KÖRNYEZETVÉDELMI KÖRNYEZETVÉDELMI BIOTECHNOLÓGIABIOTECHNOLÓGIA

BIODEGRADÁCIÓ, BIOREMEDIÁCIÓ

A környezet alkotó elemei egymással szoros összefüggésben léteznek,az egyes elemekreható ártalmak a környezet egészére kihatnak. Ha a fennálló egyensúlyt megbontjuk,beláthatalan környezetvédelmi problémákkal találhatjuk szembe magunkat.

Fejlődő ipar felhalmozódó hulladék

veszélyes anyagok

  A Föld mikroflórájának válasza az újonnan megjelenő anyagokra adaptáció

Alapfogalmak

biotechnológia

“biotechnologie - (EREKY Károly, 1917) all work by which products are produced from raw materials with the help of living organisms” [Ereky]

alkalmazott mikrobiológia

- biokonverzió, biotranszformációkülönböző (toxikus) vegyületek mikrobiális

átalakítása

- biodegradáció nem kívánatos, környezetre káros anyagok

lebontása mikrobiális úton

- bioremediáció (= tisztítás) a környezet megtisztítása a toxikus hulladékoktól

mikrobiális módszerekkel

környezetvédelem

- megelőzés- tervszerű környezetfejlesztés- környezetünk megóvása, védelme

A biotechnológiai eljárások szempontjából legfontosabb enzimek

• oxidázok, hidroxilázok, dehydrogenázok • reduktázok, hydrogenázok• hidrolázok• izomerázok• proteázok, lipázok

A biotechnológiában fontos mikroorganizmus csoportok

• Metanogének• Metilotrófok• Clostridiumok• Tejsav baktériumok• Bacillusok• Pseudomonasok• Fotoszintetizáló baktériumok, algák• Streptomycesek• Élesztők• Fonalas gombák

Metanogének:• archea• obligát vagy strict anaerobok• biogáz

Metilotrófok:• aerobok• C1-C3 szénforrások hasznosítása• pl. Metanotrófok metán oxidáció

Clostridiumok:• obligát anaerobok• Gram pozitívok• hőstabil endospóra• rendkívül sokféle reakcióra képesek

Tejsav baktériumok:• anaerobok• Gram pozitívok• élelemiszeripar

Bacillusok:• aerobok• endospóra• extracelluláris enzimek

Pseudomonasok:• aerob• heterotróf, Gram negatívok• exopoliszaharidok• biodegradáció

Fotoszint. baktériumok, algák:• aerob vagy anaerob• biopolimerek• Fotoszintézis, CO2 fixálás

Streptomycesek:• aerob, spórázó szervezetek• antibiotikum termelők• extracelluláris enzimek

Élesztők:• alkoholgyártás• pékélesztő

Fonalas gombák:• heterotróf eukaryota• szaprofita vagy parazita• jellegzetes sejtfal• spóraképzők• antibiotikumok• biokonverzió

XENOS = IDEGEN SZINTETIKUS = NEM TERMÉSZETES

EREDETŰ

Példák: peszticidek, herbicidek, oldószerek, egyes szerves vegyületek

Lebontásukra megoldás: - fizikai - kémiai módszerek

- biológiai

Az 1960-as évek elején felfedezték, hogy számos talajlakó mikroorganizmus képes a xenobiotikumok bontásáraEgyféle szennyezés ritkán fordul elő, ált. vegyes hulladék

sokféle enzim, mikroorg. szükséges

Legproblémásabb vegyületek az aromás, valamint halogén elem tartalmú vegyületek

Szerves oldószer hatása az organizmusra

egyik fő támadáspont a membrán

ahogy az oldószer akkumulálódik a membránban sérülnek annak funkciói:

1, aspecifikus permeabilizáció

E. coli : fenol jelenlétében ATP és K+ szabadul ki a sejtekből

toluol hatására RNS, foszfolipid és fehérje szivárgás

2, H+ és más ionok passzív áramlása membránon keresztül

sérül az ATP szintézis

3, membránban lévő fehérjék funkciója is sérül

4, megváltozik, nő a membrán fluiditása változik a membrán struktúrája, stabilitása és

membránon belüli kölcsönhatások

membránfelszín hidrációs tulajdonságai változnak

membrán vastagság változik

membrán felszín növekedés

védekezési mechanizmusok törzsről törzsre változnak

I. Citoplazma és külső membrán adaptáció: mind lipid mind fehérje szinten

cél: szolvens által megzavart membrán fluiditásának, stabilitásának újrateremtése

I/1. zsírsav összetétel

- megváltozik telített és telítetlen zsírsavak aránya

alkohol és aceton növelitelítetlen zsírsavak arányát a membránban

apoláris oldószerek pl. benzol csökkenti

szaturáció változás fluiditás változás szolvens hatását kompenzálja

"homoviszkózus adaptáció"

