K I ? P B : E B A B J : G G : M Q ? D J H ; B H E H = B Y ... Autoref Radi-… · Д-РЛЮБКА...

СПЕЦИАЛИЗИРАН НАУЧЕН СЪВЕТ ПО МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ ИИМУНОЛОГИЯ ПРИ ВАК

======================================================================================================================

Н.с. I ст. РАДОСТИНА ИВАЙЛОВА АЛЕКСАНДРОВА

ИЗОЛИРАНЕ, ХАРАКТЕРИЗИРАНЕ И ПРИЛОЖЕНИЕ НА ПОСТОЯННИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ОТ ПРЕДИЗ-ВИКАН С ВИРУС Мс29 ТРАНСПЛАНТИРУЕМ ХЕПАТОМ У ПИЛЕ

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

На дисертационен труд за присъждане на образователната и научна степен „ДОКТОР”Научна специалност Вирусология (01.06.13)

НАУЧНИ КОНСУЛТАНТИ:ПРОФ. Д-Р РАДКА АРГИРОВА, ДМН

(НАЦИОНАЛЕН ЦЕНТЪР ПО ЗАРАЗНИ И ПАРАЗИТНИ БОЛЕСТИ, СОФИЯ, БЪЛГАРИЯ)ПРОФ. ЧЕСТМИР АЛТАНЕР

(ИНСТИТУТ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ НА РАКА, БРАТИСЛАВА, СЛОВАКИЯ)

ОФИЦИАЛНИ РЕЦЕНЗЕНТИ:С.Н.С. І СТ. Д-Р МАРИН ДИЛОВСКИ, ДВМН

СТ.Н.С. ІІ СТ. Д-Р ЛЮБКА ДУМАНОВА

София, 2008 г.

Дисертационният труд съдържа 350 страници текст, онагледен е с 61 фигури и 48 таблици. Библиографията включва 1033 литературни източни-ка.

Дисертационният труд е одобрен от разширено заседание на секция „Онковирусология” в Интитута по експериментална патология и паразитоло-гия при БАН и е насочен за защита към Специализирания научен съвет по микробиология, вирусология и имунология при ВАК

Експерименталната работа, свързана с изложените в представения дисертационен труд резултати, е извършена основно в лабораториите ививариума на Института по експeриментална патология и паразитология при БАН. Част от изследванията са проведени в други наши (Институтпо експериментална морфология и антропология с музей, Институт по молекуларна биология, Национален център по заразни и паразитни болес-ти, Университетска болница „Царица Йоанна”) и чужди (Институт за изследване на рака към Словашката академия на науките, Братислава, Сло-вакия; Институт по хематология и имунология към Националния медицински център, Будапеща, Унгария) институти.

Посвещавам този труд на най-скъпите на сърцето ми хора – моите родители, брат ми и люби-

мия ми малък племенник

Защитата на дисертационния труд ще се състои на 09.03.2009 г. от 14.00 часа в аудиторията на Националния център по заразни и паразитниболести на заседание на СНС по микробиология, вирусология и имунология.Материалите по защитата са на разположение на интересуващите се в Библиотеката на Националния център по заразни и паразитни болести -Бул „Янчо Сакъзов” № 26, София.

НЯКОИ ПО-ЧЕСТО ИЗПОЛЗВАНИ СЪКРАЩЕНИЯ И ОЗНАЧЕНИЯ

ФТС - фетален телешки серумНТС – нормален телешки серумТСА – тумор свързан антигенЦК50 – цитотоксична концентрация 50

s.c.- подкожноPBS – фосфатно солеви буферSR-RSV – Rous sarcoma virus щам Schmidt RuppinLSCT-BPO, Хепатом Мс29 – трансплантируем хепатом у пиле, предизвикан с миелоцитоматозния вирус Мс29PCR – полимеразна верижна реакция

І

І. В Ъ В Е Д Е Н И Е

Интензивните проучвания върху птичите онкогенни ретровируси (в частност тези от левкозо-саркомната група) извършени през 70-те и80-те години на миналия век, безспорно са една от най-интересните страници в историята на медико-биологичната наука. Достатъчно е да споме-нем, че в хода на тези изследвания бяха намерени вирусните онкогени (v-onc) и техните клетъчни аналози (c-onc) - откритие, което даде мощентласък за развитието на молекулярната биология и направи възможно изясняването на някои ключови механизми на канцерогенезата. Изключи-телна гордост за нас, като учени и българи, е фактът, че редица птичи и миши онкогенни ретровируси са изолирани за пръв път именно в нашатастрана. Сред тях е и миелоцитоматозният вирус Мс29. Но докато в продължение на десетилетия този вирус е бил обект на задълбочени генетич-ни, молекулярно-биологични, биохимични и клетъчно-културелни изследвания не само у нас, но и в немалко водещи чуждестранни лаборатории,то предизвиканите от него тумори все още са недостатъчно изследвани в редица отношения. Специално внимание сред тях заслужават карцино-мите на черния дроб. Като спонтанна находка, злокачествени новообразувания с подобна локализация се срещат изключително рядко при птици.В същото време обаче, това са едни от честите и отличаващи се с бърза прогресия, устойчивост на лечение и лоша прогноза малигнени неопла-зии при човека. Не е за пренебрегване и фактът, че трансформираните с вирус Мс29 клетки съдържат гена v-myc, който е хомолог на клетъчнитепротоонкогени от семейство MYC – известно е, че те играят важна роля в осъществяването на различни жизненоважни биологични процеси, асмущенията в нормалната им регулация имат отношение към патогенезата на редица ракови зяболявания при хора и животни. Ето защо, отмомента на създаването си (в средата на 1970те години) до днес трансплантируемият хепатом у пиле, предизвикан с вирус Мс29 (LSCT-BPO,хепатом Мс29), е бил обект на задълбочени патоморфологични, биохимични и имунологични проучвания, както в Института по експерименталнапатология и паразитология при БАН, така и в много чужди лаборатории. Независимо от извършената сериозна изследователска дейност и полу-чените резултати с висока научна стойност, възможностите на този експериментален модел при изясняването на туморната биология, далеч неса напълно използвани. Така например, според достъпната литература, до момента при този, а и въобще при вирус-обусловените тумори, не сапровеждани системни проучвания върху хетерогенността на раковите клетки. Оскъдна е и информацията за влиянието на потенциални инхибито-ри на вирусната канцерогенеза – напр. метални съединения и някои растителни продукти - върху трансформирани с вирус клетки. Изложенитефакти ни позволяват да предположим, че изолирането и охарактеризирането на постоянни клетъчни линии от предизвикания с вирус Мс29 транс-плантируем хепатом у пиле, не просто ще илюстрира феномена „хетерогенност на туморните клетки”, но би могло да доведе до създаването намоделна система за проучвания върху това уникално биологично явление, както и за изясняване на механизмите на вирус-индуцираната канцеро-генеза, прогресията/регресията на злокачествените новообразувания, разпространението им в далечни органи и тъкани; ще подпомогне търсене-то на нови средства с антинеопластично действие.

Подобни модели са изключително необходими и високо ценени за осъществяване на разнообразни изследвания, представляващи ин-терес за вирусологията, молекулярната биология, фармакологията, ветеринарната и хуманната медицина. От особена важност е възможносттаза лесно и достъпно сравнение на резултатите, получени при хепатом Мс29, респективно изолираните от него клетъчни линии, с клетъчни култу-ри от тъкани и органи на здраво пиле, включително пилешки ембрионални клетки.

ІІ. Ц Е Л И З А Д А Ч И

ЦЕЛТА на представения Дисертационен труд е получаване, клониране и характеризиране на постоянни клетъчни линии от предизвикан с миело-цитоматозния вирус Мс29 трансплантируем хепатом у пиле, с оглед създаването на моделна система за проучвания върху хетерогенността нараковите клетки, вирус-индуцираната канцерогенеза и изпитването на нови средства с антинеопластично действие.

ЗАДАЧИ:1. Получаване, клониране и субклониране на постоянна клетъчна линия от трансплантируемия хепатом у пиле, предизвикан с миелоцитома-

тозния вирус Мс29.

2. Определяне на основните биологични характеристики на получените постоянни клетъчни линии:

- Морфологична характеристика;- Растежни свойства в култура – време на удвояване на туморните клетки, плътност на растеж, включване на 3Н тимидин, способ-

ност за образуване на колонии в полутечна среда;- Кариотипен анализ;- Растежни свойства (Туморогенен потенциал) в опитни животни (пилета, голи мишки) in vivo – латентен период, брой реагирали

опитни животни, наличие на метастази, спонтанна регресия, патоморфологични и патохистологични изследвания; прояви на кле-тъчния и хуморалния имунен отговор при тумор-носещи пилета;

- Провирусно съдържание;- Вирусна продукция в култивирани в лабораторни условия и трансплантирани in vivo клетки на пилета;- Експресия на тумор-свързани антигени.

3. Приложение на получените клетъчни линии при изпитване на потенциалните цитотоксични и антипролиферативни свойства на изохиноли-нови алкалоиди и метални съединения:

3.1. Определяне влиянието на изследваните вещества (чрез тестовете за включване на неутрално червено и оцветяване с трипаново синьо)върху преживяемостта на клетки (ЦК50) от животински и човешки туморни линии;

3.2. Сравняване чувствителността (ЦК50) към изпитваните алкалоиди и метални съединения на култивирани в лабораторни условия птичи,миши и човешки туморни линии и нетуморни клетки със същия (или близък) произход;

3.3. Установяване ефекта на металните съединения и алкалоидите върху пролиферативната активност на използваните като модели човешки иживотински туморни клетъчни линии чрез колонии-формиращ тест и определяне степента на включване на 3Н-тимидин;

3.4. Проучвания върху способността на веществата да предизвикват увреждания в ДНК молекулите на третираните клетки - чрез провежданена електрофоретично изследване на единични клетки (Comet assay);

3.5. Проследяване влиянието на веществата върху морфологията на култивираните в тяхно присъствие клетки.

ІІІ. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ М А Т Е Р И А Л И

1. Опитни животни- - Пилета порода Бял легхорн, линия 15I (324 броя) - свободни от левкоза, силно чувствителни към птичите левкозни и саркомни

вируси. Линията е предоставена на Института по обща и сравнителна патология при БАН (Днес Институт по експериментална патология и пара-зитология) от Regional Poultry Research Laboratory, East Lansing, Michigan, USA;

- - Комерсиални пилета порода Джилинг (143 броя);- - BALB/c мишки (27 броя);- - Плъхове от линия Wistar (12 броя) ;

- Голи мишки BALB/c-nu (21 броя), работата с които беше осъществена в Департамента по молекулярна вирусология, Институт заизследване на рака, Словашка академия на науките, Братислава, Словакия;

- Зайци (2 броя).

2. Клетъчни култури – представени са в Табл. 1

3. Експериментални тумори- Трансплантируем хепатом у пиле, предизвикан с миелоцитоматозния вирус Мс29 (LSCT-BPO, Хепатом Мс29);- Трансплантируем сарком у плъх, предизвикан с Rous sarcoma virus щам Schmidt-Ruppin (SR-RSV) (Александров, 1996);- Трансплантируем асцитен хепатом на Заждела у плъх, предизвикан с диметиламиноазобензен (Zajdela, 1964);- Асцитен тумор (химически индуциран карцином) на Герен у плъх (Софин, 1980);- Асцитен тумор на Ерлих, получен от спонтанно възникнал карцином на млечната жлеза у мишка (Софин, 1980)

Предизвиканият с миелоцитоматозния вирус Мс29 трансплантируем хепатом у пиле (LSCT-BPO, хепатом Мс29) е предоставен предиблизо три десетилетия на учените от Института по експериментална патология и паразитология при БАН от проф. Foldes – по онова времедиректор на Изследователска група по микробиология към Унгарската академия на науките (Mladenov et al., 1980). Хепатомът е поддържан in vivoв продължение на години от учени в ИЕПП – БАН, като е бил обект на редица биохимични, имунологични и патоморфологични проучвания.

