KIR 与移植、疾病的关联研究 邓志辉 深 圳 市 血 液 中 心 深圳市免疫遗传与组织配型医学重点实验室 二 0 一三年八月

19q13.4

ILT ILT

LAIR

KIR

FCaR

NK

p46

GPV

I

LRC

HLA polymorphism: allelic diversificationKIR polymorphism: allelic + chromosomal

6p21.3MHC

MIC

B MIC

AH

LA-B

HLA

-C

HLA

-J

HLA

-E

HLA

-A

HLA

-G

HLA

-F

HLA

-H

3DL3 2DL3 2DP1 2DL1 3DP1Haplotype A

2DL4 2DS4 3DL23DL1

3DL3 2DS2 2DL2 2DL43DP1 2DL5 2DS1 3DL22DS53DS1Haplotype B

Inhibitory (L) Activating (S) pseudogene

内容简介• KIR 分子的结构、功能， KIR 基因结构、命名、多态性• KIR 基因的分子生物学检测方法 PCR-SSP, Flow-rSSO, Quantitative PCR, PCR-SBT

• KIR 与骨髓及器官移植• KIR 与疾病的关联研究（病毒感染性疾病，白血病）

KIR 分子• 天然杀伤细胞 ( natural killer cell ， NK) 是机体固有免疫

系统的重要组成部分，近年来 NK 细胞的免疫调节作用受到人们的广泛关注。

• 杀伤细胞免疫球蛋白样受体 (KIRs) 属免疫球蛋白超家族成员，主要表达于自然杀伤细胞和部分活化 T 细胞表面。

KIR 分子结构及分类• 结构• 胞外区、跨膜区及胞内区。 • 分类1 、胞外结构域的数量 KIR2D/KIR3D2 、胞浆尾的长短 L 型 /S 型3 、功能效应 抑制型 / 激活型

NK Cell Normal Cell

No Lysis

Dominant inhibition

iKIR HLA

Act. rec.

Protection

ligand

Lysis

Cytokines

Missing-self recognition

NK Cell

iKIR

Act. rec.

HIV+

Targetsligand

KIR 分子的功能• KIR 分子与 HLAⅠ 类配体结合，共同调节 NK 细胞的活性。

• KIR 在移植免疫、生殖免疫、肿瘤免疫、机体抗感染中发挥着重要作用。

HLA-C 分子 1 区的第 80 位氨基酸残基与KIR 分子特异性识别方式的不同：

• C1 组（ C*01, 03, 07, 08, 12, 14 ） 等位基因的 α 重链上第 80 位氨基酸残基为天冬氨酸，特异性识别 KIR 分子中KIR2DL2 、 2DS2 和 2DL3 。

• C2 组（ C*02, 04, 05, 06, 15, 16, 17, 18 ）等位基因的 α 重链上第 80 位氨基酸残基为赖氨酸。特异性识别 KIR 分子中KIR 2DL1 和 2DS1 。

KIR 分子的配体

KIR 分子的配体HLA-B

Bw4 (40%) Bw6 (60%)

KIR3DL1 ligands

KIR3DS1 ligands?

Not a ligand for KIR(good control group for studying effects of KIR3DL1 subtypes)

80I 80T

KIR2DL2/2DL3 KIR2DL1 KIR2DL4 KIR3DL1 KIR3DL2KIR2DS2 KIR2DS1 KIR3DS1

B*13

B*27

B*37

B*44

80DCw1

Cw3

Cw7

Cw8

Cw12

Cw13

Cw14

80KCw2

Cw4

Cw5

Cw6

Cw15

Cw17 HLA-A3, A11

HLA-C1

HLA-C2HLA-Bw4

Bw4-80I Bw4-80T

HLA-G

B*51

B*52

B*53

B*57

B*58

A*24

KIR 分子的配体

NK 细胞的受体 inhibitory activatinginhibitory activatingReceptor Structure type Ligand Receptor Structure type LigandReceptor Structure type Ligand Receptor Structure type Ligand

KIR2DL Ig HLA-C KIR2DS Ig HLA-CKIR2DL Ig HLA-C KIR2DS Ig HLA-C

KIR3DL Ig HLA-B,C KIR3DS Ig HLA-B?KIR3DL Ig HLA-B,C KIR3DS Ig HLA-B?

LILRB1,2 Ig HLA-G LILRA3 Ig ?LILRB1,2 Ig HLA-G LILRA3 Ig ?

CD94:CD94:NKG2A NKG2A Lectin Lectin HLA-E HLA-E CD94: CD94:NKG2C/E NKG2C/E Lectin Lectin HLA-EHLA-E LAIR-1 Ig ? LAIR-2 Ig ?LAIR-1 Ig ? LAIR-2 Ig ? NKG2D Lectin MIC-A,BNKG2D Lectin MIC-A,B NKp30 Ig ?NKp30 Ig ?

NKp44 Ig ?NKp44 Ig ?

