89

A Kss1 é uma proteína que, na ausência de sinal, se mantém inactiva, ligada a

um complexo no citosol. Nem todas as MAP cinases são substituíveis e as que o são, não o são por

qualquer outra MAP cinase. As especificidades de cada uma geram limitações na sua substituição.

Mensageiros Secundários: Os 4 segundos mensageiros intracelulares mais comuns são:

- AMP ciclíco (c-AMP); - GMP ciclíco (c-GMP); - Diacilglicerol (DAG);

- Inositol 1,4,5 – trifosfato (IP3). O AMPc é sintetizado pela adenilato ciclase por estimulação hormonal de GPCRs,

não havendo conhecimento da intervenção de AMPc em sinalização iniciada por RTKs. No entanto existem outros segundos mensageiros actuantes, que intervêm ligados a RTKs e

GPCRs, nos processos ligados à via das MAP cinases. O aumento de AMPc produz efeitos diferentes em diferentes tipos de células. Este

mensageiro actua em proteínas cinases que dele dependem e que se designam cAPKs ou proteínas cinases A (PKAs).

Os receptores de AMPc estão em vários tecidos, levando a diferentes respostas,

provocadas por hormonas também diferentes. Contudo a mesma hormona pode induzir diferentes processos (dependendo do tecido).

Exemplo: Epinefrina. A epinefrina actua ao nível dos adipócitos (aumento da hidrólise de

triglicerídeos), fígado (aumento da conversão de glicogénio a glicose), intestino (secreção de fluidos) e células do músculo cardíaco (aumento da taxa de contracção) e esqueléticas

(conversão de glicogénio a glicose). A mesma hormona produz diferentes respostas, no entanto também algumas iguais (Ex. Fígado e células musculares esqueléticas).

Kss1

90

PKAs ou cAPKs: As cAPKs têm uma constituição tetramérica (forma inactiva), com duas

subunidades catalíticas (C) e duas reguladoras (R). Cada subunidade reguladora tem dois locais de ligação para AMPc (A e B), localizados em domínios diferentes da subunidade. A

ligação é cooperativa, deste modo, quando o AMPc liga ao local B, provoca uma transformação conformacional que expõe o local A. Este local ligado a AMPc permite a dissociação das subunidades catalíticas (forma activa) e consequentemente a fosforilação.

Quanto maior a quantidade de AMPc presente, maior o número de subunidades catalíticas livres.

As cinases dependentes de mensageiros secundários (neste caso AMPc) possuem

uma sequência peptídica reguladora que:

- Ou constitui as subunidades R (caso das cAPKs); - Ou é apenas uma parte da subunidade C que também contém o local catalítico.

Em ambos os casos designa-se por pseudosubstrato (é a parte reguladora) e inibe a actividade enzimática por ligação ao local catalítico. A ligação do segundo mensageiro à cinase inactiva:

- Dissocia as subunidades reguladoras; - Ou o local da subunidade catalítica liberta-se da acção inibidora do pseudosubstrato (domínio regulador).

Nos dois casos, a cinase torna-se ezimaticamente activa. Por vezes, algumas proteínas cinases sofrem fosforilação de certos aminoácidos

(ao nível do lábio de fosforilação). Ocorre uma alteração conformacional que promove a

ligação de ATP e substratos proteicos antes da activação. A desfosforilação desliga ATP e substratos proteicos e cessa a actividade. As cAPKs fosforilam resíduos de serina e treonina da enzima onde actuam,

alterando a sua actividade.

Metabolismo do Glicogénio: A primeira resposta celular mediada por cAMP que se descobriu foi a produção de

glicose a partir de glicogénio, em células de músculo e fígado, estimuladas por epinefrina

ou agonistas dos receptores β-adrenérgicos.

B A

91

O glicogénio é um polímero de glicose sintetizado por algumas enzimas e

degradado por outras.

Síntese:

1. Três enzimas convertem a glicose em uridinadifosfoglicose ou UDP-Glicose; 2. A UDP-Glicose é transferida, pela glicogénio sintase, para o grupo hidroxilo livre do carbono 4 de um resíduo de glicose, no final de uma cadeia de glicogénio em

construção.

Degradação: Na degradação do glicogénio é removido um resíduo de glicose de cada vez. Esta

reacção é catalisada pela glicogénio fosforilase, libertando-se Glicose-1-P.

1. A glicogénio fosforilase liberta Glicose-1-P da cadeia de glicogénio em degradação; 2. A Glicose-1-P é convertida, por acção da fosfoglucomutase, em Glicose-6-P (um

intermediário na via glicolítica). 3. No músculo, pelo processo de glicólise, formava Glicose-6-P com gasto de ATP, assim, a Glicose-6-P proveniente de Glicose-1-P permite que o ATP seja usado na

contracção muscular. No fígado, a fosfatase hidrolisa a Glicose-6-P originando glicose, estas é transportada na corrente sanguínea, indo alimentar outras células (Ex. cérebro e músculos).

As células do músculo e do fígado são estimuladas, por epinefrina ou agonistas

dos receptores β-adrenérgicos, para a degradação do glicogénio. A presença de epinefrina (por indução do receptor) aumenta os níveis de AMPc,

activando as cAPKs, que podem:

1. Estimular a degradação do glicogénio: Fosforilam a fosforilase cinase do

glicogénio (GPK), activando-a. Esta pode assim fosforilar a fosforilase do glicogénio (GP), levando à degradação do glicogénio e consequentemente formação de Glicose-1-P.

2. Inibir a síntese de glicogénio: Fosforilam o inibidor da fosfoproteína fosfatase (IP), activando-o. A fosfoproteína fosfatase (PP)

liga-se ao inibidor ficando inactiva e assim, a sintetase do glicogénio (GS) é fosforilada, ficando

inactiva (a glicose não é transformada em glicogénio). Dá-se um aumento da concentração de glicose.

