či i aerobní, ale pak nevlastní cytochrom oxidasu c (mohou ale mít jiné oxidasy)

- Detekce: oxidace bezbarvých derivátů p-fenylendiaminu na modro-fialově zbarvené produkty (např. N, N, N’, N’-tetramethyl-p-fenylenediamin dihydrochlorid se oxiduje na indofenolovou modř)

Postupkultura je přenesena na plochu navhlčenou činidlem pomocí platinové či plastové kličky (nikoliv železné ! – možná falešně pozitivní reakce), produkce oxidázy dojde ke vzniku sytě fialové až modré barvy do cca 20-30 s – v závislosti na formátu testu

Oxidáza pozitivní G- bakterie (OXI +)Pseudomonas sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Campylobactersp., Pasteurella sp., Moraxella sp., Legionella pneumophila aj.Oxidáza negativní G- bakterie (OXI -)Čeleď Enterobacteriaceae, Acinetobacter sp.

125

Metabolismus cukrůBakterie zkvašují cukry za tvorby • organických kyselin (např. octová, mléčná, propionová)

• detekce pomocí acidobazických indikátorů• plynů jako jsou CO2 a H2

• detekce v tekutém médiu - Durhamova zkumavka (plynovka)• detekce ve ztuženém agaru (anaerobní fermentace) – změny homogenity agaru

(„roztrhání“)• organických kyseliny a plynů současně

Test v tekutém médiu na zkvašování cukrů za tvorby plynu a/nebo kyseliny: Zkumavky obsahují peptonovu vodu a 1% testovaného cukru (glukosa, sacharosa, laktosa, manitol, xylosa), plynovku a acidobazický indikátor.

http://www.mesacc.edu/~johnson/labtools/Dbiochem

/cho.html

tvorba kyseliny a plynu

tvorba kyseliny

nezkvašuje

Durhamova zkumavka

Acidobazický indikátor: fenolová červeň

Anaerobní fermentace glukózy za tvorby kyseliny a plynu (TSI agar – biochemické testy Salmonella spp.) – očkování vpichem (anaerobní podmínky) – acidobazický indikátor fenolová červeň– „roztrhání“ agaru

126

Metabolismus cukrůMetabolismus glukózy• základní identifikační znak pro gramnegativní bakterie• oxidativní metabolismus: tvorba kyseliny z glukózy nastává pouze za aerobních

podmínek (+ malé množství CO2 případně)• fermentativní metabolismus: tvorba kyseliny nebo též plynu i za anaerobních podmínek• anaerobní podmínky:

• Ztužená média: očkování vpichem (do média zbaveného kyslíku)• Tekutá média: překryv parafínovým olejem

Bez utilizace• glukóza není metabolizovánaOxidace glukózy • pouze v přítomnosti kyslíku se

tvoří z glukózy kyselina • pozitivní (žlutá) pouze

zkumavka bez překryvu parafínovým

olejem (aerobní prostředí) Fermentace glukózy • kyselina se tvoří z glukózy i v

nepřítomnosti kyslíku • obě zkumavky pozitivní

(žlutá) (anaerobní prostředí)

Anaerobní fermentace glukózy za tvorby kyseliny a plynu (TSI agar –biochemické testy Salmonella spp.) – očkování vpichem (anaerobní podmínky) – acidobazický indikátor fenolová červeň + „roztrhání“ agaru

OX FERMBEZ UT.