- membránban telítetlen zsírsavak cis trans izomerizációja

emeli a membrán rendezettségét és csökkenti a fluiditást

Adaptációs mechanizmusok

I/2. változik lipidek fejcsoportjainak összetétele

P. putida: difoszfatidil-glicerol (kardiolipin) aránya nő

P. putida Idaho: foszfatidiletanolamin nő

I/3. foszfolipid szintézis fokozódik

I/4. változik fehérje összetétel

I/5. lipopoliszacharid összetétel változás külső membránban

magának lipopoliszacharidoknak és lipoproteineknek is nő a mennyisége

LPS hidrofóbicitás csökkentő hatása van

I/6. külső membrán porinjai

P. putida OmpL mutáns: hiperszenzitív szolvensekre

P. aeruginosa OmpF hiány növeli a toleranciát

I/7. zsíroldékony vegyületek

Zymomonas mobilis: etanol jelenlétében hopanoidok mennyisége nő

Staphylococcus aureus: olajsav jelenlétében karotenoid szintézis nő

II. sejtfelszín hidrofóbicitás

csökkenése növeli a szolvens toleranciát

P. putida toluol adaptáció után sejtek felszíne kevésbé hidrofób (sok fehérje és LPS) III. ionok stabilizáló szerepe

Mg2+, Ca2+ stabilizálják Gr(-)-ok külső membránját pl.: Pseudomonas sp. - toluol

IV. Szerves oldószerek degradációja vagy kevésbé toxikus formává való transzformációja

V. Aktív exkréció a sejtből

bioremediáció

új, szerves oldószerekben stabil proteázok, lipázok egyéb enzimek

Biotechnológiai potenciál

A biodegradációs eljárásokban legismertebb,leggyakrabban előforduló mikroorganizmusok

PseudomonasokSphingomonasokRhodococcusok

BacillusokSugárgombák

A (szubsztituált) aromás szerves oldószerek lebontásáraaz oxigenáz, dehalogenáz enzimek alkalmasak

LEBONTÁSI ÚTVONAL LEHET AEROB, ANAEROB

aerob: mono- és dioxigenázok

anaerob: reduktív dehalogenáció, oxidált vegyületek: szulfát, nitrát

Aerob vs. anaerob metabolizmus

Aanerob metabolizmus benzoil-CoA-n keresztül

Benzoil-CoA konverziója acetil-CoA-vá

Monooxigenázok (hidroxilázok)

Monooxigenázok:

az O2 molekula egyik atomját építik be a célmolekulába

SH2 + O2 = SO + H2O (internal monooxigenáz, a szubsztrátról jön az elektron)

S + O2 + H2X = SO(H) + OH-_ + X (external monooxigenáz)

Példák:

- p-hydroxybenzoát hydroxiláz család

- phenol 2-hidroxiláz

- alkil csoport hidroxiláz (metán monooxigenáz)

- kámfor 5 monooxigenáz (Citokróm P-450 család)

Dioxigenázok, hidroxilázok

Y

X4-X-dihidroxihexadién

O2

NADH+H NAD+

H

OH

O

X

+

Sztereospecifikus hidroxilálás

enzimatikus szintézisek

hidroxiláz4-X-katekolát

H

OH

O

X

Aromás gyűrű hidroxilázok

Aromás gyűrűt hasító dioxigenázok

R

OH

OH

+ O2

COOHCOOH

R

intradiol cleaving/ 3,4-dioxygenases

CHO

R

OH

COOH proximal-extradiol cleaving/ 2,3-dioxygenases

COOHCHO

OH

R

distal-extradiol cleaving/ 4,5-dioxygenases

Mono- és dioxigenáz családok I.

Mono- és dioxigenáz családok II.

Mono- és dioxigenáz családok III.

METANOTRÓFOK: MMO=metán monooxigenáz

CH4

NADH+H+

O2

H2O

NAD+

O2

H2O

Xox

Xred

sMMOpMMO

CH3OH

Két fajta enzim: membrán kötött (pMMO, Cu+), citoplazmatikus szolubilis (sMMO, Cu-)

