1

Klasifikasi, Mekanisme dan Aplikasi Enzim DNA Ligase

Abdul Arifin20508013

Klasifikasi DNA LigaseNomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology

(NC-IUBMB)Enzim NomenklaturDNA Ligase (ATP) EC.6.5.1.1

Definisi; DNA Ligase: salah satu enzim ligase yang membentuk ikatan kovalen fosfodiester diantara ujung 3’Hidroksi dari satu nukleotida dengan ujung 5’fosfat dari nukleotida yang lain dan melibatkan ATP dalam reaksinya.

Struktur molekul

Mekanisme ReaksiSecara Umum;

(DNA)n + (DNA)m (DNA)n+m

ATPDNA Ligase

AMP + Ppi

Sisi Aktif (Lysine)

3

NH-AMP

DNA ligase

DNA ligase

NH2

ATP

PP1

T4E.coli

NAD+

NMN

AMP

Ligated DNA

Mekanisme DNA Ligase

Suatu rantai DNA yang terpisah

Pembentukan intermediate enzim energi tinggi dengan transfer gugus adenosil dari NAD+ atau ATP pada gugus amino dari residu lysine

Transfer gugus adenosil ke ujung 5’ fosfat pada DNA yang terpisah

Gugus hidoksil menyerang ujung 5’ fosfat – adenosil - enzim

Tipe-tipe DNA Ligase

Pada Hewan Mamalia terdapat 4 tipe spesifik dari enzim DNA Ligase, diantaranya ;• DNA Ligase I : yang mengkatalis reaksi ligasi fragmen-fragmen

Okazaki pada pemanjangan rantai sewaktu proses replikasi DNA berlangsung dan beberapa fragmen-fragmen rekombinasi

• DNA Ligase II : Bentuk alternative dari DNA Ligase III yang ditemukan pada sel yang tidak dapat membelah diri

• DNA Ligase III : Bentuk kompleks dengan XRCC1 suatu protein yang memperbaiki DNA dengan mencegah terjadinya mutasi penghilangan basa DNA dan fragmen-fragmen rekombinan

• DNA Ligase IV : Bentuk kompleks dengan XRCC4. Kompleks enzim ini mengkatalisis tahap akhir proses perbaikan penggabungan ujung non-homolog DNA rantai ganda.

Umumnya enzim-enzim DNA ligase pada mulanya ditemukan dalam T4 bakteriofag, E. coli dan bakteri lainnya.

Regulator DNA LigaseRegulation of DNA Ligase activity by poly(ADP-ribose) yang disusun oleh Debbie Creissen dan Sydney Shall dalam Nature 296, 271-272 (18 March 1982)

Cell cycle regulation of a DNA ligase-encoding gene ( CaLIG4) from Candida albicansDisusun oleh Andaluz, E., et. al., yang dipublikasikan dalam Yeast volume 15 issue 12, 1999, p1199-1210

Regulation of inter- and intramolecular ligation with T4 DNA ligase in the presence of polyethylene glycol yang disusun oleh Hayashi, K., et. al., yang dipublikasikan dalamNucleic Acids Research, 1986, vol. 14, No.19 7617-7631

Polyethylene glycol (PEG) mempengaruhi reaksi ligasi pada T4 DNA ligase. Dalam 10% (w/v) larutan PEG 6000, hanya ligasi intermolekular yang dipertinggi oleh kation-kation monovalent, sementara reaksi ligasi inter- dan intramolekular dapat terjadi tanpa PEG. 

Nuclear ADP-ribosyl transferase (ADPRT) menkatalisis transfer ADP-ribos dari NAD+ ke protein Kromatin untuk membentuk mono-,oligo-, and poly (ADP-ribose)-termodifikasi. Enzim ini sangat tergantung DNA untuk aktivitasnya dan diaktivasi dengan adanya celah dalam DNA. Hal ini mengindikasikan biosintesis poly(ADP-ribose)n dibutuhkan untuk perbaikan yang efektif untuk beberapa jenis kerusakan DNA.

menjelaskan tingkat transkripsi enzim CaLIG4 dalam C. albicans bervariasi selama siklus sel ragi. Sel-sel yang baru terbentuk mengandung tingkat transkripsi basa yang meningkat sampai tingkat maksimum ketika sel dalam keadaan G1 akhir. Sesudah itu, tingkat ranskripsi menurun ketika replikasi DNA dimulai.

pisahkan gen DNA ligase menjadi DNA rantai tunggal dengan pemanasan 94oC selama 1 menit

gabungkan primer ke rantai tunggal DNA, dengan suhu 50oC/140 detikAnnealing

Denaturasi

pembentukan rantai ke dua dengan DNA polymerase dan dNTP pada suhu 72oC selama 1,5 menit

Extension

Dilakukan PCR sampai 40 siklus, Fragmen yang dihasilkan (total panjang 600nt), yang mirip dengan gen DNA ligase organisme x

Isolasi gen DNA ligase dari Thermococcus sp. 1591

Isolasi dan Karakterisasi DNA Ligase

Primer merupakan urutan daerah dari DNA ligase organisme x

Primer 1 and 2 Membentuk gen utuh.

