YUSRINA RAKHMAH/P05114031/BTK 11LAPORAN PRAKTIKUMREKAYASA BIOPROSESMateri: Kinetika Reaksi EnzimatisTanggal: 22 Maret 2012Asisten: EdiOLEH:YUSRINA RAKHMAHP051114031/BTKBIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANAINSTITUT PERTANIAN BOGOR2012Kinetika reaksi enzimatik enzim -amilase terhadap substrat amilumYusrina RakhmahMahasiswa Pascasarjana Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian BogorAbstrakAmilase merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis pati menjadi gulagula sederhana, seperti maltosa, maltotriosa, dan glukosa. Amilase merupakan biokatalisator yang mempercepat jalannya reaksi tampa ikut bereaksi. Kinetika reaksi enzimatik enzim -amilase terhadap substrat amilum dilakukan dengan mengukur kecepatan reaksi enzim -amilase terhadap substrat amilum pada beberapa konsentrasi substrat, yaitu 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, pada pH (7) dan suhu tetap (90-95oC), serta menghitung Km dan Vmax enzim. Nilai Km yang diperoleh pada praktikum kali ini adalah 0,4892, menunjukkan bahwa enzim -amilase mempunyai afinitas rendah terhadap substrat, sehingga kesetimbangan reaksi kearah E + S. Vmax atau kecepatan maksimum dari reaksi enzimatis ini diperoleh dengan nilai 12,64 ppm/menit, yang artinya pada enzim -amilase dapat mengubah substrat amilum menjadi glukosa sebesar 12,64 ppm tiap menitnya. Kecepatan laju reaksi enzimatik dipengaruhi oleh kadar substrat dan enzim. Pada penambahan substrat sampai jumlah tertentu dengan jumlah enzim yang tetap akan mempercepat reaksi enzimatik sampai mencapai maksimum. Namun penambahan substrat selanjutnya tidak akan menambah kecepatan reaksi.Kata kunci: enzim -amilase, substrat, kinetika enzim.PendahuluanLatar BelakangAmilase merupakan enzim yang penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis pati menjadi gulagula sederhana. Amilase mengubah karbohidrat yang merupakan polisakarida menjadi maltosa (alfa dan beta) ataupun glukosa (glukoamilase). Amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti tanaman, binatang dan mikroorganisme. Saat ini sejumlah enzim amilase telah diproduksi secara komersial. Penggunaan mikroba dianggap lebih prosepektif karena mudah tumbuh, cepat menghasilkan dan kondisi lingkungan dapat dikendalikan (wordpress.com, 2010). Untuk produksi enzim amilase dapat menggunakan berbagai sumber karbon, seperti molase, amilum, tepung jagung, tepung tapioka, dan sebagainya.Amilase sendiri adalah enzim yang merupakan biokatalisator yang mempercepat jalannya reaksi tampa ikut bereaksi. Pada umumnya enzim bekerja mengkatalis reaksi satu arah, meskipun ada yang mengkatalis reaksi dua arah. Enzim bekerja secara spesifik, karena sisi aktif enzim setangkup dengan permukaan subtrat tertentu. Umumnya enzim tidak dapat bekerja tanpa adanya suatu zat non protein tambahan yang disebut kofaktor. Enzim bersifat thermolabil, mudah rusak bila dipanaskan lebih dari 60C. Enzim merupakan senyawa protein, sehingga sifat protein masih melekat pada enzim. Enzim dibutuhkan dalam jumlah sedikit, sebagai biokatalisator, reaksinya menjadi sangat cepat dan berulang ulang. Enzim dapat bekerja didalam sel (endoenzim) dan diluar sel (ektoenzim). Enzim bekerja dengan membentuk kompleks substrat sebelum membentuk produk.Reaksi enzimatik merupakan reaksi spesifik yang dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain suhu, pH, tekanan, substrat dan jenis reaksinya. Pada praktikum ini, suhu dan pH dibuat tetap untuk menetapkan nilai Km dan aktivitas tertinggi dari enzim -amilase. Laju kinetika enzim dapat diukur berdasarkan penurunan konsentrasi substrat dan pengambilan contoh yang dapat dilakukan selama reaksi berlangsung (Mangunwidjaja dan Suryani, 1994). Kecepatan reaksi enzimatik juga dipengaruhi kadar enzim, jumlah enzim yang terikat substrat (ES) dan konstanta Michaelis (Km). Km menggambarkan kesetimbangan disosiasi kompleks ES menjadi enzim dan substrat. Nilai Km kecil berarti enzim mempunyai afinitas tinggi terhadap substrat maka kompleks ES sangat mantap, sehingga kesetimbangan reaksi kearah kompleks ES. Apabila nilai Km besar berarti enzim mempunyai afinitas rendah terhadap substrat, sehingga kesetimbangan reaksi kearah E + S. TujuanTujuan praktikum ini adalah untuk mempelajari kinetika reaksi enzimatik enzim alpha-amilase terhadap substrat amilum dan menghitung Km dan V max enzim.MetodologiAlat dan BahanAlat yang digunakan pada praktikum ini waterbath (suhu 90 95oC), spektrofotometer, tabung reaksi, gelas ukur, timbangan, vortex, erlenmeyer, dan stop watch.Bahan yang digunakan untuk enzim -amilase, substrat (larutan amilum) dengan konsentrasi 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% dan 0,5%, buffer fosfat sitrat pH 7.00 50 mM, standar glukosa, pereaksi DNS (garam Na K tartat + NaOH + aquades + DNS).Cara KerjaPembuatan kurva standarStandar glukosa dibuat dengan menyiapkan larutan glukosa murni dengan konsentrasi 0,0 mg/mL sampai 0,35 mg/mL dengan selang 0,05. Sebanyak 1 mL dari masing-masing larutan glukosa murni dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah 3 mL pereaksi DNS. Larutan divortex untuk dihomogenisasai kemudian dipanaskan dalam air mendidih selama tepat 5 menit (gunakan stop watch). Blanko dibuat dengan mengganti sampel dengan akuades dan diperlakukan sama. Setelah itu diukur absorbansinya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang () 550 nm. Kurva standar dibuat dengan memplot data konsentrasi glukosa murni (sumbu X) versus absorbansinya (sumbu Y). Catat pada tabel.Pengukuran kecepatan reaksi Enzim -amilase terhadap substrat amilum pada beberapa konsentrasi substratPrinsip pengukuran kecepatan reaksi enzimatis ini ialah laju hidrolisa amilum diukur dari glukosa yang terbentuk oleh reaksi enzim -amilase terhadap substrast amilum. Sebanyak 10 mL substrat amilum dengan konsentrasi 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5% dibuat dengan melarutkan amillum sesuai konsentrasi pada buffer fosfat sitrat pH 7. Substrat tersebut diinkubasi pada suhu 90-95oC. Pada masing-masing tabung substrat tersebut ditambahkan larutan enzim + buffer (0,1 mL enzim ditambah 0,9 mL buffer fosfat sitrat pH 7, 50 mM, kemudian dipanaskan pada suhu 90-95oC selama 5 menit). Campuran enzim substrat diinkubasi kembali pada suhu 90-95oC dan setiap 5 menit diambil sampel sebanyak 1 mL. Sampel tersebut ditambah 3 mL DNS, dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit dan diukur absorbansinya pada 550 nm. Catat pada Tabel 2. Kadar glukosa yang dibentuk oleh hasil hidrolisis enzim terhadap substrat amilum diukur dengan memplotkan absorbansi pada kurva standar di atas (pekerjaan no. 1) dan dicatat pada Tabel 3.HasilHasil pembuatan kurva standar glukosa diperoleh absorbansi dari setiap konsentrasi glukosa yang ditunjukkan dalam Tabel 1. Sedangkan grafik kurva standar glukosa, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.Absorbansi (sumbu Y) pada setiap konsentrasi glukosa murni (sumbu X).Konsentrasi Glukosa(mg/L)Absorbansi 550 nmUlangan 1Ulangan 2Rata-rata500,0310,0240,02751000,0600,0560,05801500,0980,0910,09452000,1480,1510,14952500,1940,1930,19353000,2290,2690,24903500,3130,3210,3170Kurva Standar GlukosaHasil pengukuran absorbansi dengan panjang gelombang () 550 nm pada berbagai konsentrasi amilum yang dihidrolisis oleh amilase setiap 5 menit, selama 30 menit,ditunjukkan pada Tabel 