KARAKTERISASI MOLEKULER TANAMAN PADI

NIPPONBARE TRANSGENIK 35S::OsERA1 YANG

TOLERAN KEKERINGAN

SISKA KARTIKA

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Karakterisasi

Molekuler Tanaman Padi Nipponbare Transgenik 35S::OsERA1 yang Toleran

Kekeringan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan

belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.

Penelitian ini didanai oleh BB-Biogen atas nama Dr. Tri Joko Santoso, S.P, M.Si.

Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun

tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan

dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, September 2013

Siska Kartika

NIM G84090038

ABSTRAK

SISKA KARTIKA. Karakterisasi Molekuler Tanaman Padi Nipponbare

Transgenik 35S::OsERA1 yang Toleran Kekeringan. Dibimbing oleh POPI ASRI

KURNIATIN dan BUDI SANTOSA.

Kekeringan merupakan salah satu faktor yang mengakibatkan pertumbuhan

dan perkembangan tanaman padi terhambat. Salah satu cara untuk mengatasi

masalah tersebut adalah dengan penggunaan tanaman padi transgenik yang toleran

kekeringan. Keberhasilan transformasi gen OsERA1 pada tanaman padi genotip

Nipponbare memerlukan konfirmasi lebih lanjut mengenai toleransi terhadap

cekaman kekeringan. Penelitian ini bertujuan mendapatkan genotip padi

Nipponbare transgenik OsERA1 toleran kekeringan, mengetahui jumlah salinan

gen, dan membandingkan biji padi isi dan hampa dengan kontrolnya. Evaluasi

toleransi kekeringan menggunakan metode Standard System Evaluation for Rice

(IRRI 1996). Hasil evaluasi diperoleh semua genotip transgenik toleran terhadap

kekeringan. Hasil karakterisasi molekuler dengan hibridisasi southern

menunjukkan tanaman padi transgenik memiliki 1-3 kopi transgen. Hasil cekaman

kekeringan menghambat pertumbuhan tanaman, yaitu menurunkan jumlah biji isi

dan meningkatkan kehampaan. Genotip 18.5.4 dan 6.4.10 dinilai toleran terhadap

kekeringan. Genotip 18.5.4 memiliki jumlah biji isi per malai 36 biji dan genotip

6.4.10 memiliki persentase biji hampa 38.03%.

Kata kunci: gen OsERA1, hibridisasi southern, kekeringan, padi transgenik

ABSTRACT

SISKA KARTIKA. Molecular Characterization of Drought Tolerant Nipponbare

Transgenic 35S::OsERA1 Rice Plants. Supervised by POPI ASRI KURNIATIN

and BUDI SANTOSA.

Drought is one of the factors that resulted in the growth and development of

rice plants inhibited. One way to overcome this problem is use of transgenic rice

plants that are tolerant to drought. The success of the transformation using

OsERA1 gene in Nipponbare genotype rice requires further confirmation of

tolerance to drought stress. The aim of this study was to obtain transgenic

Nipponbare genotype rice contain gene 35S::OsERA1 drought tolerant, know the

number of gene copies, and compare the contents and empty seeds with control.

The evaluation of drought the tolerance was performed using Standard System

Evaluation for Rice method (IRRI 1996). All tested transgenic genotypes were

tolerant to drought. Molecular characterization using southern hybridization

showed that transgenic rice plants had 1-3 copies of transgen. Drought stress

inhibited plant growth, which lowers the amount of seed and increasing the void

content. 18.5.4 and 6.4.10 genotypes are considered tolerant to drouht. 18.5.4

genotype have the number of grains per panicle contents of 36 seeds and 6.4.10

genotype have a 38.03% percentage of empty seeds.

Keywords: OsERA1 gene, southern hybridization, drought, transgenic plant

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

pada

Departemen Biokimia

KARAKTERISASI MOLEKULER TANAMAN PADI

NIPPONBARE TRANSGENIK 35S::OsERA1 YANG

TOLERAN KEKERINGAN

SISKA KARTIKA

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

Judul Skripsi : Karakterisasi Molekuler Tanaman Padi Nipponbare Transgenik

35S::OsERA1 yang Toleran Kekeringan

Nama : Siska Kartika

NIM : G84090038

Disetujui oleh

Popi Asri Kurniatin, S.Si.,Apt., M.Si

Pembimbing I

Dr Ir Budi Santosa, MP

Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc

Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan

karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan, serta shalawat dan

salam semoga tercurahkan pada Rasulullah SAW. Karya ilmiah yang berjudul

“Karakterisasi Molekuler Tanaman Padi Nipponbare Transgenik 35S::OsERA1

yang Toleran Kekeringan” ini ditujukan sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar sarjana sains di Departemen Biokimia yang dilaksanakan dari

bulan Januari sampai dengan Juni 2013 di Laboratorium Biologi Molekuler dan

Rumah kaca, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan

Sumberdaya Genetik Pertanian, Cimanggu-Bogor.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Popi Asri Kurniatin, S.Si., Apt.,

M.Si selaku pembimbing I dan Dr Ir Budi Santosa, MP selaku pembimbig II atas

bimbingan dan arahan yang telah diberikan. Terima kasih penulis juga sampaikan

kepada Dr Tri Joko Santoso SP.M.Si, Bapak Iman, Bapak Unang, Mira Sitepu,

dan teman-teman semuanya yang senantiasa memberikan bimbingan, ilmu,

dorongan, inspirasi, motivasi, dan arahan, serta kepada ayah, ibu, serta seluruh

keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam karya ilmiah ini. Oleh

karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk

perbaikan di masa mendatang. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2013

Siska Kartika

Judul Skripsi: Karakterisasi Molekuler Tanaman Padi Nipponbare Transgenik 35S::0sERAl yang Toleran Kekeringan

Nama : Siska Kartika NIM : 084090038

Disetujui oleh

Popi Asri Kum atin, S.Si.,Apt., M.Si ~MP Pembimbing I Pembimbing II

La 2G,\4Tanggal Lulus: U 5 r ""

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

PENDAHULUAN 1

METODE 2

Waktu dan Tempat Penelitian 2

Bahan 2

Alat 3

Prosedur Penelitian 3

HASIL 5

PEMBAHASAN 10

SIMPULAN DAN SARAN 14

Simpulan 14

Saran 15

DAFTAR PUSTAKA 15

LAMPIRAN 17

RIWAYAT HIDUP 22

DAFTAR TABEL

1 Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun menggulung

pada fase vegetatif) 3

2 Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun mengering

pada fase vegetatif) 4

3 Klasifikasi tanggap kesembuhan tanaman setelah perlakuan pemulihan 4

4 Skor hasil pengujian daun menggulung, daun mengering, dan skor

kesembuhan tanaman padi Nipponbare transgenik (generasi T2) dan

tanaman Nipponbare kontrol dengan perlakuan kekeringan pada fase

vegetatif 6

5 Hasil analisis dan pola integrasi gen sisipan (OsERA1) pada generasi

kedua (T2) pada kultivar Nipponbare menggunakan gen hptII untuk

PCR dan pelacak hpt untuk hibridisasi southern 8

6 Jumlah biji isi dan biji hampa tanaman padi Nipponbare transgenik dan

Nipponbare kontrol setelah perlakuan kekeringan 9

DAFTAR GAMBAR

1 Penampilan tanaman padi Nipponbare transgenik generasi T2 dan

Nipponbare kontrol setelah uji kekeringan. 6

2 Hasil amplifikasi PCR beberapa tanaman padi Nipponbare transgenik

menggunakan primer hptII. 7

3 Hasil amplifikasi PCR beberapa tanaman padi Nipponbare transgenik

menggunakan primer OsERAI-R. 7

4 Profil hibridisasi southern 16 genotip padi Nipponbare transgenik. 8

DAFTAR LAMPIRAN

1 Selisih bobot tanah per hari pada perlakuan cekaman kekeringan 17

2 Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA daun padi 18

3 Hasil amplifikasi PCR tanaman padi transgenik menggunakan primer

OsERAI-R 19

4 Hasil amplifikasi PCR tanaman padi transgenik menggunakan primer

hptII 20

5 Data kadar air tanah 21

PENDAHULUAN

Tanaman padi (Oryza sativa L.) merupakan penghasil beras dan menjadi

salah satu komoditas pangan utama. Beras merupakan sumber utama gizi dan

energi bagi lebih dari 90% penduduk Indonesia (BPS 2011). Saat ini, penyediaan

pangan terutama beras menjadi prioritas utama pembangunan nasional untuk

memenuhi kebutuhan penduduk Indonesia (Abdullah et al. 2007; Litbang Pangan

2012). Akan tetapi, usaha akan pemenuhan kebutuhan padi tersebut sering

terhambat oleh beberapa kendala, di antaranya adalah cekaman abiotik. Cekaman

abiotik yang umum dialami oleh tanaman padi adalah cekaman terhadap

kekeringan (Rachmawati 2006; Pratama 2010). Pemanasan global menyebabkan

berkurangnya ketersediaan air sehingga terjadi kekeringan yang berpengaruh

dalam peningkatan hasil produksi tanaman padi (Suardi 2002; Makarim 2009).