4. Вещества4.1. Метални съединения

4.1.1. Комплекси на метални йони [Cu(I, II), Co(II), Fe(II, III), Ni(II)] с лиганди тип Манихови бази - N,N’-бис(4-антипирилметил)пиперазин(BAMP) (Фиг. 1 а) и N,N’-тетра-(антипирил-1-метил)-1,2-диаминоетан (TAMEN) (Фиг. 1 б), както и със смесени лиганди (BAMP или TAMEN + пири-дин (py) или 2,2 бипиридил (dipy). Комплексите са представени в Табл. 2.

Веществата са синтезирани, физикохимически охарактеризирани и предоставени за изследване от колектив с ръководител проф. Отилия Кости-шор, Институт по химия към Румънската академия, Тимишоара, Румъния.

4.1.2. Комплекси на Zn(II), Cu(II), Co(II), Na(I) и La(III) с жлъчни киселини (Табл. 3). Представените в таблицата вещества са синтезирани,физикохимически охарактеризирани и предоставени за изследване от колектив с ръководител проф. Луминица Патрон, Институт по физикохимиякъм Румънската академия, Букурещ, Румъния.

4.1.3. Oсновни соли на цинк и мед - Zn5-xCux(OH)8Cl2.H2O и CuCO3Cu(OH)2.nH2O. Веществата ни бяха любезно предоставени за изследванеот ст.н.с. ІІ ст. д-р Стефка Тепавичарова, Институт по обща и неорганична химия, БАН.

4.2. Бисбензилизохинолинови алкалоиди

- (+) Хернандезин (Фиг. 2 а) - изолиран от Thalictrum foetidum (Ranunculaceae) (Velcheva et al., 1991).

- (-) Талфетидин и Талидазин (Фиг. 2 б) - изолирани от T. flavum L. (Ranunculaceae) (Dutchewska et al., 1989).

Алкалоидите са предоставени за изследване от н.с. І ст. д-р Мария Велчева, Институт по органична химия с център по фитохимия при БАН.

Всички метални съединения и алкалоиди бяха първоначално разтворени в малък обем диметилсулфоксид (DMSO, Serva), след което бя-ха разредени в хранителна среда без серум (до концентрация 10 mg/ml при металните съединения и 1 mM при алкалоидите). Крайната концент-рация на DMSO в тези изходни разтвори беше 10%. Работните разреждания на изпитваните вещества бяха приготвяни в хранителна среда.Всички разтвори бяха съхранявани при температура 4оС.

Таблица 1. Клетъчни култури използвани при проведените от нас експeрименти

Част от клетъчните линии ни бяха любезно предоставени за провеждане на експериментите от техните създатели, за което им изказваме сърдеч-на благодарност:проф. Власта Совова, Институт по молекулярна генетика, Чешка академия на науките, Прага, Чехия (LSCC-PR2-Mc29); проф. Катлин Немет,Лаборатория по експериментална генна терапия, Институт по хематология и имунология, Национален медицински център, Будапеща, Унгария(Клетъчни линии NCI-H1650 и А431, както и получените от тях клонове); д-р И. Халупа, Институт за изследване на рака, Братислава, Словакия(BP6); ст.н.с. ІІ ст. д-р Ивайло Алек-сандров, двмн, ИЕПП – БАН (Линия LSR-SF(SR), която, въпреки дублирането на имената, е различна отклетъчната линия, получена и характеризирана от Полянова и сътр., 1981); ст.н.с. ІІ ст. д-р Иван Иванов, ИЕПП-БАН. (LSTC-SF-Mc31).

NNO CH3

CH3

NN

NN OCH3

CH3

Фиг. 1 а. N,N’-бис(4-антипирилметил)-пиперазин (BAMP)

NN N

N

NN

N NO

CH2 N

CH2

CH2

NCH2

CH2 O

CH3

CH3

CH3

CH2

O

CH3

O

CH3

CH3

CH3

CH3

Фиг. 1 б. N,N’-тетра-(антипирил-1-метил)-1,2-диаминоетан (TAMEN)

Таблица 2. Комплекси на метали с лиганди тип Манихови бази

Таблица 3. Комплексни съединения на метали с жлъчни киселини

Фиг. 2. Структурни формули на бисбензилизохинолинови алкалоиди

N MeH

MeO

NMeH

OMe

OMe

OMe

OMe

O

O

2а. Хернандезин

NH3C

OCH3

OCH3

OR

NCH3

H3CO

H3CO

O

O1

H H

34 5 6

78

910

1'

5'

9'

10'

1. Thalidasine R = CH32. Thalfoetidine R = H

A A'

B B'

a

b

2б. Талфетидин и (R = H) Талидазин (R = CH3)

М Е Т О Д И

І. Клетъчно култивиране:

1. Получаване и клониране на постоянна клетъчна линия от експериментален тумор;2. Получаване на първични култури от кокоши ембриони;3. Изолиране на перитонеални макрофаги и клетки от слезка, черен дроб, бъбрек, тестис, тимус и бурза на Фабриций (Вursa cloacalis) на експери-ментални животни;4. Замразяване и размразяване на клетки.

2 Методи за определяне на преживяемост и пролиферативна активност на клетки в култура:- Построяване на растежни криви;

- Колонии-образуващ тест;- Авторадиография (включване на 3Н-тимидин);- Тест за определяне виталността на клетките чрез оцветяване с трипаново синьо;- Тест за включване на неутрално червено по Borenfreund и Puerner (1985).

3. Кариотипен анализ.

4. Методи за доказване на вирусна продукция в клетки:4.1. Електронно-микроскопски изследвания;4.2. Провеждане на експерименти in vivo;4.3.Концентриране и пречистване на вирус.

5. Биохимични методи:Изолиране на тотална ДНК от еукариотни клетки;

Изолиране на тотална РНК от еукариотни клетки;

Пречистване на РНК от ДНК (DNase treatment);

Спектрофотометрично определяне на нуклеинови киселини;

Определяне на белтъчно съдържание по метода на Брадфорд (1976);Получаване на екстракт с 3М KCl по Ignjatovich и сътр. (1978).

6. Молекулярно-биологични методи:Тест за установяване наличието на обратна транскриптаза в културални течности;

PCR за доказване присъствието на гена gag-myc;

RT-PCR за доказване експресията на гена gag-myc;

Полуколичествен PCR за определяне на провирусното съдържание;

Електрофоретичен анализ на единични клетки (“Comet assay”) в алкални условия (Olive et al., 1995).

7. Имунологични методи.7.1. За доказване експресията на тумор-свързани антигени с помощта на моноклонални антитела:

Имунизация на опитни животни;Получаване, клониране и субклониране на хибридомни клетъчни линии по стандартния метод описан от Kohler и Milstein (1975);Опити за получаване на асцитна течност в BALB/c мишки;Комплементзависима цитотоксичност;Двойноимунодифузионен тест по Ouchterloni (1948) със стандартен кит (Sigma Immuno Chemicals);Непряка имунофлуоресценция с нативни и с фиксирани клетки;Имуноточков метод (Dot immunobinding assay);Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA);SDS-Полиакриламидна гел електрофореза и електроимуноблот (Western Blotting).

7.2. За определяне на имунния статус на опитни животни:Тест за определяне на миграционната активност in vitro на слезкови лимфоцити и перитонеални макрофаги по George и Vaughan (1962);Определяне на антитяло-синтезиращи плако-образуващи клетки по Cunningham (1965);Определяне титъра на серумните антитела (хемолизини и аглутинини) срещу овчи еритроцити по метода на Кэбот и Мейери (1968) с

микротитратор Такачи;Радиоизотопен метод за определяне пролиферацията на слезкови клетки в присъствие на митоген (Реакция бластна трансформация).

8. Проучвания върху туморогенен потенциал на клетки in vivo.

9. Цитологични, патоморфологични и патохистологични изследвания.

10. Статистическа обработка на получените резултати - Метод на еднофакторния дисперсионен анализ (ANOVA); Рost hoc тестове (Dunnettили Newman-Keuls); t-тестът на Student-Fisher. При статистическата обработка на експерименталните данни и построяването на графики бяхаизползвани компютърните програми “Microsoft Excel”, Microsoft Corporation, U.S.A. 1997 и GraphPad Prizm, GraphPad Software Inc., U.S.A., 2000.

ІV. Р Е З У Л Т А Т И

ПОЛУЧАВАНЕ, КЛОНИРАНЕ И ХАРАКТЕРИЗИРАНЕ НА ПОСТОЯННИ КЛЕТЪЧНИ ЛИНИИ ОТ ТРАНСПЛАНТИРУЕМ ХЕПАТОМ У ПИЛЕ, ПРЕ-ДИЗВИКАН С МИЕЛОЦИТОМАТОЗНИЯ ВИРУС Мс29

IV.1. Получаване на постоянна клетъчна линия от трансплантируем хепатом у пиле, предизвикан с миелоцитоматозния вирус Мс29(LSCT-BPO, Хепатом Мс29)

Като изходен материал за получаване на постоянната клетъчна линия беше използван тумор (с размери 1.0/1.0 cm) у 16-дневно пиле Бял легхорнлиния 15І, инжектирано подкожно в областта на колянната гънка на едноседмична възраст с 5.0 х 106 живи клетки от хепатом Мс29. Първичнатаклетъчна култура беше получена чрез механично раздробяване и химично (0.05% трипсин, 0.02% ЕДТА) въздействие върху тъканите. Съгласнопредложената от Witter (1979) международна номенклатура за означаване на птичите клетъчни линии и туморни трансплантанти създадената отнас постоянна клетъчна линия беше означена с инициалите LSCC-SF(Mc29).

IV.2. Клониране и субклониране на клетките от линия LSCC-SF(Mc29)Клонирането и субклонирането на клетъчна линия LSCC-SF(Mc29) беше проведено на 54ия пасаж. Предварително трипсинизираните и промити (вхранителна среда МЕМ без серум) клетки бяха ресуспендирани в среда за култивиране - смес от равни съотношения МЕМ и 199 (1 : 1, vol/vol),съдържаща антибиотици (100 μg/ml стрептомицин и 100 U/ml пеницилин) и 20% фетален телешки серум). Клетките бяха засети в плоскодънни96-ямкови плаки в концентрация 1 клетка/ямка. В резултат бяха получени 4 постоянни клетъчни /суб/линии (клонове) - E7, D6Е10, E10 и G9В4.

IV.3. Определяне на основни биологични характеристики на култивирани в лабораторни условия клетки от линия LSCC-SF(Mc29) и по-лучените от нея клонове

IV.3.1. Морфологична характеристика – На Фигури 3а-6а са представени култури от линия LSCC-SF-(Mc29 и получените от нея клетъчни клоно-ве.

IV.3.2. Растежни свойства на клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клетъчни клонове

Особености на растежа. Изисквания към хранителни среди и растежни фактори Клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове прилепват към стъкло и пластмаса и растат в монослой, без да показ-

ват контактно инхибиране. При прерастване (поради закъсняло пасиране или неравномерно засяване) те образуват наподобяващи гроздовеструпвания от голям брой закръглени клетки, които се отделят в културалната срeда и продължават да нарастват триизмерно в нея. Тези гроздо-ве са свързани с дъното на съда за култивиране чрез тънка верижка от клетки, която лесно може да бъде прекъсната при разклащане. Проверка стеста за оцветяване с трипаново синьо показа, че преобладаващата част от тези клетки (> 85-90%) са живи.

Нашият експериментален опит показа, че клетъчна линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове могат да бъдат успешно култи-вирани в хранителни среди DMEM, IMDM, както и в смеси от равни съотношения (1 : 1, vol/vol) IMDM или МЕМ + Е 199. Клетките се развиватоптимално в присъствие на 10% фетален телешки серум (ФТС). Количеството му в растежната среда може да бъде намалено до 5%, без това дасе отрази на морфологията и растежните свойства на клетките. Феталният телешки серум може да бъде заменен със смес от 5% ФТС + 5% НТС,10% Newborn серум, както и с 10% нормален телешки серум (НТС).

Клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове бяха култивирани успешно както в присъствие на топлинно инактивиран(30 минути при 56оС), така и на неинактивиран ФТС.

