INTRODUCCIÓN A LAS SEPARACIONES

CROMATOGRÁFICAS.FUNDAMENTOS

Karla Backhoff

Alejandra Ramírez

Nallely Stephanie Ramírez Solano

CROMATOGRAFÍA Inventada Mikhail Tswett (1900)

para separar distintos pigmentos de la clorofila pasándola por una columna de carbonato de calcio.

Croma=Color

Graphein=Escritoχρομα

γραφω

Es la separación de dos o más compuestos

químicos en un medio

Fase Móvil: Gas ó Líquido

Fase Estacionaria: Inmiscible; es sólido o líquido fijado en un sólido.

La movilidad de los componentes de la mezcla a separar depende de la afinidad química o propiedades / FE & FM

Si 1 Componente tiene propiedades químicas = FM, tendrá gran movilidad, es decir, el efecto de retención que provocaría la fase estacionaria sería nulo.

El Desplazamiento diferencial de los solutos (Fenómeno de adsorción) al ser arrastrados por una FM sobre una FE, nos permite identificar cuantos componentes tiene una mezcla.

CLASIFICACIÓN

Cromatografía plana. FE=Placa plana o papel

Cromatografía en papelCromatografía en capa fina

Cromatografía en columna. FE=Columna

Según el fluido empleado:Cromatografía de Líquidos

Cromatografía de Líquida de Intercambio Iónico Cromatografía de Líquida de alta eficiencia Cromatografía de Líquida de Exclusión Cromatografía de Líquida de Adsorción Cromatografía de Líquida en fase Inversa y Normal

Cromatografía de GasesCromatografía de líquidos súper críticos

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

Se aplica la muestra sobre el papel Introducción del papel en la cubeta que contiene el disolvente. Éste atraviesa el papel por capilaridad arrastrando los componentes de la mezcla.

FE= papel de celulosa.FM= disolvente y la mezcla de varios líquidos que contiene agua.

Separación en función de la afinidad por las dos fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del punto donde se aplicó la muestra, y las menos solubles en agua y más solubles en el disolvente llegarán más lejos. Las sustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos físicos o químicos.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

• Con la ayuda de un capilar de vidrio, una pequeña cantidad de muestra se deposita sobre el adsorbente, muy cerca del

extremo inferior de la placa.

1

FE= Soporte inerte (Sílica)FM= Eluyente y muestra

Los compuestos que avanzan a lo largo de la placa se ven atraídos por fuerzas sobre la superficie del adsorbente, interaccionando el disolvente con ambos.

Esta interacción competitiva establece las velocidades relativas con que ascienden por la capa de adsorbente, el frente de disolvente y un determinado compuesto. Cuanto mayor es la polaridad de los compuestos, más intensamente se ven éstos atraídos por el adsorbente.

Eluyentes mas comúnes:

éter de petróleo Tolueno dietil-éter, t-butil-éter Diclorometano acetato de etilo n-pentano, n-hexano Ciclohexano tetracloruro de carbono éter dietílico Cloroformo Acetona Iso-propanol Etanol Metanol ácido acético

Adsorbentes más comunes:

Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

b) Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)

c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)

d) Poliamidas

FACTORES QUE INFLUYEN EN UNA SEPARACIÓN POR CCF

Pureza de los

disolventes

Limpieza de las Placas

Temperatura

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

La separación por cromatografía de intercambio iónico depende de la adsorción reversible de una molécula de soluto cargada a un grupo de intercambiadores iónicos inmovilizados de carga opuesta.

FE = resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados.FM = generalmente una solución amortiguadora de pH

5 ETAPAS

Equilibrio de la matriz

• pH, fuerza iónica

Adsorción de la muestra

Comienzo de la remoción

Fin de la remoción

SELECCIÓN DE LA MATRIZ

Fuertes: permanecen ionizadas en todo el rango útil de pH.

Débiles: disminuyen su ionización en función del pH.

