Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga...
Transcript of Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga...
![Page 1: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/1.jpg)
Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkällor
Sten-Erik Bäck
Klinisk kemi
Labmedicin Skåne
![Page 2: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/2.jpg)
Analyser inom allmänkemi
•Beställs ofta
•Har kort analystid
•Analyseras utan föregående upparbetning (utfällning, extraktion etc.)
•Baseras på spektrofotometri eller jonselektiv mätning
•Analyseras på samma plattform
•Använder färdigköpta reagens
•Utförs i plasma/serum
![Page 3: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/3.jpg)
Metodprinciper inom allmänkemi P-ALAT Enzym P-Koldioxid Enzymreagens P-ALP Enzym P-Kolesterol ER + Komplexbindning P-Ammonium Enzymreagens P-Kreatinin (enz) Enzymreagens P-Apolipoprotein A1 Immunturbidimetri P-Kreatinkinas (CK) Enzym P-Apolipoprotein B Immunturbidimetri P-LDL-kolesterol Enzymreagens P-ASAT Enzym S-LD Enzym P-Bilirubin, konj Komplexbindning P-Lipoprotein (a) Immunturbidimetri P-Bilirubin Komplexbindning S-Litium Komplexbindning P-Calcium Komplexbindning P-Magnesium Komplexbindning P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv mätning P-Fosfat Komplexbindning P-Natrium Jonselektiv mätning S-Gallsyror Enzymreagens P-Pankreasamylas Enzym P-Glukos Enzymreagens P-Paracetamol Immunoassay (EMIT) P-GT Enzym P-Salicylat Enzymreagens P-HDL-kolesterol Enzymreagens P-TIBC Immunturbidimetri P-Järn Komplexbindning P-Triglycerider Enzymreagens Dv-Kalium Jonselektiv mätning P-Urat Enzymreagens P-Kalium Jonselektiv mätning U-Urat Enzymreagens Dv-Klorid Jonselektiv mätning P-Urea Enzymreagens P-Klorid Jonselektiv mätning P-Homocystein Enzymreagens
![Page 4: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/4.jpg)
Metodprinciper inom allmänkemi P-ALAT Enzym P-Kolesterol Enzymregens
P-ALP Enzym P-Digoxin Immunoassay P-ASAT Enzym P-Paracetamol Immunoassay (EMIT) P-GT Enzym P-Apolipoprotein A1 Immunturbidimetri
P-Kreatinkinas (CK) Enzym P-Apolipoprotein B Immunturbidimetri S-LD Enzym P-TIBC Immunturbidimetri
P-Pankreasamylas Enzym Lp(a) Immunturbidimetri P-Ammonium Enzymreagens Dv-Kalium Jonselektiv mätning
S-Gallsyror Enzymreagens P-Kalium Jonselektiv mätning P-Glukos Enzymreagens Dv-Klorid Jonselektiv mätning P-HDL-kolesterol Enzymreagens P-Klorid Jonselektiv mätning
P-Koldioxid Enzymreagens Dv-Natrium Jonselektiv mätning P-Kreatinin (enz) Enzymreagens P-Natrium Jonselektiv mätning
P-LDL-kolesterol Enzymreagens P-Bilirubin, konj Komplexbindning P-Salicylat Enzymreagens P-Bilirubin Komplexbindning
P-Triglycerider Enzymreagens P-Calcium Komplexbindning P-Urat Enzymreagens P-Fosfat Komplexbindning U-Urat Enzymreagens P-Järn Komplexbindning
P-Urea Enzymreagens S-Litium Komplexbindning P-Homocystein Enzymreagens P-Magnesium Komplexbindning
![Page 5: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/5.jpg)
Enzymbestämningsmetoder
• Enzymer används som markörsubstanser
• Goda analysegenskaper
– Känsliga
– Lätta att mäta
– Billiga
![Page 6: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/6.jpg)
Princip: do your thing!
• Substrat ↔ Produkt
• Substrat i överskott
• Lämpliga reaktionsbetingelser i övrigt (pH, temperatur, coenzymer etc.)
