Klinički zavod za kemiju KBC Sestre milosrdnice...•DNA profiling (DNA fingerprinting)...
Transcript of Klinički zavod za kemiju KBC Sestre milosrdnice...•DNA profiling (DNA fingerprinting)...
Klinički zavod za kemijuKBC Sestre milosrdnice
Tečaj HKMBAnalitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: elektroforetske i kromatografske separacije
Farmaceutsko biokemijski fakultet, A. Kovačića 1, Velika predavaonica, 10.3.2018.
Odvajanje nukleinskih kiselina - CF u gradijentu • na osnovu razlike u brzini sedimentacije • dugotrajno, velike količine uzorka• teška oprema
ALTERNATIVA elektroforeza:• pokretljivost DNA u ionskim otopinama u električnom polju• gel matrica, vertikalni pločasti gelovi
• agar (prirodni ugljikohidrat)• agaroza (komponenta agara) postupno zamjenjuje agar• poliakrilamid sintetički gelovi, agaroza-akrilamid
• korelacija sa sedimentacijskim koeficijentom • otkriće RE + radioaktivno označavanje nukleinskih kiselina• cjevasti gel format preteča kapilarne elektroforeze • etidij bromid (EtBr)• horizontalni pločasti gelovi agaroze (McDonell i sur. )Analitička i preparativna primjena
• koristi se i u novim tehnologijama:• uređivanja genoma • sekvenciranje nove generacije (NGS)
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 2
1960ih
1971
1972
1977
1967
Razlika pokretljivosti molekule ovisi izravno o:
veličini, obliku i naboju
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 3
Preuzeto sa: https://www.thermofisher.com
• migracija DNA u slobodnoj otopini je neovisna o Mr• mehanizam razdvajanja u gelu – dva glavna modela:Ogstonov model • široko prihvaćen prosijavanje molekula manjih od pora matriksa• kratke, kružne, zapetljane molekule DNAReptacijski model (model zmije/gusjenice)• kada su molekule znatno veće od pora
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 4
prema: Butler JM. Forensic DNA Typing. 2nd Ed, Elsevier Academic Press (2005)
kratka DNA duga DNA
Ogstonov model Reptacijski model
pore gela
Udaljenost migracije korelira s veličinom molekula
• moguće izračunati veličinu DNA nepoznatog uzorka
• samo za linearne dsDNA molekule:
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 5
udaljenost migracije ~1
log(𝑀𝑟)
mo
biln
ost
log
(vel
ičin
a)
1000bp
100bp
10bp
Dvije izvedbe:1. horizontalna (tzv. submarine elektroforeza) 2. vertikalna
Različite veličine, ovisi o broju uzoraka i Mr DNA• šira kadica više uzoraka • dulja kadica više redaka / dulja migracija u gelu
Veći formati za:• polimorfizam duljine fragmenta (RFLP) • Southern blot
Mini formati za:• brzo razdvajanje i manji broj uzoraka
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 6
Preuzeto sa: https://www.btlabsystems.com
Preuzeto sa: http://www.bio-rad.com
Preuzeto sa: https://www.agilent.com
Sastav ili gradijent pufera• nativna EF• alkalno denaturirajuća EF• gradijentna EF
Električno polje • elektroforeza pulsnog polja, PFGE
Matriksi• agaroza• poliakrilamid/PAGE (denaturirajući ili nativni)
• sredstva za denaturaciju (npr. NaOH + urea/formamid) • ssDNA (npr. tehnike SSCP, DGGE, ili DNA footprinting)• za kratke dsDNA• za RNA 20 - 60bp
• industrijske varijacije - različiti proizvođači• polimeri u uskim silikatnim kapilarama
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 8
U obliku:
• tanke "ploče" pravokutnog oblika (horiz./vert. EF)
• kapilarna elektroforeza, mikrouzorak – danas• komercijalni sustav s gotovim gelom ispunjenim kapilarama