Време на удвояване на клетките и плътност на растеж На Фигура 7 са представени растежните криви на клетките от линия LSCC-SF(Mc29) (пасаж 150 -155) и на получените от нея клонове

(пасажи 135 -150) при различни изходни концентрации на засяване на клетките – 3.0 х 104, 5.0 х 104 и 1.0 х 105 клетки/сm2. С увеличаване наизходната концентрация беше наблюдавано известно скъсяване на времето необходимо за удвояване на броя на клетките, както и на времетонеобходимо за достигане на т.нар. плътност на растежа (максимален брой клетки/сm2) (Табл. 4).

Включване на 3Н тимидин в ДНК на туморните клетки Степента на включване на 3Н тимидин, отразяваща нивото на репликация на ДНК в клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от

нея клонове, беше определена чрез авторадиография. Използвани бяха 48-часови култури от засети върху стерилни ламели клетки. При отчита-нето на резултатите за всяка линия бяха изброени под светлинен микроскоп клетките включили 3Н тимидин (сред не по-малко от 200 – 250 клеткиза всяка проба в 4-5 различни зрителни полета). Данните са представени в Табл. 4.

Растеж в полутечна среда на клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове (Колонии-образуваща способност на клет-ките)

В полутечна среда (смесени в равни съотношения двойноконцентрирана хранителна среда DMEM и 0.9% агар Difco) клетките от линияLSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове (засети в концентрации 0.5, 0.75, 1.5, 3.0 и 6.0 х 103 клетки/ямка) се размножават, като образуватхарактерни компактни колонии. Първите микроскопски установими колонии от по 8-10 клетки се появяваха 3-5 дена след засяването. Съществениразличия във формата и големината на колониите, образувани от клетките на отделните туморни линии, не бяха наблюдавани (Фиг. 8).

Фигура 8. Колонии в полутечна среда образувани от клетките на линии LSCC-SF(Mc29) (a), E7 (b) и D6E10 (c).

Чрез изброяване на образуваните колонии под инвертен микроскоп беше определена т. нар клонална ефективност на туморните клетки отлинии LSCC-SF(Mc29), E7, D6E10, E10 и G9B4, представляваща процентът от засетите клетки (1.0 х 103) дали началото на колонии съставени отне по-малко от 10 клетки (Табл. 4). В зависимост от способността си да образуват колонии в полутечна среда, изследваните от нас туморни линиисе подреждат както следва:

E7 ³ LSCC-SF(Mc29) > D6E10 > E10 > G9B4

Фигура 7. Растежни криви на линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клетъчни клонове

Табл. 4. Растежни свойства на култивирани в лабораторни условия клетки от линия LSCC-SF(Mc29)и получените от нея клонове

Клетъчналиния

Изходнаконцентрация назасетите клетки,

х 106

Време наудвояване на

клетките(часове)

Плътност нарастеж на

клетките (бройклетки / cm2)

Време задостигане на

максималнатаплътност на

клетките (часове)

Способност заобразуване на

колонии вполутечна среда

(% a)

Включване на3Н-тимидин

(% b)

LSCC-SF(Mc29)

3510

28.824.021.3

8.120 ± 3.3617.653 ± 3.5737.636 ± 3.250

1209672

10.203 ± 1.047 ** 33.6 ± 3.18

E7 3510

22.518.019.4

8.109 ± 3.9537.750 ± 3.5407.536 ± 3.359

1209672

10. 804 ± 0.895 ** 37.9 ± 3.24

D6E10 3510

2628.721.4

6.723 ± 4.0045.517 ± 2.2106.919 ± 3.153

1209772

8.412 ± 0.950 ** 28.6 ± 2.18

E10 3510

32.734.332.6

5.913 ± 3.2495.333 ± 2.6386.323 ± 3.013

1209672

7.345 ± 0.897 * 22.9 ± 2.84

G9B4 3510

40.532.729

5.420 ± 2.0945.112 ± 2.3376.218 ± 2.364

1209672

4.533 ± 0.138 17.4 ± 2.02

* P < 0.05, ** P < 0.01 (степента на достоверност на получените резултати е отчетена спрямо G9B4)a – Процентът на образувалите колонии в полутечна среда клетки е отчетен спрямо общия брой засети в ямка клетки (1 х 103).b - Включването на 3Н-тимидин е отчетено чрез авторадиография в 48-часови клетъчни култури. В таблицата е представен %

клетки включили 3Н-тимидин

IV.4. Кариотипен анализ

От всяка клетъчна линия бяха анализирани по 50 метафазни пластинки. При интерпретацията на получените резултати беше използ-вана въведената номенклатура за хромозомния набор на кокошката (Gallus domesticus). Във всяка метафазна пластина бяха идентифицирани до8 автозомни хромозомни двойки, както и две полови хромозоми. Където беше възможно, са преброени и микрохромозомите. Проведеният карио-типен анализ доказа, че клетките на всички изследвани от нас туморни линии принадлежат на вид Gallus domesticus. В същото време обаче, бяханаблюдавани и някои изменения в броя на хромозомите. Така например, диплоиден хромозомен набор беше констатиран в 87% от клетките налинии LSCC-SF-Mc29 и Е7, в 67 % от клетките на линия D6E10 и в 59% от клетките на линия G9B4. Най-често срещаната аномалия при клетките стриплоиден хромозомен набор беше липсата на едното копие на хромозома №1. Такава дизомия на хромозома 1 беше намерена при 13% оттриплоидните клетки на линия D6E10. Ендоредупликация беше наблюдавана при всички анализирани клетъчни линии, като честотата й бешенай-висока при клетките от линии Е7 и G9B4 - 7%. Кариотипният анализ на клетките е проведен с любезното съдействие на н.с. І ст. Пламена Йорданова, ИЕПП - БАН

Фиг. 9. Хромозомен набор на клетки от линии D6E10 (а) и Е7 (б)

а. D6E10

b. E7

IV.5. Туморогенен потенциал in vivo на клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове

IV.5.1. При пилетаIV.5.1.1. Туморогенност за инбредни пилета порода Бял легхорн линия 15I

Опитните животни бяха разпределени в групи (n = 4 – 8) и клетки от отделните туморни линии (чиято жизненост беше определена чрезтеста за оцветяване с трипаново синьо) бяха имплантирани подкожно (s.c.) в областта на колянната гънка. Отделните експерименти бяха изпъл-нени при използването на пилета на различна възраст, както и при инжектиране на различен брой туморни клетки. Във всеки отделен експери-мент обаче бяха включени пилета на еднаква възраст, които бяха третирани при идентични условия.

Резултатите от проведените проучвания са обобщени в Табл. 5. Те показват, че според способността си да предизвикват образуванена тумори in vivo в пилета Бял легхорн линия 15І, изследваните клетъчни линии се подреждат както следва:

E7 ³ LSCC-SF(Mc29) > D6E10 > E10 > G9B4

В някои случаи масата на туморите предизвикани с клетки от линия Е7 достигаше до 6.62% - 8.89 % от масата на пилето.

Клетки от линия LSCC-PR2(Mc29) също бяха трансплантирани (s.c. в областта на колянната гънка) в 7- и 14-дневни пилета Бял легхорн линия 15І.Част от тези животни (19/30) бяха безболезнено убити на 14-18ия ден след имплантирането на туморните клетки, а останалите (11/30) бяха прос-ледени в течение на по-дълъг период от време - ≥ 34 дена. В нито един от случаите не беше установено наличие на туморни образувания намястото на трансплантацията на хепатомните клетки от линия LSCC-PR2(Mc29). Но докато при аутопсираните на 14-18ия ден след имплантациятапилета не бяха забелязани съществени видими изменения в тъканите и органите, то при част (9/11) от изследваните след по-дълъг период отвреме (≥ 34 дена) експериментални животни бяха намерени солидни тумори в някои вътрешни органи: при всички реагирали пилетабяха наблюдавани злокачествени новообразувания в областта на тимуса, а в един от случаите тази находка се съпътстваше от новообразу-вания (два възела с маса 1.5 gr и 18.8 gr) в единия бъбрек. Появилите се върху тимуса (понякога двустранно) туморчета бяха с плътно еластичнаконсистенция, с размери 1-4 mm в диаметър, като при едно от пилетата отделните възелчета на тимуса бяха срастнали (пакетирани) помежду си.

IV.5.1.2. Туморогенност при комерсиални пилета порода ДжилингПри провеждането на експерименти с комерсиални пилета порода Джилинг бяха получени резултати, сходни с представените при

използването на пилета Бял легхорн линия 15І. Данните са обобщени в Табл. 6. С най-висока туморогенна активност и тук се отличаваха клеткитеот линия LSCC-SF(Mc29) и E7, а с най-ниска – тези от линия G9B4.Инжектирането на едноседмични пилета порода Джилинг с клетки от линия LSCC-PR2(Mc29) (2.5, 5.0, 7.5 или 10.0 х 106) не доведе до поява натуморни образувания на мястото на трансплантацията. Опитните животни от тази група бяха безболезнено убити и изследвани 21 – 28 дена следимплантацията на хепатомните клетки, но видими промени във вътрешните органи и в кръвните показатели не бяха наблюдавани.

Патоморфологични изследванияПри аутопсирането на повечето опитни животни не бяха констатирани макроскопски изменения във вътрешните органи. При част от

тумор-носещите пилета беше забелязано наличие на изразена в различна степен спленомегалия, а в отделни случаи размерът на този органбеше намален. Често се наблюдаваше атрофия на Фабрициевата бурза и/или тимуса. При малък брой пилета Бял легхорн линия 15І беше уста-новено наличие на туморни образувания и/или извън мястото на имплантиране на хепатомните клетки (Табл. 5). При комерсиалните пилетапорода Джилинг наличие на неопластични образувания извън областта на инокулиране на туморните клетки не беше наблюдавано. Някои оттуморите бяха с кашава консистенция поради напредналите некротични процеси, но се срещаха и меко- или плътноеластични тумори. Срезнатаим повърхност беше пъстра поради наличие на различно изразени кръвоизливи и нeкрози. В малка част от туморите, предизвикани с клетки отлинии LSCC-SF(Mc29) и E7, беше констатирано наличие на белезникава течност с неприятен мирис. Кожата над туморите обикновено бешеливидна, а в някои случаи разязвена. Големината им варираше от житено зърно до бобено зърно и голям лешник. Повечето тумори бяха сраст-нали с подлежащите тъкани, често се наблюдаваше инфилтративен растеж към бедрената мускулатура, към коремната и/или гръдната стена. Внякои случаи (много рядко) беше установено наличие на капсула. Бяха регистрирани и случаи на спонтанна регресия, особено при пилета породаДжилинг, на които бяха имплантирани клетки от линия Е10 (Табл. 6).

Патохистологични изследванияНа Фигури 3б – 6Б са представени срези от тумори, получени при инокулирането на клетки от отделните туморни линия в пиленца

порода Бял легхорн линия 15 I.

Таблица 5. Туморогенност in vivo на клетъчна линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове при пилета Бял легхорн линия 15І

- Брой пилета (тумор-носещи, както и нереагирали с развитие на туморни образувания) преживели 20 дена след имплантирането на туморнитеклетки;b – В знаменателя е посочен общият брой на инокулираните с туморни клетки пилета, а в числителя – броят на реагиралите с развитие на тумор-ни образувания опитни животни;с – Част от тези пилета са убити 7 дена след имплантирането на туморните клетки за провеждане на имунологични реакции;d - Брой пилета реагирали с поява на туморни образувания на мястото на имплантиране на хепатомните клетки;

е – В скобите е посочена локализацията на новообразуванията (Б – бъбрек; ЧД – черен дроб, П – панкреас, Т - тимус, Сл – слезка).