Kekeringan merupakan salah satu faktor yang berdampak terhadap produksi

tanaman. Pada tanaman padi, kekeringan mengakibatkan pertumbuhan dan

perkembangan tanaman terhambat. Akibat kekeringan tanaman dapat kehilangan

hasil sampai 50% (Jongdee et al. 2006). Hasil penelitian di rumah kaca

menunjukkan terjadi penurunan hasil padi rata-rata 52.3% pada lingkungan

tercekam kekeringan dibanding padi yang tumbuh pada lingkungan normal

(Sammaullah dan Darajat 2001).

Usaha untuk meningkatkan produktivitas tanaman padi toleran kekeringan

dapat dilakukan melalui rekayasa genetika. Bioteknologi atau teknologi molekuler

memiliki peranan penting dalam menghasilkan kultivar dengan sifat unggul baru.

Penggunaan varietas unggul merupakan cara paling ekonomis untuk mengatasi

masalah kekeringan yang diharapkan dapat menjaga produksi dan kestabilan hasil

padi (Soedarini & Patricia 2006). Hal yang penting dalam pengembangan ini

adalah memahami mekanisme toleransi kekeringan karena karakter kekeringan

dikendalikan oleh banyak gen. Gen-gen tersebut ada yang ekspresinya tergantung

asam absisat (ABA) dan ada yang tidak (Yamaguchi-Shinozaki dan Shinozaki

2005).

Asam absisat memiliki peranan penting dalam proses selular, di antaranya

perkembangan biji, dormansi, germinasi, pertumbuhan vegetatif, penutupan

stomata, dan respon terhadap cekaman. Asam absisat merupakan fitohormon yang

berperan di dalam membuka dan menutupnya stomata untuk mengurangi

kehilangan air pada tumbuhan saat terjadi transpirasi. Sejumlah gen pada tanaman

telah diketahui dapat meningkatkan dan menurunkan respon terhadap fitohormon,

terutama hormon asam absisat. Salah satunya adalah gen Enhanced Response to

ABA1 (ERA1) yaitu gen yang berperan dalam meningkatkan sensitifitas sel

penjaga pada stomata terhadap asam absisat. Gen ERA1 pertama kali diisolasi dari

tanaman model Arabidopsis thaliana. Gen ERA1 mengkode sub unit β dari enzim

farnesiltransferase yang berperan dalam respon tanaman terhadap hormon asam

absisat (Pei et al. 1998; Wang et al. 2005). Padi mutan era1 diidentifikasi

berdasarkan pada peningkatan dormansi biji dan kadar asam absisat yang sangat

sedikit. Padi mutan era1 menunjukkan adanya peningkatan toleransi terhadap

cekaman kekeringan melalui pengurangan intensitas membuka stomata dan

berkurangnya tingkat layu tanaman (Ziegeholfer et al. 2000).

Toleransi tanaman terhadap kekeringan juga dapat dinyatakan dalam tingkat

produktivitas tanaman (Passioura l983; Blum l988) yaitu membandingkan hasil

2

pada kondisi tercekam dengan kondisi optimal atau normal. Hall (1993)

menyatakan bahwa toleransi terhadap kekeringan dapat diukur dari produktivitas

relatif antara genotip yang satu dengan genotip yang lain pada saat mengalami

cekaman kekeringan yang sama.

Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan

Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN) sedang

mengembangkan padi yang toleran terhadap cekaman abiotik berupa kekeringan

dengan melakukan rekayasa genetik terhadap gen ERA1. Gen ERA1 dari tanaman

padi (Oryza sativa-ERA1 yang kemudian disingkat OsERA1) sebelumnya telah

berhasil diklon ke dalam vektor kloning pGEM-T easy oleh Peneliti di

Laboratorium Biologi Molekuler BB-BIOGEN. Selain itu, gen OsERA1 juga telah

berhasil disisipkan pada pCAMBIA 1301 yang kemudian ditransformasi ke dalam

kalus padi Nipponbare dengan menggunakan bantuan vektor Agrobacterium

tumefaciens dan promoter 35S sehingga terbentuk tanaman padi Nipponbare

transgenik OsERA1. Penelitian juga telah dilakukan terhadap tanaman padi

Nipponbare transgenik OsERA1 generasi T1 yang toleran terhadap cekaman

kekeringan. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lanjutan terhadap gen

OsERA1 pada generasi T2 dengan melakukan uji toleransi kekeringan dan

southern blot untuk mengetahui kestabilan gen OsERA1 di dalam tanaman padi

Nipponbare transgenik tersebut.

Penelitian ini bertujuan mendapatkan genotip padi Nipponbare transgenik

generasi T2 yang mengandung gen OsERA1 yang toleran kekeringan, untuk

mengetahui jumlah salinan gen OsERA1 pada genotip padi Nipponbare transgenik,

dan membandingkan biji isi dan biji hampa antara Nipponbare transgenik dengan

Nipponbare kontrol. Manfaat penelitian adalah genotip padi Nipponbare

transgenik OsERA1 yang toleran kekeringan dapat digunakan sebagai sumber

plasma nutfah padi dan dapat digunakan sebagai tetua persilangan untuk merakit

varietas unggul padi.

METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan dari Januari - Juni 2013. Tempat pelaksanaannya di

rumah kaca dan laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Jalan Tentara

Pelajar No.3A, Cimanggu-Bogor.

Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian antara lain benih padi

Nipponbare transgenik dan Nipponbare kontrol, nitrogen cair, bufer ekstraksi,

RNase, kalium asetat, natrium asetat, isopropanol dingin, primer hpt forward,

primer hpt reverse, 10x bufer PCR, larutan MgCl2, dNTPs, enzim Taq DNA

polimerase, ddH2O, agarosa, 1x bufer TAE, marker 1 kb ladder, enzim restriksi

EcoRI, plasmid pCambia OsERA1, Digoxigenin-11-dUTP (DIG-11-dUTP), 5x

GC Rich, 10 μM 35S forward, 10 μM OsERA1-reverse, membran Hybond-N+,

kertas Whatmann 3 MM, larutan denaturasi, larutan depurinasi, larutan netralisasi,

3

larutan 20x SSC, larutan washing, larutan antibodi, larutan developer, larutan fixer,

substrat CDP-Star, dan Amersham Hyperfilm.

Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian meliputi, mikropipet, tabung

eppendorf (0.5 mL, 1.5 mL, dan 2 mL), spin, ice maker, coolbox, waterbath,

inkubator, stirer, autoklaf, vorteks, pH meter, oven, sentrifus, neraca analitik Kern

770, nanodrop Thermo Fisher Scientific 2009, PCR DNA Engine Tetrad Peltier

Thermal Cycler 225, chemidoc gel system, microwave, shaker, dan tangki

elektroforesis.