NKp46 Ig ?NKp46 Ig ?

CD16 Ig FcCD16 Ig Fc

KIR-HLA 受配体• KIR 配体： 阐明： 2DL1~2DL4, 3DL1,3DL2; 2DS1, 2DS2

可能： 3DS1

未知： 2DS3 ， 2DL5….

• KIR 重复次数存在个体差异• NK 细胞上除了 KIR 分子，还存在其它受体（ NKG2ANKG2A /2C ）

NK 细胞受 - 配体的复杂性，仅根据单个 KIR 分子配体的缺失，难以预测 NK 细胞激活。从 KIR+HLA 配体基因组合型，开展移植 / 疾病关联的研究十分必要。

19q13.4

ILT ILT

LAIR

KIR

FCaR

NK

p46

GPV

I

LRC

KIR 基因家族

3DL3 2DL3 2DP1 2DL1 3DP1Haplotype A

2DL4 2DS4 3DL23DL1

3DL3 2DS2 2DL2 2DL43DP1 2DL5 2DS1 3DL22DS53DS1Haplotype B

Inhibitory (L) Activating (S) pseudogene

KIR 基因家族： 14 个功能性框架基因、 2 个假基因。

IPD-KIR database ( http://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/ )

KIR 等位基因的命名方式

KIR 框架基因名称后紧接着“ *” 号，“ *” 号之后的前 3 位数表示等位基因，即编码区的非同义突变；第 4 、 5 位数表示编码区的同义突变，第 6 、 7 位数表示非编码区的碱基取代。KIR3DL1/3DS1 ：同一基因座，不同的 lineage ，等位基因不重叠命名，如有 3DL1*002 ，则没有 3DS1*002 。            

KIR2DL2/2DL3

序号 相同 不同1 同一基因座编码 检出频率不同，以南方汉族为例，

2DL3: 达 98.4%; 2DL2: 20.7%

2 配体相同：与HLA-C1 配位

2DL3 与单倍体 A 相关， 2DL2 与单倍体 B 相关， 2DL2-2DS2 存在LD

3 L 型，传导抑制信号 抑制能力： 2DL2-C1>2DL3-C1

4 在不同人群中，与不同的疾病相关联。

KIR 新等位基因的序列提交• accession number GenBank: http://

www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.htmlEMBL: http://www.ebi.ac.uk/Submissions/index.html

DDBJ: http://www.ddbj.nig.ac.jp/sub-e.html

• KIR Nomenclature Committee http://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/submit_guide.html

• Full length sequences are preferable though not essential.

• 2DL1*020 （ GQ421728 ）， Hou L., Hurley C.K., Jiang B.; tggtcgtcag catggcgtgt gttgnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120• nnnnggttct tcttgctgca gggggcctgg ccacatgagg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 180• nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gagtccacag aaaaccttcc ctcctggccc acccaggtcg 300 • cctggtgaaa tcagaagaga cagtcatcct gcagtgttgg tcagatgtca tgtttgaaca 360• cttccttctg cacagagagg ggatgtttaa cgacactttg cgcctcattg gagaacacca 420 • tgatggggtc tccaaggcca acttctccat cggtcgcatg acgcaagacc tggcagggac 480 • ctacagatgc tacggttctg ttactcactc cccctatcag gtgtcagctc ccagtgaccc 540• tctggacatc gtgatcatag nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 600• nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 660• gtctatatga gaaaccttct ctctcagccc agctgggccc cacggttctg gcaggagaga 720 • atgtgacctt gtcctgcagc tcccggagct cctatgacat gtaccatcta tccagggaag 780 • gggaggccca tgaacgtagg ctccctgcag ggcccaaggt caacggaaca ttccaggctg 840 • actttcctct gggccctgcc acccacggag ggacctacag atgcttcggc tctttccatg 900 • actctccata cgagtggtca aagtcaagtg acccactgct tgtttctgtc acagnnnnnn 960 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1020• nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngaaacc cttcaaatag ttggccttca 1080 • cccactgaac caagctccaa aaccgnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1140• nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1200• nnnnngtaac ccccgacacc tgcacattct gattgggacc tcagtggtca tcatcctctt 1260• catcctcctc ttctttctcc ttcatcgctg gtgctccaac aaaaaaannn nnnnnnnnnn 1320• nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1380 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnatg ctgcggtaat ggaccaagag tctgcaggaa 1440 • acagaacagc gaatagcgag nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1500 • nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1560• gactctgatg aacaagaccc tcaggaggtg acatacacac agttgaatca ctgcgttttc 1620• acacagagaa aaatcactcg cccttctcag aggcccaaga cacccccaac agatatcatc 1680 • gtgtacacgg aacttccaaa tgctgagtcc agatccaaag ttgtctcctg cccatga 1737

KIR 基因结构

功能性 KIR 基因组全长序序在 10-16 kb, HLAⅠ 类等位基因全长序列 3.3 kb, 具有 5’-promotor ~ 3’-UTR 区的 KIR 等位基因总数为 304 个。

KIR2D

Leader D0 D1 D2 Linker TM Cyt.