Таблица 6. Туморогенност in vivo на клетъчна линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клетъчни клонове при комерсиални пилетапорода Джилинг

а - В знаменателя е посочен общият брой на инокулирираните с туморни клетки пилета, а в числителя – броят на реагиралите с развитие натумор опитни животнив – Случаи на спонтанна регресия

Фиг. 3. А. 24-часова култура от линия LSCC-SF(Mc29): клетки със сфероидни хомогенно оцветени ядра и епителоидни клетки,формиращи ацинарноподобни структури, както и малко на брой фибробласти; по-тъмно оцветени струпвания от епителоидниклетки. ХЕ. 100х.Б. Хистологична картина на тумор, предизвикан с подкожното инжектиране на 5.0 х 106 клетки от линия LSCC-SF(Mc29). Наблю-дават се псевдодуктални структури, заобиколени от хлабава съединителна тъкан и групи от бързо растящи туморни клетки с хи-перхроматични ядра. ХЕ. 250 х.

Фиг. 4. А. 24-часова култура от клетъчна линия Е7. Формиране на многобройни тъмнооцветени струпвания от епителоидни клетки.Наблюдават се клетки с неправилна форма и малко на брой фибробласти. ХЕ. 100 х.Б. Подкожен тумор у пиле, появил се след инокулирането на 5.0 х 106 клетки от линия Е7. Умерено изразен клетъчен и ядрен ати-пизъм и умерено изразена лимфоцитна инфилтрация. Наблюдават се усилена митотична активност в епителоподобни клетки ипсевдодуктални структури, заобиколени от съединителна тъкан и некротични участъци. ХЕ. 250 х.

Фиг. 5. А. 24-часова култура от клетъчна линия D6Е10. Формиране на кластерни образувания от епителоидни клетки с хиперхро-матични ядра, неправилни митози и маргинация на хроматина. Наблюдават се характерните за инфектираните с вирус Мс29 кле-тки проминиращи нуклеоли. ХЕ. 100 х.Б. Подкожен тумор в пиле предизвикан с клетки от линия D6E10.

Фиг. 6. А. 24-часова култура от плеоморфни клетки от линия G9B4. ХЕ. 100 х.Б. Подкожен тумор у пиле, предизвикан с подкожно имплантиране на 7.5 х 106 клетки от линия G9B4. Умерено изразен ядрен иклетъчен атипизъм с преобладаване на относително мономорфни ядра и клетки. Присъствие на клетки с големи везикуларни яд-ра, маргинация на хроматина и големи проминиращи нуклеоли. ХЕ. 250 х.

Кръвни показатели при пилета (Бял легхорн линия 15І, Джилинг) с имплантирани туморни клетки Анализирането на натривките, изготвени от периферната кръв както на тумор-носещите, така и на нереагиралите с образуване на

тумори експериментални животни, не показа наличие на съществени отклонения в броя и зрелостта на кръвните клетки. В отделни случи бешеотбелязано наличието на слабо изразена анемия или левкоцитоза, но без промяна в зрелостта на левкоцитите. Аномалии в кръвната картина небяха отбелязани и при пилетата, на които бяха имплантирани клетки от линия LSCC-PR2(Mc29).

IV.5.2. Туморогенност за голи мишки В експериментите бяха използвани безтимусни (голи) мишки от линия BALB/c-nu и от двата пола на възраст 5-6 седмици. Мишките бяха

инжектирани подкожно в областта на гърба с различен брой живи клетки - 2.5, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0 или 20.0 х 106 клетки/мишка, суспендирани в 0.1ml фосфатно-солеви буфер (PBS) с рН 7.2. В някои от случаите експерименталните животни бяха инокулирани двустранно. Туморните клетки ототделните линии бяха предварително трипсинизирани и промити с PBS чрез центрофугиране (1200 об/мин за 10 минути, 4оС). Виталността имбеше определена чрез теста за оцветяване с трипаново синьо. Животните бяха проверявани през ден (2-3 пъти седмично) чрез палпация заналичие на туморни образувания, както и за промяна в общото им състояние. Размерите на наблюдаваните тумори бяха определени с помощтана шублер, а обемите (V) им бяха изчислени по формулата

V = a . b2/2,

където „V” e обемът, “а“ е по-малкият, а “в” е по-големият диаметър на тумора (Pelletier et al., 1991). Всички мишки бяха наблюдавани за период не по-кратък от 3 месеца. Данните от проучванията, проведени върху трансплантационната

способност на клетки от изследваните туморни линии в безтимусни (голи) мишки са представени в Табл. 7.

От развилия се след инжектирането на 10.0 х 106 клетки от линия Е7 тумор в мишка № 9, беше получена клетъчна култура, означена отнас с работно наименование E7-NMT-CC. Тя беше създадена чрез култивиране в лабораторни условия (в 24 ямкова плака) на експланти от ту-морната тъкан в среда DMEM допълнена с 20% фетален телешки серум и антибиотици (100 μg/ml стрептомицин и 100 U/ml пеницилин). По-нататък клетките бяха субкултивирани със стандартна смес от 0.05% трипсин и 0.02% ЕДТА при постигане на 75-100% плътност на монослоя ипретърпяха около 15 пасажа. От тази клетъчна култура, както и от предизвиканите с клетки от линия LSCC-SF(Mc29) и Е7 тумори, бяха изолираниДНК и РНК, в които беше доказано присъствието и експресията на вирусния gag-myc ген съответно чрез PCR и RT-PCR (Виж по-нататък, Фиг. 15 и16/17).

За съжаление, поради ограничения брой опитни животни, с които разполагахме, нямаше възможност за прехвърляне (пасаж) на туморните клеткина други мишки.

Експериментите с голи мишки бяха проведени в Департамента по молекулярна вирусология в Института за изследване на рака към Словашкатаакадемия на науките, Братислава, Словакия.

Табл. 7. Трансплантационна способност на клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове у безтимусни мишки

КЛЕТЪЧНА

ЛИНИЯ

№МИШКА

ПОЛ ВЪЗРАСТ(ДНИ)

БРОЙ ИНОКУЛИРА-НИ

КЛЕТКИ, Х 106

МЯСТОНА ИНОКУЛА-

ЦИЯ

НАЛИЧИЕНА ТУМОР

ЛАТЕНТЕНПЕРИОД(ДНИ)

LSCC-SF(Mc2

9)

1.2.3.4.56.

MMMMMF

434343343437

10.010.020.05.015.012.5

ГръбГръбГръбГръбГръбГръб

-----+

-----

16Е7 7.

8.9.

10.

11.

FМM

М

F

393944

44

43

5.05.010.020.07.015.01.02.5

ГръбГръбЛявоДясноЛявоДясноЛявоДясно

-+++++--

-2010101010--

D6E10 12.

13.14.

F

FF

35

3737

5.010.012.515.0

ЛявоДясноГръбГръб

----

----

Е10 15.

16.

M

F

44

37

5.05.07.015.0

ЛявоДясноЛявоДясно

----

----

G9B4 1718.

19.

FF

F

3434

34

7.05.010.012.520.0

ГръбЛявоДясноЛявоДясно

-----

-----

LSCC-PR2

(Mc29)

20.

21.

F

F

39

39

10.020.05.010.0

ЛявоДясноЛявоДясно

----

----

Фигура 10. Обем на туморите (mm3), предизвикани чрез подкожното импланитране на клетки от линия Е7 в голи мишки

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Обе

м н

а ту

мор

а, m

m3

5 (5) 7 (3) 10 15 (3) 20

Брой инокулирани клетки, x 106;В скобите е посочен интервалът от време (дни), след който е направено второто измерване

I измерване ІІ измерване

Първото измерване е направено при установяването на тумора. В скобите е посочен интервалът (дни), след който е осъществено второто измер-ване.

Фигура 11. Тумори у гола мишка, предизвикани чрез инокулиране на 10.0 х 106 (ляво) и 20.0 х 106 (дясно) клетки от линия Е7 (а) и изграждащите ги клетки в отпечатъчен препарат, оцветен по Giemsa при обектив 100 Х (b).

IV.6. Проучвания върху някои прояви на имунния отговор на пилета, на които са имплантирани клетки от линия LSCC-SF(Mc29) и полу-чените от нея клонове

В тези проучвания са използвани двуседмични пилета Бял легхорн линия 15I, на които бяха инокулирани подкожно в областта на колянната гънка5.0 х 106 туморни клетки. Имунологичните реакции са проведени 7 дена след имплантирането на клетките. Получените резултати са обобщени вТабл. 8 и 9.

Таблица 8. Проучвания върху някои прояви на хуморалния имунен отговор при пилета, на които са имплантирани туморни клетки от линияLSCC-SF-Mc29 и получените от нея клонове

a - В скобите е представено съответното разреждане на серума* - p < 0.05; ** p < 0.01 (в сравнение с контролата)С „Тумор + „ са означени тумор-носещите пилета, а с „Тумор –„ – пилетата без видими туморни образувания

Таблица 9. Проучвания върху някои прояви на клетъчния имунен отговор при пилета, на които са имплантирани туморни клетки от линия LSCC-SF-Mc29 и получените от нея клонове

* - p < 0.05; ** p < 0.01 (в сравнение с контролата)

* (IS) - Индекс на стимулация – представлява отношението между количеството на включения 3Н-тимидин (cpm) в слезковите клетки култивиранив присъствие на фитохемаглутинин (ФХА) спрямо радиоактивността на пробите култивирани в отсъствие на митоген.в- Данните са представени като процент спрямо контролата

С „Тумор + „ са означени тумор-носещите пилета, а с „Тумор –„ – пилетата без видими туморни образувания

IV.7. Установяване присъствието на тумор-свързан антиген в клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове IV.7.1. Получаване на хибридомни клонове секретиращи моноклонални антитела срещу тумор-свързан антиген

Имунизация Четиридесет и пет дневни мъжки мишки от линия BALB/c (4 броя) бяха имунизирани четирикратно последователно през 10 дена, както

следва: първият път с по 1.0 х 107 живи клетки от линия LSCC-SF(Mc29), смесени с пълен адювант на Freund в общ обем 0.4 ml, а останалите 3пъти с по 1 mg белтък, съдържащ се в 0.5 ml екстракт с 3M KCl от туморни клетки без адювант.

Фузия Хибридомните клетки бяха получени след сливане на слезкови лимфоцити от две мишки, изолирани на 4ия ден след последната имуни-

зация и експоненциално растящи миши миеломни клетки от линия P3U1 по метода на Kohler и Milstein (1975).

Подбор на хибридомни клетки, секретиращи антитела От засетите общо 480 ямки (пет 96-ямкови плоскодънни плаки) растеж на хибридомни колонии беше наблюдаван в 96 (20%). Суперна-

тантите от отделните ямки бяха събирани, когато поне 2/3 от дъното им се покриеше с активно делящи се хибридомни клетки. Изпробването насупернатантите за наличие на специфични антитела беше проведено чрез 3 стандартни метода – имуноточков метод, ELISA и непряка имуноф-луоресценция. Като антиген при първите два теста беше използван екстракт с 3М KCl от клетките на линия LSCC-SF(Mc29). За антиген при про-веждането на непряката имунофлуоресцентна техника служеха нефиксирани (живи), както и фиксирани клетки, от тази туморна линия. За поло-жителна контрола беше използван серум от мишка, послужила като донор на слезка при провеждане на сливането. Отрицателна контрола бешехранителна среда, аналогична на тази, в която култивирахме хибридомните клетки. Всяка супернатанта беше подлагана най-малко три пъти наоценка (чрез повече от един метод) преди клетките от съответната ямка да бъдат отстранени като непродуциращи антитела. По този начин бяханамерени 12 ямки, растящите в които клетки секретираха антитела разпознаващи антиген/и в клетките на линия LSCC-SF(Mc29). С цел да бъдатполучени клонове, клетките от тези ямки бяха подложени на клониране.

