DISOSIASI JARINGAN, PENENTUAN JUMLAH DAN VIABILITAS SEL

Oleh :

Nama : Ita Pratiwi KNIM : B1J012042Rombongan : IIKelompok : 3

LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN HEWAN

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO

2014

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kultur sel hewan berasal dari eksplan jaringan atau supensi sel sebagai

kultur sel primer yang dapat di subkultur dengan rentang hidup yang terbatas. Sel-

sel mungkin kehilangan beberapa sifat asli mereka karena adanya transformasi.

Banyak cellline yang bersifat aneuploidi dengan materi genetik yang tidak stabil.

Sintesis berbagai bioproduk seperti vaksin, antibody monoklonal, enzim, dan

hormon didapatkan dengan kultur sel sehingga banyak usaha yang dilakukan

untuk mengembangkan dan meningkatkan teknologi kultur sel. Penelitian akan

rmerangsang kemajuan metode kultur sel yang memberikan pemahaman lebih

baik mengenai invasi tumor dan mengungkapkan pentingnya matriks ekstra

seluler untuk pengaturan fisiologis interaksi sel-sel yang tidak dapat diamati

dengan system kultur monolayer atau suspensi. Pengetahuan akan hal ini

membantu untuk meningkatkan aplikasi kultur sel yang digunakan dalam

perawatan klinis seperti halnya untuk penyembuhan luka dengan implantasi

epidermis atau organ cacat seperti hati yang dapat didukung dengan organ

bioartificial yang bersifat sementara (Hülser, 2004).

Kultur Jaringan adalah suatu ungkapan umum yang digunakan untuk

mengisolasi sel, jaringan, atau organ dari hewan dan menempatkan mereka ke

lingkungan buatan untuk pertumbuhannya. Hal ini juga dikenal sebagai teknik

untuk menjaga jaringan hidup dan tumbuh dalam media kultur yang tepat.

Jaringan tumbuh organisme hidup di luar tubuh harus berada dalam media kultur

yang tepat, yang mengandung campuran nutrisi seimbang dalam bentuk padat atau

cair. Kultur sel berasal dari isolasi sel dari hewan atau tumbuhan dan pertumbuhan

selanjutnya berada dalam lingkungan buatan yang menguntungkan. Sel-sel dapat

diambil dari jaringan secara langsung dan dipisahkan dengan cara enzimatik atau

mekanis sebelum dikultur (Gibco, 2013).

B. Tujuan

Tujuan dari praktikum disosiasi jaringan, penentuan jumlah dan viabilitas sel

yaitu untuk membekali mahasiswa dengan keterampilan untuk mempersiapkan

kultur primer.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini adalah alat bedah, cawan

petri, waterbath, tabung sentrifugator, tabung falcon, mikroskop,

haemocytometer, pipet transfer, mikropipet, dan stopwatch.

Bahan–bahan yang digunakan adalah hepar, limfe dan ginjal ikan Nilem,

tripsin-EDTA, alkohol 70%, mediun DMEM, serum, antibiotik, dan Trypan blue.

B. Metode

1. Ikan dilumpuhkan dengan merusak bagian syaraf menggunakan gunting.

Tangan dicuci besih menggunakan sabun hinggga bersih.

2. Bagian abdomen ikan dibersihkan dengan menggunkan tissue yang telah

dibasahi oleh alkohol 70%.

3. Bagian abdomen ikan dibedah dengan menggunakan alat bedah yang telah

disterilisasi, hepar, limfe dan ginjal diangkat dan diletakkan di cawan petri

steril. Handling medium ditambahkan ke dalam cawan petri agar hepar, limfe

dan ginjal tidak mengalami dehidrasi. Proses ini dilakukan dalam kondisi

aseptis di dekat bunsen.

4. Hepar, limfe dan ginjal dipotong hingga berukuran kecil sekitar 1 mm3

kemudian masukan kedalam tabung berisi dissociating medium yang

mengandung 0,025% Tripsin.

5. Tabung dimasukan kedalam waterbath dengan temperatur 37oC selama 15

menit. Setiap 5 menit sekali, tabung diagitasi untuk menghomogenkan.

6. Setelah itu tabung disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit.

Supernatan dibuang dan tambahkan washing medium yang mengandung

serum kedalam tabung.

7. Natan yang didapat diresuspensi menggunakan washing medium kemudian

sentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit. Tahap ini diulang

hingga dua kali untuk menghilangkan tripsin.