92

Quando ocorre a remoção da epinefrina, dá-se uma diminuição da concentração

de AMPc. Deste modo a fosfoproteína fosfatase (PP) fica activa, uma vez que o seu inibidor

(IP) não é fosforilado pela cAPK, encontrando-se inactivo. Assim a PP pode: 1. Inibir a degradação de glicogénio: Desfosforila a fosforilase cinase do

glicogénio (GPK) e a fosforilase do glicogénio, inibindo-as (não há degradação de glicogénio). 2. Estimular a síntese de glicogénio: Desfosforila a sintase do glicogénio (GS),

activando-a, ocorrendo síntese de glicogénio a partir de UDP-Glicose.

Dá-se um aumento da concentração de glicogénio (forma de reserva, não

utilizável).

O mecanismo que regula o metabolismo do glicogénio envolve uma cascata de

reacção, que é uma série de reacções onde a enzima que cataliza um passo é activada ou inibida pelo produto da etapa anterior. Isto traz duas vantagens para a célula:

1. As 3 enzimas (cAPK, fosforilase cinase do glicogénio e fosforilase do glicogénio) são todas reguladas por um único tipo de molécula, o AMPc; 2. Favorece uma enorme ampliação de um pequeno sinal inicial.

Exemplo: Epinefrina

Uma concentração de 10-10 pode fazer

aumentar os níveis de glicose sanguíneos em 50% e o AMPc aumentar de concentração em 10 vezes. O nível de amplificação aumenta ao longo

da cascata, ocorrendo uma amplificação (ao nível do AMPc) de 100000x, sinalizando-se 10-6 M.

Os efeitos do AMPc na síntese e degradação do glicogénio só ocorrem em células

do fígado e músculo, que armazenam glicogénio. No entanto, o AMPc também medeia respostas intracelulares de outras células, onde diversas hormonas estimulam GPCRs.

O AMPc actua em uma ou mais cAPKs mas, nos diferentes tecidos, ocorrem diversas respostas metabólicas. O efeito do AMPc num dado tecido depende:

- Da especificidade de uma dada cAPK; - Dos substratos da cAPK que a célula consegue expressar.

93

Pelo aumento do AMPc, uma APKc pode actuar em adipócitos, estimulando a produção de ácidos gordos que podem ser usados por outros tecidos na produção de ATP. Nos ovários, o AMPc promove a síntese de estradiol e progesterona.

Exemplos:

Um aumento em AMPc provoca actividade numa cAPK:

- Em adipócitos, estimula a produção de ácidos gordos, actuando em lipases. Os ácidos gordos ficam assim disponíveis como fonte de energia para outras células e

órgãos (rins, coração e músculos); - Em ovários, promove a síntese de estradiol e progesterona. Um aumento do nível celulares de AMPc pode dar uma resposta de interesse

numa parte da célula que pode prejudicar outra parte (Ex. células migrantes, alterações no

citoesqueleto). Nestes casos actuam proteínas de ligação (ancoragem) que fixam certas isoformas de cAPK a determinados locais da célula, estas proteínas são conhecidas como proteínas associadas à proteína cinase A ou AKAP. Possuem uma estrutura com duas

partes: - Uma região que determina uma ligação exacta a nível celular;

- E uma região que liga à subunidade reguladora das cAPKs. Exemplos:

AKAP250 Localiza-se em filopódios de células migrantes e regula a estrutura do

citoesqueleto de filamentos de actina, facilitando o movimento. Em outras partes da célula, a mesma acção pode prejudicar o movimento celular. AKAP15 Está ancorada à face citosólica da membrana plasmática, próximo de

certos canais de Ca2+ em células do músculo cardíaco. A fosforilação dos canais pela cAPK leva à abertura do canal e consequente influxo de Ca2+, que aumenta a contracção do

músculo cardíaco. A proximidade de cAPK ao canal garante uma resposta mais rápida. Noutros casos a ancoragem de cAPK junto ao núcleo também facilita a entrada (no núcleo) de unidades catalíticas, que activam factores de transcrição no interior do núcleo.

Geração de segundos mensageiros por modificação de um precursor

fosfolipídico comum:

Os níveis de fosfatidil-inositol (PI) nas células podem ser regulados por sinais

extracelulares (Hormonas), sendo os receptores RPKs ou GPCRs estimulados. O PI tem uma parte integrada na membrana e outra (grupo inositol) no citosol. O grupo inositol pode ser reversivelmente fosforilado em diferentes locais, por exemplo na posição D3, pela

PI-3 cinase, originando diversos fosfoinositídeos (Ex. Fosfatidilinositol-3-P) ligados à membrana, que funcionam como segundos mensageiros. Estes podem ser clivados pela fosfolipase C (PLC, uma enzima associada à membrana plasmática) gerando outros

mensageiros secundários, como o 1,2 – diacilglicerol (DAG), que se mantém na membrana plasmática e o inositol 1,4,5 – trifosfato (IP3) que fica livre no citosol.

Existem duas isoformas da PLC que são estimuladas por receptores diferentes: - Isoforma PLCβ – GPRCs;

- Isoforma PLCγ – RTKs.

94

A toxina Pertussis (Tosse convulsa) liga-se à subunidade Gα na forma inactiva

(ligada a GDP), impedindo a activação da PLCβ mesmo na presença de hormona. Tem um efeito contrário ao da toxina da cólera, que provoca uma activação continuada desta

subunidade, levando à produção de muito AMPc. Cálcio como segundo mensageiro:

As propriedades físico-químicas do cálcio permitem interacções altamente

específicas com outras moléculas. A concentração de cálcio livre no citosol de qualquer célula é extremamente baixa

(10-7 M = 100 nM), compatibilizando-se com:

- A síntese frequente de energia metabólica na forma de ATP depender de elevados

valores de Pi livre. Baixas concentrações de Ca2+ evitam a formação de sais de fosfato de cálcio insóluveis; - O Ca2+ ser uma molécula sinalizadora que se torna actuante quando a

concentração de Ca2+ sofre um aumento. Nos fluidos extracelulares e em compartimentos intracelulares especializados a concentração é muito maior (> 1 μM a 1 mM). Assim, o gradiente de cálcio tem têndencia a movimentar cálcio para o citosol através da membrana

plasmática e da membrana dos reservatórios intracelulares. Quando um sinal abre transitoriamente canais de cálcio nestas membranas, o cálcio acorre rapidamente ao citosol aumentando enormemente a sua concentração e activando mecanismos de respostas

sensíveis a cálcio.

