KROMATOGRAFI KERTAS

&

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

METODE PEMISAHAN BAHAN ALAM

R. Herni Kusriani,M.Si.,Apt.

PENDAHULUAN

Kromatografi adalah suatu cara pemisahandimana komponen-komponen yang akandipisahkan didistribusikan antara 2 fase, salahsatunya yang merupakan fase stasioner (diam),dan yang lainnya berupa fasa mobil (fasa gerak).

Fase gerak dialirkan menembus atau sepanjang fasestasioner.Fase diam cenderung menahan komponen campuran,sedangkan fasa gerak cenderung menghanyutkannya.

KROMATOGRAFI PLANAR

Kromatografi datar Kromatografi kolom

Sistem : Sistem terbuka interaksi antara fase diam, fase gerak dan solut berada pada sistem terbuka, ada kontak dengan udara

Sistem : Sistem tertutupinteraksi antara fase diam, fase gerak dan solut berada pada sistem tertutup, tidak terjadi kontak dengan udara (minimal)

Arah : sebagian besar merupakan ascending (menaik), melawan gravitasi

Arah : Searah dengan gravitasi

KROMATOGRAFI KERTAS

Kromatografi kertas merupakan kromatograficairan - cairan dimana sebagai fasa diamadalah lapisan tipis air yang diserap darilembab udara oleh kertas.

Partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang

saling tidak bercampur.

Partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air danfasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.

Prinsip dasar kromatografi kertas

Kertas dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakanpolimer dari gula sederhana, yaitu glukosa.

Teknik KKt :cuplikan yang mengandung campuran yang akandipisahkan diteteskan / diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana iaakan meluas membentuk noda yang bulat. Bila nodatelah kering kertas dimasukkan dalam bejana tertutupyang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesancuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai nodatercelup karena berarti senyawa yang akan dipisahkanakan terlarut dari kertas).

Metoda identifikasi yang paling mudah adalahberdasarkan pada kedudukan dari noda relatifterhadap permukaan pelarut, menggunakanharga Rf.

Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasisuatu senyawa pada kromatogram dan padakondisi konstan merupakan besaran karakteristikdan reprodusibel.

Harga Rf didefinisikan sebagai perbandinganantara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepimuka pelarut dari titik awal.Rf = Jarak titik tengah noda dari titik awal

Jarak tepi muka pelarut dari titik awal

1) Pelarutkoefisien partisi menyebabkanperubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan harga Rf.

2) Suhuperubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.

3) Ukuran dari bejanavolume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen - komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf.

4) Kertas,Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi.

5) Sifat dari campuranberbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf mereka.

Faktor yang menentukan harga Rf

Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda analisis asamamino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomenakapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketika pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan.

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkantahun 1938 oleh Ismailoff dan Schraiber.

Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fase diam.

Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diamdan terbentuklah kromatogram.

Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahantinggi dan mudah untuk memperoleh kembalisenyawa-senyawa yang terpisahkan.

Didasarkan atas partisi dan adsorpsi. Zat penjerap merupakan fase stasioner, berupa bubuk halus dibuat serba rata dan tipis diatas lempeng kaca. Fase diam yang umum digunakan adalah silika gel

Prinsip KLT

Cara kerja KLT :

Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahanfisikokimia.

Lapisan yang memisahkan, yang terdiri atasbahan berbutir butir (fase diam), ditempatkan padapenyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan yang cocok.

Campuran yang akan dipisah berupa larutan , ditotolkan berupa berupa bercak atau pita (awal).

Setelah plat itu ditaruh didalam bejana tertutup rapatyang berisi larutan pengembang yang cocok.

Gelas kimia atau chamber wadah pengembang ditutup supaya terjenuhkan olehuap dari pelarut.

Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelaskimia biasanya ditempatkan kertas saring yang terbasahi oleh pelarut.

Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uapmencegah penguapan pelarut.

Proses Penjenuhan

Sifat penjerap dan sistem larutan pengembang harus dipilih dengan tepat karena keduanya bekerjasama untuk mencapai pemisahan.Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf.

Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanyadapat ditentukan dua desimal. hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berjangka 0 100.

Jika angka hRf lebih tinggi dari hRf yang dinyatakan, kepolaran pelarut harus dikurangi, jika hRf lebih rendahmaka komponen polar pelarut harus dinaikkan.

Bahan adsorben sebagai fasa diam : silica gel, alumina, dan serbuk selulosa.

Partikel silica gel mengandunggugus hidroksil di permukaannyayang akan membentuk ikatanhidrogen dengan molekul -molekulpolar.Alumina lebih disukai untukmemisahkan senyawa -senyawapolar lemahMagnesium silikat, kalsium silikat, dan arang aktif mungkin juga dapatdigunakan sebagai adsorben.

Fase Diam KLT

Kebanyakan penjerap yang digunakan adalahsilika gel.

Silika gel yang digunakan kebanyakan diberipengikat yang dimaksudkan untuk memberikekuatan pada lapisan dan menambah adhesipada gelas penyokong. Pengikat yang digunakan kebanyakan kalsium sulfat.