Клониране и реклониранеКлонирането беше осъществено в общо шест плоскодънни 96-ямкови микроплаки (по ½ плака за клетките от всяка отделна ямка) по

метода на крайните разреждания върху монослой от миши перитонеални макрофаги, които бяха посети (104 клетки/ямка) 24 часа преди хибри-домните клетки. Проведен беше стриктен ежедневен контрол под инвертен микроскоп с цел своевременно откриване на единични колонии ипроследяване на развитието им. Такива колонии се появиха общо в 46 ямки, като първите бяха забелязани на 8ия ден след засяването. Следвашеописаната вече процедура - събиране на супернатанти (при достигане на 2/3 конфлуентност) и провеждане на изброените по-горе тестове -имуноточков метод и непряка имунофлуоресценция. В резултат на клонирането бяха получени 8 хибридомни клона, секретиращи моноклоналниантитела (MoAbs), които реагираха с клетките от линия LSCC-SF(Mc29). Те бяха означени както следва: 1А5, 1А6, 1F5, 2Е9, 3B10, 3G8, 4А1 и 4D3.

Опити за получаване на асцитна течност В експериментите бяха използвани BALB/c мишки от двата пола. Опитните животни бяха третирани предварително (i.p.) с 0.2 ml Прис-

тан, а експоненциално растящи хибридомни клетки от клон 1А5 или 1А6 бяха импланитрани (i.p.) 48 часа по-късно. Проведени бяха два независими експеримента – с инокулиране на 2.0 х 106 клетки (I експеримент) и 5.0 х 106 (II експеримент). Общият

брой на включените в тях животни беше 20 – по 10 за всеки хибридомен клон. Животните бяха убити под етерна наркоза чрез декапитиране 14-19дена (I експеримент) и 12-18 дена (II експеримент) след трансплантирането на хибридомните клетки. При по-голямата част от мишките бешенаблюдавано наличие на тумори с размери около 1-2 mm по мезентериума, а понякога и във вътрешни органи (черен дроб, бъбрек, пикоченмехур, тестис, маточни връзки). При някои от опитните животни беше установено наличие на спленомегалия. В нито един от случаите обаче небеше намерена асцитна течност.

IV.7.2. Характеризиране на моноклоналните антитела Комплементзависима цитотоксичност

Моноклоналните антитела, секретирани от получените от нас хибридомни клонове - 1А5, 1А6, 1F5, 2E9, 3B10, 3G8, 4D1 и 4D3, не проя-вяват комплементзависима цитотоксичност спрямо клетки от: линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове; линии LSCC-PR2(Mc29), LSTC-SF(Mc31) и LSR-SF(SR); 11-дневни кокоши ембриони Бял легхорн линия 15І; черен дроб, бъбрек, слезка, тимус, бурза на Фабриций, костно-мозъчни клетки и клетки от периферна кръв и перитонеална кухина на здрави 45-дневни пилета; клетки от асцитните тумори на Герен, Ерлих иЗаждела.

Определяне на класа и субкласа на получените моноклонални антителаПри проведената от нас двойна имунодифузия по Ouchterlony (1948) с кози антисеруми специфични за различните класове и субкласо-

ве на мишите имуноглобулини (търговски кит Sigma Immuno Chemistry), беше установено, че моноклоналните антитела секретирани от хибридом-ни клонове 1А5, 1А6 и 3G8 са от субклас IgG1, а от клон 4D1 – от субклас IgG2b.

В по-нататъшната експериментална работа използвахме основно антитялото, секретирано от хибридомния клон 1А6. Решението ни дасе спрем именно върху него беше обусловено преди всичко от добрите растежни свойства на секретиращите го клетки и най-вече от силно изра-зената му реакция с клетките от линия LSCC-SF(Mc29).

СпецифичностРезултатите от проведените експерименти са систематизирани в Табл. 10. Те показаха, че при условията на проведените от нас експе-

рименти моноклоналното антитяло 1А6 реагира с клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове, но не взаимодейства с клетки, респектив-но екстракт с 3M KCl, от:

- пилешки ембриони (на 5, 8 и 11-дневна възраст);- нормални органи на възрастно (45-дневно) пиле;- линии от трансформирани с SR-RSV и Мс31 клетки. Кръстосана реакция не беше наблюдавана и с клетките от линия LSCC-

PR2(Mc29), получена от трансплантируем хепатом у пиле, предизвикан с вирус Мс29;- останалите клетъчни линии и експериментални тумори посочени в Табл. 10.

Табл. 10. Определяне на клетъчната и тъканната специфичност на туморния антиген, с който реагира секретиранотоот хибридомен клон 1А6 моноклонално антитяло

НИФ ELISA Имуно-точковметод

Електро-имуно-

блот

КЗЦТ

Линия LSCC-SF(Mc29) + + + + -Линия E7 + н.д. + + -Линия D6E10 + н.д. + + -Линия E10 + н.д. - - -Линия G9B4 + н.д. - - -Други клетъчни линии LSCC-PR2(Mc29) LSTC-SF(Mc31) LSR-SF(SR) ВР6 HepG2

-----

н.д.н.д.н.д.н.д.н.д.

--

н.д.н.д.н.д.

--

н.д.н.д.н.д.

-----

Тумор у пиле предизвикан чрез s.c.имплантиране на клетки от линии: LSCC-SF(Mc29) E7 D6E10 E10 G9B4

+++++

н.д.н.д.н.д.н.д.н.д.

+++

н.д.н.д.

+++

н.д.н.д.

-----

Други експериментални тумори:- Асцитен хепатом на Заждела- Асцитен тумор на Герен- Асцитен тумор на Ерлих

---

н.д.н.д.н.д.

н.д.н.д.н.д.

н.д.н.д.н.д.

---

Кокоши ембриони 5-дневни 8- дневни 11-дневни

н.д.н.д.

-

н.д.н.д.

-

---

---

н.д.н.д.

-Клетки от органи на здраво пиле: Черен дроб Бъбрек Слезка Тимус Бурза на Фабриций Костен мозъкПеритонеални клеткиКлетки от периферна кръв

--------

-----

н.д.н.д.н.д.

-----

н.д.н.д.н.д.

-н.д.н.д.н.д.н.д.н.д.н.д.н.д.

--------

Вирус Мс29 н.д. н.д. - - н.д.

Реакциите непряка имунофлуоресценция (НИФ) и комплемент-зависима цитотоксичност (КЗЦТ) са изпълнени склетки, а останалите три теста – ELISA, Имуноточков и Eлектроимуноблотът (Western Blotting) – с екстракти с 3МKCl от клетки, тъкани и органи.С (+) е означено наличието на положителна, а с (-) - на отрицателна реакция; н.д. – няма данни

IV.7.2. Характеризиране на тумор-свързания антиген

Локализиране на антигена в клеткатаАнтигенът, реагиращ с моноклоналното антитяло 1А6, беше локализиран in situ чрез непряка имунофлуоресцентна микроскопия, проведена кактос нативни, така и с фиксирани клетки. Присъствието на антигена беше установено под формата на гранули както върху клетъчната мембрана,така и интрацелуларно. Светене беше установено при около 25% от клетките. В контролните проби, където туморните клетки бяха инкубиранисъс среда RPMI, вместо със супернатанта, или само с белязано с флуоресцин изотиоцианат антитяло, реакцията беше отрицателна (Фиг. 12).

Фигура 12. Непряка имунофлуоресцентна реакция на фиксирани с метанол клетки от линия LSCC-SF-Mc29 с моноклонално антитя-ло, секретирано от хибридомен клон 1А6, и конюгирани с флуоресцин изотиоцианат антимиши имуноглобулини (a); Липса на реакцияпри клетки от същата линия, при които реакцията е проведена в отсъствие на моноклоналното антитяло 1А6 (Отрицателна контрола)(б). X 400.

Определяне на молекулната маса на антигена Чрез провеждане на SDS-полиакриламидна гел-електрофореза (SDS-PAAGE) последвана от електроимуноблот (Western Blotting) беше

установено, че молекулната маса на антигена, с който реагира моноклоналното антитяло секретирано от хибридомен клон 1А6, е около 25 kDa.Присъствието му беше доказано в екстракти с 3M KCl от клетъчни линии LSCC-SF(Mc29), E7 и D6E10, но не и в пробите от линии E10, G9B4,LSCC-PR2-Mc29 и LSTC-SF-Mc31, от кокоши ембриони и от концентриран и пречистен вирус Мс29 (Фиг. 13).

Фиг. 13. Определяне на молекулната маса на тумор-свързания антиген, с който реагира секретираното от хибридомен клон 1А6 монокло-нално антитяло. Електроимуноблот (Western blotting) след провеждане на електрофореза в 10% полиакриламиден гел (SDS-PAAGE). Ре-акцията е проведена с екстракти с 3М KCl от клетъчни линии LSCC-SF(Mc29) (2), LSCC-PR2(Mc29) (3), E7 (4), D6E10 (4), E10 (5), G9B4 (7),LSTC-SF(Mc31) (8); култура от 11-дневни кокоши ембриони (9); черен дроб от здраво пиле (10). Използвани са белязани с пероксидазаантимиши имуноглобулини и маркери (1) на Bio Rad (Dual Color).

IV.8. Доказване присъствието на гена gag-myc

С помощта на полимеразна верижна реакция (PCR) беше доказано наличието на гена gag–myc (v-myc) в клетките на: линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове; предизвиканите с тези линии тумори в пилета и голи мишки; култура E7-NMT-CC (получена от тумор убезтимусна мишка предизвикан с клетки от линия Е7); използваната за сравнителен анализ клетъчна линия LSCC-PR2(Mc29). За провежданетона PCR конструирахме следните праймери, които бяха изработени от фирмата “Invitrogen”: 5’-GAC GGG GGG AAC GGA CTA ACT T-3’ (forward) и5’-TTC CAG ATG TCC TCG GAC GG-3’ (reverse). Праймерите разпознават и амплифицират гранична област, включваща части от гените gag(който липсва в c-myc) и v-myc, но не разпознават нуклеотидни последователности в клетъчния му хомолог c-myc. Амплифицираният в хода наPCR продукт е с дължина 535 bp и обхваща областта между 1707та и 2241та нуклеотидни последователности. Полимеразната верижна реакция

беше проведена в обем 25 ml в DNA Engine DYAD (MJ Research) по оптимизирана от нас програма: Първоначалната денатурация на двойновери-жната ДНК беше осъществена при температура 94°C за 2 минути. Амплификацията беше проведена в продължение на 35 цикъла, включващиследните стъпки - денатурация при 94°C за 40 секунди, топене при 66°C за 1 минута, синтез при 72°C за 50 сек; удължаване на ДНК веригата при72°C за 7 минути и охлаждане на реакционната смес до 4°C.

ДНК беше изолирана чрез стандартна техника за екстракция с фенол-хлороформ-изоамилов алкохол от 48-часови култури намиращисе в експоненциална фаза на растеж, както и от малки парченца туморна тъкан. При провеждането на PCR бяха използвани следните контроли:

- Проба, към която не беше добавена ДНК, за да бъде проверена чистотата на реактивите и достоверността на получените резултати;

- ДНК от пилешки ембрионални клетки (2ри пасаж), за да потвърдим неспособността на конструираните от нас праймери да разпознават и ампли-фицират участъци от пилешкия c-myc;

- ДНК от здрава гола мишка, за да докажем липсата на реакция между използваните праймери и мишия ген c-myc.

Полуколичествено определяне на провирусното съдържание

Първата стъпка при полуколичественото определяне на провирусното съдържание на миелоцитоматозния вирус Мс29 в изследванитеот нас клетъчни култури, беше да изравним в максималната възможна степен съдържанието на ДНК в отделните проби. Това беше постигнаточрез спектрофотометрично определяне на концентрацията на ДНК и беше потвърдено чрез сравняване на сигнала получен при амплификациятана един от т.нар. house keeping гени – пилешкият β-актин.

Измерването на концентрацията на всяка проба ДНК беше осъществено трикратно през интервали от 2-3 дена с помощта на спектро-фотометър (UV/Vis Diode-Array Spectrophotometer, WPA).

Амплификацията на гена, кодиращ пилешкия β-актин, беше проведено с конструирани от нас и изработени от фирмата „Invitrogen” пра-ймери: 5’-CCC CGT GCT GTG TTC CCA T-3’ (forward) и 5’-TGG GCT TCA TCA CCA ACG-3’ (reverse). Амплифицираният продукт е с дължина 418 bpи обхваща областта между 1621та и 2038та нуклеотидни последователности.