Mecanismos que garantem a baixa concentração de cálcio no citosol, em

animais: Todas as células eucariotas possuem uma Ca2+/ATPase na membrana plasmática,

que utiliza a hidrólise do ATP para bombear Ca2+ para fora do citosol. Nas células musculares e nervosas, que utilizam extensivamente a sinalização por

Ca2+, têm outra bomba de na Ca2+ membrana plasmática que associa o efluxo de Ca2+ ao

influxo de Na+. Este trocador Na+/ Ca2+ tem uma baixa afinidade para o Ca2+, começando a actuar eficientemente apenas quando os níveis de Ca2+ citosólico sobem cerca de 10x relativamente ao nível de repouso.

Também há uma bomba de Ca2+ na membrana dos reservatórios intracelulares

de Ca2+, nomeadamente vesículas semelhantes ao Retículo Endoplasmático (compartimentos sequestradores de cálcio) e vesículas do Retículo Sarcoplasmático, no tecido muscular, que mantém baixa a concentração citosólica de Ca2+. Esta Ca2+ ATPase

permite aos compartimentos intracelulares captarem grandes quantidades de Ca2+

proveniente do citosol, contra um elevado gradiente de concentração. O cálcio é armazenado no lúmen dos compartimentos fracamente ligado a uma proteína que liga

Ca2+, chamada calsequestrina, com baixa afinidade mas alta capacidade de acumular Ca2+. Quando as células são danificadas e não podem bombear eficientemente Ca2+

para fora do citosol, então a concentração de Ca2+ pode subir a níveis altamente perigosos (> 10-5 M). A estas concentrações, uma bomba de Ca2+ com baixa afinidade e alta

capacidade entra em acção na membrana mitocondrial interna, usando o gradiente electroquímico formado durante a transferência de electrões da cadeia respiratória mitocondrial.

95

Funções do Ca2+ como mensageiro intracelular: A primeira prova do Ca2+ como mensageiro intracelular foi obtida em 1947, onde

a injecção de pequenas quantidade de Ca2+ causava contracção das células do músculo esquelético. Actualmente têm-se visto que o Ca2+ actua como segundo mensageiro numa

grande variedade de respostas celulares. Estão bem definidas duas vias de sinalização de Ca2+ (como segundo

mensageiro) em células animais, onde este funciona como mediador intracelular de sinais extracelulares:

A – O Ca2+ entra num terminal nervoso a partir do fluido extracelular através de canais de Ca2+ sensíveis à voltagem, quando a membrana do terminal nervoso é

despolarizada por um potencial de acção; B – Quando uma molécula sinal extracelular liga a um receptor da superfície celular,

estimula a libertação de Ca2+ dos compartimentos intracelulares de Ca2+ da célula. Uma via funciona em células com actividade eléctrica (1) e outra é usada por

quase todas as células eucariótas (2). 1. Nomeadamente em células nervosas, nas quais a despolarização da membrana

plasmática causa um influxo de Ca2+ para dentro do terminal nervoso, inicia-se com a secreção do neurotransmissor. O Ca2+ entra através de canais controlados por voltagem

que abrem quando a membrana plasmática é despolarizada por um potencial de acção invasor. 2. É uma via ubiquista, a ligação de moléculas sinalizadoras extracelulares

(hormonas) a receptores de superfície de várias células (Ex. fígado e tecido adiposo), induz o aumento de Ca2+ citosólico à custa do Ca2+ acumulado nos compartimentos sequestradores de Ca2+ (CSC) e/ou do Ca2+ externo.

Libertação de Ca2+ do RE induzida por hormonas e mediação por IP3: No início dos anos 80 mostrou-se que a elevação de Ca2+ citosólico, devido ao

Ca2+ acumulado no RE (CSC), é normalmente precedida pelo aumento de outro segundo

mensageiro, o IP3. O IP3, sendo hidrosolúvel,

difunde-se da membrana plasmática para o RE, aqui pode ligar-se aos

canais de Ca2+. Estes têm 4 subunidades iguais e todas ligam IP3 no terminal-N do domínio citosólico,

a ligação induz a abertura do canal e a saída de Ca2+ para o citoplasma, elevando a sua concentração. Esta

subida é temporária, uma vez que, o IP3 é imediatamente hidrolizado a inositol 1,4 – bifosfato (IP2), que

não estimula a libertação de Ca2+ do RE. As Ca2+ATPases retiram rapidamente o excesso de Ca2+ do citosol, voltando este

para o RE e/ou para o exterior.

96

Se não existisse um processo de reabastecimento do RE em Ca2+, as reservas

deste ião seriam rapidamente esgotadas e não era possível induzir uma série de processos

na célula. No entanto, estudos mostram a existência de Store Operated Channels (SOCs), que abrem em resposta ao aumento da concentração citoplasmática de Ca2+, mantendo assim as reservas deste ião normais no RE.

O IP3 tem uma elevada especificidade, comprovada pela seguinte experiência,

onde se isolaram mitocôndrias, recolhendo-se o sobrenadante e, a partir deste, separaram-se vesículas de retículo endoplasmático (RE). Estas sofrem a acção de vários inositois fosforilados, sendo que apenas o IP3 induz a libertação de Ca2+ pelas vesículas. No

entanto, outras células podem responder diferentemente ao IP3, ou porque existem isoformas de canais de Ca2+ com diferentes solubilidades a IP3, ou porque existem variações do conteúdo de Ca2+ no RE.

Conclusão: Diferentes tipos de células podem ter respostas diferentes ao mesmo

sinal extracelular. O próprio Ca2+ citosólico também potencia a abertura dos canais de Ca2+

sensíveis a IP3 ao aumentar a afinidade dos receptores de IP3. Conclusão: É o próprio Ca2+ que potencia a abertura dos canais de Ca2+ do RE,

uma vez que aumenta a afinidade dos receptores por IP3. No entanto, acima de uma determinada concentração, este ião reduz a afinidade dos receptores de IP3 e a libertação

do Ca2+ das reservas intracelulares é inibida. Na glândula pituitária, por acção do factor de libertação da hormona luteinizante

– HLHR, ocorre estimulação das células que segregam a hormona, causando esta estimulação, rápidos e repetidos picos de subida da concentração do Ca2+ citosólico. Isto

pode justificar-se devido à toxicidade do Ca2+ no citosol, se concentrações elevadas permanecerem por um período prolongado.