116 Kb

KIR3D

KIR2DL4/5

KIR3DL3

KIR3DP1a

KIR3DP1b

                       2DL2 2DL3 2DL5B 2DP1 2DL1 3DL1 3DS1 2DL5A 2DS3 2DS5 2DS1 2DS42DS2 0.976 -0.988 0.512 -0.687 -0.687 -0.181 0.193 0.130 0.373 0.151 0.164 -0.164

<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 0.025 0.014 NS <0.001 NS 0.038 0.0382DL2 -0.964 0.526 -0.705 -0.705 -0.139 0.150 0.086 0.386 0.098 0.122 -0.122

<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 NS NS NS <0.001 NS NS NS2DL3 -0.506 0.707 0.707 0.202 -0.186 -0.124 -0.366 -0.145 -0.186 0.186

<0.001 <0.001 <0.001 0.009 0.016 NS <0.001 NS 0.016 0.0162DL5B 0.136 0.136 -0.316 0.325 0.223 0.838 0.172 0.286 -0.286

NS NS <0.001 <0.001 0.007 <0.001 0.037 <0.001 <0.0012DP1 1.000 -0.064 0.090 0.110 0.172 0.050 0.090 -0.090

<0.001 NS NS NS 0.029 NS NS NS2DL1 -0.064 0.090 0.110 0.172 0.050 0.090 -0.090

NS NS NS 0.029 NS NS NS3DL1 -0.952 -0.887 -0.382 -0.806 -0.984 0.984

<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.0013DS1 0.902 0.427 0.783 0.936 -0.936

<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.0012DL5A 0.411 0.810 0.902 -0.902

<0.001 <0.001 <0.001 <0.0012DS3 0.118 0.356 -0.356

NS <0.001 <0.0012DS5 0.819 -0.819

<0.001 <0.0012DS1 -1.000

<0.001

Linkage Disequilibrium Analysis of KIR Genes in CEPH( National Cancer Institute ， Maureen P Martin, Lewontin’ Standardised measure, D’ )

• LD 3DS1-2DS1

• LD 2DS4-3DL1

• LD 2DL1-2DP1

• LD 2DL2-2DS2

• LD 2DL5-2DS3/2DS5

KIR 基因的多态性• 等位基因水平• 单倍体组成• NK 细胞表达水平• 不同人群之间的差异

IPD-KIR 数据库公布的 KIR 等位基因， Release 2.4.0 除两个假基因外，包括 14 种功能性的 KIR 框架基因，每一框架基因具有 14~107 个不同的等位基因。

框架基因

2DL1

2DL2

2DL3

2DL4

2DL5

2DS1

2DS2

2DS3

2DS4

2DS5

3DL1

3DS1

3DL2

3DL3

2DP1

3DP1

总数

所有等位基因数 43 28 34 46 41 15 22 14 30 16 73 16 84 107 22 23 614

已公布序列的等位基因数 43 27 32 46 40 15 22 13 30 16 70 16 84 101 22 23 600

未公布序列的等位基因数 0 1 2 0 1 0 0 1 0 0 3 0 0 6 0 0 14

nulls 等位基因数 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 6

蛋白质种类 24 11 17 22 17 7 8 5 13 11 58 12 61 55 0 0 321

3DL3-2DS2-2DL2-2DL5B-2DS3-2DP1-2DL1*004-3DP1-2DL4-3DS1-2DL5A-2DS3-2DS1-3DL2 (f = 0.035)

3DL3-2DS2-2DL2-3DP1-2DL4-3DL1-2DS4-3DL2 (f = 0.14)X

+3DL3-2DS2-2DL2-2DL5B-2DS3-2DP1-2DL1*004-3DP1-2DL4-3DS1-2DL5A/3DP1-2DL4-3DL1-2DS4-3DL2

3DL3-2DL3-2DP1-2DL1-3DP1/2DL5A-2DS3-2DS1-3DL2

Historic Unequal Crossover within the KIR Gene Cluster

KIR 单倍体组成的差异3DL3 2DS2 2DL5B 2DP1 2DL1 3DP1 2DL4 2DL5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4 3DL2

2DL22DL3

2DS32DS5

3DL13DS1

12345678910111213141516171819202122232425262728293031323334353637

33223332222222222222322

3

233222

223

33

5

5333

3

3

33

? ?

? ?

? ? ? ?

