Kobe University Repository : KernelpAS2-1-Rorl及び、 pACT2-CKIε を酢酸リチウム法...
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Kobe University Repository : Kernel
タイトルTit le
CKIεによるCKIεによる受容体型チロシンキナーゼRor1の活性制御機構解析(Funct ional analysis of regulat ion of receptor tyrosine kinase Ror1by CKIε)
著者Author(s) 可児, 修一
掲載誌・巻号・ページCitat ion 神戸大学医学部紀要=Medical journal of Kobe University,64(3/4):29-35
刊行日Issue date 2004-03
資源タイプResource Type Departmental Bullet in Paper / 紀要論文
版区分Resource Version publisher
権利Rights
DOI
JaLCDOI
URL http://www.lib.kobe-u.ac.jp/handle_kernel/00422376
PDF issue: 2021-05-29
29
CKIε による受容体型チロシンキナーゼ Rorl
の活性制御機構解析
可 児修一
神戸大学大学院医学系研究科
ゲノム科学講座ゲノム制御学
連絡先:可児修一
神戸大学大学院医学系研究科
ゲノム科学講座ゲノム制御学
神戸市中央区楠町 7-5-1
電話:078-382-5561
ファックス:078-382-5579
(平成16年1月19日受付)
[要約]
Rorファミリー受容体型チロシンキナーゼ (RTKs)
はRor1及び, Ror2から構成されており,発生過程に
おける形態形成において重要な役割を担っている O こ
れまでの解析からRor2に関しては, Wnt5a受容体と
してnon-canonicalWnt5ajJNKシグナル伝達経路を
活性化すること, Dlxin-1との会合により転写制御に
関与すること,さらにカゼインキナーゼ 1e (CKI e)
によってチロシンキナーゼ活性が制御されることが知
られている O しかしながら, Ror1を介するシグナル
伝達機構についてはほとんど明らかにされていなかっ
た。本研究においては, Ror2の活性制御分子である
CKI eとRor1についての構造機能連関解析を行った。
動物培養細胞における発現実験からRor1がCKIε と
物理的に会合し, この会合はRor1のプロリンリッチ
領域,セリン・スレオニンリッチ領域を含むC末端領
域を必要とすることを見いだした。更に, CKIε のキ
ナーゼ活性依存的にRor1がセリン・スレオニンリン
酸化されることを明らかにした。しかし,セリン・ス
レオニンリン酸化をともなう Ror1のチロシン自己リ
ン酸化誘導は認められず, Ror1のチロシン自己リン
酸化及びチロシンキナーゼ活性化機構はRor2のそれ
とは異なった機構であることが示唆された。
[緒言]
多細胞生物の発生過程における細胞間相互作用には
様々な受容体型チロシンキナーゼが重要な役割を担っ
ている 1)0 Rorファミリー受容体型チロシンキナーゼ
はショウジョウパエからマウス ヒ卜に至るまで互い
に構造の類似した 2つのメンバ-Ror1, Ror2から構
成され,発生過程における特徴的な発現動態を示
す2寸)Ror1, Ror2ノックアウトマウス及びRor1j
Ror2ダブルノックアウトマウスの表現型解析から,
Ror1, Ror2ともに骨格系及び心臓・大血管系の形成
に関与すること, Ror2がRor1の機能を部分的に代償
し得ることが明らかになった。さらに組織学的解析に
より Ror1, Ror2は神経堤細胞及び間葉系細胞の増殖,
分化,移動に関与する重要な分子であることが報告さ
れている 1九また,生化学的解析からは, Ror2の細
胞外領域とWnt5aが特異的に会合すること, Ror2が
Wnt5aシグナルの下流にあるJNKの活性化を誘導す
ること,および:Ror2とWnt5aが,アフリカツメガエ
ル腔のconvergentextension movementを協調的に
抑制することから, Ror2がWnt5a受容体複合体の構
成要素として機能し, non-canonical Wntシグナル伝
達に関与するという興味深い知見が報告されている 11)。
これらの知見に加え, Ror2の細胞内領域と会合する分
子としてDlxin-1ω及びカゼインキナーゼ 1E (CKI E t) が同定されている。Dlxin-1は神経発生や骨形成シグ
ナルに関わるホメオドメイン蛋白質D1x5,Msx2ωに
会合し,これらの転写制御に関わるアダブタ一分子で
あり,またCKIE はWntシグナル伝達系の調節分子と