• Ett signalsystem
=> Reaktionshastigheten = k x Ea (µkat/L)
![Page 7: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/7.jpg)
Ofta utnyttjat signalsystem
NADP+ + H+ + 2e- NADPH
![Page 8: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/8.jpg)
Enzymbestämningsmetoder
• Mäter omvandlingen substrat – produkt
• Betingelserna (pH, temperatur, cofaktorer etc.) avgör hastigheten
• Optimerade betingelser för mätning har definierats av IFCC
• Spårbarhet?
![Page 9: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/9.jpg)
Enzymbestämningsmetoder - mer eller mindre komplexa
Nitrofenylfosfat+ H2O Nitrofenol (gul) + fosfat (ALP)
L-Laktat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+ (LD)
L-Alanin + 2-oxoglutarat pyruvat + L-glutamat (ALAT) Pyruvat + NADH + H+ L-Laktat + NAD+ (LD)
L-Aspartat + 2-oxoglutarat oxalacetat + L-glutamat (ASAT) Oxalacetat + NADH + H+ L-Malat + NAD+ (MDH)
Kreatinfosfat + ADP kreatin + ATP (CK) ATP + D-glukos ADP + G6P (HK) G6P + NADP+
D-6-fosfoglukonat + NADPH + H+ (G6PDH)
![Page 10: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/10.jpg)
Enzymer som reagens
• Metoderna mäter substratkoncentration
• Hög specificitet för ett visst substrat eller en substratfamilj – ex ureas, urikas,
glukosoxidas
– eliminerar behovet av upparbetning
– minskar interferensrisken
Kreatinin
Urat
Ammoniak
Urea
Glukos
Laktat
Triglycerider
etc.
![Page 11: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/11.jpg)
Kopplad reaktion för ökad specificitet
Glukos + ATP ADP + glukos-6-fosfat (HK, ospec)
Glukos-6-fosfat + NADP+ 6-fosfoglukonat +
NADPH + H+ (G6PDH, spec för glukos)
![Page 12: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/12.jpg)
Jfr CK-metoden
Kreatinfosfat + ADP kreatin + ATP (CK)
ATP + glukos ADP + G6P (HK)
G6P + NADP+ 6-fosfoglukonat + NADPH + H+
(G6PDH) (Kreatinfosfat, ADP, glukos, NADP, HK, G6DPH i överskott)
![Page 13: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/13.jpg)
Exempel: kreatinin
• Tidigare metod (Jaffe) komplexbindning med pikrat
– känslig för interferenser (glukos, protein, bilirubin, ketonkropper etc. etc.)
– många metodvarianter för att öka specificiteten
![Page 14: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/14.jpg)
Trinderreaktionen
Färgreaktion
• H202 + 4-aminofenazon + fenol -> kinoniminfärgämne
Används i metoder för t ex
• Kreatinin
• Laktat
• Glukos
• Triglycerider
• Kolesterol
• HDL
• LDL
• Urat
![Page 15: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/15.jpg)
Kreatinin + H2O Kreatin (kreatininas) Kreatin + H2O Sarkosin + Urea (kreatinas) Sarkosin + O2 + H2O Glycin + HCHO + H2O2 (sarkosinoxidas)
Urat + 2 H2O + O2 Allantoin + CO2 + H2O2 (urikas)
Kolesterolester + H2O Kolesterol + RCOOH (kolesterolesteras) Kolesterol + O2 Kolest-4-en-3-on + H2O2 (kolesteroloxidas)
Metoder som utnyttjar Trinderreaktionen
![Page 16: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/16.jpg)
![Page 17: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/17.jpg)
Komplexbindningsmetoder
• Användning av speciella bindarmolekyler som bildar färgade komplex med hög affinitet för analyten – Pikrinsyra (Kreatinin)
– Diazoreagens (Bilirubin)
– BAPTA (Ca)
– FerroZine (Fe)
– CPZ-III (Mg)
• Traditionell klinisk kemi
![Page 18: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/18.jpg)
Jonselektiva elektroder (ISE)
• Används för mätning av elektrolytkoncentrationer (eller -aktiviteter!)