L1L1L1L1S1S1S1L1S1S1L1S1L1L1L1L1L1S1S1S1L1L1L1

S1L1L1L1L1L1L1

L1

L1S1S1

inhibitory (L) activating (S) pseudogene

KIR genes are expressed on some but not all NK cell clones within a given individual

0 20 40 60 80 100 120

KIR2DL1

KIR2DL2

KIR2DL3

KIR2DL4

KIR3DL1

KIR3DL2

KIR2DS2

KIR2DS4

NK

NK

NKNK

NKNK

The more copies of a given KIR gene present in a given person, the greater the number of NK cells that express that gene

Valiente et al. Immunity, 1997

Li et al. PLoS Genetics, 2008

不同人群之间的差异• KIR3DL1*01501 仅在非洲人群中出检出，在其他人群中尚未见报道

(Artavanis, et al. J Immunol) 。• KIR3DL1*01502 为日本和南方汉族人群中检出频率最高，均大于 70% ；高

加索、非洲人群中的频率＜ 25% 。• KIR3DL1*001 、 *002 、 *004 和 *005 是高加索人群中检出频率最高的四种

等位基因，均大于 15%(Middleton, et al. Immunogenetics) ，但其中的KIR3DL1*002 和 *004 在南方汉族、日本人群中均未检出。

• KIR3DL1*004 、 *01501 、 *01701 和 *031 在非洲人群中检出率均大于 10% (Jiang, Tissue Antigens) ，但在中国南方汉族人群和日本人群中均未检出。

南方汉族 KIR-HLAⅠ 类复合物多态性• KIR 框架基因频率、单倍体组合型频率等数据和论文，以往研究

者作了大量的报道。• KIR 发挥作用，依赖于相应的配体存在。• KIR 与移植、疾病关联研究中，不仅仅是 KIR 基因多态性， HLAⅠ 配体 单个 KIR+HLA

“KIR—HLAⅠ 类配体复合物”基因组合型• 从四个方面调查南方汉族无关人群 KIR—HLAⅠ 类复合物多态性

Observed frequencies of KIR frame genes in southern Chinese Han population (n=503)

KIR locus KIR3DL1

KIR2DL1

KIR2DL3

KIR2DS4

KIR2DL2

KIR2DL5

KIR3DS1

KIR2DS1

KIR2DS2

KIR2DS3

KIR2DS5

KIR2DL4

KIR3DL2

KIR3DL3

KIR2DP1

KIR3DP1

Observed Frequencies

（%）

96.2 99.2 98.4 96.2 20.7 37.6 33.6 32.6 20.7 18.5 22.9 100 100 100 99.2 100

KIRprofile ID

3DL1

2DL1

2DL3

2DS4

2DL2

2DL5

3DS1

2DS1

2DS2

2DS3

2DS5

2DL4

3DL2

3DL3

2DP1

3DP1

检出次数 频率 (%)

AA1 275 54.7

AB2 62 12.3

AB3 16 3.2

AB4 26 5.2

AB5 16 3.2

AB6 8 1.6

AB7 7 1.4

AB8 35 7.0

AB9 7 1.4

AB11 3 0.6

AB13 4 0.8

AB14 8 1.6

AB15 1 0.2

AB17 1 0.2

AB23 2 0.4

AB27 3 0.6

AB29 1 0.2

AB33 1 0.2

AB188 2 0.4

BB68 3 0.6

BB69 3 0.6

BB70 3 0.6

BB71 2 0.4

BB75 6 1.2

BB76 2 0.4

BB81 1 0.2

BB113 1 0.2

BB117 2 0.4

BB204 1 0.2

BB320 1 0.2

Frequencies of HLA ligands in southern Chinese Han population (n=503)

Locus Individuals Frequency (%)HLA-C1 471 98.1 HLA-C1/263ins 443 92.3 HLA-C1/263del 127 26.5 HLA-C2 142 29.6 HLA-C2/263ins 65 13.5 HLA-C2/263del 82 17.1 HLA-B Bw4-80I 162 33.8 HLA-B BW4-80T 158 32.9 HLA-A Bw4 149 31.0 HLA-A3/11 288 60.0

Frequencies of matched KIR+HLA pairs in southern Hans

KIR+HLA pairs Individuals Frequency (%)

Inhibitory2DL1+C2 141 29.4 2DL2/3+C1 471 98.1 3DL1+Bw4 motif* 352 73.3 3DL1+Bw4-80I 155 32.3 3DL1+Bw4-80T 153 31.9 3DL1+A Bw4 144 30.0 3DL2+A3/11 288 60.0 Activating2DS1+C2 48 10.0 2DS2+C1 98 20.4 3DS1+Bw4 motif 115 24.0 3DS1+Bw4-80I 45 9.4 3DS1+Bw4-80T 47 9.8 3DS1+A Bw4 59 12.3

KIR-HLA compound gene profiles in southern Han（ A total of 193 compound KIR-HLA ligand profile in 480 individuals was identified ）