• brzo, osjetljivo i standardizirano izvođenje elektroforeze
Agarozni gelovi:
• ugljikohidrat iz morske trave
• velike pore (~200nm), brža migracija
Akrilamidni gelovi:
• polimer akrilamidnih skupina
• male pore (~20nm), spora migracija/bolja rezolucija
Komercijalne izvedenice agaroze i PAG
• Clearose®, Spreadex®, TruPAGE™, Novex®…
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 9
• Gustoća gela• Veličina i linearnost DNA • Konformacija DNA • Priprema uzorka• Napon i vrijeme• Pufer (Tris/acetat/EDTA – TAE, Tris/borat/EDTA - TBE)
• Koncentracija boje pri bojenju gela (npr. EtBr)
Elektroforeza RNA:• provjera kontaminacije genomskom DNA • eukariotska RNA 28s i 18s rRNA• provjera degradacije RNA (razmazana vrpca)
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 10
Aem 605 nm
Aabs210/285nm (UV)
Preuzeto sa: https://www.hoelzel-biotech.com/en/infothek/nucleic-acid-detection/
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 11
GelRed•Biotium•sličan EtBr,osjetljiviji•dsDNA, ssDNA i RNA•nije kancerogen •nije toksičan
Amax ~ 280nmEmax ~ 590nm
SYBR Green I •Molecular Probes•karcinogen
Amax497nmEmax 520nm
GelGreen•Biotium•manje toksičan •dsDNA, ssDNA i RNA
Amax~500nmEmax ~520nm
Ostale cijaninske boje•SYBR Green II (za bojenje ssDNA i RNA)•SYBR Gold (pojačana osjetljivost)•Safe-green (manja toksičnost)
Etidij bromid•1950ih (homidium)•>20ng DNA/RNA 20X jači intenzitet
•mutagen•karcinogen
Amax210/285nmEmax 610nm
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 12
DNA standardi (Molecular Weight Markers)
• usporedba duljine fragmenata nepoznatog uzorka
• različitih duljina ili ljestvica (ladder)
184bp
124bp
213bp
234bp
267bp
MWM 1 2 3 4 5 6
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 13
Dijelovi• UV transiluminator (260-300-312nm)• kamera ili scanner• software za očitavanje i analizu• pojedinačno ili kao gel imaging sustav
By Bonnvenn - Own work, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=7861132
http://www.gelanalyzer.com/
Moguće varijacije:• količina i kvaliteta uzorka (5 – 8 – 10 – 12uL…)• postavke napona (60 - 80 - 100 - 120 - 150V…)• gustoća gela (0,5 - 0,8 - 1,0 - 2,0 - 5,0 - 10 - 16%)• duljina trajanja (15 – 30 – 60 – 120min …)• bojenje i vizualizacija (EtBr – GelRed – SYBR…)
Priprema gelova:• zahtjevan postupak:
• kuhanje agaroze, izlijevanje gela • priprema i pranje kalupa, polimerizacija akrilamida• problemi sa zaostalim mjehurićima zraka• nanošenje malih količina uzorka• prelijevanje uzorka iz jažica
• neurotoksičnost akrilamida, kancerogene boje
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 15
• RFLP, kvantifikacija, preparacija, ispitivanje kvalitete• nije za određivanje SNP
• 0,7% (5–10kb) – vrlo krhki gelovi• 2% (0,2–1kb) • 3% za vrlo kratke fragmente• 1% - najčešće
• Postupak:1. Izvagati točnu količinu agaroznog praha, dodati pufer
• npr. 1% agaroza = 1g + 99ml H2O2. Zagrijati u vodenoj kupelji u mikrovalnoj/magnetskom grijaču
• bistra otopina (70°C)3. Pripremiti kalup izliti otopinu gela, umetnuti češalj4. Ohladiti gel, izvaditi češalj5. Postaviti gel u kadicu6. Pripremiti uzorke i molekularni standard (marker), 7. Nanositi 5-10uL, pomiješan sa obojenim puferom za
nanošenje (npr. BFP+glicerol)
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 16
• razdvajanje fragmenata slične duljine, SNP polimorfizmi, insercije/delecije >1-2bp..