して報告されていた16-22)0 CKI Eに関しては, Ror2及
び、一連のRor2変異体を用いた生化学的解析から, Ro
キーワード:受容体型チロシンキナーゼ Ror1, Ror2, CKI E
(59 )
30
r2がCKIeによりセリン・スレオニンリン酸化される
とともに,チロシン自己リン酸化能が顕著に克進する
ことが明らかにされている。さらに,チロシン自己リ
ン酸化を受けた Ror2によりチロシンリン酸化される
蛋白質として, G蛋白質共役型受容体キナーゼ 2
(GRK2)が同定されている。このようにRor2に関し
ては,セリン・スレオニンキナーゼによる受容体型チ
ロシンキナーゼの活性化というユニークな機構が明ら
かになってきたがω,Ror1については発生過程の形
態形成において必須の分子であるにもかかわらず,そ
の活性制御機構及び~Ror1を介するシグナル伝達機構
については不明のままであった。本研究では, Ror1
を介するシグナル伝達機構及びチロシンキナーゼ活性
制御機構を解明することを目的とし, CKIε との構造
機能連関解析を行った。
[方法]
プラスミドの構築
CKIε 遺伝子はヒト胎盤cDNAより PCR法を用いて
増幅し, pBSベクターにクローニングしたl心。 Ror1遺
伝子はマウス 11.5日限のcDNAより PCR法を用いて
pBSベクターにクローニングした 6)。更にCKIε 及び
Ror1の各種変異体についてもPCR法により増幅し, p
cDNAベクターにクローニングした。また, DNA結
合領域を持ったpAS2-1ベクターにCKIe遺伝子を, G
AL4活性化領域を持ったpACT2にRor1遺伝子をクロー
ニングした。
yeast two-hybrid法
MA TCHMAKER system 2 (Clontech)を利用し,
pAS2-1-CKIε及び、pACT2-Ror1を用いて添付のマニュ
アルに基づ、き結合実験を行ったヘ
細胞,抗体及びDNA導入
HEK293T細胞は, 10% (v /v)ウシ胎児血清 (FBS,
Sigma)を含むDulbecco'smodified Eagle's medium
(DMEM, Nissui)を用いて培養した。酵母Y190株は,
添付のマニュアルに従って培養した。
抗FLAG抗体として,マウスモノクローナル抗体
M2 (Sigma)を用いた。抗CKle抗体としてはマウス
モノクローナル抗体 Casein kinase 1 e
(Transduction Laboratories)を用し、た。また,抗リ
ン酸化チロシン抗体としてマウスモノクローナル抗体
PY20 (Cell signaling), 4G10 (Upstate
biotechnology)を用いた。抗リン酸化セリン抗体と
してはラビットポリクローナル抗体Phospho-Serine
(60 )
Antibody (Zymed)を用いた。抗リン酸化スレオニン
抗体としてはラビットポリクローナル抗体Phospho-Thr
eonine Antibody (Cell signaling)を用いた。
HEK293T細胞への遺伝子導入は, リン酸カルシウ
ム法を用いた。
免疫プロット及び免疫沈降
遺伝子を導入したHEK293T細胞を抽出液 (50mM
Tris-HCl (pH7.4), 0.5% (v /v) NP-40, 150mM NaCl,
5mM EDTA, 50mM NaF, 1mM Na3 V04, 1mM
PMSF, 10μg/m1ロイペフチン, 10μg/m1アプロ
チニン)を用いて可溶化し,プロテインAセフアロー
スビーズに抗FLAG抗体を結合させたものと反応後
(40
C, 2時間),抽出液で 5回洗浄しLaemmliサンプ
ルバッファーにより溶出した。
各試料はSDS-PAGE(9% PAG)によりタンパク質
を分離後, PVDFメンブレン (Immobilon,Millipore)
に転写し,一次抗体として各種抗体で免疫ブロットし
た。 2次抗体としてHRP標識された抗マウス IgG抗
体 (Cellsignaling)及びHRP標識された抗ラビット
IgG抗体 (Cellsignaling) を用い chemilumine-
scence reagent (Western Lightning, Perkin Elmer
Life Sciences)にて検出した。
[結果]
Ror1とCKleの会合動態解析
CKIε はyeasttwo hybrid法によるスクリーニン
グにより, Ror2に会合する分子として同定された。
Ror1についてもCKIε と酵母内で会合し得るかどう
かを検討した結果, Ror2と同様にRor1についても
CKleとの特異的結合が認められた(図1)。更に,
Ror1とCKIeが会合するかどうかをHEK293T細胞を
用いた蛋白質発現実験により検討した。 FLAG標識を
つけたRor1WTとCKIε とをHEK293T細胞に共発現
させ,抗FLAG抗体で免疫沈降したところ, Ror1と