Оптимизираната от нас програма на PCR започваше с т.нар. "горещ старт" за денатуриране на двойноверижната ДНК в отсъствие наензима Так-ДНК полимераза и дезоксирибонуклеотид трифосфати (dNTP) - загряване до 94°C за 10 минути, след което беше добавян разтвор,съдържащ буфер за PCR, MgCl2, праймери, dNTP и Так-ДНК полимераза. Амплификацията беше проведена в продължение на 35 цикъла, всекиедин от които включваше етапи на денатурация (94°C, 1 минута), топене (58°C, 1 минута), синтез (72°C, 1 минута).

След провеждането на PCR за β-актин не се наложиха корекции в съдържанието на ДНК на отделните проби (Фиг. 14).

По-нататък полуколичественото определяне на гена gag-myc продължи по следната схема:

1. Провеждане на PCR с проби от отделните линии, съдържащи еднакво количество ДНК. Получените резултати са представени на Фиг.15. Те показват изявата на различен по интензивност сигнал при амплифицирането на гена gag-myc в ДНК от изследваните клетъчнилинии – той беше най-силен при линии LSCC-SF(MC29) и E7, а най-слаб при клетъчна линия G9B4.

2. От ДНК пробите (с предварително изравнено съдържание) бяха приготвени двукратни разреждания в стерилна дейонизирана вода, вкоито крайното съдържание на ДНК беше: 0.500 μg, 0.250 μg, 0.125 μg, 0.063 μg и 0.031 μg. Резултатите от проведената PCR за gag-mycса представени на Фиг.16/17. Интензивността на сигнала в изходната проба (0.500 μg ДНК) при отделните линии значително се разли-чава. С намаляване съдържанието на ДНК в тях той постепенно заглъхва.

3. Проведена беше PCR с онези количества ДНК, с които, според получените в т. 2 резултати, при пробите от отделните линии се наблю-даваше сходен по сила сигнал. Установено беше, че за тази цел е достатъчно най-малко количество ДНК от линии LSCC-SF(Mc29) иЕ7 – 0.063 μg, а най-голямо от линия G9B4 – 0.500 μg. При останалите клетъчни линии – D6E10, E10 и LSCC-PR2(Mc29), както и при Е7NMT-CC близък по интензитет сигнал се получава при амплифициране на 0.125 μg ДНК.

За достоверността на получените от нас резулатти при полуколичественото определяне на провирусното съдържание на миелоцитоматозниявирус Мс29 говорят следните обстоятелства: 1) С помощта на спектрофотометричен анализ беше изравнена концентрацията на ДНК във всичкиизследвани проби; 2) Проведената полимеразна верижна реакция за амплифициране на гена за пилешкия бета актин (house-keeping gene) пока-за еднакви по интензивност сигнали за всички проби; 3) При провеждането на електрофорезата на получените при полуколичествена PCR проду-кти беше накапвано едно и също количество (2 μl) материал от всяка проба в съответните ямки; 4) Целият процес – от изолирането на ДНК дофотографирането на агарозните гелове след изтичане на електрофорезите, беше провеждан едновременно за всички проби, с едни и същиреактиви и при изпълнението на един и същ работен протокол.

Доказване експресията на гена gag–myc

Eкспресията на гена gag–myc на ниво иРНК беше доказана с помощта на т. нар. one-tube RT-PCR изпълнен с Promega kit съгласно инструкциитена Фирмата производител.

Липсата на интрони в гена v-myc направи възможно използването на същите праймери, които бяха приложени за установяване присъствието натози ген в ДНК на туморните клетки. Ето защо беше много важно да бъдем сигурни, че изолираната от нас РНК не съдържа дори и следи от ДНК.Това беше постигнато по следните два начина:

1. След изолирането й, РНК беше подложена на обработка с ДНКази (DNAse treatment). С така пречистената РНК беше проведена PCR - липсатана сигнал в този случай потвърди, че в пробите РНК, с които работим, действително не се съдържат специфични ДНК последователности.

Количественото определяне на РНК беше направено с помощта на спектрофотометрично изследване. Въз основа на получените данни съдържа-нието на РНК в отделните проби беше изравнено, след което беше осъщстевена RT-PCR по описания метод (с Promega kit). И тук, както и приамплификацията на ДНК за gag-myc, най-силни сигнали бяха регистрирани при клетъчни линии LSCC-SF(Mc29) и Е7, а най-слаба изява се наб-людаваше при линия G9B4 (Фиг. 24). Сигналите при останалите РНК проби (Е10, D6E10, LSCC-PR2-Mc29, E7-NMT-CC) бяха със сходен интензи-тет. Получените при проведения RT-PCR продукти бяха разредени (1:2, 1:4, 1:8, 1:16) в дейонизирана, свободна от РНКази стерилна вода, следкоето беше извършен електрофоретичен анализ в 1% агарозен гел. Установено беше отслабване на сигналите с напредване на разрежданията.

В Табл. 11. са представени разрежданията на получените при провеждането на RT-PCR продукти, които при електрофоретичен анализ в 1%агарозен гел дават сходни по сила сигнали.

Таблица 11. Обобщени данни, получени при полуколичественото определяне на провирусното съдържание в клетките от линия LSCC-SF(Mc29)и получените от нея клонове

а – Количества ДНК, които при провеждане на PCR за амплифициране на гена gag-myc дават сходни по сила сигнали;

б - Разреждания на получени при изпълнението на RT-PCR продукти, които при електрофоретичен анализ в 1% агарозен гел дават сходни посила сигнали.

М 1 2 3 4 5 6 7 8 К

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 К

Експериментите свързани с доказване присъствието и експресията на гена gag-myc, както и полуколичественото определяне на прови-русното съдържане на миелоцитоматозния вирус Мс29 в изследваните от нас клетъчни линии, бяха проведени в Департамента по молекулярнавирусология в Института за изследване на рака към Словашката академия на науките в Братислава, Словакия.

Фиг. 14. Амплификация на гена за пилешки бета-актин в клетки от линии LSCC-SF(Mc29) (1), E7 (2), D6E10 (3), E10 (4), G9B4 (5), LSCC-PR2(Mc29) (6); култура оттумор у гола мишка предизвикан с клетките от линия Е7 (7); нормални пилешкиембрионални клетки (8). M – маркери (1 kb DNA ladder, Promega); К –несъдържаща ДНК контрола. Реакцията е изпълнена при използване на еднаквиколичества ДНК (1 μg) от всяка проба.

418 bp

Фиг. 15. Амплификация на гена gag-myc в: клетките от линии LSCC-SF(Mc29) (1),E7 (2), D6E10 (3), G9B4 (4), E10 (5); култура от тумор в гола мишка предизвиканс клетките от линия Е7 (E7-NMT-CC) (6); линия LSCC-PR2(Mc29) (7). Генът не сеоткрива в ДНК от нормални пилешки ембрионални клетки (8) и здрава мишка (9).М – Маркери (1 kb DNA ladder, Promega), К – Несъдържаща ДНК контрола.

535 bp

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

М 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 К

Фиг. 16/17. Полимеразна верижна реакция за амплифициране на гена gag-myc изпълнена при различни изходни количества ДНК изолирана отклетките на линии:

LSCC-SF(Mc29):0.500 μg (1), 0.250 μg (2), 0.125 μg (3), 0.063 μg (4), 0.031 μg (5);

E7:0.500 μg (6), 0.250 μg (7), 0.125 μg (8), 0.063 μg (9), 0.031 μg (10);

D6E10:0.500 μg (11), 0.250 μg (12), 0.125 μg (13), 0.063 μg (14), 0.031 μg (15);

E10:0.500 μg (16), 0.250 μg (17), 0.125 μg (18), 0.063 μg (19), 0.031 μg (20);

G9B4: 0.500 μg (21);Клетъчна култура от тумор у гола мишка, предизвикан с клетките от линия Е7

0.500 μg (22), 0.250 μg (23), 0.125 μg (24), 0.063 μg (25), 0.031 μg (26);М – Маркери (1 kb DNA ladder, Promega); К – Несъдържаща ДНК контрола

IV.9. Вирусна продукция

Доказване присъствието на ензима обратна транскриптаза в културалната течност

Наличие на ензима обратна транскриптаза (RT) като доказателство за продукция на вирус в културалните течности на изследваните отнас линии беше установено с помощта на търговски тест на HS-kit LentiRT-Cavidi, Швеция. Този кит е разработен за HIV-1, но практически опре-деля всички транскриптази, за чието оптимално действие е необходим Mg2+, поради което се спряхме на неговото използване. Културални течно-сти бяха събрани от 48-часови култури от линии LSCC-SF(Mc29), E7, D6E10, E10, G9B4 и LSCC-PR2(Mc29), както и от ембрионални клетки (2ри

пасаж) получени от 11 дневни кокоши ембриони Бял легхорн линия 15І.

Таблица 12. Данни за наличие на ензима обратна транскриптаза в клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове

А405 – Екстинкция определена при λ = 405 nm

535 kb

535 kb

Съгласно инструкциите на Фирмата, произвела използвания от нас кит, RT активността се считаше за положителна, когато стойноститена А405 за изследваната течност надвишаваха поне два пъти стойността на А405 за отрицателната контрола. В противен случай пробата бешеотчитана като такава, в която липсва RT активност (Табл. 12).

Електронно-микроскопски изследванияПроведени бяха електронно-микроскопски изследвания на култивирани в лабораторни условия клетки от линии LSCC-SF(Mc29), E7,

E10, G9B4 и D6E10, както и на туморни образувания появили се след инокулиране на клетки от посочените туморни линии в пилета. Във всичкиматериали беше установена продукция на ретровирусни частици от тип С. Вирионите имаха характерната за птичите ретровируси структура. Тебяха наблюдавани както под формата на единични частици в междуклетъчното пространство и вътреклетъчните вакуоли (Фиг. 18), така и подформата на струпвания от множество вирусни частици (Фиг. 19) .

Проведените електронно-микроскопски наблюдения разкриха, че навлизането на Мс29 вирионите в клетките се осъществява чрезадсорбция на вирусните частици върху клетъчната повърхност и последваща ендоцитоза ( Фиг. 20). Вирусните нуклеоиди се формират в непос-редствена близост с плазматичната мембрана на клетките и едновремено с пъпкуването им от клетъчната повърхност (Фиг. 21), което е харак-терна особеност за морфогенезата на ретровирусите от тип С. В същото време в отделни клетки се откриват структури, показващи съществува-нето на атипизъм в морфогенезата на Мс29 в изследваните от нас клетки. Така например пъпкуване на незрели ретровирусни частици от тип А сеосъществява и във вакуолите на ендоплазмения ретикулум (ЕПР) на някои от клетките (Фиг. 22). Наблюдавано беше и формиране на ретровиру-сни нуклеоиди, единични или като струпвания от множество частици, в цитоплазмата на клетките (Фиг. 23). Подобен начин на образуване навирусни сърцевини е характерен за ретровируси от тип В и D (Payne, 1992). За разлика от тях обаче, в нашия случай не беше наблюдавано пъп-куване на преформираните в цитоплазмата нуклеоиди на клетъчните мембрани. Подобни структури са описани и при миелоцитоматозния вирусМс31 (Младенов, 1972). В митохондриите на някои от клетките бяха открити ретровирус-подобни структури (Фиг. 24, 25), каквито не са описанипри друти птичи ретровирусири, в това число и при вирус Мс31.

Експерименти in vivo

Експериментите бяха проведени с еднодневни пилета Бял легхорн линия 15І, които се характеризират с висока чувствителност къмптичите левкозни и саркомни вируси. Те бяха инжектирани интравенозно в крачето (vena Metatarsalis plantaris superficialis) или крилото (v. venacutanea ulnaris) с 0.1 ml вирус-съдържащ материал (клетъчнокултурална течност събрана след 48 часово култивиране на клетките от изследвани-те туморни линии; плазма от тумор-носещи пилета).