Receptores de rianodina na libertação de Ca2+ intracelular: Nas células musculares e nervosas existem outros canais de Ca2+, denominados

receptores de rianodina (RYRs), estes possuem sensibilidade a um alcalóide vegetal (rianodina).

Existem no Retículo Sarcoplaspático das

células musculares estriadas e têm ligação com o

domínio citoplasmático de receptores de dihidropiridina, sensíveis à voltagem. Uma alteração no potencial de

membrana (despolarização) induz uma alteração conformacional nos RYRs libertando o Ca2+ do RS para o citosol. A repolarização leva ao fecho dos canais.

Nas células musculares com RYR, a libertação de Ca2+ das reservas intracelulares

é suficiente para induzir a contracção muscular. Pelo contrário, a saída de Ca2+ induzida por IP3 precisa da activação dos SOCs, na membrana plasmática, para manter as respostas

celulares. O Ca2+ citosólico também estimula os RYR mas, ao contrário dos canais do RE

sensíveis a IP3, a subida da concentração não os inibe.

97

Os RYRs dos neurónios encontram-se na membrana do RE. Recentemente

descobriu-se uma molécula sinalizadora diferente, a ADP-ribose cíclica (novo segundo

mensageiro), que promove a libertação de Ca2+ dos RYR neuronais. No músculo liso arterial, os RYRs medeiam a libertação de Ca2+, em íntima

ligação com a membrana plasmática, onde influenciam a abertura de canais de K+-. Este fluí para fora da célula, hiperpolarisando-a, conduzindo à inibição da contracção, o consequentemente ao relaxamento muscular. No entanto a libertação de Ca2+ no interior

da célula (afastada da membrana plasmática) induz a contracção. Outros processos relacionados com o Ca2+:

1. Nas células dos ilhéus de Langherans do pâncreas produz-se insulina. É um aumento do Ca2+ citosólico que desencadeia a exocitose de vesículas secretoras e a

libertação de insulina no sangue. 2. Em células do musculares e do fígado, é o Ca2+ que activa a degradação de

glicogénio para dar Glucose-1-P. Respostas celulares mediadas por Calmodulina (CaM):

Muitas vezes os efeitos celulares são precedidos por

aumento de IP3, estando relacionados com uma pequena proteína

citosólica, a calmodulina. Cada molécula de calmodulina liga 4 iões Ca2+, sofrendo

uma transformação conformacional que lhe permite, enquanto complexo (Ca2+ - calmodulina), activar e ligar muitas enzimas, como a cinase da cadeia leve da miosina, que controla a actividade

da miosina na contracção muscular. A ligação do Ca2+ à calmodulina é cooperativa, uma vez que um pequeno

aumento da concentração de Ca2+ citosólico aumenta muito o nível de calmodulina activa. Um exemplo bem conhecido da activação da Ca2+ - calmodulina é a

fosfodiesterase do AMPc (que degrada AMPc finalizando os seus efeitos). Também neste caso interagem dois segundos mensageiros, para concretizar aspectos de regulação celular. O complexo Ca2+ - calmodulina também activa várias proteínas cinases envolvidas

na fosforilação de factores de transcrição actuantes na regulação da expressão genética.

Activação da proteína cinase C por DAG e regulação de proteínas: O DAG (resultante do PIP2 ou outros Pis) mantém-se sempre ligado à membrana

plasmática e tem como função principal a activação da proteína cinase C (pertencente à

família das proteínas que actuam ligadas à membrana plasmática). A proteína cinase C citosólica, solúvel e mantém-se cataliticamente inactiva até que ocorra estimulação hormonal. Um aumento na [Ca2+] (no citosol) leva a proteína cinase C a

ligar-se à face citosólica da membrana plasmática, onde pode ser activada por DAG. Exemplos:

1. Nas células do fígado, a proteína cinase C participa n regulação do metabolismo do glicogénio. Inactiva a glicogénio sintetase por fosforilação.

2. A proteína cinase C também fosforila vários factores de transcrição que podem induzir ou reprimir a actividade de certos RNAm, dependendo do tipo de células.

98

Síntese de GMPc induzida por hormonas e óxido nítrico: O GMPc regula a actividade de certas proteína cinases

envolvidas na regulação de canais iónicos das células dos bastonetes dos olhos.

A síntese de GMPc é catalizada por dois tipos de guanilato

ciclases:

1. Uma forma solúvel citosólica; 2. Uma forma transmembranar (em receptores de superfície).

A ligação (do ligando) ao domínio extracelular

dos receptores, da forma transmembranar, promove a

actividade do domínio catalítico intracelular da guanilato ciclase, que leva à formação de GMPc.

As guanilato ciclases da forma solúvel são activadas

por NO (óxido nítrico). Estas ciclases são heterodímeros, ou

seja, são constituídas por duas subunidades diferentes, α e β,

ligadas por um grupo hemo (com ferro). O NO promove a alteração conformacional da enzima, activando-a por ligação ao grupo hemo. A guanilato ciclase converte GTP em GMP cíclico e

pirofosfato (PPI).

A síntese de NO faz-se a partir de O2 e arginina e a sua difusão é apenas local,

uma vez que, o seu tempo médio de vida é muito curto. O NO tem funções importantes, por exemplo, no controlo local da contractilidade do músculo liso arterial:

1. Ocorre libertação de acetilcolina pelos tecidos adjacentes; 2. Dá-se o influxo de Ca2+ para o interior das

células endoteliais; 3. A ligação de Ca2+ à calmodulina estimula a actividade da NO sintase;

4. Há produção de NO e citrulina; 5. Este vai actuar sobre a guanilato ciclase das células do músculo liso;

6. Levando à produção de GMPc; 7. O músculo relaxa, dilatando o vaso sanguíneo (artéria).

O NO também tem importância no controlo da comunicação em certas sinapses do

SNC.