Prosedur Penelitian

Analisis Tanaman Padi Transgenik terhadap Kekeringan

Benih padi Nipponbare kontrol dan Nipponbare transgenik ERA 6.4, 11.7,

18.2, 18.5, dan 18.8 (generasi T2) masing-masing sebanyak 30 biji

dikecambahkan pada cawan petri yang telah dilapisi kertas saring dan diberi air

secukupnya. Benih padi yang telah tumbuh dipindahkan ke dalam media tanah

dalam bak plastik untuk bibit di rumah kaca, kemudian dipindahkan ke dalam

ember yang berisi 8 kg tanah, 4 liter air, dan 2 gram pupuk NPK dengan 1

tanaman per ember. Tanaman padi dikelompokkan menjadi tiga kelompok yaitu

tanaman padi Nipponbare kontrol tanpa perlakuan kekeringan, tanaman padi

Nipponbare kontrol dengan perlakuan kekeringan, dan tanaman padi Nipponbare

transgenik dengan perlakuan kekeringan. Penyiraman dilakukan satu atau dua hari

sekali. Tanaman Nipponbare transgenik yang dipindahkan ke dalam ember

berjumlah 43 tanaman yang terdiri atas 18 ulangan tanaman dari genotip ERA 6.4,

2 ulangan tanaman dari genotip ERA 11.7, 8 ulangan tanaman dari genotip ERA

18.2, 11 ulangan tanaman dari genotip ERA 18.5, dan 4 ulangan tanaman dari

genotip ERA 18.8.

Perlakuan cekaman kekeringan dilakukan pada saat tanaman akan

memasuki fase berbunga dengan dihentikan penyiramannya. Selama dilakukan

perlakuan kekeringan diambil beberapa sampel tanah untuk mengetahui kadar

airnya. Pengamatan respon tanaman dilakukan dengan pemberian skoring

berdasarkan gejala daun menggulung dan gejala daun mengering. Setelah itu,

dilakukan pemulihan tanaman dengan cara menyiram. Tanaman yang masih

tumbuh kemudian dilakukan penilaian kesembuhan. Skoring dilakukan mengikuti

metode Standard Evaluation System for Rice (IRRI 1996, Silitonga et al. 2003)

seperti tertera pada Tabel 1, 2, dan 3:

Tabel 1 Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun menggulung pada

fase vegetatif)

Skor/Skala Keterangan

0 Daun-daun sehat

3 Daun-daun melipat (berbentuk huruf V)

5 Daun betul-betul kuncup (membentuk huruf U)

7 Ujung-ujung daun bersentuhan (bentuk O)

9 Daun menggulung ketat

4

Tabel 2 Klasifikasi tanggap tanaman terhadap kekeringan (daun mengering pada

fase vegetatif)

Skor/Skala Keterangan

0 Tidak ada gejala

1 Ujung daun sedikit mengering

3 Ujung-ujung daun mengering sampai ¼ panjang pada hampir

semua daun

5 ¼ sampai ½ dari semua daun betul-betul kering

7 Lebih dari 2/3 dari semua daun betul-betul kering

9 Tanaman mati

Tabel 3 Klasifikasi tanggap kesembuhan tanaman setelah perlakuan pemulihan

Skor/Skala Keterangan

1 90-100% tanaman sembuh

3 70-89% tanaman sembuh

5 40-69% tanaman sembuh

7 20-39% tanaman sembuh

9 0-19% tanaman sembuh

Isolasi DNA

DNA genomik dari tanaman padi diekstraksi dengan metode isolasi DNA

mengikuti metode Dellaporta et al. (1983) yang telah dimodifikasi. Metode ini

dilakukan melalui tiga tahap yaitu ekstraksi DNA, pemurnian DNA, dan

pemekatan DNA. Preparasi ekstrak sel dimulai dengan daun padi digerus

menggunakan liquid nitrogen (LN) sampai halus, kemudian dimasukkan ke dalam

tabung korning 50 mL, dan ditambahkan bufer ekstraksi serta larutan 20% SDS.

Pemurnian dan pemekatan DNA dilakukan dengan penambahan kalium asetat 5M,

natrium asetat 3M, RNase, dan isopropanol dingin. Pelet DNA dilarutkan dengan

bufer TE (Tris EDTA) 0.1x sebanyak 50 μL. Selanjutnya kemurnian dan

konsentrasi DNA diukur dengan nonodrop (Thermo Fisher Scientific 2009).

Amplifikasi PCR

Hasil isolasi DNA yang telah ditentukan konsentrasinya selanjutnya

diamplifikasi dengan mesin PCR DNA Engine Tetrad Peltier Thermal Cycler.

Analisis molekuler dengan PCR di tahap awal menggunakan primer spesifik hpt

(hygromycin phospho transferase) yang mengamplifikasi bagian gen higromisin

yang merupakan marka seleksi pada plamid pCAMBIA yang disisipkan. Total

volume reaksi pada setiap tabung PCR adalah 20 μL yaitu 19 µL PCR mix yang

terdiri atas 10x bufer PCR, 25 mM MgCl2, dNTPs, 10 μM primer hpt II (forward

dan reverse), dan Taq DNA polimerase (5 U/µL), dan 1 µL DNA hasil isolasi

(100 ng/µL). Program PCR yang digunakan adalah HYG65 sesuai dengan primer

yang digunakan, yaitu hpt (hygromysin phospho transferase) dan annealing yang

digunakan 650C. Proses PCR diawali dengan tahap pradenaturasi pada 94

oC

selama 3 menit, denaturasi DNA pada 94oC selama 30 detik, penempelan primer

pada 65oC selama 30 detik, dan pemanjangan primer pada 72

oC selama 1 menit.

Siklus kedua sama seperti siklus pertama, sampai terjadi 30 siklus. Pemanjangan

primer terakhir dilakukan pada 72oC selama 7 menit dan inkubasi pada 15

oC

selama 10 menit.

5

Selain itu, untuk deteksi transgen secara molekuler juga digunakan primer

spesifik untuk gen OsERA1 yang dikombinasikan dengan primer untuk promoter,

yaitu dengan kombinasi pasangan primer 35S-F/OsERA1-R. Amplifikasi PCR

dilakukan dengan total volume reaksi yaitu 20 μL menggunakan program ERA1-

N50 dengan siklus pradenaturasi pada 95oC selama 3 menit, denaturasi pada 94

oC

selama 1 menit 30 detik, penempelan primer pada 55oC selama 1 menit 30 detik,

dan pemanjangan primer pada 72oC selama 2 menit. Siklus kedua sama seperti

siklus pertama, sampai terjadi 34 siklus. Pemanjangan primer terakhir dilakukan

pada 72oC selama 10 menit dan inkubasi pada 15

oC selama 15 menit.

Elektroforesis DNA

Produk hasil PCR selanjutnya diseparasi menggunakan gel agarosa 1% di

dalam 1x bufer TAE (Tris HCl-asam asetat-EDTA). Pewarnaan gel dilakukan

dengan menambahkan GelRed (BIOTIUM) pada loading dye yang akan

dimasukkan ke dalam sumur bersama produk hasil PCR. Kemudian pita-pita

DNA divisualisasi menggunakan chemidoc gel system.

Hibridisasi Southern

Hibridisasai southern dilakukan berdasarkan metode Trijatmiko et al.

(2011) menggunakan pelabelan Digoxigenin -11-dUTP (DIG-11-dUTP). Kegiatan

terdiri atas beberapa tahap, yaitu pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi

EcoRI, pelabelan marker, transfer DNA yang sudah dipotong dengan enzim

restriksi ke membran Hybond-N+, pelabelan pelacak, hibridisasi membran dengan

pelacak yang telah dilabel, dan deteksi sinyal dengan larutan CDP star.

Pengamatan Biji Hasil Perlakuan Kekeringan

Tanaman padi Nipponbare transgenik dan Nipponbare kontrol setelah uji

kekeringan diamati jumlah biji isi dan jumlah biji hampa untuk mengetahui

produktivitasnya.

HASIL

Analisis Tanaman Padi Transgenik terhadap Kekeringan

Bibit tanaman padi Nipponbare transgenik yang berasal dari lima genotip

dilakukan uji terhadap cekaman kekeringan selama 7-10 hari tertera pada Tabel 4.