8. Kepadatan sel dihitung dengan menggunakan haemocytometer.

9. Suspensi sel diambil 9 bagian dan tambahkan 1 bagian trypan blue untuk

mewarnai sel yang mati. Proporsi sel yang hidup dihitung untuk menentukan

viabilitas sel

10. Hasil disosiasi disimpan dalam refrigerator.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Tabel 1. Jumlah dan Viabilitas dari Disosiasi Hepar, Limfe dan Ginjal Ikan Rombongan 1

Jenis Jaringan

Berat Jaringan

(g)

Volume suspensi sel (ml)

Kepadatan (sel/ml)

Jumlah Sel dalam

Suspensi (sel)

Viabilitas (%)

Jumlah sel per gram

Hepar 0,2 1 6,96 x 106 6,96 x 106 38,9 3,48 x 107

Ginjal 0,03 1 2,51 x 106 2,51 x 106 46,215 8,37 x 107

Limfa 0,03 1 1,53 x 106 1,53 x 106 52,77 5,12 x 107

Tabel 1. Jumlah dan Viabilitas dari Disosiasi Hepar, Limfe dan Ginjal Ikan Rombongan 2

Jenis Jaringan

Berat Jaringan

(g)

Volume suspensi sel (ml)

Kepadatan (sel/ml)

Jumlah Sel dalam

Suspensi (sel)

Viabilitas (%)

Jumlah sel per gram

Hepar 0,1 1 2,43 x 107 2,43 x 107 66,46 2,43 x 108

Ginjal 0,03 1 9,75 x 106 9,75 x 106 78 3,25 x 108

Limfa 0,04 1 2,82 x 107 2,82 x 107 70,2 7,05 x 108

Perhitungan :

1. Viabilitas Sel = Jumlah sel hidup/Jumlah sel hidup dan mati X 100 %

= 323/486 x 100 % = 66,46 %

2. Kepadatan Sel = Rata-rata 5 kotak X 2,5.105

= 97,2 x 2,5.105 = 2,43 x 107

3. Sel dalam suspensi = Kepadatan sel x volume suspense

= 2,43 x 107 x 1 mL = 2,43 x 107

4. Jumlah sel per gram jaringan = Jumlah sel/gram jaringan

= 2,43 x 107/0,1 = 2,43 x 108

Gambar 1. Jaringan Hepar Hasil Disosiasi

B. Pembahasan

Berdasarkan hasil pengamatan bahwa rombongan 1 kelompok 1

mendapatkan kepadatan sel 6,96 x 106 dengan viabilitas 38,9 %, kelempok 2

mendapatkan kepadatan sel 2,51 x 106 dengan viabilitas 46,215 %, dan kelempok

3 mendapatkan kepadatan sel 1,53 x 106 dengan viabilitas 52,77 %. Hasil

rombongan 2 kelompok 1 mendapatkan kepadatan sel 2,43 x 107 dengan viabilitas

66,46 %, kelempok 2 mendapatkan kepadatan sel 9,75 x 106 dengan viabilitas 78

%, dan kelempok 3 mendapatkan kepadatan sel 2,82 x 107dengan viabilitas 70,2

%. Viabilitas sel dari semua kelompok tidak sesuai dengan pustaka yaitu viabilitas

sel paling sedikit 95% (Gibco, 2013). Jumlah sel yang didapatkan ketiganya tidak

sesuai dengan pustaka yaitu jumlah sel hasil disosiasi hepar ikan forel yaitu

2,92x106 (Klaunigetal., 1985). Adanya perbedaan antara rombongan 1 dan 2

dimugkikan karena perbedaan medium basal yang digunakan serta septisitas saat

kerja.

Berdasarkan penelitian yang dilakukan Duncan et al. (2010) menyebutkan

hepatosit primer diisolasi dengan dua langkah kolagenase perfusi 11 dan kultur

hepatosit diisolasi dengan tripsinisasi. Protokol rinci dijelaskan untuk

isolasi/analisis populasi ploidi hepatosit dengan sitometri. FACS (fluorescence

activated cell sorting) dimurnikan dari hepatosit tikus tua 3-6 bulan yang diambil

jumlah sel yaitu 1000-2000 sel/cm2. Sel awalnya diinkubasi dalam media kultur

hepatosit mengandung DMEM dengan 4,5g/l glukosa (HyClone), 10% FBS

(HyClone), asam amino nonesensial (Cellgro) dan antibiotic anti mycotic

(Cellgro). Setelah 24 jam, medium kultur diganti dengan medium SUM3

ditambah dengan 0,5% FBS. Sel dikultur untuk interval di definisikan.

Media yang digunakan adalah handling medium yang meliputi media dasar

(DMEM) dan antibiotic yang dapat berupa streptomycin atau penicillin. Media

yang digunakan untuk tripsinasi berupa media yang mengandung tripsin.Washing

medium yaitu media dasar (DMEM) yang ditambahkan antiobiotik dan serum

yang biasanya berupa fetal bovine serum (Hülser, 2004). Disosiasi dari jaringan

ke suspense sel tunggal membutuhkan sebuah disosiasi atau penghancuran

matriks ekstra seluler (stroma). Metode yang digunakan bergantung pada

komposisi dari stroma. Parameter-parameter lain, jenis, kualitas, dan kuantitas sel

juga harus diperhatikan. Penggunaan enzim hidrolitik akan mengubah kondisi

ekstraseluler sel (Krause, 1973).