99

Sinalização e cálcio em plantas: Os processos de sinalização em células vegetais também associam Ca2+ à acção

de todas as fitohormonas, à excepção do etileno. As células vegetais, tal como as animais, também mantêm a [Ca2+] numa gama

de valores muito baixa (raramente excedendo 1 μM). Exemplos de moléculas sinalizadoras dos vegetais com função de ligando

(fitohormonas): Auxinas, giberelinas, citocininas, etileno, ácido absicíco, poliamidas, jasmonatos, ácido salicílico, brassinosteroides.

1. Fitohormonas;

2. Ca2+ ATPase; 3. Canais de ou outros transportadores; 4. [Ca2+]i;

5. Outro segundo mensageiro (E. IP3); 6. Reservas intracelulares de Ca2+; 7. Proteínas ligadas a Ca2+;

8. Resposta celular específica. A abertura de canais de Ca2+ nas membranas que separam o citosol de

reservatórios externos e internos (de Ca2+) pode rapidamente aumentar a [Ca2+]i (interna).

Por outro lado bombas de Ca2+ na membrana plasmática e no sistema endomembranar mantêm o baixo nível de Ca2+ e podem rapidamente restabelecer a [Ca2+]i inicial a níveis basais a seguir a um aumento. O Ca2+ também actua através de proteínas reguladoras que

ligam Ca2+, como a calmodulina, sendo que estas respondem a alterações da [Ca2+]i, modulando as suas actividades.

Os canais de Ca2+ das plantas superiores são regulados pela voltagem, pelo

próprio Ca2+ e pela tensão.

Na membrana plasmática e no tonoplasto há canais de Ca2+ usados para elevar o

[Ca2+]i e o Ca2+ externo modula o interno.

Identificação e localização dos sistemas de transporte envolvidos na

homeostase do Ca2+ citosólico em vegetais:

Na membrana plasmática: H+ ATPase

(1); Ca2+ ATPase (troca Ca2+ por H+) (2); Canal de Ca2+ sensível a dihidropiridina (3); Outros tipos de canais permeáveis a Ca2+ (4). Na membrana vacuolar: H+ ATPase

(5); Trocador Ca2+/H+ (6); Canal de Ca2+

sensível a IP3 (7); Canal de Ca2+ sensível à voltagem (8). Transporte de Ca2+ em outras

membranas: Canal de Ca2+ na membrana envolvente dos cloroplastos (9); Ca2+/ATPase

do RE (10).

100

Resumindo: Há transportadores de Ca2+ dependentes de energia na membrana

plasmática, retículo endoplasmático e no tonoplasto essenciais na homeostase do Ca2+

baixando a [Ca2+]i. Estes transportadores são de dois tipos: - Bombas de Ca2+ que associam directamente a hidrólise de ATP ao transporte de

Ca2+, na membrana plasmática e no RE; - Antiportas H+/Ca2+ que exploram gradientes de H+ estabelecidos por H+ ATPases ou H+ PPases (pirofofatases) para associar o movimento energeticamente favorável de H+

ao movimento de Ca2+, na membrana plasmática e no tonoplasto. As H+ ATPases e as H+

/PPases são reguladas pela [Ca2+]i.

Tal como nas células animais, a actividade das bombas de Ca2+ da membrana

plasmática e do RE são reguladas por CaM. Como a activação de CaM depende deste ião, a

actividade das bombas de Ca2+ por CaM envolve um mecanismo de “feedback” para a regulação da [Ca2+]i.

A parede celular contém concentrações milimolares de Ca2+ e, dependendo do pH

e das propriedades de carga da parede, a concentração de Ca2+ no apoplasto das células

em crescimento estima-se que seja na ordem de 100 a 200 μM (1000x maior que no citosol – 100 nM). O vacúolo e o RE também contêm concentrações relativamente elevadas de Ca2+.

Considera-se que o vacúolo é o reservatório de Ca2+ mais importante na

homeostase da célula vegetal. Admite-se que o canal de Ca2+ associado a IP3 esteja no tonoplasto.

As reticuloplasminas são proteínas que ligam Ca2+ no lúmen do RE animal e

também em vegetais. Os cloroplastos e as mitocôndrias das plantas superiores também contêm muito

Ca2+ (mM). No invólucro dos cloroplastos há um canal de Ca2+ para repor o Ca2+ do cloroplasto. A luz actua nestes mecanismos. Em mitocôndrias, o transporte não está

esclarecido. Exemplo: Nos cloroplastos, a actividade da frutose 1,6 – bifosfatase (enzima da

glicolise) é regulada pela luz de um modo dependente do Ca2+. Nos cloroplastos também há CaM e enzimas reguladas por CaM.

O Ca2+, embora eficiente como molécula sinalizadora, não é adequado como

efector, por este facto associa-se a certas moléculas (efectoras), normalmente poteínas que, ligando Ca2+, alteram a sua conformação e ficam activas:

1. Calmodulina (CaM): Nas plantas, o complexo Ca2+ - Cam activa várias enzimas, incluindo a Ca2+ ATPase do RE e da membrana plasmática e um canal iónico no tonoplasto;

2. Proteínas cinases dependentes de Ca2+ (CDPKs): As CDPKs têm um domínio de cinase, outro semelhante a CaM e outro inibitório. A H+/ATPase da membrana plasmática (raiz/aveia) é fosforilada por CDPK;

3. Transportadores iónicos e elementos do citoesqueleto: O Ca2+, por acção directa, participa na abertura de canais de saída de K+, na membrana plasmática de células guarda (nos estomas).

101

Vias de sinalização reveladas em plantas: O IP3 actua também como segundo mensageiro, estando envolvido na regulação

da [Ca2+]i. Os vacúolos actuam como uma fonte de Ca2+ mobilizado por IP3. Em plantas, como nos animais, o pHi actua conjuntamente com a [Ca2+]i, ao nível

da regulação das células guarda dos estomas.

A auxina hiperpolariza a membrana plasmática. Identificou-se um canal de Ca2+

dependente da voltagem no tonoplasto de beterraba açucareira. Dentro das células estomáticas de guarda, a despolarização da membrana plasmática activa dois canais aniónicos accionados por voltagem depedentes de Ca2+.