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)-Gran sensibilidad-Determinaciones cuantitativas exactas-Determinación de compuestos no volátiles (alto Peso Molecular, iones metálicos) o termolábiles.-El sistema HPLC requiere una

mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el líquido a la columna.- La fase móvil fluye a través de la columna estrechamente empaquetada.-Presiones de hasta 1500 – 2000 PSI. -Tiempo de análisis reducido. -Los eluidos se identifican al

abandonar la columna por métodos: UV Índice de Refracción Fluoresencia

VENTAJAS DE HPLC

Resolución Elevada

Velocidad Sensibilidad elevada

DESVENTAJA DE HPLC

Pequeña capacidad

Limita purificaciones a gran escala

APLICACIONES

Pureza de materias primas Industria farmacéutica Productos de degradación Metabolitos en medicamentos en muestras

biológicas Análisis toxicológicos Análisis de muestras medioambientales

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE EXCLUSIÓN (FILTRACIÓN EN GEL)

-Fase Estacionaria: El material que llena la columna (gel o resina) está formado por partículas con poros de un cierto intervalo de tamaños.

-Las moléculas mayores que los poros no pueden entrar en ellos, por lo que "pasan de largo" y avanzan por la columna (eluyen) con mayor rapidez que las de tamaño menor, que pueden entrar en los poros y así realizan un recorrido mayor, progresando más lentamente a lo largo de la columna.

APLICACIONES DETERMINACIÓN DE MASAS

MOLECULARES

DETERMINACIÓN DE ESTRUCTURA 3ª Y 4ª DE PROTEÍNAS PURIFICADAS

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ADSORCIÓN

Las moléculas se fijan sobre sustancias insolubles:

Alúmina (Al2O3)Carbón activadoTierra de Diatomeas (Kieselguhr)Sacarosa pulverizadaGel de sílice

Asociaciones de Van der Waals

Enlaces H O

Eluyente:

Separa substancias No Polares

Columna polar – Disolvente no polar

Cloroformo Hexano Éter Etílico

Fase inversa (FI)– Fase móvil polar/ Fase estacionaria no polar

Fase normal (FN)– Fase móvil no polar/ Fase estacionaria polar

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS EN FASE INVERSA Y FASE NORMAL

Es la más utilizada actualmente. La separación se basa en interacciones

hidrofóbicas entre grupos hidrocarburo de la fase estacionaria y del analito.

Componentes más polares eluyen primero. La retención aumenta cuando aumenta la

hidrofobicidad del analito.

FASE INVERSA

FASE ESTACIONARIA APOLAR

Sílica con hidrocarburos saturados, insaturados o aromáticos de diferentes tipos.

Más empleados:• octadecil (C18)• octil (C8).

Cuanto mayor es el #C, mayor es la eficacia.

Agua o solución buffer con: MetanolAcetonitrilo TetrahidofuranoAcetato de etiloAcetona

FASE MÓVIL POLAR

Cuanto menos polar es el disolvente, más fuerza eluyente tiene

Elimina las colas de los picos. Menos sensible a impurezas en el eluyente. Se ha adaptado uso de columnas. HPLC: alta presión para mejorar la resolución

y reducir los tiempos de separación.

VENTAJAS

Separación compuestos Farmacéuticos Bioquímicos Forenses Clínicos Industriales

Purificacion de biomoleculas proteínas y péptidos. oligonucleótidos

Desalado Analisis cuantitativo

APLICACIONES

Primera descrita, menos utilizada Basada en interacción de los analitos con

grupos funcionales polares de la superficie de la fase estacionarial originada por fuerzas eléctricas entre dipolos permanentes o inducidos.

El componente menos polar se eluye primero, debido a que es el más soluble en la fase móvil

FASE NORMAL

Un aumento de la polaridad de la fase móvil, hace disminuir el tiempo de elución.

Sílica con grupo: grupo ciano diol amino dietilamino

Solventes muy apolares:

• hexano• heptano mezclados con

solventes más polares:

• isopropanol• cloroformo• etilacetato

FASE ESTACIONARIA

POLARFase móvil

apolar

La fuerza de elución de la fase móvil de modifica con n-hexano.

Herramienta de separación muy potente debido a la amplia gama de eluyentes disponibles que se pueden utilizar para ajustar con precisión la selectividad de una separación.

Se ha dejado de utilizar debido a su complejidad. Período de equilibrado prolongado Problemas de reproducibilidad Sensibilidad de la técnica a presencia de pequeñas

concentraciones de contaminantes polares en la fase móvil.