Tanaman Nipponbare kontrol dengan perlakuan kekeringan memiliki skor

kesembuhan tanaman 9 yaitu tanaman mati semua, sedangkan semua genotip

tanaman padi Nipponbare transgenik memiliki skor kesembuhan 1 berarti tanaman

masih dapat tumbuh dengan baik. Tanaman padi Nipponbare transgenik memiliki

skor daun menggulung 9 yaitu daun menggulung ketat, sedangkan nilai skor daun

mengering bervariasi berkisar antara 3-7 berarti tanaman padi Nipponbare

transgenik generasi T2 masih mengalami segregasi.

Pertumbuhan dan perbedaan tanaman padi Nipponbare transgenik generasi

T2 dan Nipponbare kontrol ditunjukkan pada Gambar 1. Padi Nipponbare

transgenik hasil perlakuan kekeringan tumbuhnya berbeda dengan Nipponbare

kontrol perlakuan. Batang-batang tanaman Nipponbare transgenik tumbuh tegak

6

yang disertai dengan pertumbuhan daun yang segar dan malai-malai bermunculan.

Pertumbuhannya hampir menyerupai tanaman Nipponbare kontrol normal dengan

pengairan optimal, sedangkan tanaman Nipponbare kontrol dengan perlakuan

kekeringan menunjukkan tidak terbentuknya tanda-tanda pertumbuhan karena

batang tanaman rebah, daun kering, dan tidak munculnya malai.

Tabel 4 Skor hasil pengujian daun menggulung, daun mengering, dan skor

kesembuhan tanaman padi Nipponbare transgenik (generasi T2) dan

tanaman Nipponbare kontrol dengan perlakuan kekeringan pada fase

vegetatif

Genotip Jumlah Tanaman

Fase Vegetatif

Kesembuhan Daun

Menggulung

Daun

Mengering

Nipponbare

Perlakuan 5 9 9 9

ERA 6.4 18 9 3-7 1

ERA 11.7 2 9 7 1

ERA 18.2 8 9 3-7 1

ERA 18.5 11 9 5-7 1

ERA 18.8 4 9 7-7 1

Keterangan: skor 1 = 90-100% tanaman sembuh, skor 3 = 70-89% tanaman sembuh, skor

5 = 40-69% tanaman sembuh, skor 7 = 20-39% tanaman sembuh, skor 9 =

0-19% tanaman sembuh.

Gambar 1 Penampilan tanaman padi Nipponbare transgenik generasi T2 dan

Nipponbare kontrol setelah uji kekeringan

Analisis Molekuler dengan PCR

Kualitas DNA hasil isolasi diuji secara kualitatif dan kuantitatif. Uji

kuantitatif dilakukan menggunakan nanodrop yang meliputi konsentrasi dan

kemurnian DNA (Lampiran 2). Uji kualitatif dilakukan dengan melihat DNA hasil

isolasi yang diseparasi dengan teknik elektroforesis horisontal menggunakan gel

agarosa 1% dan divisualisasi dengan menggunakan GelREd staining. Hasil

7

kualitatif DNA padi transgenik dengan primer spesifik hptII terlihat pada Gambar

2. Pita DNA yang muncul menunjukkan ukuran pita yang diharapkan yaitu 500 pb.

Hasil amplifikasi PCR tanaman padi transgenik menggunakan primer gen target

OsERAI-R juga menunjukkan pita DNA dengan ukuran yang diharapan yaitu

1400 pb seperti yang terlihat pada Gambar 3.

Gambar 2 Hasil amplifikasi PCR beberapa tanaman padi Nipponbare transgenik

menggunakan primer hptII. M=marker, K+=kontrol positif (OsERA1),

K-= kontrol negatif (ddH2O), W=Nipponbare kontrol, 6.41-6.4.27=

ulangan tanaman dari genotip 6.4

Gambar 3 Hasil amplifikasi PCR beberapa tanaman padi Nipponbare transgenik

menggunakan primer OsERAI-R. M=marker, K-= kontrol negatif

(ddH2O), K+=kontrol positif (OsERA1), W=Nipponbare kontrol, 6.4.1-

6.4.13= ulangan tanaman dari genotip 6.4

Hibridisasi Southern

Lima genotip tanaman Nipponbare transgenik yang digunakan kemudian

dipilih 16 tanaman yang lebih toleran terhadap cekaman kekeringan berdasarkan

gejala tanaman layu dan kemampuan mempertahankan kandungan air selama

proses cekaman kekeringan. Hasil analisis hibridisasi menunjukkan bahwa

8

beberapa genotip memiliki 1-3 salinan transgen seperti terlihat pada Gambar 4.

Genotip 6.4.2, 6.4.3, 18.2.13, 18.2.15, dan 18.8.5 memiliki 1 salinan transgen,

genotip 6.4.4, 6.4.6, dan 6.4.22 memiliki 2 salinan transgen, dan genotip 6.4.27

memiliki 3 salinan transgen, sedangkan genotip 18.2.8, 18.2.11, 18.2.17, 18.2.21,

18.5.3, 18.5.4, dan 18.8.9 tidak menghasilkan salinan transgen, begitupun dengan

genotip kontrol.

Gambar 4 Profil hibridisasi southern 16 genotip padi Nipponbare transgenik.

Lingkaran-lingkaran pada gambar menunjukkan pita DNA hasil

southern

Tabel 5 juga menggambarkan hasil analisis PCR dan southern. Hasil PCR

pada 16 sampel genotip Nipponbare transgenik menggunakan primer hptII

menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan adanya pita DNA pada gel

agarosa. Namun, hasil hibridisasi southern menggunakan pelacak hpt

menunjukkan jumlah salinan gen yang bervariasi. Hal ini menunjukkan bahwa

masih terjadi segregasi pada pada tanaman padi Nipponbare transgenik generasi

T2.

Tabel 5 Hasil analisis dan pola integrasi gen sisipan (OsERA1) pada generasi

kedua (T2) pada kultivar Nipponbare menggunakan gen hptII untuk PCR

dan pelacak hpt untuk hibridisasi southern

Genotip PCR Salinan Gen

Nipponbare perlakuan - 0

6.4.2 + 1

6.4.3 + 1

6.4.4 + 2

6.4.6 + 2

6.4.22 + 2

6.4.27 + 3

18.2.8 + 0

18.2.11 + 0

18.2.13 + 1

18.2.15 + 1

18.2.17 + 0

18.2.21 + 0

18.5.3 + 0

18.5.4 + 0

18.8.5 + 1

18.8.9 + 0

9

Analisis Jumlah Biji Padi setelah Perlakuan Kekeringan

Produktivitas tanaman padi yang baik salah satunya dapat dilihat dari

banyaknya biji yang dihasilkan. Jumlah biji isi per malai tanaman padi

Nipponbare transgenik generasi T2 pada umumnya lebih tinggi dibandingkan

Nipponbare kontrol dengan perlakuan kekeringan, dan genotip 18.5.4 memiliki

jumlah biji isi per malai sebanyak 36 biji yang lebih tinggi dari Nipponbare

kontrol tanpa perlakuan kekeringan yaitu 34 biji seperti terlihat pada Tabel 6.

Tanaman padi Nipponbare transgenik juga menunjukkan persentase biji hampa

lebih rendah dari Nipponbare kontrol dengan perlakuan kekeringan, namun tidak

lebih tinggi dari Nipponbare kontrol tanpa perlakuan kekeringan.