Contracção Muscular: O movimento é uma propriedade intrínseca associada a todas as coisas vivas. No

interior das células, as moléculas estão sujeitas a movimentos coordenados e organizados

e as próprias células podem mover-se através de uma superfície. A nível de tecido, a contracção muscular permite aos organismos superiores

desenvolver e controlar funções internas cruciais, como a peristalse (movimentos peristálticos) no intestino e o bater do coração. A contracção muscular também permite ao organismo realizar movimentos organizados e sofisticados, como andar, correr, voar e

nadar.

O movimento do tecido muscular apresenta diversas semelhanças com o

movimento realizado pelos elementos dos cílios, dos flagelos e do citoesqueleto. A fonte de energia para o movimento muscular é o ATP. A ligação do ATP e subsequente hidrólise

controlam alterações conformacionais que resultam em deslizamento ou movimento de uma molécula em relação a outra.

Os músculos constituem cerca de 40% a 50% do peso do corpo e consomem

25% de O2 quando se encontram em repouso, sendo que aquando do exercício físico, a

taxa de consumo é 10 a 20 vezes superior. Podemos encontrar 4 tipos diferentes de músculos:

1. Esquelético – Mais complexo, possui fibras musculares (longas e

multinucleadas), reveste o osso de uma forma geral e apresenta uma certa estriação, pelo que se diz estriado; 2. Cardíaco – Estriado e multinucleado;

3. Liso – Sem estrias e multinucleado; 4. Células mioepiteliais – Miócitos e uninucleadas.

Os tempos de contracção e relaxamento dos diversos tipos de músculo variam:

102

- Músculo esquelético de contracção súbita (msec): Tempo de resposta rápido; - Músculo esquelético de contracção lenta: Tempo de resposta intermédio; - Músculo liso (alguns segundos): Tempo de resposta mais lento.

Contracção isotónica e isométrica:

Contracção isotónica: Tipo de contracção em que um músculo encurta, enquanto

exerce uma força constante, que corresponde à carga que está a elevar. Divide-se em

concêntrica e excêntrica:

- Na concêntrica, a contracção vence a resistência e há encurtamento muscular; - Na excêntrica, a resistência vence a contracção havendo alongamento muscular.

Exemplo: Pernas de rã fixadas numa extremidade e com um peso na outra. Contracção isométrica: Tipo de contracção em que o comprimento externo do

músculo não se altera, pois a força gerada pelo músculo é insuficiente para mover a carga à qual está fixado.

Exemplo: Fixação de ambas as extremidades das pernas de rã, desenvolvendo tensões.

No corpo, a maioria das contracções é uma combinação de ambas.

Propriedades fundamentais do músculo esquelético:

1. A força (tensão) que o músculo desenvolve é proporcional ao aumento do seu comprimento, até um determinado valor, decaindo para além desse valor. Este valor designa-se por comprimento óptimo (valor intermédio para o qual a força é máxima).

2. A velocidade de encurtamento diminui com o aumento da carga. A partir de um determinado limite (carga máxima) o músculo já não consegue contrair.

3. Quanto maior for a carga suportada pelo músculo durante a contracção, maior será o dispêndio energético. Como a energia provém do ATP, a maior carga corresponde

mais ATP consumido. Conclusão: O músculo é capaz de ajustar o dispêndio de energia ao trabalho

realizado. As três propriedades fundamentais do músculo esquelético podem explicar-se em

função dos mecanismos moleculares do processo de contracção.

103

Estrutura do músculo esquelético: O músculo esquelético constitui cerca de 40 a 45% do

peso corporal. Cada célula de músculo contém vários núcleos, resulta da fusão de mióblastos e é conhecida como fibra

muscular. Esta tem dimensões na ordem dos 10 a 100μm de diâmetro e pode atingir 10 a 20cm de comprimento, sendo por vezes igual ao comprimento do músculo.

As extremidades do músculo associam-se a tecido conjuntivo formando os tendões, que ligam os músculos aos

ossos. Existem ramificações de axónios que enervam cada uma das células musculares e que são responsáveis pela transmissão do impulso que estimulará a contracção muscular.

Ultraestrutura: Quando observamos o músculo esquelético estriado ao MO vemos estrias, estas

resultam da junção dos elementos contractivos, as miofibrilhas. As miofibrilhas são

elementos cilíndricos compridos e com 1 a 2μm de diâmetro, que se agrupam formando a célula muscular. Constituem 80% das fibras musculares sendo os restantes 20% constituídos por sistemas membranares, mitocôndrias, núcleos e afins.

As miofibrilhas são compostas por unidades repetitivas, os sarcómeros. Cada

sarcómero apresenta dois tipos de filamentos predominantes, que são agregados de moléculas:

1. Actina: Mais finos (1μm de compromento e 50Å de diâmetro); 2. Miosina: Mais grossos (1,5μm de comprimento e 150 Å de diâmetro).

Sistema Sarcotubular: A célula muscular possui um sistema de túbulos membranosos semelhante ao

retículo endoplasmático de outras células. Este sistema, no caso da célula muscular, pode dividir-se em sistema longitudinal – Retículo Sarcoplasmático e em sistema transversal –

Sistema T.

104

O retículo sarcoplasmático é formado por

uma rede de túbulos e cisternas no citoplasma da

célula muscular, que envolve as miofibrilhas. Já o sistema T representa invaginações da membrana externa da célula, na região da linha Z, na maior

parte das células, embora nas células de algumas espécies as invaginações ocorram na junção das bandas A e I.

O retículo sarcoplasmático de um dado sarcómero é contínuo entre duas linhas Z,

ocorrendo nas regiões das linhas Z de 2 túbulos membranosos, paralelos aos túbulos do sistema T resultantes do retículo sarcoplasmático do

sarcómero. Estes túbulos são designados por cisternas terminais. Entre as cisternas terminais dos vários sarcómeros surgem as invaginações da

membrana plasmática da célula, formando assim o sistema T. Este não tem continuidade morfológica com o retículo sarcoplasmático.