KIR-HLAcompoundprofile ID

KIR gene profile ID

HLA-C1 HLA-C2

Bw4 MotifHLA-

BBw6

HLA-A3/11

IndividualsFrequency (%)HLA-B

Bw4-80IHLA-B

Bw4-80THLA-A Bw4

1 AA1 31 6.5 2 AA1 29 6.0 3 AA1 25 5.2 4 AA1 17 3.5 5 AA1 14 2.9 6 AA1 12 2.5 7 AA1 11 2.3 8 AA1 10 2.1 9 AA1 10 2.1 10 AA1 8 1.7 11 AA1 8 1.7 12 AA1 8 1.7 13 AA1 7 1.5 14 AA1 6 1.3 15 AA1 5 1.0 16 AA1 5 1.0 17 AA1 4 0.8 18 AA1 4 0.8 19 AA1 4 0.8 20 AA1 4 0.8 21 AA1 4 0.8 22 AA1 4 0.8 23 AA1 3 0.6 24 AA1 3 0.6

二、 KIR 基因的分子生物学检测方法1 、 KIR 框架基因有无的检测KIR PCR-SSP, Flow rSSO ， etc.

2 、 KIR 框架基因的测序

1 、 KIR 框架基因有无的检测• KIR PCR-SSP• 商品化试剂盒： Invitrogen, Inno-train, etc

1 、 KIR 框架基因有无的检测• NCI 方法：设计并采用两对 KIR 框架基因特异性异物检

测同一个 KIR 框架基因，防止漏检和丢失。• PCR 扩增：单个扩增、复合扩增（ Multiplex PCR ）• PCR 产物的检测：琼脂糖电泳，毛细管电泳自动检测

KIR2DS4 subtyping using Labchip GX machine

Detection of PCR product using melting curve analysis (Sybr-Green ， ABI 7900 )

KIR 框架基因有无的检测• 高通量 Flow-rSSO (Lot#004, n=77, 2 例与已知的 KIR SSP 结果不一致， rSSO 显示 KIR2DL2 存在 )

KIR 框架基因有无的检测

初检采用商品化 KIR SSP 检测 KIR2DL2 结果为阴性，复检采用 NCI 的方法结果仍为阴性。

KIR 框架基因有无的检测• 调节第20号磁珠荧光校准 cut-off 值 , 更新后的Lot#005 rSSO 的结果为阴性，与KIR SSP 结果相一致。 KIR的应用研究中，重视质量控制和平行对照。

KIR 框架基因的测序1 、不同的 KIR 框架基因，其表达水平不同： McErlean 等研究发现，不同的 KIR 框架基因 mRNA 表达水平由高到低依次为：

KIR3DL2>KIR2DS2>KIR3DS1> KIR2DS5 >KIR2DL5>KIR2DS3>KIR2DL1 >KIR3DL1 > KIR2DS1>KIR2DL2>KIR2DL4> KIR2DS4 >KIR2DL3 。

2 、同一框架基因中的不同等位基因，其表达水平、介导的抑制性 / 激活性强弱也存在差异。

McErlean 等报道 KIR3DL1 mRNA 表达水平由高到低依次为： KIR3DL1*007>*004>*00101>*002> *005>*01502>*008

Yawata 等研究发现 KIR3DL1 各等位基因： 在细胞膜上表达水平由高到低依次为： KIR3DL1*01502>*020>*001>*007>*005 介导的抑制性作用由强到弱依次为： KIR3DL1*001> *005>*01502>*020>*007

从等位基因水平开展 KIR多态性的应用研究十分必要。

KIR 框架基因的测序• 当前尚无商品化 KIR 测序分型试剂，• 也没有配套的 KIR 分析软件。 当前大多采用 PCR-SSP 和 Flow-rSSO 方法检测

受检者 KIR 框架基因的有、无，目前尚达不到等位基因水平。

KIR 框架基因测序的策略

KIR3DL1

E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9

bp 34 36 285 300 294 51 102 53 177

leader D0 D1 D2 stem cytoplasmic

transmenbrance

5’pro 3’-UTR

14kb

南方汉族 SSP 法 KIR 框架基因的检测结果

288 个随机个体， KIR3DL1 框架基因阳性个体 279个，阳性率为 96.88% ， 图 1 PCR-SSP 法 KIR 框架基因的扩增效果

• DNA 序列比对软件 :Clustal

PCR-SBT 的 PCR 产物特异性扩增效果

KIR3DL1 各外显子 PCR 产物电泳图图中第 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6孔为 KIR3DL1阳性标本，第 7孔为KIR3DL1 阴性标本。 M ： TaKaRa DL2000 marker

PCR 产物的纯化 采用 OMEGA 公司的磁珠试剂纯化 PCR产物。 10

μL扩增产物中加入 18 μL磁珠悬浮液，混匀后，室温下孵育 5min ，而后放到磁力架上，采用全自动工作站进行操作。

KIR3DL1 框架基因 PCR-SBT 测序

表 3 南方汉族人群 KIR3DL1 等位基因检出频率及其与其它人群的比较

KIR3DL1

等位基因检出频率 (%)

南方汉族 （ n=279 ） 日本人群 [12]

（ n=116 ） 高加索人群 [13] (n=151)

非洲人群 [14]