Tabel 6 Jumlah biji isi dan biji hampa tanaman padi Nipponbare transgenik dan

Nipponbare kontrol setelah perlakuan kekeringan

Sampel Ʃ Biji Isi Ʃ Biji Hampa Ʃ Biji Isi per

Malai % Biji Hampa

Nipponbare Perlakuan 38 347 5 90.13

6.4.1 599 560 27 48.32

6.4.2 259 452 19 63.57

6.4.3 208 444 17 68.10

6.4.4 274 431 18 61.13

6.4.5 55 442 6 88.93

6.4.6 149 420 11 73.81

6.4.7 187 407 14 68.52

6.4.8 71 374 9 84.04

6.4.9 319 451 15 58.57

6.4.10 383 235 32 38.03

6.4.11 476 404 26 45.91

6.4.13 291 412 21 58.61

6.4.15 205 327 19 61.47

6.4.17 201 391 13 66.05

6.4.21 492 388 27 44.09

6.4.22 111 357 11 76.28

6.4.25 457 371 25 44.81

6.4.27 290 258 24 47.08

11.7.4 299 294 20 49.58

11.7.7 245 351 22 58.89

18.2.8 312 479 21 60.56

18.2.11 89 459 8 83.76

18.2.12 369 624 14 62.84

18.2.13 312 376 20 54.65

18.2.15 299 442 17 59.65

18.2.16 126 425 11 77.13

18.2.17 295 412 17 58.27

18.2.21 224 406 12 64.44

18.5.1 80 476 9 85.61

10

lanjutan

18.5.2 69 491 6 87.68

18.5.3 97 477 9 83.10

18.5.4 395 267 36 40.33

18.5.5 107 319 12 74.88

18.5.6 41 321 6 88.67

18.5.7 151 400 14 72.60

18.5.8 56 323 6 85.22

18.5.10 36 245 7 87.19

18.5.11 88 376 11 81.03

18.5.15 41 302 7 88.05

18.8.5 150 182 17 54.82

18.8.9 129 316 14 71.01

18.8.13 60 462 7 88.51

18.8.15 283 226 24 44.40

Nipponbare Normal 1004 477 34 32.21

PEMBAHASAN

Analisis Tanaman Padi Transgenik terhadap Kekeringan

Penggunaan varietas padi yang toleran terhadap kekeringan merupakan

cara paling ekonomis untuk mengatasi masalah kekeringan yang diharapkan dapat

menjaga produksi dan kestabilan hasil padi. Hasil uji kekeringan telah dilakukan

selama 7-10 hari terhadap 43 tanaman padi Nipponbare transgenik dan disertakan

tanaman padi Nipponbare kontrol sebagai pembanding. Kadar air pada saat

dilakukan cekaman kekeringan menunjukkan semua tanaman berada dalam

kondisi tercekam karena kadar air tanah sebesar 18.45% (Lampiran 5) yang

nilainya lebih rendah dari pF (kemampuan partikel tanah mengikat air) yaitu

sebesar 18.84% (titik layu permanen). Hasil pengamatan daun menggulung fase

vegetatif menunjukkan bahwa semua genotip memiliki skor 9 (daun menggulung

ketat) (Tabel 4). Hasil pengamatan daun mengering pada fase vegetatif

menunjukkan bahwa genotip 6.4, 11.7, 18.2, 18.5, dan 18.8 memiliki skor 3-7

(ujung daun mengering sampai ¼ panjang pada hampir semua daun – lebih dari

2/3 dari semua daun betul-betul kering) (Tabel 4), sedangkan tanaman Nipponbare

kontrol dengan perlakuan kekeringan memiliki skor 9 (tanaman mati) (Tabel 4).

Variasi skor yang terjadi pada masing-masing genotip tanaman padi Nipponbare

transgenik dapat disebabkan adanya segregasi gen OsERA1 dan kemungkinan

menyisipkan gen pada tempat yang berbeda.

Hasil pengamatan kesembuhan tanaman menunjukkan semua genotip

tanaman padi Nipponbare transgenik memiliki skor 1 (hampir 100% tanaman

sembuh, sedangkan Nipponbare kontrol dengan perlakuan kekeringan memiliki

skor 9 (0-19% tanaman sembuh) ) (Tabel 4). Hal ini menunjukkan bahwa tanaman

masih ada yang hidup dan dapat tumbuh dengan baik. Tanaman padi Nipponbare

dengan perlakuan yang tumbuh kembali dapat disebabkan waktu cekaman

kekeringan yang kurang lama sehingga tanaman ini yang seharusnya mati ternyata

11

masih dapat tumbuh. Selain itu, varietas tanaman padi Nipponbare kemungkinan

memiliki respon yang cukup baik dalam menanggapi kekeringan, sedangkan pada

tanaman padi Nipponbare transgenik menunjukkan bahwa gen ERA1 yang

disisipkan ke dalam tanaman dapat bekerja dengan baik sehingga tanaman toleran

terhadap kekeringan. Penampilan tanaman padi Nipponbare transgenik dan

Nipponbare kontrol yang diberikan perlakuan kekeringan terlihat berbeda setelah

uji kekeringan. Tanaman transgenik terlihat dapat tumbuh menjadi segar kembali

setelah uji kekeringan dibandingkan dengan tanaman kontrol (Gambar 1).

Gen ERA1 yang diintroduksikan ke dalam genom tanaman berperan dalam

meningkatkan sensitifitas dari sel penjaga pada stomata terhadap asam absisat.

Respon asam absisat pada tanaman saat terjadi cekaman kekeringan akan

berlangsung secara cepat sehingga dapat menyebabkan terjadinya penutupan

stomata. Hormon asam absisat akan meningkatkan sinyal cascade pada sel

penjaga sehingga menghasilkan penutupan stomata dengan menghambat

pembukaan stomata (Qiagen 2003). Hal inilah yang menyebabkan terjadinya

penutupan stomata pada tanaman padi Nipponbare transgenik ketika kekurangan

air akibat cekaman kekeringan sehingga masih dapat melangsungkan siklus

hidupnya.

Analisis Molekuler dengan PCR

Kestabilan integrasi transgen dalam tanaman transgenik dapat diketahui

dengan melakukan uji kestabilan gen. Uji stabilitas gen dilakukan dengan

mendeteksi transgen pada turunan tanaman transgenik menggunakan teknik

polymerase chain reaction (PCR). Individu-individu putatif transgenik dari

genotip-genotip Nipponbare-OsERA1 generasi T2 yang toleran kekeringan

kemudian dianalisis secara molekuler untuk mengetahui keberadaan transgen

OsERA1. Peningkatan toleransi terhadap kekeringan berkaitan dengan adanya

ekspresi gen faktor transkripsi OsERA1 yang telah terintegrasi ke dalam tanaman.

Oleh karena itu, tanaman putatif transgenik masih perlu diidentifikasi secara

molekuler untuk mengkonfirmasi keberadaan dan integrasi gen yang

diintroduksikan di dalam genom tanaman.

Analisis integrasi awal dilakukan menggunakan primer spesifik hptII

(hygromycin phospho transferase) yang mengamplifikasi bagian gen higromisin.

Gen higromisin merupakan marka seleksi yang terdapat pada plasmid

pCAMBIA1301 yang disisipkan. Primer hptII mengandung forward sequence: 5’

GAT TCC TTG CGG TCC GAA TG 3’, dan reverse sequence: 5’ TCC GAC

CTG ATG CAG CTC TC 3’. Hasil PCR divisualisasi menggunakan elektroforesis

gel agarosa 1% (80 volt, 45 menit). Kontrol positif dan kontrol negatif juga

disertakan dalam proses PCR. Kontrol positif yang digunakan yaitu plasmid

pCAMBIA-ERA1 dan kontrol negatif berupa air. Hasil visualisasi menunjukkan

bahwa proses PCR berjalan dengan baik tanpa adanya kontaminasi, artinya 43

tanaman Nipponbare transgenik positif mengandung gen hptII. Tanaman padi

yang positif PCR hptII ditandai dengan terbentuknya pita produk PCR berukuran

500 pb (Gambar 2, Lampiran 4a, 4b, 4c).