Целта ни беше да работим с културални течности, съдържащи вирус отделен от приблизително равен брой клетки. Ето защо от всякаклетъчна линия бяха култивирани паралелно по две 25 ml матрачета-близнаци със засети равен брой клетки в тях. На 48ия час едното матрачебеше двукратно замразено и размразено, след което съдържащата се в него културална среда беше центрофугирана на 2 000 оборота за 10минути при 4оС (Центрофуга тип Янецки К23) – така беше получена вирус-съдържащата проба. Клетките от съответните втори матрачета бяхатрипсинизирани и преброени. В зависимост от намерения брой клетки някои от вирус-съдържащите проби бяха „разредени” чрез добавяне нахранителна среда. Така „изравнените” проби бяха филтрирани (Millipore, 0.22 μm), за да бъде елиминирана напълно вероятността в пилетата дабъдат въведени цели туморни клетки. До момента на използването им вирус-съдържащите проби бяха съхранявани в дълбоко замразяващ хла-дилник при -80оС. От инжектираните (с 0.1 ml, i.v.) общо 30 пиленца (4-6 в група) с развитие на туморни образувания в различни органи реагираха22 (73%), разпределени както е посочено в Табл. 13).

От инжектираните с културални течности от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове 25 пиленца, 18 (72%) реагираха с развитие насолидни тумори. При 15 от тях (83.33%) злокачествените новобразувания бяха в черния дроб, а при 12/18 (66.66%) в бъбрека (в 3 от случаитезасягането беше двустранно). Макар и по-рядко, бяха наблюдавани и тумори в тимуса (при 1 пиле) и слезката (при 1 пиле). В 44.44% (8/18) отслучаите неопластичен процес беше открит само в един орган, докато при половината от реагиралите пилета (9/18) бяха засегнати по два вътре-шни органа – черния дроб и бъбрека (8 пилета) и черен дроб и тимус (1 пиле). При едно от пилетата тумори бяха намерени в черния дроб, бъбре-ка и слезката (Фиг. 37).

От инжектираните с културална течност от линия LSCC-PR2(Мc29) 5 пиленца, 4 (80%) реагираха с поява на злокачествени новообра-зувания: в бъбрека (3 случая), черния дроб (2 случая) и тимуса (1 случай). При едно от реагиралите пилета малигненият процес обхващашеедновременно черния дроб, бъбрека и тимуса.

Наблюдаваните туморни образувания бяха плътно еластични, като размерите им варираха от 1-2 mm до 10-15 mm в диаметър. Обикновенозасегнатите органи бяха покрити с множество проминиращи на повърхността им възелчета, а при разрез се виждаше, че неопластичният процесе обхванал значителна част от паренхима на органа. В сърцевината на по-големите по обем тумори се наблюдаваше некротичен разпад. Засяга-нето на черния дроб често се съпътстваше от застой на жлъчка. При някои пилета бурзата и/или тимусът бяха силно атрофирали. В едно отпилетата беше констатирано наличие на асцит, а при друго - кръвоизлив в коремната кухина. Засегнатите от злокачествени процеси пилета бяхазначително по-слаби от здравите контроли на същата възраст, поведението им беше вяло и често се залежаваха.

При изследване на реагиралите с развитие на туморни образувания пилета бяха установени промени в костния мозък и периферната кръв (Фиг.27).

Фиг. 18. Зрели Мс29 вирусни частици в междуклетъчното пространство

Фигура 19. Струпване на Мс29 вириони в извънклетъчното пространство

Фигура 20. Проникване на Мс29 вирион в клетка от линия D6E10

Фигура 21. Пъпкуване на Мс29 вируси от плазматичната мембрана в клетка от линия G9B4

Фигура 22. Формиране на ретровирусни частици във вакуоли на ендоплазмения ретикулум на клетка от линия G9B4

Фигура 23. Формиране на ретровирусни нуклеотиди в цитоплазмата на клетка от линия D6E10

Фигура 24. Ретровирусоподобни структури в митохондриите на клетка от линия G9B4

Фигура 25. Ретровирусоподобни структури в митохондриите на клетка от линия Е10

Таблица 13. Туморогенна реакция у пилета, инокулирани с културални течности от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове

Интравенозното инжектиране в крилната вена на три 1-дневни пиленца с 0.1 ml плазма (предварително десетократно разредена с физиологиченразтвор) от пилета, развили тумори след имплантиране на клетки от линии LSCC-SF(Mc29), E7 и G9B4, също доведоха до поява на неопластичниобразувания в бъбрека и черния дроб.

Фиг. 26. Онкогенен спектър на изолирания от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове вирус Мс29

83,33%66,66%

5,56% 5,56%

Черен дробБъбрекСлезкаТимус

44,44%

50%

5,56%

Една локализацияДве локализацииТри локализации

Фиг. 27 а, б. Промени в периферната кръв на пиле инжектирано с 48-часова културална течност от линия LSCC-SF(Mc29)

ПРИЛОЖЕНИЕ НА КЛЕТКИТЕ ОТ ЛИНИЯ LSCC-SF(Mc29) ПРИ ПРОУЧВАНИЯ ВЪРХУ ЦИТОТОКСИЧНИТЕ И АНТИПРОЛИФЕРАТИВНИТЕСВОЙСТВА НА ВЕЩЕСТВА

1. Бисбензилизохинолиновите алкалоиди (хернандезин, талфетидин и талидазин) Данните, получени при проведените от нас експерименти саобобщени в Табл. 14.

Табл. 14. Вляние на бисбензилизохинолинови алкалоиди върху преживяемостта и пролиферативната активност на туморни клетки

ЦК50 (μM) – Цитотоксична концентрация 50, т.е. концентрацията, при която преживяемостта на клетките намалява с 50%. Определена е чрезтестовете за оцветяване с трипаново синьо (ТВ) и включване на неутрално червено (NR);а - Концентрация (mМ), при която веществото потиска напълно способността на туморните клетки да образуват колонии в полутечна среда;б - Клетки включили 3Н тимидин, % спрямо контролата; * - P < 0.05, ** - P < 0.01

2. Основни соли на цинк и мед

Цитотоксичните и антипролиферативните свойства на двете основни соли – Zn5-xCux(OH)8Cl2.H2O и CuCO3Cu(OH)2.nH2O, бяха изпитани върхуклетъчни линии получени от злокачествени новообразувания у човек (SK-BR-3, 8-MG-BA, Caco-2), плъх (BP6, LSR-SF-SR) и пиле (LSCC-SF-Mc29).Получените резултати показаха, че CuCO3Cu(OH)2.nH2O проявява по-силно изразена цитотоксична и антипролиферативна активност в сравенниес Zn5-xCux(OH)8Cl2.H2O. Така например, тази сол потиска напълно растежната способност на туморните клетки в полутечна среда приложена вконцентрации > 0.1 μg/ml (LSCC-SF-Mc29, BP6, LSR-SF-SR), > 1 μg/ml (Caco2), > 10 μg/ml (SK-BR-3, 8 MG-BA).

3. Комплексни метални съединеня

3.1. Комплекси на метали с жлъчни киселиниДанните за влиянието на изпитваните метални комплекси са обобщени в Табл . 15-18.

Табл. 15. Влияние на метални комплекси с жлъчни киселини върху включването на 3Н тимидин в ДНК молекулите на третираните клетки

a - Клетки включили 3Н тимидин, % спрямо контролата; * - P < 0.05, ** - P < 0.01

Авторадиографските изследвания са проведени с любезното съдействие на ст.н.с. ІІ ст. д-р Йорданка Мартинова, ИЕМАМ - БАН

Табл. 16. Цитотоксичен ефект (ЦК50, mg/ml) на метални комплекси с жлъчни киселини върху култивирани в лабораторни условия туморниклетъчни линии

Вещество LSCC-SF(Mc29) 24 h 48 h

LSR-SF(SR) 24 h 48 h

8 MG-BA 24 h 48 h К562

24 h 48 h P3U1 24 h 48 h

Zn(Chol)2.3H2O NR 55 15 69 53 189 93

Cu(Chol)2.4H2O NR 61 53 100 60 - -

Co(Chol)2.5H2O NR 127 110 144 115 - -

La(Chol)3.2H2O NR 117 68 120 106 - 174

CuDHC NR TB

50 36 9 7.1

90 47 20 8

н.д. н.д. н.д. н.д.

93 64 80 56

75 - 69

ZnDHC NR TB

132 63 - » 200

181 95 125 68

149 135 100 н.д. - - - 200

ZnLH NR TB

28 3.1 8.5 3.8

- 47 64 31

25 20 - 86 - - 75 74

CoLH NR TB

56.5 5.9 8.4 2.5

- 4.5 8.3 4.6

70 2689 н.д.

85 20 77 10

17 - <10

NaLH NR TB

- 75.5 100 22.5


н.д. н.д. н.д. н.д. -

200 н.д. н.д.

Литохолева NR киселина TB

200 95 - 160 134 72

107 69 121 90 -

148 н.д. н.д.

Дехидрохолева NRкиселина TB

- - - -

- - - -

- - - - - - - н.д.

(-) означава случаите, при които преживяемостта на клетките е > 50% при всички изпитвани концентрации;н.д. - няма експериментални данни; NR - тест за оцветяване с неутрално червено; ТВ – тест за оцветяване с трипановосиньо

Табл. 17 . ДНК увреждания при култивирани в присъствие на метални комплекси с жлъчни киселини туморни клетки

Проучването е проведено чрез електрофоретичен анализ на единични клетки в алкални условия (по Olive et al., 1995) и отчита наличието наедноверижни скъсвания в ДНК молекулите;* - Процент от третираните клетки (спрямо контролата), в които са наблюдавани увреждания на ДНК молекулите ("комети"). Металните комплексиса приложени в концентрация 100 mg/ml, а продължителността на въздействието е 24 часа при линии LSCC-SF(Mc29) и К562 и, 48 часа при LSR-SF(SR).

„Кометното” изследване е осъществено е проведено с любезното съдействие на ст.н.с. ІІ ст. д-р Георги Милошев и неговия колектив, Институт помолекулярна биология БАН.

3.2. Комплекси на Cu(I, II), Co(II), Fe(II, III) и Ni(II) с Манихов тип лигандиПолучените експериментални данни за цитотоксичните и антипролиферативните свойства на комплексите на Cu(I, II), Co(II), Fe(II, III) и

Ni(II) с Манихов тип лиганди N,N’-бис(4-антипирилметил)пиперазин (BAMP) (Фиг. 1а) и N,N’-тетра-(антипирил-1-метил)-1,2-диаминоетан (TAMEN)(Фиг. 1б) са обобщени в Табл. 18, 19 и 20. Те позволиха веществата от тази група да бъдат разделени условно в две подгрупи - А и Б:

В група А бяха включени металните комплекси с относително по-силно изразена цитотоксична активност, чиито ЦК50 стойности приклетките от линия LSCC-SF(Mc29) са £ 100 mg/ml. Това са TS-1, TS-2, TS-3, TS-4, TS-5, TS-10, TS-13 и TS-14. Проведеното „Кометно изследване”показа, че някои от тези съединения (приложени в концентрация 100 μg/ml за 48 часа) предизвикват ДНК увреждания (едноверижни скъсвания) вклетките от линия LSR-SF(SR) – напр. TS-1 (в 100 % от клетките), TS-2 (35%), TS-5 (15%) и др.

В група В бяха обединени веществата проявяващи по-слабо изразени цитотоксични и антипролиферативни свойства при използвани-те от нас като моделни системи клетъчни култури – TS-6, TS-7, TS-8, TS-9, TS-11, TS12, TS-15, TS-16, TS-17, TS-18, TS-19 и TS-20.

3.3. Комплекси на Cu(I, II), Co(II) и Fe(II, III) със смесени лигандиВъз основа на активността си (Табл. 18, 21-24) тези съединения могат да бъдат разделени условно в три групи, които са представени в

Табл. 25.