Estes três componentes associados (duas cisternas terminais e um sistema T) são

designados como uma tríade. Constituição dos sarcómeros:

Os filamentos de miosina existem exclusivamente na região do sarcómero

designada como banda A. Nesta região os filamentos de miosina estão orientados paralelamente aos filamentos de actina. Estes encontram-se ligados, nas extremidades do sarcómero, à estrutura designada como linha Z, que delimita o sarcómero.

Assim, o comprimento do sarcómero corresponde à distância entre duas linhas Z. Estas linhas têm uma estrutura mal definida e,

aparentemente, têm a função de servir como ponto de apoio onde se ligam os filamentos de actina. Além da banda A e da linha Z distinguem-

se, no sarcómero, as regiões designadas bandas I e zona H. As bandas I representam as regiões do

sarcómero onde não existem filamentos de miosina e, portanto, correspondem às regiões entre as extremidades da banda A e as linhas Z.

A zona H corresponde a uma região localizada no centro da banda A e que representa a região onde existem apenas filamentos de miosina, isto é, representa o

espaço entra as extremidades dos filamentos de actina. Em 1 o músculo está descontraído, em 2 está parcialmente contraído e em 3 o músculo encontra-se totalmente contraído.

Teoria da interpenetração dos filamentos:

A teoria do processo da contracção muscular que mais convincentemente explica

o seu mecanismo de acção designa-se pela teoria da interpenetração dos filamentos, tendo

sido originalmente desenvolvida por H. Huxley, A. F. Huxley e J. Hansen. Esta teoria

105

propõe que durante a contracção ocorre um encurtamento dos sarcómeros devido ao deslize dos filamentos de actina sobre os filamentos de miosina, com aproximação das linhas Z, mas nenhum dos filamentos encurta.

Quais as evidências estruturais que se observam?

O microscópio electrónico permite observar que a banda A não sofre alterações

no seu comprimento, uma vez que é constituída apenas por miosina e segundo a teoria, os

filamentos de miosina não sofrem alteração. Em contraste, as bandas I e H diminuem o seu comprimento quando o sarcómero se torna mais curto (durante a contracção).

Devemos considerar que a miofibrilha

é cilíndrica e, em secção transversal, observa-se

que cada filamento de miosina está rodeado por seis filamentos de F – actina, constituída por

subunidades globulares de G – actina (esta agregação ocorre na presença de ATP e Mg2+, em meio de KCl 0,1M). Cada molécula de G –

actina liga uma molécula de ATP, que passa a ADP durante a polimerização (formação do filamento).

Os filamentos de actina organizam-se à volta do filamento de miosina de modo a formar um hexágono. Os filamentos de miosina estabelecem conexões com cada um dos

seis filamentos de actina que o rodeiam. Estas conexões são responsáveis pelo desenvolvimento da contracção e

designam-se por pontes transversais. São parte dos filamentos da miosina, que durante a contracção se ligam aos filamentos de actina.

Miosina: Molécula solúvel em concentrações superiores a 0,3M KCl, precipitando em

soluções mais diluídas. No processo de contracção, as duas cadeias entrelaçadas da miosina são muito

importantes, uma vez que a cadeia leve (LMM) apresenta propriedades de solubilidade e a

cadeia pesada (HMM) lhe atribui as propriedades enzimáticas de ATPase. Em concentrações inferiores a 0,3mM de KCl:

Miosina + Actina = Actomiosina Esta associação é fundamental para o processo de contracção muscular. São os

subfragmentos S1 da miosina (cabeças) que interagem com a actina, sendo que esta ligação activa a ATPase da miosina.

106

A actomiosina é activada por concentrações fisiológicas de Mg2+ (5 a 10mM) se

houver algum Ca2+ no meio (10-6). A redução deste último ião para 10-8 inibe a actividade enzimática da actomiosina. A miosina hidrolisa ATP ADP + Pi quando activada por Ca2+.

A célula muscular possui uma estrutura membranar que a envolve por completo.

Esta é conhecida por sarcolema e está associada a fibras de colagénio, sendo mais complexa que a própria membrana plasmática. Além da miosina (43%) e da actina (22%), que são as proteínas contrácteis,

duas proteínas reguladoras têm um papel muito evidente, ligadas a filamentos finos de

actina, são a tropomiosina (molécula com duas cadeias em hélice α, peso molecular 74 kD

e cadeia com 284 aminoácidos. 5%) e a troponina (5%). Mas há outras proteínas (25%) que desempenham papéis importantes na

manutenção da estrutura molecular contráctil e no processo de contracção muscular. De acordo com a proteína contráctil associada, as proteínas reguladoras classificam-

se em: - Proteínas associadas à miosina;

- Proteínas associadas à actina. Modelo do mecanismo de regulação da contracção:

Este modelo sugere que a troponina e a tropomiosina actuam como repressores, inibindo a interacção entre a miosina

e a actina. A troponina transmite à tropomiosina o seu efeito inibidor, sendo depois transmitido a várias moléculas de actina no filamento de F – actina, evitando que esta reaja com a

miosina. Assim a ATPase característica do complexo actomiosina é inibida. É a presença de

troponina que inibe a formação do complexo actomiosina, no entanto, a interacção do Ca2+ com a troponina anula a acção repressora das proteínas reguladoras, ocorrendo contracção.

As proteínas reguladoras, troponina e tropomiosina, são

uma espécie “travão” do processo contractivo. O Ca2+ remove a

acção “travão” das proteínas reguladoras e a contracção ocorre. Portanto, a adição e a remoção de Ca2+ induz o ciclo contracção-

relaxamento. O Ca2+, ao reagir com a troponina, altera a sua conformação estrutural desencadeando um sinal que, através da tropomiosina, vai

ser transmitido ao filamento de actina. Assim este pode reagir com o filamento de miosina.

Ciclo da formação das pontes transversais durante o deslize dos filamentos de

actina e miosina:

O deslizamento dos filamentos de actina e miosina que leva ao encurtamento do

sarcómero, deve-se à actividade das pontes transversais que, ciclicamente, reagem com o filamento fino.