Tanaman yang terdeteksi positif PCR hptII diharapkan juga positif PCR gen

target OsERA1. Analisis integrasi lanjutan digunakan primer spesifik gen OsERA1

yang dikombinasikan dengan primer untuk promoter 35S (primer 35S-F/OsERA1-

R) telah dilakukan terhadap 43 tanaman Nipponbare transgenik yang positif PCR

12

hptII. Primer OsERA1-R telah dikonstruk sebelumnya oleh Tim Peneliti

Laboratorium Biologi Molekuler, BB-BIOGEN. Primer tersebut adalah primer

spesifik terhadap gen ERA1 sehingga hanya genom tanaman yang tersisipi gen

target yang dapat teramplifikasi. Tanaman Nipponbare transgenik yang tidak

mengandung gen ERA1 tidak akan teramplifikasi karena tidak adanya sekuen

spesifik terhadap primer yang digunakan. Hasil PCR divisualisasi menggunakan

elektroforesis gel agarosa 1% menunjukkan adanya produk PCR berupa pita DNA

tunggal yang berukuran sekitar 1400 pb (Gambar 3, Lampiran 3a, 3b). Hal ini

menunjukkan bahwa semua tanaman Nipponbare transgenik positif mengandung

gen ERA1 karena ukuran fragmen DNA tersebut sesuai dengan ukuran fragmen

gen ERA1 yaitu sekitar 1400 pb yang terbentuk pada hasil digesti dari vektor

rekombinan pGEM-ERA1 yang telah dilakukan dalam penelitian sebelumnya di

Laboratorium Biologi Molekuler, BB-BIOGEN.

Tanaman Nipponbare transgenik yang terdeteksi positif PCR hptII dan

OsERA1 pada 43 sampel menunjukkan adanya hubungan dengan analisis terhadap

kekeringan. Tanaman Nipponbare transgenik tersebut memiliki nilai kesembuhan

tanaman dengan skor 1 (90-100% tanaman sembuh) (Tabel 4). Semua tanaman

Nipponbare transgenik tumbuh kembali setelah uji kekeringan dengan adanya

pertumbuhan batang, daun, dan malai. Hal ini menunjukkan bahwa tanaman

Nipponbare transgenik memiliki gen ERA1 yang telah berhasil disisipkan ke

dalam genom tanaman dan gen tersebut dapat berfungsi dengan baik karena

toleran terhadap kekeringan sehingga tanaman Nipponbare transgenik dapat

tumbuh dan melangsungkan siklus hidupnya.

Analisis Hibridisasi Southern

Metode hibridisasi southern merupakan salah satu cara untuk mengetahui

informasi tentang integrasi dan jumlah kopi dari gen yang berhasil masuk ke

dalam genom tanaman. Tanaman transgenik yang digunakan untuk analisis

southern yaitu sebanyak 16 sampel yang dipilih berdasarkan gejala tanaman layu

dan kemampuannya yang lebih baik dalam menanggapi cekaman kekeringan,

yaitu kemampuan dalam mempertahankan kandungan air di dalam tanah yang

lebih lama selama proses cekaman (Lampiran 1). Semakin lama tanaman bertahan

dalam kondisi tercekam menunjukkan tanaman semakin toleran terhadap

kekeringan. Selain itu, pemilihan sampel juga dilakukan berdasarkan konsentrasi

dan kemurnian DNA yang tinggi. Pemotongan pita-pita DNA dalam penelitian ini

dilakukan menggunakan enzim restriksi EcoRI, dan pelacak hptII.

Analisis hibridisasi southern pada 16 sampel tanaman transgenik OsERA1

menunjukkan bahwa 1 tanaman membentuk 3 pita DNA, 3 tanaman membentuk 2

pita DNA, 5 tanaman membentuk 1 pita DNA, dan tanaman-tanaman lain tidak

membentuk pita DNA pada X-ray film yang telah dipaparkan membran nilon

Hybond N+

(Gambar 4). Lajur DNA yang tidak terbentuk seperti terlihat pada

sampel 18.2.8 18.2.11, 18.2.17, 18.2.21, 18.5.3, 18.5.4, dan 18.8.9 dapat

disebabkan karena rendahnya konsentrasi DNA pada membran (Roche 2013).

Rendahnya konsentrasi DNA pada membran dapat terjadi akibat degradasi DNA

dan rendahnya konsentrasi DNA yang dielektroforesis pada gel agarosa. Selain

itu, tidak terbentuknya pita DNA dapat disebabkan kemungkinan transgennya

masuk ke dalam sel, namun tidak terintegrasi ke dalam genom tanaman sehingga

13

positif ketika di deteksi dengan PCR dan negatif ketika di deteksi dengan analisis

southern.

Hasil hibridisasi southern menunjukkan jumlah kopi gen hptII yang

terintegrasi di dalam tanaman Nipponbare transgenik bervariasi, berkisar 1-3 kopi

(Tabel 5). Pita-pita tersebut terbentuk karena DNA pada padi Nipponbare

transgenik yang telah dipotong oleh enzim restriksi EcoRI memiliki sekuen hptII

dan dapat terhibridisasi oleh pelacak hptII. Variasi kemunculan pita dapat

disebabkan oleh jumlah salinan gen yang menyisip dalam genom padi tidak sama.

Adapun tanaman Nipponbare kontrol tidak menghasilkan pita DNA karena tidak

mempunyai gen spesifik. Hal ini menunjukkan bahwa pelacak dan kondisi

hibridisasi hanya dapat mendeteksi keberadaan transgen secara spesifik. Dalam

penelitian ini dijumpai hubungan yang sistematis antara jumlah transgen yang

dimiliki dengan tingkat toleransi kekeringan pada tanaman, yaitu pada genotip

6.4.2, 6.4.3, 18.2.13, 18.2.15, dan 18.8.5. Genotip-genotip tersebut memiliki 1

salinan transgen (Tabel 5) dan memiliki tingkat toleransi kekeringan yang lebih

baik dibandingkan dengan genotip lain (Lampiran 1). Hal ini menunjukkan posisi

integrasi dari transgen pada genom tanaman padi Nipponbare transgenik

menentukan level toleransi terhadap kekeringan dan jumlah salinan transgen

(Santosa 2008).

Semakin banyak jumlah salinan transgen pada genom tanaman maka akan

semakin tinggi persentase pembungkaman gen (Tang et al. 2007).

Pembungkaman gen merupakan salah satu fenomena yang menyebabkan

terjadinya kegagalan dalam mengekspresikan gen dan terbentuknya dupleks RNA

yang mengakibatkan terhalangnya proses translasi sehingga pembentukan protein

terganggu (Malik 2005).

Analisis Jumlah Biji Isi dan Biji Hampa Tanaman Padi Nipponbare

Transgenik

Teknik transformasi genetik dapat dikatakan berhasil jika ditandai dengan

keberhasilan menyisipkan rangkaian gen yang diintroduksikan ke dalam genom

tanaman sehingga dapat diekspresikan dan tetap terpelihara dalam seluruh

pembelahan sel berikutnya. Oleh karena itu, salah satu upaya untuk menentukan

gen tersebut dapat berfungsi dengan benar adalah dengan melihat fenotip tanaman

padi tersebut (Santoso 2008). Keberhasilan teknik transformasi genetik dapat

dilihat dari fenotip tanaman transgenik yang dibandingkan dengan fenotip

tanaman kontrol.

Perlakuan cekaman kekeringan dilakukan pada umur tanaman 40 hari,

yaitu pada saat fase vegetatif menuju fase generatif. Kekurangan air pada fase

vegetatif menyebabkan pertumbuhan tanaman terhambat, sedangkan fase

generatif merupakan fase pertumbuhan yang peka bagi tanaman padi terhadap

kekeringan. Kekeringan pada fase tersebut dapat menyebabkan tanaman tidak

berkembang atau tidak menghasilkan gabah. Penurunan hasil akibat defisit air

setelah fase berbunga terjadi karena penurunan jumlah gabah isi dan

meningkatnya kehampaan (Samaullah et al. 1996).

Jumlah biji isi per malai tanaman padi Nipponbare transgenik genotip

18.5.4 menunjukkan nilai yang lebih tinggi dari Nipponbare kontrol tanpa

kekeringan, yaitu 36 biji (Tabel 6). Tanaman Nipponbare kontrol tanpa

kekeringan memiliki jumlah biji isi per malai 34 biji. Hal ini menunjukkan

14

genotip tanaman padi Nipponbare transgenik 18.5.4 dinilai lebih toleran terhadap

kekeringan. Kekurangan air pada genotip tersebut tidak terlalu berpengaruh

terhadap jumlah biji yang dihasilkan. Genotip tanaman padi Nipponbare

transgenik yang lain juga menunjukkan jumlah biji isi per malai lebih tinggi dari

Nipponbare kontrol yang diberi perlakuan kekeringan dengan jumlah 5 biji per

malai (Tabel 6). Penelitian ini mengharapkan hanya tanaman padi transgenik saja

yang dapat berproduksi, namun pada Nipponbare kontrol yang diberi perlakuan

kekeringan terlihat menghasilkan biji. Hal ini dapat disebabkan sebelum masuk

masa perlakuan kekeringan, tanaman sudah memasuki fase pengisian biji

sehingga masih dapat menghasilkan biji padi meskipun sedikit.