CKIε との共沈降が認められた(図 2)。次にRor1と
CKIε との会合領域の同定を行った。 FLAG標識をつ
けたRor1WT及び細胞内領域の C末端側を欠失した
一連の変異型 Ror1(Ror1ムC及び Ror1Tc) (図3-
A) を, CKI eと共にHEK293T細胞に発現させ,抗
FLAG抗体で免疫沈降を行ったところ, Ror1ムCと
の共沈降はほとんど認められず, Ror1 Tcとは全く共
沈降が認められなかった(図 3-B)。以上の結果から,
CKI e はRor1の細胞内領域のC末端側(プロリンリッ
チドメイン,セリン・スレオニンリッチ 2ドメイン)
を介して主に会合することが示唆された。また,
pACT2 + pAS2・1園CKle pACT2・Ror1+ pAS2・1岡CKIe
図1.酵母内で、のRorlとCKIε の会合解析
pAS2-1-Rorl及び、pACT2-CKIε を酢酸リチウム法
で酵母Y190株に導入し, SD-LTH選択培地 (SD/Lu/Trp/His)で培養後形成されたコロニーをろ紙に転写
し, β-galactosidaseの活性を青い発色で示した。図
の左はpACT2及び, pAS2-1-CKI eを導入し,右は
pACT2-Ror1及び, pAS2-1-CKIε を導入した。 RorlとCKIε ともに導入した酵母においてのみ発色(青色)が認められた。
Ror1輔 FLAG + + CKIε 岨+
IP:anti圃 FLAGBlot:anti-FLAG
IP:anti圃 FLAGBlot:antトCKIε
WCL Blot:antトCKIε
---Ror1
← CKIε
ー-CKIε
図 2.晴乳動物培養細胞におけるRorlとCKIε の会合
解析
HEK292T細胞にRor1-FLAGとCKleをリン酸カル
シウム法で導入した。全細胞抽出液 (WCL)と抗FLAG抗体で免疫沈降した蛋白質を9%SDS-PAGEを用
いて泳動し,免疫ブロットを行った。 Ror1-FLAG蛋白質はそれぞれ抗FLAG抗体, CKle蛋白質は抗
CKI e抗体を用いて検出した。
RorlムCとCKIε の共沈降がわずかに認められたの
に対して, Rorl Tcとは全く認められなかったことか
ら, Rorlのキナーゼドメインも CKIε との会合に関
与することが示唆された。
CKIε によるRorlのセリン・スレオニンリン酸化動
態解析
日甫乳動物細胞において, RorlがCKIε によりセリ
31
A
Rorl WT
937
Rorl AC
783
…(…闇園圃副
B Ror1 WT-FLAG +
Ror1 dC幽 FLAG 欄+Ror1 Tc-FLAG -開+CKIε+ + + +
IP:anti-FLAG
Blot:anti幽 FLAG
IP:anti-FLAG
Blot:anti-CKIε
WCL
Blot:antトCKIε
図 3. Ror1とCKIε の会合領域の解析
--Ror1WT
--Ror1dC
← Ror1Tc
--CKIε
--CKIε
(A) Rorl WTの構造と c末端欠失変異体型Rorlの構造を示している。数字はアミノ酸の位置を示して
いる。 (B)HEK293T細胞にRor1WT-FLAG, Ror1 ムC-FLAG,Rorl Tc-FLAGとCKIε とをそれぞれリ
ン酸カルシウム法で導入した。全細胞抽出液 (WCL)と抗FLAG抗体で免疫沈降した蛋白質を9%SDS-PA GEを用いて泳動し,免疫ブロットを行った。 Rorl-FLAG蛋白質はそれぞれ抗Flag抗体, CKIε 蛋白質は
抗CKIε 抗体を用いて検出した。
( 61 )
ン・スレオニンリン酸化されるかどうかを, HEK293T
細胞を用いた蛋白質発現実験により検討した。 FLAG
標識をつけたRorlWTとCKIεWTまたはCKle
DKをHEK293T細胞に共発現させ,抗FLAG抗体で免
疫沈降を行ったところ, RorlがCKIε のキナーゼ活
性依存的にセリン・スレオニンリン酸化されることが
明らかになった(図 4-A)。次に各種Ror1変異体を用
いてCKIε によるRorlのリン酸化部位の検討を行っ
た。 FLAG標識をつけたRorlWT及び細胞内領域を
欠失した一連の変異型Ror1(Ror1ムC及び~Ror1 Tc)
(図 3-A)とCKIeとをHEK293T細胞に共発現させ,
抗FLAG抗体により免疫沈降を行い,抗リン酸化セリ
ン・スレオニン抗体でブ、ロット解析を行ったところ,
Ror1 dCにおけるセリン・スレオニンリン酸化は
Rorl WTと比べて顕著に減少し, Rorl Tcにおいて
は全く認められなかった(図 4-B)。以上の結果から,
32
A Ror1 WT-FLAG
CKIεWT
CKIεDK
IP:anti綱 FLAG
Blot:anti-phospho
serine/threonine
+
・
+剛+
++
IP:anti-FLAG