（ n=99 ）3DL1*001 9 ． 68 12.07 31.79b 17.17c

3DL1*002 0 0 16.56 3.03

3DL1*004 0 0 35.76 17.17

3DL1*005 25.45 22.41 26.49 11.11c

3DL1*007 15.77 25.00a 12.58 8.08

3DL1*008 0.36 0 10.60b 3.03c

3DL1*009 0 0 2.65 0

3DL1*01501 0 0 0 29.29

3DL1*01502 76.70 70.69 14.57b 23.23c

3DL1*016 0 0 0 1.01

3DL1*01701 0 0 0 10.10

3DL1*019 0 0 1.32 2.02

3DL1*020 7.17 10.34 0 5.05

3DL1*022 0 0 0 6.06

3DL1*023 0 0 0 1.01

3DL1*025 0 0 0 2.02

3DL1*028 0 0 0 1.01

3DL1*029 3.58 0 0 1.01

3DL1*031 0 0 0 10.10

3DL1*033 0 0 0 2.02

3DL1*039 0 0 0 1.01

3DL1*041 0 0 0 2.02

3DL1*059 0 0 0 3.03

3DL1*00101variant 0.72 0 0 0

3DL1*01502variant 0.36 0 0 0

KIR2DS4 的测序• KIR2DS4 为 AA 单倍体组合型中唯一的激活型 KIR 框架基因，• 若 AA 型的个体中 KIR2DS4 等位基因均因第 5 外显子存在

22 bp 缺失 ( 如： 2DS4*003, 004, 006~010, 012, 013) ，导致产生无激活效应的变异体，则不存在任何激活型 KIR 框架基因。

• AA 型、携带 2 个无激活效应的 KIR2DS4 变异体的个体，在高加索人群中达 14% ，在南方汉族中占 8.55% (43/503 ）。

KIR2DS4 的测序 Exon1 exon2 intron2 exon4 intron4 exon5 intron5 exon6 exon7 exon8

2DS4-F2DS4-F 2DS4-R2DS4-R

2DS4-4F2DS4-4F 2DS4-4R2DS4-4R 4DS4-5F4DS4-5F 2DS4-5R2DS4-5R

PCR PCR 扩增扩增

扩增引物 引物序列2DS4-F 5’-AAGGTTGGCTRCACCGAGAT-3' 2DS4-R 5'-TTCCAGCATAGGAGACAGAG-3'

类型 个数 频率Normal/Normal 96 0.522

Normal/Deleted 54 0.293

Deleted/Deleted 24 0.130

KIR2DS4 第五外显子完整 / 缺失情况(n=184)

KIR2DS4 的多态性 等位基因 中国汉族人群 北爱尔兰人群

南方汉族 浙江汉族KIR2DS4*00101KIR2DS4*003KIR2DS4*004KIR2DS4*006KIR2DS4*007KIR2DS4*010KIR2DS4*015KIR2DS4*010ne

wKIR2DS4-

NormalKIR2DS4-

DeletedNormal/NormalNormal/DeletedDeleted/Deleted

0.6580.0330.1000.00500.1390.0030.0080.6770.2770.5220.2930.130

0.5760.0710.07100.114---0.5760.256

0.360.640.070.33----0.2450.7050.130.230.59

KIR2DL3 的测序分型

三、 KIR 与骨髓及器官移植

KIR 与 SCT

• Ruggeri et al. 首次报道，在 AML患者经血缘关系、 HLA 相合的供者骨髓移植， KIR 配体不匹配，可以减少白血病复发及GvHD 的发生，促进移植患者的长期成活 (1999, Blood; 2002,Science; 2007, Blood) 。

• 以后的研究者基于血缘、非血缘关系 HSCT ，以及不同的白血病类型的病例进行回顾性分析， Bishara 等没有发现 KIR 配体错配的优势， Miller 等报道 KIR错配产生的抗白血病复发效应不明显，但会导致 GvHD增加。 造血干细胞移植中供 - 受者 KIR 是否应相合，还有待深入研究。

Verheyden S et al. 2008, Leukemia

HLA-E 与 SCT• HLA-E interacts with the NKG2A and NKG2C receptors on NK cells and on a subset of CD8+ T cells

•HLA-E is a low polymorphic non-classical HLA class I gene, with only two functional alleles; HLA-E*01:01 and HLA-E*01:03

• HLA-E*01:03 is higher expressed on cell surface of PBMC than HLA-E*01:01 (Lauterbach et al. submitted)

  90 100 110

E*01:01 LRGYYNQSEA GSHTLQWMHG CELGPDRRFL

E*01:03 ---------- ---------- ------G---

107

Marcel G.J. TilanusTransplantation Immunology Maastricht Tissue Typing Laboratory