Hasil pengamatan menunjukkan gabah hampa tidak hanya dihasilkan pada

tanaman dengan perlakuan kekeringan, namun juga pada perlakuan pengairan

normal. Menurut Yoshida (1981) kondisi kekeringan pada periode 0-2 minggu

menjelang pembungaan dapat menyebabkan kehampaan malai. Nipponbare

kontrol dengan perlakuan kekeringan menunjukkan persentase biji hampa paling

tinggi (90.13%) dibandingkan dengan semua tanaman padi Nipponbare transgenik

(Tabel 6). Namun, tanaman Nipponbare transgenik tidak ada yang lebih rendah

persentase biji hampanya dari Nipponbare kontrol normal (32.21%). Akan tetapi,

tanaman padi Nipponbare transgenik genotip 6.4.10 memiliki persentase biji

hampa 38.03% yang dinilai lebih toleran terhadap kekeringan karena

persentasenya tidak jauh berbeda dengan Nipponbare kontrol normal. Biji hampa

yang dihasilkan oleh tanaman padi Nipponbare transgenik dan Nipponbare kontrol

dapat disebabkan perlakuan cekaman kekeringan terjadi pada fase reproduktif

(Yoshida 1981) .

Jumlah biji isi dan biji hampa tanaman padi Nipponbare transgenik tidak

semuanya lebih unggul dari tanaman Nipponbare kontrol, sehingga dapat

dikatakan bahwa tidak semua fenotip dapat dibandingkan dengan jumlah salinan

gen yang terintegrasi dalam genom tanaman padi Nipponbare transgenik. Hal ini

terlihat pada genotip 18.5.4 meskipun dinilai lebih toleran terhadap kekeringan

karena memiliki jumlah biji isi per malai lebih tinggi daripada Nipponbare kontrol

tanpa kekeringan, namun tidak memiliki salinan kopi gen. Menurut Kolensik et al.

(2004) penentuan fungsi gen dari fenotip yang diekspresikan akan menjadi sulit

apabila ada dua atau lebih posisi T-DNA dalam satu genom. Gen tidak hanya

elemen-elemen yang memisah dan menghasilkan pengaruh individu yang jelas,

tetapi interaksi gen satu dengan yang lainnya memberikan fenotip yang berbeda

secara menyeluruh (Sudharmawan 2009).

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Tanaman padi Nipponbare transgenik yang mengandung gen OsERA1

semuanya toleran terhadap kekeringan dan memiliki 1-3 salinan transgen. Hasil

PCR dengan primer hptII menghasilkan pita berukuran 500 pb, sedangan hasil

PCR dengan primer OsERA1-R menghasilkan pita berukuran 1400 pb. Hasil

cekaman kekeringan menghambat pertumbuhan tanaman, yaitu menurunkan

jumlah biji isi dan meningkatkan kehampaan. Genotip 18.5.4 memilki jumlah biji

15

isi per malai lebih tinggi dari Nipponbare kontrol dengan pengairan normal, yaitu

36 biji. Tanaman padi transgenik genotip 6.4.10 juga menunjukkan persentase biji

hampa 38.03% yang tidak jauh berbeda dengan Nipponbare kontrol normal

dengan persentase 32.21%. Genotip 6.4.10 dan 18.5.4 tersebut dinilai lebih toleran

terhadap kekeringan.

Saran

Perlu dilakukan optimasi metode perlakuan kekeringan agar antara fase

vegetatif, fase pembungaan, dan fase fase generatif dapat terkontrol dengan baik.

DAFTAR PUSTAKA

Abdullah A, S Ito, dan K Adhana. 2007. Estimate of Rice Consumption in Asian

Countries and the World Towards 2050. Jepang: Tottori University.

Allen GJ, Y Murata, SP Chu, M Nafiei, JI Schroeder. 2002. Hypersensitivity of

abscisic acid-induced cytosolic calcium increases in the Arabidopsis

farnesyltransferase mutant era1-2. The Plant Cell. 14: 1649-1662.

[BPS] Badan Pusat Statistik. 2011. Statistik Indonesia. Berita Resmi Statistik.

Jakarta: BPS.

Dellaporta SI, Jonathan W, James BH. 1983. A plant DNA minipreparation:

version II. Plant molecular Biology Reporter 1: 19-21.

Hall AE. 1993. Is dehydration tolerance relevant to genotypic difference in leaf

senescence and crop adaptation to dry environments. In: Close TJ and Bray EA

(Eds.). Plant responses to cellular dehydration during environmental stress. p:

110. The American Soc. Plant Pathologist. Maryland: Rockville.

[IRRI]. 2010. morfologi dan pertumbuhan padi. [terhubung berkala] http:// www.

Knowledgebank. Irri. org/ morph/ morphology.htm [1 Maret 2013].

Jongdee B, Pantuwan G, Fukai S, Fischer K. 2006. Improving drought tolerance

in rainfed lowland rice: AN example from Thailand. Agricultural Water

Management (80): 225-240.

Kolesnik T, Szeverenyi I, Bachmann D, Kumar CS, Jiang S, Ramamoorthy R, Cai

M, Ma ZG, Sundaresan V, Ramachandran S. 2004. Establishing an afficient

Ac/Ds tagging system in rice: large-scale analysis of Ds flanking sequences.

Plant J. 37: 301-314.

Litbang Pangan. 2012. Repositori peningkatan pangan menuju 2020. [terhubung

berkala]

http://pangan.litbang.deptan.go.id/index.php?bawaan=download/download_det

ail&&id=35. (25 Agustus 2013).

Muliarta IGP, Sudantha LM, Santoso BB. 2012. Daya hasil dan penampilan

fenotipik karakter kuantitatif galur-galur F2BC4 padi gogo beras merah. PG 5

Prosiding InSINas. 2012 Nov 29-30; Bandung, Indonesia. Bandung (ID):

Insentif Ristek. hlm 1-7.

Nafari IB. 2006. Kestabilan pewarisan gen entC dan pmsB pada padi transgenik

generasi ketiga (T2) [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

16

Pei Z, M Ghassemian, CM Kwak, P McCourt, JI Schroeder. 1998. Role of

farnesyltransferase in ABA regulation of guard cell anion chanells and plant

water loss. Science. 282: 287-290.

Pratama GS. 2010. Analisis Respon Toleransi Padi Nipponbare Transgenik

Terhadap Salinitas Tinggi [Skripsi]. Bogor: Departemen Biokimia, FMIPA,

Institut Pertanian Bogor.

Qiagen. 2003. GeneGlobe Pathways: Absicid acid. 2003. [terbuhung berkala].

http//:www.qiagen.com/pathways.aspx. (13 Januari 2013).

Rachmawati S. 2006. Studi Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi

Menggunakan Transformasi Agrobacterium. Jurnal AgroBiogen. 2(1): 36-44.

Roche. 2013. Troubleshoot Southern hibridization. [terhubung berkala].

https://www.rocheapplied-science.com/sis/lad/index.jsp?id=LA030400, (10

September 2013).

Samaullah MY, Sutaryo B, Taryat T. 1996. Peluang pemanfaatan genotip padi

toleran kekeringan pada daerah terbatas sumber air. Seminar Nasional

Masyarakat Konservasi Tanah dan Air. Universitas Brawijaya, Malang.

Sammaullah MJ, Darajat AA. 2001. Toleransi beberapa genotip padi gogo

terhadap cekaman kekeringan. Penelitian Pertanian Tanaman Pangan. 20(1):

17-23.