日lot:anti剛ドしAG
IP:anti-FLAG
Blot:anti-CKIε
B Ror1 WT-FLAG + Ror1 ilC刷 FLAG 幽+幽
Ror1 Tc-FLAG 剛 働 十
CKIε ゅ + や や
IP:anti-FLAG Blot:anti-phospho serine/threonine
IP:anti-FしAGBlot:anti欄 FLAG
IP:anti幽FしAG日lot:anti綱 CKIE:WCL Blot:anti剛 CKle
噌 Ror1
冊目 Ror1
噌 CKIε
--RorlWT
← Ror1ilC
叫-RorlWT
4一向。r1LlC
骨肉 Ror1Tc
時 CKIE
十 CKIE
岡 4.CKIε によるRorlのセリン・スレオニンリン
酸化解析
(A) HEK293T細胞にRor1-FLAGとCKIεWT及びCKIεDKをリン酸カルシウム法で導入した。抗FLAG
した蛋白質を9%SDS-PAGEを用いて
泳動し,イムノブロットを行った。 Ror1-FLAG蛋白
はそれぞれ抗FLag抗体, CKIε 褒白質は抗CKIε抗体を用いて検出した。 Ror1のセリン・スレオニン
リン酸化は抗セリン・スレオニンリン酸化抗体を用
いて検出した。 (B) HEK293T 細胞に RorlWT-FLAG,氏。r1ム C“FLAG,日or1 Tc-FLAGと
CKIε とをそれぞれリン酸カルシウム法で導入した。
全細胞抽出液 (WCL)と抗 FLAG抗体で免疫沈降し
9%SDS-PAG日を用いて泳動し,免疫プロッ
トを行った。 Ror1-FLAG蛋白質はそれぞれ抗FLAG抗体, CKIε 蛋白質は抗 CKIε 抗体を用いて検出し
た。 Ror1のセリン・スレオニンリン酸化は抗セリン・
スレオニンリン酸化抗体を用いて検出した。
Ror1 W下FLAG
CKIεWγ
CKIε 口K
+ + +
+ +
IP:anti-FLAG
Blot:anti削 phospho
tyrosine
IP:anti欄 FLAG
Blot:anti-phospho
serine/threonine
州一円or1
噌 Ror1
IP:anti側 FLAG
Blot:anti午しAG
IP:anti蝋 FLAG
Blot:anti“CKlc
--Ror1
--CKIε
図 5.Rorlのチロシンリン酸化解析
HEK293T細胞にRor1-FLAGとCKIεWT及びCKI εDKをリン酸カルシウム法で導入した。抗FLAG抗体で免疫沈降した環白質を9%SDS叩 PAGEを用いて
泳動し,免疫ブロットを行った。 日or1同FLAG讃白質
はそれぞれ抗FLAG抗体, CKI E蛋白質は抗CKIε 抗
体を用いて検出した。日。r1のセリン・スレオニンリ
ン酸化は抗セリン・スレオニンリン酸化抗体を用い
て検出し,チロシンリン験化は抗チロシンリン酸化
抗体で検出した。
CKIε によるRor1のリン酸化には C末端領域のプロ
リンリッチ領域及びセリン・スレオニンリッチ 2領
域が必要であることが示唆された。
Rorlのチロシンリン酸化の動態解析
Rorlのチロシン自己リン酸化について, HEK293T
細胞奇用いた議白質発現実験により検討した。 FLAG
つけたRorlWTとCKIεWTまたはCKIε を
HEK293T細胞に共発現させ,抗FLAG抗体で免疫沈
降を行った後,抗リン酸化チ口シン抗体でブロット解
析を行ったが,どの組み合わせにおいてもRor1のチ
ロシン自己リン酸化は認められなかった(図 5)。
[考察〕
受容体型チロシンキナーゼ Rorl,Ror2は瓦いに構
造が類似し,発生渦程の発現動態解析13,おノックア
ウトマウスの表現型解析10)から,発生過程の形態形成
において必須の役割告担っている分子であることが報
されている 10, 24)。線虫におけるRor2の相同分子の
CAM-l~i,遺伝学的解析からキナーゼ活性依存的な
機能とキナーゼ活性非依存的な機能を有していること
が報告されている 8.9) また,最近Ror2のリガンド
としてWnt5aが同定され,キナーゼ活性非依存的に
( 62 )
norトcanonicalWnt/JHKシグナル伝達経路が活性化
されることが報告されているω。しかしながら,
Ror1, Ror2,特に, Ror1についてはチロシンキナー
ゼとしてのその機能についてほとんど報告がなかったD
これまでに細胞外領域特異的抗体を用いた架橋化によ
るチロシンキナーゼ活性化の検討,及び:Ror1, Ror2
の細胞外領域をgranulocytemacrophage colony-
stimulating factor (GMCSF) receptorの細胞外領域
に置換したキメラRor1.Ror2変異体を用いたGMCS
Fによるチロシンキナーゼ活性化を検討したが,いず
れの場合もチロシン自己リン酸化及びチロシンキナー
ゼ活性化は認められなかった (datanot showm)。
最近,このような細胞外からの刺激によって活性化さ