Marcel G.J. Tilanus

HLA-E in SCT• HLA-E polymorphism is associated to risk of GVHD, severe

bacterial infections and mortality in stem cell transplantation

KIR 与 肝移植

原位同种肝脏移植 (orthotopic liver transplant, OLT) 治疗终未期肝病和致死性肝功能衰竭的有效手段。

肝移植患者病因分析• 病因：• 急性肝衰• 肝硬化• 酒精性肝硬化• 胆汁性肝硬化• 原发性胆管硬化• 硬化病• 代谢性疾病• 癌症

KIR 与成人原位肝移植（一）• 当前肝移植临床的实际中，无需像肾移植那样检测针对供者的特异性预存抗体，也不考虑供 / 受者 HLA-A 、 B 、 DRB1 配型的程度。• 受供肝来源短缺的影响，供 - 受者 ABO 血型不合的肝移植病例，也在研究应用中。• 肝移植患者需长期服用免疫抑制剂来预防和治疗急性排斥反应。但长期使用免疫抑制剂会导致肾毒性等毒副作用；继发肝移植后肾功能进行性衰竭；对原发性肝癌肝移植患者而言，肿瘤易于复发和再生，而复发后患者 1 年生存率只有 18% 。

KIR 与成人原位肝移植（二）• 肝移植急性排斥反应为术后严重的并发症，发生率达 10%~70% 。• 2011 年， López-Álvarez发现 KIR2D 与肝移植排斥相关，供 /

受者的 HLA-C1/C2 相合时肝移植后一年内急性排斥率显著低于错配组（ 5% : 59% ）。

• Moya-Quiles 等发现病人带有 HLA-C*06 ，肝移植后发生急性排斥的机率要高；

• Moya-Quiles 报道病人带有 HLA-C*07 ，出现急性排斥明显减少， 未发现 HLA-A 、 B 基因配型与急性排斥相关。

KIR 与成人原位肝移植（三）• Hanvesakul 等发现供肝带有一个 HLA-C2 ，移植物丧失减少 16.2% 、病人十年成活率提高 13.6% ，而且对移植物长期生存研究中观察到 HLA-C2 组存在基因剂量效应。 Ahlenstiel 的 NK 细胞体外培养试验也发现HLA-C2 配体对 NK 细胞介导细胞毒性作用产生了较强的抑制。 • 但 Tran 等回顾性调查 913例源于德国 14 家移植中心的肝移植病例，结果并未发

现 Hanvesakul 等所报道的 HLA-C2供肝移植给患者对其长期成活有决定性的影响。 移植资料来源、病例类型、种族背景的不同，得到的结果存在很大的差异并难以重复。 但已有的研究报道，肝移植急性排斥主要集中在与 HLA-C 、 KIR 关联。

四、 KIR 与疾病的关联研究

KIR 与 HBV感染• 中国是乙型肝炎的高发地区，截止 2013 年，大约 1.2亿人感染 HBV ，其中，

每年大约 30 万 HBV 感染者死于肝硬化和肝癌 （ Cui Y ， 2013 ）

• Lu Zhi-min 等研究汉族 150 位 CHB患者、 251 位自发康复个体和 412 例健康个体的 KIR多态性，发现 KIR2DS2 、 2DS3 是 HBV易感基因， KIR2DS1 、 3DS1 和 2DL5 是 HBV拮抗基因；

• Xuejun Gao 等（ Clin Immunol. 2010 ）发现 KIR2DL1-C2 是 CHB 感染的易感因素，KIR2DL3-C1/C1 为 CHB 感染的保护因素。

• 不同抑制性 KIR 与 HLA-C1/C2 的亲合力不同， KIR2DL1-C2介导的抑制性信号最强，而 KIR2DL3-C1介导的抑制性信号最弱，携带 KIR2DL3-C1 的个体，其 KIR2DL3阳性 NK 细胞更容易被激活，进而杀伤 HBV 感染靶细胞 (Winter CC et al. J Immunol; Parham P et al. Science.)

KIR 与 HCV感染• HCV 感染是引起终末期肝病的主要原因之一 , 在 HCV 感染初期 70%-80% 的

病人发展成为持续性的慢性 HCV 感染 , 其中约 10%-20%HCV 感染者将转变成为肝硬化→肝癌 , 但大约 20%-40% 的 HCV 感染者能够自我清除 HCV 病毒。

• 大量研究 (Romero V, et al, Mol Immunol ； Khakoo SI ， et al. Science ； Vidal-Castiñeira JR,

et al. J Virol ； ) 表明， 2DL3/2DL3-HLA-C1C1 与低浓度 HCV 病毒感染后的自发清除相关。低浓度的 HCV 感染时，天然免疫占主导地位。

• 2DL3/2DL3-HLA-DRB1*1201 组合也与 HCV 病毒自发清除相关 (Romero V, et al, Mol Immunol ）

• 但是 KIR2DS2 、 2DS3 是否与持续性的慢性 HCV 感染有关在不同人群中还存在着很大的争议。

KIR 与 HIV• Qi Y, Martin MP, Gao X, Jacobson L, et al. KIR/HLA pleiotropism: protection against both HIV and

opportunistic infections. PLoS Pathog. 2006; 2(8):e79.• Martin MP, Gao X, Lee JH, et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the

progression to AIDS. Nat Genet. 2002; 31(4):429-34.• Martin MP, Qi Y, Gao X, et al. Innate partnership of HLA-B and KIR3DL1 subtypes against HIV-1. Nat