107

O ciclo da contracção baseia-se na existência de duas configurações para as

pontes transversais (configuração M1 e M2). A ponte transversal “relaxada" (M1) tem ADP

e Pi (produtos da hidrolise, na cabeça da miosina) ligados (1), e ao combinar-se com um dos monómeros de actina do filamento, vai formar um complexo mecanicamente instável (2).

Este rapidamente se transforma num complexo estável, por libertação do Pi, ao

mesmo tempo que faz deslizar o filamento (3), passando a configuração da ponte transversal para M2 (não relaxada). Este complexo não tem afinidade por ADP, o qual é libertado e substituído por ATP

(4), que causa o relaxamento do músculo, isto é, a separação da actina e da miosina (5). O ATP é subsequentemente hidrolisado, na presença de Ca2+ e, portanto, ocorre a

passagem de M2 para M1, podendo iniciar-se um novo ciclo (6).

Relação entre o comprimento do sarcómero e a tensão desenvolvida no

músculo:

Os músculos têm um comprimento óptimo

para a contracção. Isto é, a tensão máxima que um

músculo é capaz de desenvolver depende do comprimento a que o músculo é estimulado. Há um comprimento óptimo do músculo, acima ou abaixo do

qual a tensão desenvolvida decresce. Considerando com as três propriedades fundamentais do músculo:

1. Quando os filamentos de miosina e actina se sobrepõem de modo a estabelecer o maior número de pontes transversais, estabelece-se tensão máxima, concordante com o mecanismo molecular analisado;

2. Se a carga que o músculo tem de levantar for grande, a velocidade de contracção é baixa. Isso explica-se considerando que, se a carga aumentar, o músculo precisa de desenvolver maior tensão, exigindo a ligação de mais pontes transversais. Quanto mais

pontes se ligarem, mais lento será o encurtamento do músculo, se atendermos a que as ligações precisam de tempo para se estabelecerem;

108

3. A energia utilizada pelo músculo é tanto maior quanto maior for a carga que o músculo suporta. Se considerarmos que é a formação de ligações entre miosina e actina que cataliza a reacção de hidrólise de ATP:

Miosina + Actina Actomiosina

ATP ADP + P + Energia (por acção da actomiosina)

Visto que o número de pontes transversais formadas é determinado pela carga, a quantidade de ATP consumida para libertar energia é também determinada pela carga.

Distribuição do Ca2+ no tecido muscular: 1. Proteínas contrácteis 56%; 2. Tecido conjuntivo 4%;

3. Retículo sarcoplasmático e outros sistemas de membranas 40%;

4. Ca2+ livre no citoplasma 10-8M.

Grande parte do Ca2+ encontra-se ligada irreversivelmente às proteínas

contrácteis. Trocas do Ca2+ intracelular ocorrem predominantemente entre o retículo sarcoplasmático e o mioplasma.

Da estimulação à contracção:

Quando a célula muscular é estimulada gera-se na superfície um potencial de acção. O sinal eléctrico

resultante do potencial de acção transmite-se, ao longo de túbulos

transversais contíguos com a membrana plasmática, para o interior da célula muscular. Este sinal eléctrico induz a

libertação de cálcio do retículo sarcoplasmático, cujas cisternas terminais (carregadas de cálcio) se

encontram localizadas adjacentemente nos túbulos transversais. O Ca2+ libertado liga-se à

troponina (troponica C), permitindo a interacção entre os filamentos de miosina e actina, isto é, a contracção (o

sistema é activado por 1 μM de Ca2+). A libertação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático é o sinal que a proteína

reguladora troponin recebe, alterando a sua conformação e transmitindo a “mensagem” à tropomiosina. Esta desloca-se ligeiramente na superfície do filamento de actina, de modo a

permitir que este reaja com as pontes transversais do filamento de miosina. Esta sequência de acontecimentos é reversível, de modo que, quando o cálcio é recapturado pelo retículo sarcoplasmático, o sistema troponina/tropomiosina desloca-se e desfaz-se a ligação de

actomiosina, ficando a célula relaxada.

ACh ACh ACh

Fendasináptica

Propagação dopot. acção ao longodo sarcolema e dostúbulos T

Túbulo T Sarcolema

RS

Pot. de acçãoestimula a lib.de Ca2+ do RS

Iões de Ca2+ ligam-se àtroponina removendo obloqueio dos locais deligação de miosina

Ciclo contractivo

Transporte activo de Ca2+

para o RS após o fim dopot. acção

Tropomiosina volta a bloquearos locais de ligação damiosina nas fibrasde actina.

109

Funções do ATP no processo de contracção muscular: 1. Fornece energia ao processo para causar o deslizamento dos filamentos;

2. É necessário para a acumulação de Ca2+ no RS, sendo transportado do citoplasma da célula muscular para os túbulos do RS, por uma Ca2+ ATPase;

3. É necessário para o relaxamento do sistema muscular. Quando não há ATP no meio, os filamentos de actina e miosina “congelam”

formando uma estrutura rígida que não contrai nem relaxa. É o rigor mortis que se observa nos músculos dos animais pouco depois da sua morte, depois da exaustão de todo o ATP

celular. A concentração normal de ATP na célula é apenas de 5mM, por isso a célula vai

ressintetisando ATP à medida que se consome.

As duas principais fontes de ATP na célula são: 1. Creatina fosfato (20mM): CP + ADP ATP + C (acção da creatina fosfocinase);

2. Glicólise e fosforilação oxidativa. A creatina é um composto natural que se encontra no músculo humano, quer na

forma livre, quer na combinada com um fosfato (a fosfocreatina). A CP é a principal fonte de energia imediata para a resíntese de ATP.

Após um período relativamente longo de actividade muscular, ocorrem as

seguintes alterações: 1. A concentração de CP é baixa, pois consumiu-se para ressintetizar ATP, não

tendo sido regenerada; 2. A concentração de glicogénio é baixa devido ao alto consumo de glicose na glicólise;

3. A concentração de ácido láctico aumenta, pois ele é um produto da glicólise que leva algum tempo a ser metabolizado. A eficiência da conversão da energia química em trabalho pelo músculo é de

40%, mas se entrarmos com a eficiência da conversão do glicogénio em ATP, a eficiência

passa para 20%. Concluímos assim que 80% da energia se converte em calor.

FIM!!