A metán oxidációja mellett NADH oxidáció (regenerálni kell)

sMMO: széles szubsztráspecificitás több száz szerves vegyület oxidációja

bioremediációtovábbi alkalmazás: metanolgyártás

Dioxigenázok, hidroxilázok

Y

X4-X-dihidroxihexadién

O2

NADH+H NAD+

H

OH

O

X

+

Sztereospecifikus hidroxilálás

enzimatikus szintézisek

hidroxiláz4-X-katekolát

H

OH

O

X

Aromás gyűrű hidroxilázok

Aromás gyűrűt hasító dioxigenázok

R

OH

OH

+ O2

COOHCOOH

R

intradiol cleaving/ 3,4-dioxygenases

CHO

R

OH

COOH proximal-extradiol cleaving/ 2,3-dioxygenases

COOHCHO

OH

R

distal-extradiol cleaving/ 4,5-dioxygenases

Aromás gyűrűt oxidáló hydroxilázok

Hydroxilázok szerepe a bioorganikus kémiában

Sphingomonas yanoikuyae

biphenil dioxigenáz

sztereoszelektív szintézisek

például még a morfin,

vagy a vanília szintézisében is

Hidroxilázok szerepe a biodegradációban

Hidroxilázok szerepe a klórozott vegyületek biodegradációjában

Az aromás diolok eddig ismert lebontási útvonalai

intradiol

extradiol

A gyűrűhasítás mechanizmusa

Szubsztituált (klórozott) szénhidrogénekre módosított ortho

útvonal

Szubsztrátspecificitás

Nem adaptált sejtek (periférikus útvonal)

Adaptált sejtek (periférikus útvonal)

Szubsztrátspecificitás II.

Centrális útvonal, specializálódott sejtek

ezt az adott útvonal minden enzimjére meg kellene vizsgálni

az útvonal mentén a specificitás változik

az enzimek specfificitását bővíteni kell

Szubsztrátspecificitás bővítése

a sejtek adaptációja, hosszú idő (6 – 8 hónap)

irányított evolúció

az útvonalak kombinálása egyesével, vagy...

Plasmid Size (kb) Conjugative Incompatibility group Substrate Host Reference

Peripheral pathways

  TOL 117 + P-9 Xylenes, toluene, toluate Pseudomonas putida

9

9, 100 100, 101 101, 102 102, 172 172

  NAH7 83 + P-9 Naphthalene via salicylate Pseudomonas putida

9

9, 37 37, 101 101, 139 139, 180 180, 181 181

  pWW60-1 87 + P-9 Naphthalene via salicylate Pseudomonas sp.

17

17

  pDTG1 83 + P-9 Naphthalene via salicylate Pseudomonas putida

145

145

  SAL1 85 + P-9 Salicylate Pseudomonas putida

9

9, 22 22, 101 101, 180 180, 181 181

  pKF1 82    ND Biphenyl via benzoate Acinetobacter sp. (reclassified

5

5, 53 53

  as Rhodococcus globerulus)

  pWW100   200    ND Biphenyl via benzoate Pseudomonas sp.

105

105

  methylbiphenyls via toluates

  pWW110 >200 ND ND Biphenyl via benzoate Pseudomonas sp.

18

18

  methylbiphenyls via toluates

  pCITI 100 ND ND Aniline Pseudomonas sp.

2

2

  pEB 253 ND ND Ethylbenzene Pseudomonas fluorescens

12

12

  pRE4 105 ND ND Isopropylbenzene Pseudomonas putida

38

38, 39 39

  pWW174 200 + ND Benzene Acinetobacter calcoaceticus

175

175

  pHMT112 112 ND ND Benzene Pseudomonas putida

157

157

  pEST1005 44 ND ND Phenol Pseudomonas putida

94

94

  pVI150 mega + P-2 Phenol, cresols, Pseudomonas sp.

8

8, 146 146

  3,4-Dimethylphenol

Central pathways

  pAC25 117 + P-9 3-Chlorobenzoate Pseudomonas putida

26

26

  pJP4 77 + P-1 3-Chlorobenzoate, 2,4-D Ralstonia eutropha (formerly

33

33

Alcaligenes eutrophus)

  pBR60 85 + ND 3-Chlorobenzoate Alcaligenes sp.

179

179

  pRC10 45 ND ND 2,4-D Flavobacterium sp.

28

28

  pP51 100    ND 1,2,4-Trichlorobenzene Pseudomonas sp.

165

165

  pMAB1 90 ND ND 2,4-D Burkholderia (formerly

14

14

   Pseudomonas cepacia

   aND, not determined; 2,4-D, 2,4-dichlorophenoxyacetate.

A gének sokszor (mega)plazmidon vannak

Operon struktúrák

bifenil bontás

benzoesav bontás

módosított orto útvonal

Szabályozás

a transzkripciós faktor szubsztrátspecificitása

Metabolikus útvonalak kombinálása keresztezéssel

1. plazmid 2. plazmid 3. plazmid 4. plazmid

Plazmidrekombináció

konjug.

A törzs

Strain G

F törzsE törzs

D törzsC törzsB törzs

konjug.

konjugáció

Problémák azért még vannak