Si esto se controla, se obtiene cromatogramas mejores a los de fase reversa debido a la baja viscosidad de los eluyentes que se utilizan habitualmente.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS

Separación de: PAHs (Hidrocarbonos Policíclicos

Aromáticos).

LípidosAlcanosEsteroidesAzúcares

APLICACIONES

Analizar trazas de sustancias potencialmente cancerígenas y mutagénicas en aire, agua y efluyentes.

Es la técnica para la separación de compuestos orgánicos e inorgánicos térmicamente estables y volátiles

Se produce como consecuencia de la interacción de los componentes de una mezcla vapor en una fase móvil gaseosa inerte, con una fase estacionaria (sólido/líquido) de alto punto de ebullición sobre un sólido inerte

CROMATOGRAFÍA DE GASES

CROMATÓGRAFO DE GASES

PRINCIPIO

Gas portador: Medio de transporte de los componentes de la mezcla a través del sistema cromatográfico.

Debe ser inerte: Ar, He, N2

ColumnasCapilares:Sílice fundida.Diámetros interiores: 200-250 mm.Longitud < 20 m.

Micro-empacadasTubulares abiertas

EmpaquetadasTubo de acero inoxidable, niquel o vidrio. Diámetros interiores 1,6 -9 mm.Longitud > 3 m.Se rellenan de un material adsorbente adecuado.

A MENOR DIÁMETRO, MAYOR EFICIENCIA Y RESOLUCIÓN

EL INCREMENTO DE LA LONGITUD DE LA COLUMNA INCREMENTA EL NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS, Y ASÍ LA RESOLUCIÓN

Separaciones por punto de ebullición de compuestos en un intervalo amplio de pesos moleculares:

EscualanoPolidimetilsiloxano

Para hidrocarburos insaturados y otros compuestos

polidifenildimetilsiloxanopolicarboranometilcianoetilsilicón

Para compuestos nitrogenadospoliamidapolicianoetilmetilsilicon

Para alcoholes, ésteres, cetonas y acetatospolietilenglicolpentaeritritol tetracianoetilado

Fases estacionarias

DETECTORESDetector de captura de electrones (ECD)

Conductividad térmica

Espectroscopía de masas

PROPIEDADES DE LOS FLUIDOS SUPERCRÍTICOSLa Tc de una sust. es la

temp. por encima de la cual no puede existir en fase liquida independientemente de la presión.

La Pc es presión de vapor de una sust. a su Tc.

Una sustancia a T y P por encima de su Tc y Pc (punto critico) =

FLUIDOS SUPERCRITICOS

Cromatografía líquidos supercríticos

CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS

Es una modalidad híbrida entre cromatografía de gases y de líquidos que combina mejores características de cada una de ellas y permite la separación y determinación de compuestos que no son manipulados esas cromatografías.

Compuestos no volátiles o térmicamente lábiles para los que la cromatografía de gases es inaplicable.

Compuestos con grupos funcionales no detectables por técnicas espectroscópicas o electroquímicas empleadas en cromatografía de líquidos.

Equipo instrumental de cromatografía de fluidos supercríticos.

Parecido al de HPLC con los mismos límtes de temperatura y presión

•Horno: mantener la columna termostatizada y controlar la temperatura de la fase móvil.

• Restrictor (contrapresión): mantener la presión en la columna y convertir el eluyente, de fluido supercrítico en un gas, y arrastrarlo al detector. Un restrictor para columna tubular abierta de 50 -100 μm consiste en un capilar de 2 -10 cm. De longitud y 5 - 10 μm de diámetro el cual esta directamente unido al extremo final de la columna

•Microprocesadores: permiten control de variables instrumentales. •Detectores :ionización de llama respuesta universal a compuestos orgánicos, de elevada sensibilidad .Los espectrómetros de masas se pueden adaptar como detectores mas fácilmente para SFC que para HPLC.

FASE ESTACIONARIAColumnas abiertas: similares a las columnas de sílice fundida con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. Columnas rellenas.

CO2

Disolvente excelente para moléculas orgánicas no polares.Tc = 31º ; Pc =72.9 atm. Lo cual permite jugar con una banda amplia de temperaturas y presiones.

Fase móvil

APLICACIONES

Separación de:

* Fármacos * Tensoactivos

* Alimentos * Polimeros* Pesticidas * Explosivos * Herbicidas * Propelentes