• Elektrokemisk mätteknik
• Vanliga Na, K, (Cl)
• Med eller utan spädning av provet
![Page 19: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/19.jpg)
Interferens
• Analytisk
– Interfererar i reaktionen
– Hög bakgrund
– Kompetitiv interferens
• Biologisk interferens
– Hemolys (inte Hb)
![Page 20: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/20.jpg)
Vanliga interferenser
Källa Hur
Hemolys biologisk interferens via eryrocytkomponenter, spektral interferens (Hb), direkt interferens (Hb)
Bilirubin hög bakgrund, direkt interferens, kompetitiv interferens
Lipider ljusspridning, volymseffekter
![Page 21: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/21.jpg)
Interferenser
![Page 22: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/22.jpg)
Hb-interferens i konjugerat bilirubin
![Page 23: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/23.jpg)
![Page 24: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/24.jpg)
Interferenstestning
• Interferogram enligt Glick*
• Rekommendationer finns i CLSI-dokumentet EP7-A2. Interference testing in clinical chemistry (CLSI 2005).
*Glick MR, Ryder KW, Jackson SA. Graphical comparisons of interferences in Clinical Chemistry Instrumentation. Clin Chem 32:470-5;1986
![Page 25: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/25.jpg)
Lipidcentrifugering
• Centrifugering i >10 000 x g 10 minuter
ALAT Glukos
ALP GT
ASAT Järn
Bilirubin Kreatinin
Bilirubin, konjugerat LD
Ca Natrium, Kalium, Klorid
CK Pankreasamylas
CKMB Urat Fosfat Urea
![Page 26: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/26.jpg)
Ultrafiltrering
• Eliminerar bilirubininterferens i kreatininprover
![Page 27: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/27.jpg)
Elektrolyter i lipemiska prover – mäter vi rätt?
• Patient i Kristianstad med L-index 1093
– Obehandlat prov hade Na 114, K 4,0
– Efter lipidcentrifugering Na 125, K 4,4
• Från insert ISE:
![Page 28: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/28.jpg)
Pseudohyponatremi
• Falskt lågt analysresultat beroende på hög halt av lipider eller protein
• Inträffar med metoder som mäter koncentrationen efter spädning av provet (t ex flamfotometri eller indirekt ISE (Cobas))
• Direkt ISE (ABL) mäter rätt
![Page 29: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/29.jpg)
• Plasma innehåller normalt ca 93% vatten, i vilket elektrolyterna är lösta
• Resten utgörs av protein och lipider
• I extrema fall kan vattenandelen vara betydligt lägre
![Page 30: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/30.jpg)
Vad händer när provet späds?
• Vid en spädning följer färre natriumjoner med i alikvoten till det nya röret ju högre lipidhalt i provet
Prov 1 före spädning
Prov 2 före spädning
Prov 1 efter spädning
Prov 2 efter spädning
Spädningssteg
![Page 31: Kemiska metodprinciper inom allmänkemi samt vanliga felkälloribl-inst.se/wp-content/uploads/2016/09/Analysmetoder-Allmänkemi-160908.pdf · P-Digoxin Immunoassay Dv-Natrium Jonselektiv](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022041819/5e5d06a46065e95d8157016e/html5/thumbnails/31.jpg)
Direkt/indirekt ISE
• Direkt ISE (t ex ABL) påverkas ej av höga lipid-/proteinnivåer – ABL mäter därför 7% högre elektrolyter i prover
med normal lipid- och proteinhalt, men… • mätresultatet kompenseras för denna skillnad
– Perfekt korrelation för elektrolyter kan emellertid aldrig erhållas mellan direkta och indirekta ISE-mätningar, eftersom… • kompensationen för 7% undanträngd volym bara är en
genomsnittssiffra!