れなかった Ror2が,細胞質内分子である CKIε
によりセリン・スレオニンリン酸化を受けチロシン自
己リン酸化及びチロシンキナーゼ活性化が誘導される
ことが明らかとなったω。CKIEはRor2をbaitとした
yeast two-hybridスクリーニングから同定されてお
り, Ror1についてもRor2と同様にCKIEによって活
性を制御されることが推測された。そこで本研究にお
いて, Ror1のチロシンキナーゼ活性がCKIEにより
制御されるかどうかを検討したところ, Ror1はRor2
と同様に細胞内領域でCKIε と会合し, CKIε のキナー
ゼ活性依存的にセリン・スレオニンリン酸化されるこ
とが明らかとなった。 Ror1の細胞内領域の C末端側
ドメインがCKIEとの会合に必要であることが示され
るとともに, この C末端側ドメインはRor2と同様に
CKIε によるRor1のセリン・スレオニンリン酸化に
も必要であることが示された。 Ror2についてはCKI
Eによりセリン・スレオニンリン酸化される結果,チ
ロシンリン酸化及びチロシンキナーゼ活性化が認めら
れたが, Ror1についてはCKIEによるセリン・スレ
オニンリン酸化は認められたものの,チロシン自己リ
ン酸化及びチロシンキナーゼ活性化は検出されなかっ
た。これらの結果からRor2の場合とは異なり, Ror1
の場合にはCKIε によるセノン・スレオニンリン酸化
はチロシン自己リン酸化及びチロシンキナーゼ活性化
の誘導には不十分であることが示唆される。今後更な
る解析により Ror1チロシンキナーゼの活性化機構が
解明されることが期待される。
[謝辞]
本研究にあたり,ご指導を賜りました神戸大学医学
系研究課科ゲノム制御学講座南康博教授に厚くお礼申
し上げます口
(63 )
33
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Functional analysis of regulation of receptor tyrosine kinase Ror 1 by CKIε
Shuichi Kani
Department of Genome Sciences, Faculty of Medical Sciences, Graduate School of Medicine, Kobe University. 7-5-1, Kusunoki-cho, Chuo-ku, Kobe 650-0017, Japan
ABSTRACT
35
Ror1, a member of the mammalian Ror-family of receptor tyrosine kinases, plays important roles
in developmental morphogenesis. Our recent paper reports that CKIεphosphorylates Ror2 on
serine/threonine residues and enhances the tyrosine kinase activity of Ror2. To gain insights into
Ror1-mediated signaling, 1 performed the structure-function analyses of Ror1 and CKIε. We show
that the cytoplasmic region of Ror1 associates with CKI e in yeast cells. When expressed in
mammalian cells, Ror1 associates with the CKIε. This association occurs primarily via the
cytoplasmic C-terminal region of Ror1, which contains the proline-rich and serine/threonine-rich
domains. We also show that Ror1 is phosphorylated by CKIεon serine/threonine residues depend on
its kinase activity. However, tyrosine autophosphorylation and tyrosine kinase activation of Ror1 was
not detected following CKIε-mediated serine/threonine phosphorylation of Ror1. These data imply the
possibility that tyrosine kinase activity of Ror1 and Ror2 are regulated differentially.
(65 )