2. Grafik absorbansi dari beberapa konsentrasi amilum selama 30 menit ditunjukkan dalam Gambar 2.Absorbansi 550 nm pada berbagai konsentrasi amilum yang dihidrolisis oleh amilase setiap selang 5 menit.Waktu (menit)Absorbansi 550 nm (nm)Amilum 0,1%Amilum 0,2%Amilum 0,3%Amilum 0,4%Amilum 0,5%00,3670,4560,4650,6860,74350,3610,4350,5540,5100,739100,3780,4870,5630,3730,526150,3960,4890,9610,4990,527200,4120,4980,4130,5850,554250,4360,4980,7070,5830,527300,4260,4760,7480,2990,536Absorbansi pada beberapa konsentrasi amilum selama 30 menit.Sedangkan konsentrasi glukosa yang diperoleh dari hasil hidrolisis oleh amilase terhadap berbagai konsentrasi substrat amilum setiap 5 menit, selama 30 menit, ditunjukkan pada Tabel 3. Grafik konsentrasi glukosa pada beberapa konsentrasi amilum selama 30 menit ditunjukkan pada Gambar 3.Konsentrasi glukosa yang diperoleh dari hasil hidrolisis oleh amilase terhadap berbagai konsentrasi substrat amilum setiap selang 5 menit.Waktu (menit)Konsentrasi Glukosa (mg/mL)Amilum 0,1%Amilum 0,2%Amilum 0,3%Amilum 0,4%Amilum 0,5%040449350272378053984725915477761041552460041056315433526998536564204495354506225912547353574462056430463513785336573Konsentrasi glukosa pada beberapa konsentrasi amilum selama 30 menit.Dari persamaan yang diperoleh dari konsentrasi glukosa pada beberapa konsentrasi amilum selama 30 menit, dapat dinyatakan bahwa y = ax + b, dimana a adalah slope dan dapat dinyatakan sebagai kecepatan reaksi (v) dari masingmasing konsentrasi substrat (s) amilum. Apabila a adalah kecepatan reaksi (v) dan b adalah substrat (s), maka dengan pengalihan persamaan MichelisMenten dapat diperoleh data seperti yang dapat dilihat pada tabel 4. Nilai kadar substrat amilum (s) terhadap kecepatan reaksi enzimatis (v) dan pengalihan persamaan MichelisMenten (1/s dan 1/v).s (%)v(ppm/menit)1/s1/v0.112,893010,00000,07760.27,03575,00000,14210.335,89303,33330,02790.4-28,67902,5000-0,03490.5-36,32102,0000-0,0275Dari data pengalihan persamaan yaitu dengan menggunakan nilai 1/s dan 1/v, dibuat lagi persamaan untuk mendapatkan nilai Km dan Vmax dari proses reaksi enzimatis amilase terhadap substrat amilum sehingga diperoleh kurva seperti yang terlihat pada Gambar 4.Kurva reaksi enzimatis amilase terhadap substrat amilum.Dari gambar 4. diperoleh persamaan yaitu y = 0.0387x - 0.0791 dimana nilai a = 0.0387 dan nilai b = 0.0791. Dari pengalihan persamaan MichelisMenten, yaitu:maka, dapat diketahui bahwa nilai b = dan nilai a = . Sehingga dari persamaan tersebut dapat diperoleh bahwasanya nilai Vmax adalah 1/b dimana nilai b adalah -0.0791, maka nilai Vmax = 12,64 ppm/menit, sedangkan nilai Km dapat diketahui dengan metode subtitusi nilai Vmax ke persamaan nilai a = Km/Vmax, sehingga , maka nilai Km adalah 0,4892.PembahasanBerdasarkan hasil pembuatan kurva standar glukosa diperoleh absorbansi dari setiap konsentrasi glukosa dengan persamaan, sebagai berikut:Dimana, y merupakan nilai absorbansi dari glukosa pada panjang gelombang 550 nm, dan x merupakan konsentrasi glukosa. Dari persamaan ini, maka dapat diperoleh kadar glukosa yang dibentuk oleh hasil hidrolisis enzim terhadap substrat amilum dengan memplotkan absorbansi beberapa konsentrasi amilum pada persamaan, seperti pada gambar 3.Dari hasil grafik konsentrasi glukosa pada beberapa konsentrasi amilum selama 30 menit diketahui bahwa, konsentrasi glukosa meningkat seiring lama waktu fermentasi, namun peningkatan tersebut juga dipengaruhi konsentrasi amilum. Ini dapat dilihat dari penurunan garis linier yang terjadi pada konsentrasi amilum 0,4% dan 0,5%. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi substrat yang tinggi dapat menghambat laju pembentukan produk. Menurut Mangunwidjaja dan Suryani (1994), pada reaksi dikatalisis enzim, laju kinetik pada konsentrasi substrat yang rendah merupakan garis lurus dan akan terhambat atau bahkan hilang pada konsentrasi substrat yang lebih tinggi. Reaksi enzimatik merupakan reaksi spesifik yang dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain suhu, pH, tekanan, substrat dan jenis reaksinya. Pada proses inkubasi dalam praktikum ini digunakan suhu 90-950C ditujukan untuk mengoptimalkan aktivitas enzim -amilase. Enzim -amilase pada umumnya memiliki aktivitas kerja pada kisaran suhu 250C sampai 950C (Poliana dan MacCabe, 2007). Enzim -amilase akan memotong ikatan glikosidik -1,4 pada molekul pati (karbohidrat), sehingga terbentuk molekul-molekul karbohidrat yang lebih pendek (Rodriguez, et al., 2007). Hasil dari pemotongan enzim ini antara lain maltosa, maltotriosa, dan glukosa.Pada praktikum ini, suhu dan pH dibuat tetap untuk menetapkan nilai Km dan aktivitas tertinggi dari enzim -amilase. Laju kinetika enzim diukur berdasarkan penurunan konsentrasi substrat dan pengambilan contoh yang dapat dilakukan selama reaksi berlangsung. Kecepatan laju reaksi enzimatik dipengaruhi oleh kadar substrat dan enzim. Pada penambahan substrat sampai jumlah tertentu dengan jumlah enzim yang tetap akan mempercepat reaksi enzimatik sampai mencapai maksimum. Namun penambahan substrat selanjutnya tidak akan menambah kecepatan reaksi.Kecepatan reaksi enzimatik juga dipengaruhi kadar enzim, jumlah enzim yang terikat substrat (ES) dan konstanta Michaelis (Km). Km menggambarkan kesetimbangan disosiasi kompleks ES menjadi enzim dan substrat. Nilai Km kecil berarti enzim mempunyai afinitas tinggi terhadap substrat maka kompleks ES sangat mantap, sehingga kesetimbangan reaksi kearah kompleks ES. Apabila nilai Km besar berarti enzim mempunyai afinitas rendah terhadap substrat, sehingga kesetimbangan reaksi kearah E + S. Nilai Km yang diperoleh pada praktikum kali ini adalah 0,4892. Ini menunjukkan bahwa nilai Km besar yang berarti enzim -amilase mempunyai afinitas rendah terhadap substrat, sehingga kesetimbangan reaksi kearah E + S. Vmax atau kecepatan maksimum dari reaksi enzimatis ini diperoleh dengan nilai 12,64 ppm/menit yang artinya pada enzim -amilase dapat mengubah substrat amilum menjadi glukosa sebesar 12,64 ppm tiap menitnya. KesimpulanKesimpulan yang dapat diambil dari praktikum ini adalah bahwa kecepatan laju reaksi enzimatik dipengaruhi oleh kadar substrat dan enzim. Pada penambahan substrat sampai jumlah tertentu dengan jumlah enzim yang tetap akan mempercepat reaksi enzimatik sampai mencapai maksimum. Namun penambahan substrat selanjutnya tidak akan menambah kecepatan reaksi.Nilai Km yang diperoleh pada praktikum kali ini adalah 0,4892, menunjukkan bahwa enzim -amilase mempunyai afinitas rendah terhadap substrat, sehingga kesetimbangan reaksi kearah E + S. Vmax atau kecepatan maksimum dari reaksi enzimatis ini diperoleh dengan nilai 12,64 ppm/menit, yang artinya pada enzim -amilase dapat mengubah substrat amilum menjadi glukosa sebesar 12,64 ppm tiap menitnya..Daftar PustakaMangunwidjaja, D., dan A. Suryani. 1994. Teknologi bioproses. Swadaya. Jakarta.Poliana, J., MacCabe A. P. 2007. Industrial Enzymes; Structure, Function, and Applications. Dordrecht: Springer. Halaman 20-22.Rodriguez, V. B., Alamenda E. J., Gallegos J. F. M., Requena A. R., Lopez A. I. G., Cabral J. M. S., Fernandes P., Fonseca de L. I. P. 2006. Modification of the activity of an a-amylase from Bacillus licheniformis by several surfactants. Electron J Biotechnol 9 (5).Wordpress.com. 2012. Amilase. http://ptp2007.wordpress.com/2008/05/15/ amilase/. Diakses pada tanggal 28 Juni 2012.