Genet. 2007 Jun;39(6):733-40.• Bashirova AA, Thomas R, Carrington M. HLA/KIR restraint of HIV: surviving the fittest. Annu Rev

Immunol. 2011; 29:295-317.• Pelak K, Need AC, Fellay J, et al. Copy number variation of KIR genes influences HIV-1 control. PLoS

Biol. 2011; 9(11):e1001208.• Single RM, Martin MP, Gao X, et al. Global diversity and evidence for coevolution of KIR and HLA. Nat

Genet. 2007; 39(9):1114- 1119.• Richard Apps, Ying Qi, Jonathan M. Carlson, et al. Influence of HLA-C Expression Level on HIV Control.

Science, 2013, 340:87-91.

从不同的感染途径，从高加索人群到非洲人群，从定性到定量，从单个的HLA 或 KIR 到 HLA+KIR ，进行了系统研究，提出了理论模式。

NK Cell Normal Cell

No Lysis

Dominant inhibition

iKIR HLA

Act. rec.

Protection

ligand

Lysis

Cytokines

Missing-self recognition

NK Cell

iKIR

Act. rec.

HIV+

Targetsligand

KIR regulate NK cell activity under normal and aberrant conditions

KIR 与白血病（一）• Shahsavar 等研究伊朗人群的 AML 、 ALL患者，发现

2DS3 对 AML具有保护作用，但对 ALL 没有。• 2DL2 和 / 或 2DS2 在 HLA-C1 存在时，对 CML 有抵抗作

用（Middleton, Turkey ）• 对 CML患者， 2DS4 表现易感性； 2DS3 对 ALL可能为保护作用（ Shaanxi Hans ）。

样本少，缺乏 NK 功能性实验的支持。

KIR 与白血病（二）• NK 细胞杀伤白血病细胞的机理、白血病细胞如何逃逸天然免疫的监控作用？• 通常恶性细胞 HLAⅠ 类分子表达下调或丢失，但不同的白血病， HLAⅠ 类分子下调的程度存在差异：

Bw6 组 HLA-B 抗原表达水平的下调程度＞ Bw4 分子， Bw4 为 KIR 的配体，保护 Bw4 组 HLAⅠ 类分子的表达，有利于抑制 NK 细胞

的活性。 Bw6 不是 KIR 的配体， Bw6 组 HLAⅠ 类分子表达下调有利于逃逸 T细胞毒性的作用；

• 正常情况下滋养层细胞上才有 HLA-G 分子表达，但一些白血病细胞（如： B-CLL ）反常地表达 HLA-G 分子。 HLA-G 与抑制性 2DL4 配位。

白血病细胞通过 HLA Ⅰ 类分子差异表达下调，以及非经典的 HLA-G 分子异常表达，逃逸 T 细胞毒性的作用及 NK 细胞监控作用。

KIR Disease AssociationsTumors

Association Disease2DL2/2DL3+Cw grp 1 (S)

Malignant Melanoma

3DS1/absence of Cw grp 2 &/or Bw4

Cervical Cancer

>5 activating KIR

Nasopharyngeal Carcinoma

Maternal-FetalMaternal AA haplotype; fetal Cw grp 2

Pre-eclampsia

Red=susceptibility Green=protection

Infectious Diseases

Association Disease3DS1/Bw4-80I

2DL2/2DS2HIV-1

HIV-1

2DL3/Cw grp 1 homozygosity3DS1/Bw4

3DS1/Bw4 80I

HCV

HCV assoc.HepatocellularCancer

Autoimmune/Inflammatory Diseases

Association Disease2DS1/2DS2+ Cw grp homozygosity

Psoriatic Arthritis

2DS1/Cw*062DS1;2DL5;KIR HAPLOTYPE B

Psoriasis Vulgaris

2DS1 Guttate Psoriasis

2DS2/Cw*03 Rheumatoid Vasculitis

2DS2+/2DL2- Scleroderma

2DS2/Cw grp 12DS2/2DL2

IDDM

2DS1&/or2DS2/Cw grp 1

Idiopathic Bronchiectasis

结束语KIR 在移植免疫、肿瘤免疫、胎母免疫、机体抗感染研究中，得到了广泛应用， KIR 的学术价值＞＞ HLA ，• 方法从框架基因的有无检测→精细的等位基因水平从定性→定量研究• 疾病关联 从单纯的 KIR 基因多态性→ KIR+HLA Ⅰ 类受配体复合物多态性，分析有意义的结果，并采用 NK 细胞功能实验进行验证。

谢谢您的聆听！致谢：部分幻灯片由美国 NCI 高小江和Maureen P Martin教授提供。