Santosa TJ. 2008. Identifikasi begomovirus Indonesia pada tomat dan analisis

diversitas genetik gen AV1 serta pemanfaatannya untuk pengembangan

tanaman tahab virus [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut

Pertanian Bogor.

Silitongga TS, Somantri IH, Daradjat AA, Kurniawan H. 2003. Panduan Sistem

Karakterisasi dan Evaluasi Tanaman Padi. Departemen Pertanian. Badan

Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Komisi Nasional Plasma Nutfah. 58h.

Soedarini B, Patricia N. 2006. Pangan transgenik: suatu pilihan yang dilematis.

Renai 2: 129-144.

Suardi D. 2002. Perakaran padi dalam hubungaannya dengan toleransi tanaman

terhadap kekeringan dan hasil. Jurnal Litbang Pertanian. 21(3): 100-108.

Sudharmawan AAK. 2009. Analisis segregasi persilangan varietas padi tahan dan

rentan terhadap cekaman kekeringan. Agroteksos 19: 109-114.

Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH, Kohli A. 2011. Molecular Analysis

of Transgenic Plants. New York: Springer.

Wang Y, J Ying, M Kuzma, M Chalifoux, A Sample, C McArthur, T Uchaz, C

Sarvas, J Wan, DT Dennis, P McCourt, Y Huang. 2005. Molecular Tailoring of

Farnesylation for plant drought tolerance and yield protection. The Plant

Journal. 43: 413-424.

Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 2005. Organization of cis-acting

regulatory elements in osmotic and cold stress responsive promoters. Trends in

Plant Science. 10: 88-94.

Yoshida S. 1981. Fundamental of rice crop science. IIRRI. Los Banos, Philippines.

269 p

Ziegelhoffer EC, LJ Medrano, EM Meyerowits. 2000. Cloning Arabidopsis

WIGGUM gene identifies a role for farnesylation in meristem wdevelopment.

PNAS. 97(13): 7633-7638.

17

LAMPIRAN

Lampiran 1 Selisih bobot tanah per hari pada perlakuan cekaman kekeringan

Sampel

∆ Bobot tanah (g)

16/05/

13

20/05/

13

21/05/

13

22/05/

13

23/05/

13

24/05/

13

25/05/

13

26/05/

13

Pagi Pagi Pagi Pagi Pagi Pagi Pagi Pagi

Nipponbare

Perlakuan 1487 242 97 140,5 93,5

6.4.1

960 826 114 140

6.4.2

1380 278 116 112 90

6.4.3

1350 268 110 118 104

6.4.4

1240 290 110 130 100

6.4.5

1444 256 90 110 60

6.4.6

1340 280 106 124 105

6.4.7

1272 280 108 190 96

6.4.8

1380 280 90 140 90

6.4.9

1480 270 130 120 105

6.4.10

1280 294 172 158 111

6.4.11

1540 254 136 120 40

6.4.13

1320 266 134 146 99

6.4.15

1250 260 142 126 112

6.4.17

1318 262 120 140 105

6.4.21

1420 296 128 136 100

6.4.22

1370 260 148 122 100

6.4.25

1490 250 130 124 96

6.4.27

1290 326 190 124 125

11.7.4

1318 238 124 100 100

11.7.7

1398 224 128 100 95

18.2.8

1600 218 122 110

18.2.11

1410 240 130 124 101

18.2.12

1390 310 168 128 124

18.2.13

1330 280 170 128 107

18.2.15

1100 280 190 150 130 75 75

18.2.16

1430 150 130 138 97

18.2.17

1200 308 198 148 112

18.2.21

1150 300 156 174 105

18.5.1

1150 180 100 124 25

18.5.2

1380 244 100 122 79

18.5.3

1376 264 130 130 90

18.5.4

1190 250 176 174 100

18.5.5

1420 220 120 126 74

18.5.6

860 790 120 118 76

18

lanjutan

18.5.7

1304 252 144 128 92

18.5.8

1470 210 110 138 40

18.5.10

1452 228 110 138 77

18.5.11

1542 218 110 124 91

18.5.15

1310 266 134 148 107

18.8.5

930 266 194 190 95 40 30

18.8.9

1190 266 134 164 116 30

18.8.13

1390 250 124 136 95

18.8.15

1310 270 150 136 109

Keterangan: = Gejala layu pada daun, = Tanaman mulai disiram,

sampel yang dicetak tebal merupakan sampel yang di southern

Lampiran 2 Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA daun padi

Sampel Konsentrasi (ng/μL) A260/280

Nipponbare kontrol 2124.3 1.87

6.4.1 800.2 1.91

6.4.2 1507.7 1.92

6.4.3 1150.3 1.91

6.4.4 2051.5 1.92

6.4.5 1903.7 1.92

6.4.6 1518.5 1.91

6.4.7 1260.1 1.93

6.4.8 1483.6 1.94

6.4.9 1191.5 1.91

6.4.10 723.9 1.88

6.4.11 1081.0 1.92

6.4.13 2340.9 1.90

6.4.15 1237.3 1.93

6.4.17 1134.0 1.90

6.4.21 1025.4 1.89

6.4.22 1256.7 1.90

6.4.25 719.3 1.92

6.4.27 1846.6 1.91

11.7.4 974.1 1.90

11.7.7 1259.2 1.90

18.2.8 1509.8 1.94

18.2.11 1516.0 1.94

18.2.12 1412.8 1.94

18.2.13 2142.3 1.93

18.2.15 2282.8 1.90

18.2.16 2384.8 1.93

18.2.17 362.5 1.92

18.2.21 458.8 1.90

19

lanjutan

18.5.1 1216.0 1.92

18.5.2 1088.8 1.93

18.5.3 1585.9 1.93

18.5.4 1180.4 1.91

18.5.5 932.2 1.94

18.5.6 990.7 1.93

18.5.7 1042.7 1.93

18.5.8 1876.1 1.91

18.5.10 1157.4 1.93

18.5.11 1943.3 1.91

18.5.15 1227.1 1.93

18.8.5 452.9 1.91

18.8.9 3279.0 1.91

18.8.13 3289.5 1.92

18.8.15 3249.6 1.86

Keterangan: Sampel yang dicetak tebal merupakan sampel yang di southern

Lampiran 3 Hasil amplifikasi PCR tanaman padi transgenik menggunakan primer

OsERAI-R

Keterangan: M=marker, K+=kontrol positif (OsERA1), K

-=kontrol negatif (ddH2O),

W=Nipponbare kontrol (tipe liar)

(a)

(b)

20

Lampiran 4 Hasil amplifikasi PCR tanaman padi transgenik menggunakan primer

hptII

Keterangan: M=marker, K+=kontrol positif (OsERA1), K

-=kontrol negatif (ddH2O),

W=Nipponbare kontrol (tipe liar)

(a)

(b)

(c)

21

Lampiran 5 Data kadar air tanah

Genotip Bobot tanah

(g)

Kadar air

(%)

Basah Kering

Nipponbare 8.33 6.78 18.6

18.2 8.30 6.78 18.3

Rata-rata 18.45

Contoh perhitungan:

Kadar air (%) =

× 100 %

=

× 100 %

= 18.6 %

22

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Cianjur pada tanggal 20 Maret 1990 dari ayah bernama

Elan Jaelani dan ibu bernama Teti Rohayati. Penulis merupakan anak pertama dari

dua bersaudara. Tahun 2009 penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah

Menengah Atas di SMA Negeri 1 Cianjur, Jawa Barat dan pada tahun yang sama

lolos seleksi masuk dan melanjutkan studi di Institut Pertanian Bogor melalui

jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Di IPB penulis mengambil mayor

Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Selama masa perkuliahan penulis menjadi anggota Himpunan Mahasiswa

Cianjur (HIMAT) di Bogor. Penulis melakukan Praktik Lapang di Laboratorium

Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan

Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-Biogen), Jalan Tentara Pelajar Nomor 3A

Cimanggu, Bogor dengan judul Karakterisasi Molekuler Tanaman Padi

Nipponbare Transgenik 35S::OsERA1 yang Toleran Kekeringan.