Hugh Leifsonovo glukosové médium: Pepton ze zvířecí tkáně, kvasničný extrakt, NaCl, glukóza (1 % - 10 g/l), bromothymolová modř 127

Fermentace glukózy

Glukózový agarSložení (l):Enzymaticky natrávený kasein 10.0 gKvasničný extrakt 1.5 gGlukóza 10.0 gChlorid sodný 5.0 gBromkresolová modř – acidobazický indikátorAgar 9-18 g

Anaerobní prostředíOčkování vpichem• Bezprostředně před použitím se médium

rozehřeje ve vroucí vodě nebo proudící páře po dobu 15 min, pak se rychle ochladí na inkubační teplotu

• Přídavek sterilního parafinového oleje nad povrch agaru

- +

Metabolismus cukrů

128

► INDOL test

E.coli Citrobacter Enterobacter

Pracovní postup:• na filtrační papír se nanese kapka roztoku INDOL

testu• očkovací kličkou se do ní vetře kolonie • inkubace - při laboratorní teplotě cca 5 min

Rod Proteus

130

Bakterie rodu Proteus(čeleď Enterobacteriaceae) – typický plazivý růst – příbojové vlny –Raussův fenomén

Plazivost je inhibována přídavkem deoxycholát sodného

https://www.researchgate.net/post/How_to_identify_Salmonella_from_Proteus_in_normal_Salmonella_selective_media

Proteus sp. inokulovaný do středu krevního agaru (37 °C, 24 hod)

Escherichia coli

Výsledkem biochemické identifikace je soubor biochemických vlastností, který je srovnán s databází vlastností referenčních kmenů, na které byl test aplikován- Vyhodnocení přes software TNW- Vyhodnocení přes kódovou knihu

ENTEROtest 24 N

Dle tabulky barevných hodnocení reakcí vyhodnoťte jednotlivé reakce (+/-) a zaznamenejte do záznamového archu.V jednotlivých sloupcích sečtěte čísla příslušná k pozitivním reakcím.Získaný číselný kód najděte v PDF vyhodnocovací knize a zaznamenejte výsledek identifikace, % identifikace, Tin a hodnocení identifikace.

ENTEROtest 24 NU každého identifikovaného taxonu jsou uvedeny následující informace:a/ procento identifikace ( % id. ) -udává pravděpodobnost, s jakou daný výsledek odpovídá danému taxonub/ T-index (Tin) - udává, do jaké míry daný výsledek odpovídá nejtypičtějšímu výsledku pro daný taxon; hodnota (Tin) může ležet v intervalu od 0 do 1, a je nepřímo úměrná počtu atypických testů.c/ seznam atypických znaků ( AZ ) u prvního taxonu s uvedeným procentem pozitivních reakcíd/ seznam dodatkových testů s uvedeným procentem pozitivních reakcí u nedostatečně odlišených taxonůe/ komentář vytvořený na základě hodnot % id a Tin, definující úroveň spolehlivosti identifikace

133

Skupina

mikroorganismů

Čeledi/rody Příklady dostupných identifikačních souprav v mikrotitračním provedení* (liší

se množstvím a druhem použitých reakcí, spektrem identifikovaných bakterií a

rychlostí identifikace)

G+ koky

kataláza pozitivní

Staphylococcus

Micrococcus

Rothia, Kocuria aj.

STAPHYtest 24 (Erba Lachema®, ČR)

API® Staph, RAPIDEC® Staph (bioMérieux, Francie)

MicrogenTM Staph-ID (Microgen, Velká Británie)

G+ koky

kataláza negativní

Streptococcus

Enterococcus aj.

STREPTOtest 24, EN-COCCUStest (Erba Lachema®, ČR)

API®-STREP (bioMérieux, Francie)

MicrogenTM Strep-ID (Microgen, Velká Británie)

G+ tyčinky mezofilní Bacillus spp.

Paenibacilllus

Brevibacillus

MicrogenTM Bacillus-ID (Microgen, Velká Británie)

Listeria API® Listeria (bioMérieux, Francie)

MicrogenTM Listeria-ID (Microgen, Velká Británie)

Corynebacterium API® Coryne (bioMérieux, Francie)

G- tyčinky fermentující

glukózu

Enterobacteriaceae

Vibrio

Aeromonas

ENTEROtest 24/24 N/16/Rapid/Screen (Erba Lachema®, ČR)

API® 20E, API® Rapid 20E (bioMérieux, Francie)