• tipično: 6%, 8%, 10%, 12% ili 15% gelovi
Postupak:1. Temeljito oprati i posušiti stakla za vertikalni kalup (1-3mm razmak!)2. Izvagati točne količine (akrilamid, bis-akrilamid, TEMED, APS)3. Pripremiti kalup stakla, razmaknice i češalj4. Pripremiti polimer, odmah po dodavanju TEMEDa izliti gel, (mj. zraka!)5. Nanošenje uzorka (boja za nanošenje - loading buffer!)
Problemi:• mjehurići zraka!• zagrijavanje gela tokom elektroforeze (‘smile effect’)
• zakrivljena fronta, teško odrediti veličinu• otapanje gela• hlađenje sustava za elektroforezu (hladna komora, protok hlađenog
pufera)
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 17
Aga
roza
(EtB
r)PA
GE
(SY
BR
Go
ld)
Smile efekt• previsoka T gela• loša homogenost gela
Ispravan geloštre jasno odijeljene vrpce
Mjehurići zrakaNehomogen gel• previsoka T, loša homogenost
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 18
Sekvenciranje Maxam - Gilbert
• radioaktivno obilježavanje 5‘ kraja
• kemijsko cijepanje• A+G, G, C, C+T
Preuzeto sa: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/6/66/Maxam_gilbert_sequencing.png
Preuzeto sa: http://www.generasibiologi.com/2016/03/metode-sekuensing-kimiawi-maxam-gilbert.html
1976
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 19
Sekvenciranje Sanger (terminacija lanca)• dideoksi nukleotidi – ddNTP (terminacija)
• fluorescentno obilježeni primer
• Novi DNA lanac s obilježenim dNTP, ili
• Obilježenim ddNTP
NN 1980
Preuzeto sa: http://dnamismatch.com/dna-sequencing/methods-in-development/microfluidic-sanger-sequencing/
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 20
• PCR cijepanje RE EF u gelu agaroze/PAGE
Elektroforeza
PC
R
mut/w
t
wt/
wt
wt/w
t
mu
t/w
t
wtmut
DNA
Puna krv PCR
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 21
RE
• DNA profiling (DNA fingerprinting) individualni jedinstveni DNA profil
• razdvajanje dugačkih fragmenata (PCR, RFLP, STR i VNTR lokusi i sl.)
• elektroforeza na 14°C, 18-24h
• promjena smjera napona za 60° svakih 90sekundi
1500kb
900kb
700kb
300kb
100kb+
--
+
+
-
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 22
• denaturirajući uvjeti (formamid, 95°C) 0°C
• PAGE elektroforeza na 4°C razdvajanje ssDNA
PC
R
mut/w
t
wt/w
t
wt/
wt
mut/w
t
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 23
wt/wtmut/wt mut/mut
Elektroforeza
ssDNA
DNA
Puna krvPCRmut/mut wt/wt
• povećana rezolucija razdvajanja, bez sekundarnih struktura
• denaturirajući PAGE gel:• denaturacija za vrijeme EF ssDNA (NaOH + formamid/urea, 95°C)
mut/mut wt/wt mut/wtmut/mut wt/wt
ds
ss
30%
ele
ktro
fore
za
de
ntu
rant
60%
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 24
• Fleksibilne staklene kapilare + gel matriks• Uzorak i pufer uvučen u kapilaru pod djelovanjem napona• Dugačka DNA putuje sporije od kratke• Napon viši nego kod gel elektroforeze (bolji odvod topline)• Lasersko očitavanje vezane bojePrednosti:• Nema pripreme gelova• brzo (unutar minuta), jeftino, male količine uzorka• može se automatizirati, • trenutna detekcija po završetku
Nedostaci:• Mali broj istovremenih uzoraka (kapacitet) - jedna kapilara
po uzorku• Danas postoje sustavi sa paralelnih 96 kapilara• Skupi automatizirani sustavi, skupi reagensi i kapilarni nosači
Analitičke tehnike u kliničkom laboratoriju: Elektroforetske separacije nukleinskih kiselina (HKMB -10. ožujak 2018) 25