Penghitungan jumlah sel sangat penting dilakukan untuk memonitor

pertumbuhan dalam pengaturan kultur sel dengan jumlah yang diketahui.

Hemositometer merupakan alat yang biasa digunakan dalam perhitungan juumlah

sel dan dalam menentukan viabilitas sel. Hemositometer adalah slide kaca cukup

tebal dengan dua tempat untuk menghitung. Setiap 9 kotak memiliki volume

0,0001mL. Hemositometers sangat baik untuk menentukan viabilitas sel, tetapi

tidak tepat untuk menentukan jumlah sel karena jumlah yang sel yang relative

rendah. Penghitungan otomatis akan menghasilkan data yang paling dapat

diandalkan, terutama bila digunakan dalam kombinasi dengan data viabilitas dari

hemositometer (Freshney, 2011).

Tes viabilitas sel (yaitu penentuan jumlah sel-sel yang hidup dalam

sampel), yang berguna ketika sel yang tidak membelah (seperti sel primer)

terisolasi dan dipelihara dalam kultur, hal ini membantu untuk menentukan

kondisi kultur yang optimal. Metode yang paling berguna dan mudah untuk

menentukan jumlah sel yang viable adalah untuk pewarna sel dengan pewarna

seperti Trypan blue dan menghitungnya dengan hemositometer (seperti

hemositometer Neubauer). Pewarna ini memungkinkan untuk membedakan antara

sel-sel hidup dengan tanpa tidak menyerap warna dan yang tidak hidup (berwarna

biru) (Acea, 2013).

Viabilitas tes mengukur jumlah sel yang viable dalam suatu populasi.

Kombinasi viabilitas dengan jumlah sel yang mana jumlah sel yang viable

memberikan indikasi yang akurat tentang sel kultur yang baik. Metode yang

paling umum dan cepat berdasarkan integritas membrane sel sebagai indicator

viabilitas sel. Trypan blue dan erythrosin B tidak diserap oleh sel-sel yang viable

(Freshney, 2011). Menurut Coder (1997), viabilitas sel dapat ditentukan dari

perubahan morfologi atau oleh perubahan pada permeabilitas membrane terhadap

penyerapan zat warna tertentu. Untuk menghitung viabilitas sel dapat dilakukan

dengan bantuan mikroskop dengan cara menandai sel yang tidak viable. Pewarna

yang dapat digunakan adalah typan blue. Sel yang viabel memiliki membran utuh

dan akan melarang baahan pewarna masuk ke dalam sel sehingga sel tidak

terwarnai sedangkan sel yang tidak viabel akan terwarnai oleh zat pewarna.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum disosiasi jaringan, penentuan jumlah dan

viabilitas sel dapat disimpulkan bahwa :

1. Hasil disosiasi jaringan hepar kelompok 3 dengan berat 0,1 gram

mendapatkan kepadatan sel 2,43 x 107 sel/mL dengan viabilitas sel sebesar

66,46 %, jumlah sel dalam suspense adalah 2,43 x 107 sel/mL dan jumlah

sel/gram sebesar 2,43 x 108 sel/gram.

B. Saran

Saat melakukan persiapan kultur primer aseptisitas harus dijaga agar tidak

terjadi kontaminasi dan agar viabiltas sel yang didapatkan pun tinggi sehingga

dapat digunakan untuk kultur. Saat melakukan perhitungan sel yang hidup dan

mati pun harus lebih teliti agar data yang didapatkan lebih akurat.

DAFTAR REFERENSI

Acea. 2013. Culture and Monitoring of Animal Cells Basic Techniques.ACEA Biosciences, Inc. USA.

Coder, D.M. 1997. Assessment of Cell Viability. Current Protocols in Cytometry (1997) 9.2.1-9.2.14. Copyright © 1997 by John Wiley & Sons, Inc.

Duncan, W. Andrew, M. H. Taylor, R. D. Hickey, A. E. H. Newell, M. L. Lenzi, S. B. Olson, M. J. Finegold, M.Grompe. 2010. The Ploidy Conveyor of Mature Hepatocytes as A Source of Genetic Variation. Journal of Medical Genetics467(7316): 707–710. DOI:10.1038/nature09414.

Freshney, R. 2011. Animal Cell Culture Basics: Tips and Techniques for Continuous Cell Lines.ATCC.10801 University Blvd. Manassas, Virginia.

Gibco. 2013. Cell Culture Basics. Life Technologies Corporation. Indonesia.

Hülser, F. Dieter. 2004. Brain Tumour Development and Invasion. Int. J. Dev. Biol. 48: 497-508 (2004).

Klaunig, J. E., Ruch R. J., Goldblatt P. J. 1985. Trout Hepatocyte Culture: Isolation and Primary Culture. In Vitro Cell Dev Biol. 1985 Apr;21(4):221-8.

Krause, F. Paul. 1973. Tissue Culture : Methods and Aplications. Academic Press Inc. USA.