MicrogenTM GNA-ID (Microgen, Velká Británie)

G- tyčinky

nefermentující glukózu

Pseudomonas

Acinetobacter

Stenotrophomonas

NEFERMtest 24/24N (Erba Lachema®, ČR) - (identifikace zahrnuje též Vibrio

a Aeromonas)

API®-NE (bioMérieux, Francie)


G- tyčinky mikroaerobní Campylobacter API®-CAMPY (bioMérieux, Francie)

G- koky Neisseria, Branhamella

(Haemophilus: API® NH)

NEISSERIAtest (Erba Lachema®, ČR)

API® NH (bioMérieux, Francie)

G+ a G- anaerobní

bakterie

Clostridium

Bifidobacterium

Propionibacterium

ANAEROtest 24 (Erba Lachema®, ČR)

API® 20A, Rapid ID 32A (bioMérieux, Francie)

Kvasinky Candida Trichosporon

Saccharomyces aj.

CANDIDAtest 21, CANDIDA-Screen (Erba Lachema®, ČR)

API® 20C AUX (bioMérieux, Francie)

Identifikace bakterií a kvasinek

G+ bakterie

tyčinkykoky

mající endospóry

(sporulující)

bez endospór

(nesporulující)

Listeria

Lactobacillus

Corynebacterium

Bacillus

Clostridium

kataláza

pozitivní

kataláza

negativní

Staphylococcus α-, β-hemolýza

Streptococcus

γ-hemolýza

Enterococcus

Lactococcus

Micrococcus

Zjednodušené schéma rozdělení některých významných grampozitivních bakterií

izolovaných z potravin a klinických vzorků

Identifikace G+ bakterie

STAPHYtest 24

STREPTOtest 24

ANAEROtest 24

STREPTOtest 24

MicrogenTM

Bacillus-ID API® Coryne

API® Listeria

ANAEROtest 24

ANAEROtest 24

Průkaz katalázyKatalázaEnzym, který katalyzuje rozklad peroxidu vodíku (toxický) na vodu a kyslík. Tento enzym vlastní aerobní a fakultativně anaerobní bakterie, které jsou vybaveny cytochromovým systémem.

Průkaz katalázy – do kapky 3%peroxidu vodíku přeneseme kličkou vyšetřovanou kolonii. V pozitivním případě se uvolňují bublinky kyslíku.

G+ koky:Staphylococcus sp., Micrococcus sp., Kocuria sp., Dermacoccus sp. Macrococcus sp. , Rothia sp. – kataláza pozitivní, Streptococcus sp., Enterococcus sp., Lactococcus sp. - kataláza negativníG+ tyče tvořící endospory:Bacillus sp. (fak. anaerob) – kataláza pozitivníClostridium sp. (anaerob) – kataláza negativníG- tyčinky:Enterobacteriaceae - kataláza pozitivní (mimo Shigella dysenteriae typ 1)

2 H2O + O22 H2O2

kataláza bubliny

Hemolýza

136

Ke zjištění hemolytické aktivity se používá krevního agaru, příp. dalších agarů s krví. Tvorba hemolyzinů je typická pro řadu patogenních bakterií, ale i některých podmíněně patogenních či nepatogenních (některé streptokoky, Staphylococcus aureus, hemolytické Escherichia coli, Pseudomonas, některé bacily apod.)

V okolí kolonie může dojít buď k úplné hemolýze nebo neúplné hemolýze–Při neúplné hemolýze neboli viridaci dochází k částečnému rozrušení hemoglobinu na zelenohnědý pigment methemoglobin a erytrocyty nejsou lyzovány. –Při úplné hemolýze dojde k úplnému rozložení hemoglobinu i lýzi erytrocytů, takže kolem kolonie dojde k vytvoření průhledného dvorce.Úplná hemolýza je často nepřesně obecně označována jako β-hemolýza, neúplná hemolýza poté jako α-hemolýza. Přesné označení však závisí na označení hemolyzinu, který hemolýzu vyvolává, což je rodově odlišné.