Gen DNA ligase utuh

DNA Thermococcus sp. 1591

Isolasi gen DNA ligase dari Thermococcus sp. 1591

Karakterisasi DNA Ligase

Salah satu sampel ditambahkan DNA ligase

Aktivitas ligase dapat ditentukan melalui dua metode

1.Molekul DNA kontrol2. DNA setelah penambahan enzim restriksi BstEII3. Sama seperti 2, tetapi sebelum elektroforesis sampelnya dipanaskan 70oC selama 10 menit4. Sampel fragmen DNA + BstEII dengan penambahan DNA ligase (45oC/1jam), buffer reaksi serta ATP5. Mirip dengan 4 tetapi tanpa ATP

C = produk ligasi (fragmen A + B)A dan B= fragmen hasil restriksi BstEII

Aplikasi DNA Ligase

Percobaan pertama DNA rekombinan

• 1971 ilmuwan memanipulasi DNA dan menempatkannya ke dalam bakteri

• 1972 ilmuwan menggabungkan dua molekul DNA dari sumber berbeda menggunakan endonuclease EcoRI (untuk memotong) dan DNA ligase (untuk menggabungkan kembali)

Aplikasi DNA LigaseKloning DNA pertama

Boyer, Helling Cohen, dan Chang menggabungkan fragmen-fragmen DNA dalam sebuah vector, dan mentransfer ke sel E. coli

Cohen and Chang menyimpulkan, mereka dapat menempatkan DNA bakteri ke dalam spesies bakteri yang berlainan

Tahun 1980 Boyer and Cohen menerima paten untuk metode dasar transformasi dan kloning DNA

Pemasukan gen ke dalam plasmid

menggunakan enzim restriksi

dan DNA ligase

1

Agrobacterium

Tiplasmid

T DNA

Titik restriksi

pengenalanke dalam sel tanaman yang dikembangkan

2

RekombinanTi plasmid

Plant cell

T DNApembawagen baru

dalam kromosom tanaman

Regenerasitanaman

3

Tanaman hasil rekayasa

DNA mengandung gen yang diinginkan

Aplikasi DNA LigaseDNA ligase dimanfaatkan untuk menggabungkan secara kovalen ikatan fragmen-fragmen suatu DNA, secara luas kemampuan ini diaplikasikan ke penggabungan suatu fragmen DNA pada suatu vektor plasmid, hal ini merupakan teknik dasar rekombinasi DNA

Organisma Modifikasi Genetik: Aplikasi DNA Ligase dalam Agriculture

Isolat DNAdari dua sumber

1E. coli

Potong kedua DNA dengan enzim restriksi

yang sama

2

Plasmid

Sel Manusia

DNA

Gen VSticky ends

campurkan DNA; merekabergabung berdasarkan pasangan basanya

3

DNA ligase menggabungkanikatan DNA secara kovalen

4

Rekombinan DNAplasmid

Gen V

plasmid dimasukkan ke bakteri

5

bakteri diklon6

Klon bakteri mengandung duplikat gen manusia

Perkembangan AplikasiDNA Ligase

Paul Berg, Stanley N. Cohen & Herbert Boyer, 1970 (p.1119)Klon DNA : (teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetik) 1. Potong DNA pada posisi tertentu dengan enzim restriksi endonuklease.2. Gabungkan kedua fragmen DNA dengan DNA ligase.3. Pilih molekul kecil yang mampu mereplikasi DNAnya sendiri. Potongan DNA dapat dimasukkan ke dalam kloning vektor (plasmid atau viral DNA) untuk membentuk DNA rekombinan.4. Pindahkan DNA rekombinan dari tabung tes ke sell induk untuk replikasi.5. Identifikasi cell induk yang mengandung DNA rekombinan.

Tanaman tembakakau,

diekspresikan dengan gen firefly luciferase

Beras ini dapat menolong mencegah terjadinya defisiensi terhadap vitamin A

“Beras Keemasan” telah dimodifikasi secara genetik agar meengandung beta-karotene

Tikus Rekayasa (Kanan), yang diekspresikan dengan gen HGH (Human Growth Hormone)

Kloning Sel-sel Hewan, Langkah menuju gen terapi

Sel-sel dan organisme rekombinan digunakan untuk menghasilkan protein-protein yang bermanfaat

Kesimpulan