Tetapi biasanya dalam perdagangan silika gel telah diberi pengikat. Jadi tidak perlumencampur sendiri dan diberi nama dengankode silika gel G.

Proses AdsorpsiPeranan penting : adsorpsi - desorpsi

Fase gerak dan molekul solut berkompetisi untuk sisi aktif adsorben.

Adsorpsi nisbi fase gerak naik, adsorpsi solut harus turun.

Penyebab adsorbsi : dipole-dipole antara adsorben polar

dan solut polar ikatan hidrogen, misal. SiOH....O(CH3)2

(atom basa, O, N, S, dll) daya terpolarkan : antara adsorben

polar dengan senyawa terpolarkan (senyawa aromatik, dll)

Eluen pengembang dapat berupa pelaruttunggal dan campuran pelarut dengansusunan tertentu.

Pelarut-pelarut pengembang harusmempunyai kemurnian yang tinggi.

Terdapatnya sejumlah kecil air atau zatpengotor lainnya dapat menghasilkankromatogram yang tidak diharapkan.

Fase Gerak

Pemilihan Pelarut

Sifat pelarut :

Sifat khas pemisahan

Polaritas campuran pelarut bukan fungsi linier tapi logaritmik

Pelarut A dicampur dengan pelarut B

Pencampuran

Polaritas pelarut masing-masing hendaknya tidak jauh

Pemilihan Pelarut

Syarat utama fase gerak

kekuatan dan polarita pelarut cukup tepat

rendah

kecocokan dengan detektor

stabilitas dan kecocokan pelarut dengan solut

mudah menguap

Isokratik : suatu pelarut atau campuran pelarut yang komposisi dan polaritasnya tidak berubah selama proses berlangsung

Elusi gradien/ bertahap : selama pengerjaan komposisi fase gerak diubah, pada umumnya perubahan menuju ke polarita menaik, sehingga mempercepat elusi komponen yang ditahan dengan kuat (perubahan polarita, kekuatan ion, pH)

Sistem Pengembang

Antaraksi adsorben & solut

Adsorben yang paling banyak digunakan silika, kemudian alumina, adsorben lainnya kurang.

Elusi campuran senyawa, paling dulu keluar senyawa paling nonpolar, mis. benzenasetofenonbenzil alkohol (berdasarkan urutan polaritas menaik)

(cat : asetofenon memiliki BM>> namun pemberi kepolaran sehingga lebih polar dari benzen)

Antaraksi adsorben & solut

Polaritas solut naik tambatan naik. Urutan polaritas naik (tambatan naik) :

RH

Antaraksi adsorben & solut

Senyawa yang punya gugus dalam posisi orto paling kurang ditambat, tambatan naik pada meta, kemudian para. Misalnya :

Pereaksi penampakPereaksi penampak adalah larutan pereaksi yang digunakan untuk menyemprot lempeng KLT agar bercak yang terjadi dapat jelas terlihat.

a) Anisaldehid-asam sulfat PUntuk mengamati minyak atsiri, saponin, zat pedas dan lain-lain.

b) DragendroofUntuk mengamati alkaloid.

c) Antimon (III) kloridaUntuk mengamati glikosida jantung, saponin.

d) Besi (III) kloridaMendeteksi senyawa golongan Fenolat

e) Alumunium KloridaMendeteksi senyawa golongan Flavonoiddll

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam KLT :a) Lempeng yang akan digunakan harus diaktifkan terlebih

dahulu agar pada proses elusi lempeng silica gel dapat menyerap dan berikatan dengan sampel. Pengaktifan lempeng dilakukan dalam oven pada suhu 1100C selama 30 menit.

b) Chamber harus dijenuhkan untuk menghilangkan uap air atau gas lain yang mengisi fase penjerap yang akan menghalangi laju eluen.

c) Pada saat penotolan, hendaknya sampel jangan terlalu pekat sebab pemisahannya akan sulit sehingga didapat noda berekor.

d) Penotolan harus tepat sehingga didapatkan jumlah noda yang baik.

e) Eluen yang digunakan harus murni sehingga tidak menghasilkan noda lain.

Noda pada KLT

Mekanisme panampakan noda pada UV yaitusuatu molekul yang mengabsorbsi cahayaultraviolet akan mencapai suatu keadaantereksitasi dan kemudian memancarkancahaya ultraviolet atau cahaya tampak padawaktu kembali ke tingkat dasar (emisi), emisiinilah yang digambarkan sebagai fluoresensi.

Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor disebabkan karena :

Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak tepat

Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa

Lempeng yang tidak rata

Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis yaitu : lebih cepat dan lebih reproducible dari kromatografi

kertas, untuk menyempurnakan pemisahan, area dari bercak lebih kompak dan jenis spray-reagents

lebih banyak termasuk yang bersifat korosif dapat digunakan bila adsorben bukan selulosa.

Manfaat Kromatografi Lapis Tipis Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa obat. Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman. Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat. Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif campuran senyawa obat.