http://www.bacteriainphotos.com/photo%20gallery/staphylococcus%20aureus%20B.jpg

S. aureusúplná hemolýza způsobená αhemolyzinem

Rod Streptococcus/Enterococcus

β hemolyzin

γ hemolýza

α hemolyzin

137

Skupina

mikroorganismů

Čeledi/rody Příklady dostupných identifikačních souprav v mikrotitračním provedení* (liší

se množstvím a druhem použitých reakcí, spektrem identifikovaných bakterií a

rychlostí identifikace)

G+ koky

kataláza pozitivní

Staphylococcus

Micrococcus

Rothia, Kocuria aj.

STAPHYtest 24 (Erba Lachema®, ČR)

API® Staph, RAPIDEC® Staph (bioMérieux, Francie)

MicrogenTM Staph-ID (Microgen, Velká Británie)

G+ koky

kataláza negativní

Streptococcus

Enterococcus aj.

STREPTOtest 24, EN-COCCUStest (Erba Lachema®, ČR)

API®-STREP (bioMérieux, Francie)

MicrogenTM Strep-ID (Microgen, Velká Británie)

G+ tyčinky mezofilní Bacillus spp.

Paenibacilllus

Brevibacillus

MicrogenTM Bacillus-ID (Microgen, Velká Británie)

Listeria API® Listeria (bioMérieux, Francie)

MicrogenTM Listeria-ID (Microgen, Velká Británie)

Corynebacterium API® Coryne (bioMérieux, Francie)

G- tyčinky fermentující

glukózu

Enterobacteriaceae

Vibrio

Aeromonas

ENTEROtest 24/24 N/16/Rapid/Screen (Erba Lachema®, ČR)

API® 20E, API® Rapid 20E (bioMérieux, Francie)


G- tyčinky

nefermentující glukózu

Pseudomonas

Acinetobacter

Stenotrophomonas

NEFERMtest 24/24N (Erba Lachema®, ČR) - (identifikace zahrnuje též Vibrio

a Aeromonas)

API®-NE (bioMérieux, Francie)


G- tyčinky mikroaerobní Campylobacter API®-CAMPY (bioMérieux, Francie)

G- koky Neisseria, Branhamella

(Haemophilus: API® NH)

NEISSERIAtest (Erba Lachema®, ČR)

API® NH (bioMérieux, Francie)

G+ a G- anaerobní

bakterie

Clostridium

Bifidobacterium

Propionibacterium

ANAEROtest 24 (Erba Lachema®, ČR)

API® 20A, Rapid ID 32A (bioMérieux, Francie)

Kvasinky Candida Trichosporon

Saccharomyces aj.

CANDIDAtest 21, CANDIDA-Screen (Erba Lachema®, ČR)

API® 20C AUX (bioMérieux, Francie)

Identifikace bakterií a kvasinek

Stupnice McFarland

138

Odhad koncentrace mikrobiální suspenze (KTJ/ml) na základě měření jejího zákalu (turbidity) a) přístrojem (denzilametr), b) na základě srovnání se zákalem směsi roztoků 1% BaCl2/ 1% H2SO4

Turbidita τ charakterizuje zeslabení intenzity primárního paprsku, způsobené rozptylem, při jeho průchodu disperzní soustavou tvořenou vrstvou o tloušťce x.Koncentrace (KTJ/ml) při daném McFarland závisí na velikosti a tvaru buněk – při využití pro odečet KTJ/ml nutno sestavit kalibrační křivku pro daný mikroorganismus.

McFarland Standard 0,5 1 2 3 4

1,0% BaCl2 (ml) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4

1,0% H2SO4 (ml) 9,95 9,9 9,8 9,7 9,6

Přibližná buněčná denzita(1X10^8 KTJ/ml)

1,5 3,0 6,0 9,0 12,0

% Transmitance (600 nm) 74,3 55,6 35,6 26,4 21,5

Absorbance(600 nm)

0,08 - 0,1 0,257 0,451 0,582 0,669

139

Stupnice McFarland

http://www.isanorcal.org/download/tech2007_presentations/turbidity.pdf

140

Stupnice McFarland

141

Stupnice McFarland

Turbidita τ charakterizuje zeslabení intenzity primárního paprsku, Io, způsobené rozptylem, při jeho průchodu disperzní soustavou tvořenou vrstvou o tloušťce x.

Absorbance je veličina používaná ve fotometrii a spektrofotometrii. Udává, jak mnoho světla bylo pohlceno měřeným vzorkem.

Stupnice McFarland

142

McFarlandstupnice

cca KTJ (x106/ml) (E. coli)

1% BaCl2/ 1% H2SO4 (ml)

0.5 <300 0.05/9.95

1 3*108 0.1/9.9

2 6*108 0.2/9.8

3 9*108 0.3/9.7

4 1,2*109 0.4/9.6

5 1,5*109 0.5/9.5

6 1,8*109 0.6/9.4

7 2,1*109 0.7/9.3

8 2,4*109 0.8/9.2

9 2,7*109 0.9/9.1

10 3,0*109 1.0/9.0

y = 3E+08x

0,00E+00

5,00E+08

1,00E+09

1,50E+09

2,00E+09

2,50E+09

3,00E+09

3,50E+09

0 5 10 15

KTJ

/ml

McFarland

E. coli

http://www.microbiol.org/resources/monographswhite-papers/measurement-of-cell-concentration-in-suspension-by-optical-density/

• KTJ – kolonie tvořící jednotky• Koncentrace mikrobiální suspenze při daném

McFarland závisí i na velikosti buněk – čím větší buňky, tím nižší koncentrace při stejném McFarland

• 1 McFarland E. coli - cca 108 KTJ/ml• 1 McFarland Bacillus spp. - cca 107 KTJ/ml• 1 McFarland kvasinky – cca 106 KTJ/ml

Sbírky mikroorganismů

143

Escherichia coli CCM 3954

= ATCC 25922 = CCUG 17620 = CIP 76.24 = CNCTC 5276 = DSM 1103 = IFO 15034 = JCM

5491 = LMG 8223 = NCIMB 12210 = NCTC 12241 = WDCM 00013 = FDA strain Seattle 1946

< P. Urbášková < ATCC < FDA < F. Schenknecht. Clinical isolate. International standard

reference strain for antibacterial disc susceptibility testing (5516). Antimicrobial susceptibility

quality control with seven veterinary antimicrobials (6165,6453). Media testing.. Biohazard

group 2. Medium 71, 37°C.

Sbírka mikroorganismů ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT (DBM)

Česká sbírka mikroorganismů (CCM) je specializované

vědecko-servisní pracoviště Ústavu experimentální biologie

PřF Masarykovy univerzity, které uchovává kultury

mikroorganismů pro potřeby základního a aplikovaného

výzkumu, průmyslové využití, biotechnologii a výuku.

Mnoho kultur dále slouží jako referenční vzorky pro

klinické laboratoře humánního a veterinárního zaměření.

Pojem: sbírkový kmen – kmen pocházející z některé ze sbírek, kde je setrvale deponován a udržován s důrazem na uchování jeho genotypových a fenotypových vlastností, referenční (kontrolní) kmen – kmen s určitými fenotypovými a genotypovými charakteristikami, který je používán jako kontrola pro určité typy metod či stanoveníKultury dodávané lyofilizované či na želatinových discích.

Pasážování – opakovaná rekultivace kmene – v průběhu pasážování může kmen některé svoje vlastnosti ztrácet (např. ztráta mobilních genetických elementů, rekombinace, mutace atd.)

Děkuji Vám za pozornost

[email protected]

Kultivaní metody v potravináské -...

Documents

Transcript of Kultivaní metody v potravináské -...