Табл. 18. Влияние на метални комплекси върху способността на туморните клетки да образуват колонии вполутечна среда

Код Опростена формула LSCC-

SF(Mc29)

LSR-

SF(SR)

HepG2 8 MG-BA MCF-7 K562

TS1 Cu2(BAMP)(NCS)4 ³ 1 * ³ 10 н.д. ³ 25 н.д. > 10

TS2 Cu2(BAMP)I3 ³1 ³ 10 н.д. ³ 50 н.д. > 25

TS7 Cu(TAMEN)(NO3)2 ³ 25 ³ 50 н.д. ³ 200 н.д. > 75

TS3 Co2(BAMP)Cl4 ³ 50 ³ 75 н.д. ³ 100 ³ 100 > 75

TS4 Co2(BAMP)(NCS)2 ³ 50 ³ 75 н.д. ³ 100 ³ 100 > 75

TS8 Co2(TAMEN)Cl4 ³ 75 ³ 100 н.д. ³ 150 ³ 125 > 100

TS9 Co2(TAMEN)(NCS)4 ³ 125 ³ 150 н.д. ³ 150 ³ 150 > 150

TS5 Fe2(BAMP)Cl4 ³ 75 ³ 150 ³ 100 - - ≥ 150

TS6 Fe2(BAMP)Cl6 ³ 150 ³ 75 ³ 150 ³ 100 - > 150

TS10 Fe2(TAMEN)Cl6 ³ 50 ³ 75 ³ 100 ³ 75 ³ 150 > 100

TS11 Ni(TAMEN)(ClO4)2 - - - - - -

TS12 Ni(TAMEN)(NCS)2 - - - - - -

TS13 Ni2(BAMP)(CH3COO)4 ³ 25 ³ 150 ³ 100 ³ 100 ³100 ≥ 100

TS14 Ni2(BAMP)Cl4 ³ 50 ³ 75 ³ 100 ³ 100 ³ 100 ≥ 100

TS21 - - - - - -

TS22 - - - - - -

TS23 ≥ 50 ≥ 50 > 75 ≥ 75 > 75 ≥ 100

TS26 ≥ 2.5 ≥ 5 > 7.5 ≥ 7.5 ≥ 5 ≥ 2.5

TS27 ≥ 150 - - - - ≥ 200

TS28 - - - - - -

BAMP - - - - - -

TAMEN - - - - - -

Zn(Chol)2 ³ 1 ³ 10 ³ 50 ³ 25 ³ 50 > 10

Cu(Chol)2 ³ 10 ³ 10 ³ 100 ³ 50 ³ 75 > 25

La(Chol)3 ³ 10 ³ 25 - ³ 100 ³ 100 > 50

Co (Chol)2 ³ 25 ³ 25 - ³ 100 ³ 100 > 75

CoLH ³ 1 ³ 5 ³ 25 ³ 25 ³ 10

ZnLH ³ 1 ³ 10 ³ 25 ³ 25 ³ 10

LH > 10 ³ 75 ³ 75 ³ 100 ³ 50

CuDHC ³ 10 ³ 10 ³ 50 ³ 50 ³ 25

ZnDHC > 25 ³ 50 ³ 100 ³ 100 ³ 75

DHC - - - - -

* - Концентрация (mg/ml), при която веществото потиска напълно способност на туморните клетки да обра-зуват колонии в полутечна среда; С (-) е означена липсата на потискащ ефект при изследваните концентра-ции (1 – 200 mg/ml); Н.д. – няма данни.

Табл. 19. Метални комплекси с BAMP и TAMEN,чиято цитототоксична активност е по-силно изразена (Група А)

TS-1 TS-2 TS-3 TS-4 TS-5 TS-10 TS-13 TS-14

ЦК50 £ 100 mg/ml - LSCC-SF(Mc29)

LSR-SF(SR)++

+-

+-

+-

+-

+-

++

+ -

Промени в клетъчния монослой (48 h)- LSCC-SF(Mc29)- LSR-SF(SR)- 8 MG-BA- HepG2- VERO- CEC

100, 200а

100, 200200-н.д.н.д.

100, 200100, 200--н.д.н.д.

100, 200100, 200-200н.д.н.д.

100, 200100,200-200н.д.н.д.

100, 200200-200200-

50-200100,200200-200-

50-200100, 200---н.д.

100, 200200---н.д.

Изменения, наблюдавани след оцветяванес акридин оранж (48 h)LSCC-SF(Mc29) и LSR-SF(SR)

50 - 200 50 - 200 100, 200 100, 200 100, 20050*100, 200

50*100, 200 100, 200

Цитопатологични изменения, наблюдава-ни след оцветяване с ХЕLSR-SF(SR) - 48 час

50 - 200 50 - 200 100, 200 100, 200 100, 200 100, 200 н.д. н.д.

Увреждания в ДНК на клетки от линия LSR-SF(SR), третирани 48 часа с 100 mg/mlвещество

100 %в 35 % - 5 % 15 % - н.д. н.д.

a - Концентрация, mg/ml; в - Увреждания (едноверижни скъсвания) в ДНК молекулите, % засегнати клетки спрямо конт-ролата;* - При тази концентрация, изменения са наблюдавани само при клетките от линия LSCC-SF(Mc29);н.д. - няма данни; ХЕ – хематоксилин и еозин

Табл. 20. Метални комплекси с BAMP и TAMEN, чиято цитототоксична активност е по-слабо изразена (Група Б)

ВеществоЦД50 > 100 mg/ml (48h)

Mc29 RST

Промени в клетъч-ния монослой (48 h)Mc29RST

Цитопатол. изм. видимислед оцветяване с АО

Мс29 RST

ДНК уврежданияв клетки от ли-

ния RST,100 mg/ml, 48 h

TS-7 + + 200 - 200 200 8%TS-17 Н.о. Н.о. - - - - 5%TS-18 + + 200 200 200 200 Н.д.

TS-19 + + 200 100,200

200 200 30%

TS-8 ** Н.о. 200 - 200 200 -TS-9 Н.о. Н.о. - - - - -TS-20 Н.о. Н.о. - - 200 200 -TS-11 Н.о. Н.о. - - - - Н.д.TS-12 Н.о. Н.о. - - - - Н.д.TS-6 Н.о. Н.о. - - - - -

TS-15 + + - - - - -TS-16 + - - - - - -

Н.д. – няма данни, Н.о. – При изследваните концентрации на веществото не е определена ЦК50

(-) означава липса на ефект; ** - ЦК50 < 100 mg/ml; АО – акридин оранж; Mc29 = LSR-SF(SR); RST = LSR-SF(SR)

Табл. 21. Цитотоксичен ефект на метални комплекси със смесени лиганди върху култивирани в лабораторни условия туморни и нетуморни клетки

TS 21 24 h 48h

TS 22 24h 48h

TS 23 24h 48h

TS 26 24h 48h

TS 27 24h 48h

TS 28 24h 48h

NRMc29 TB

>200 174 183 88

>200 183 >200 100

72 45 200 100

3.1 2.8 5.8 6

>200 142 100 43

>200 >200 157 100

NRRST TB

>200 >200 н.д. н.д.

>200 >200 н.д. н.д.

>200 91 >200 64

7 6 6 6


>200 >200 н.д. н.д.

NRP3U1 TB

н.д. н.д. н.д. н.д. 29 8 37.9 19.8

6 4 8.4 6.3


NR8 MG-BA TB

>200 >200 >200 >200 >200 100 46 41

26 23 34 4

н.д. н.д. .

>200 >200

NRK562 TB

>200 >200 >200 >200 >200 >200 4 1 190 155 >200 >200

NRCEC TB

н.д. н.д. н.д. н.д. 200 100 47 35 н.д. н.д. н.д. н.д.

NRBALBc / 3T3 TB



166 160 >200 >200

35 31 >200 >200



В таблицата са представени ЦK50 (mg/ml) стойностите на изпитваните метални комплекси определени чрез теста за включванена неутрално червено (NR) и оцветяване на мъртвите клетки с трипаново синьо (TB); Mc29 = LSCC-SF(Mc29), RST = LSR-SF(SR); н.д. – няма данни

Таблица 22. Влияние на метални комплекси с Манихови бази и смесени лиганди върху включването на 3H -Tимидин в ДНК на третираните клетки

a - Клетки включили 3H-Tимидин, % спрямо контролата, * - P < 0.05; ** - P < 0.01

Таблица 23. ДНК увреждания в третирани с метални комплекси със смесени лиганди клетки от линия К562

Вещество Концентрацияmg/ml

24 h 48 h

TS23 10

100

1.61

5.86

8.4

23.95

TS26 10

50

100

38

94.15

95.61

57.2

100

100

Изследването е проведено чрез електрофоретичен анализ на единични клетки в алкални условия (по Olive et al., 1995) и отчита наличието наедноверижни скъсвания в ДНК молекулите;* - Процент от третираните клетки (спрямо контролата), в които са наблюдавани увреждания на ДНК молекулите ("комети").

Наблюдението с флуоресцентен микроскоп (Opton) на оцветените с акридин оранж цитологични препарати от третирани с TS26 култу-ри показа наличие на морфологични изменения, като: 1) По-силно изразен ядрен атипизъм; 2) Налобяване на ядрото и инвагинации на ядренатамембрана; 3) Поява на окръглени пространства със загуба на хроматин; 4) Разкъсване на ядрото и образуване на апоптични телца (Фиг. 28).

Фиг. 28. Човешки глиобластомни клетки от линия 8 MG-BA. Налобени ядра с инвагинации на ядрената мембрана, оформяне на окръглени прост-ранства със загуба на хроматин (А) и Апоптични телца (Б) в третирани с 20 mg/ml TS26 за 24 h клетки. Оцветяване с акридин оранж (Ориг. Х 40)

A.

B.

Поради силно изразената му способност да намалява преживяемостта на култивираните в негово присъствие злокачествено транс-формирани клетки, медният комплекс TS26 (Cu2BAMPdipyCl4) беше изследван допълнително и върху проявяващи чувствителност/устойчивосткъм действието на различни антитуморни препарати клетки от линии: А431 (сквамозноклетъчен карцином) и получени от нея клонове (експре-сиращи гени за множествена лекарствена устойчивост MDR1, MRP, ABCG2); NCI-H1650 (недребноклетъчен рак на белия дроб) и нейните клоно-ве G7 и C11 (устойчиви към действието на един от инхибиторите на тирозин киназата – Gefitinib) (Виж раздел Материали и методи). Полученитерезултати са обобщени в Табл. 24 и показват, че медният комплекс TS26 намалява преживяемостта както на чувствителни, така и на устойчивикъм действието на антитуморни препарати клетки.

Непосредствено преди провеждането на експериментите експресията на гените за лекарствена устойчивост в клетките от полученитеот линия А431 клонове беше потвърдено от колектива на проф. Немет (Институт по хематология и имунология, Национален медицински център,Будапеща, Унгария) чрез използването на Flow cytometry и Western Blotting с помощта на специфични моноклонални антитела.

Таблица 24. Цитотоксичен ефект на TS26 (Cu2BAMPdipyCl4) върху клетките на чувствителни и устойчиви към действието на антитуморни препа-рати злокачествено трансформирани клетки

В Таблицата са представени (ЦК50, mg/ml) получени чрез теста за включване на неутрално червеноСелектирането на клетъчните клонове, получени от линия А431, е осъществено в присъствие на 500 nM митоксантрон (при A431-

ABCG2), 100 mg/ml доксорубицин и 10 mМ верапамил (при A431-MDR1) и 100 mg/ml доксорубицин и 50 mМ верапамил (при A431-MRP).

Табл. 25. Цитотоксични и антипролиферативни свойства на метални комплекси със смесени лиганди

ПРЕДСТАВИТЕ-ЛИ

ЦИТОТОКСИЧЕН ЕФЕКТ ПОТИСКАНЕ НАКОЛОНИЕ-

ОБРАЗУВАЩАТАСПОСОБНОСТ НА

ТУМОРНИТЕ КЛЕТКИ

СВЕТЛИННОМИКРОСКО-ПСКИ ВИДИМИ ПРОМЕНИВ ТРЕТИРАНИТЕ КЛЕТКИ

ПРЕДИЗВИКВАНЕ НА ДНК УВРЕЖ-

ДАНИЯ

ПОТИСКАНЕВКЛЮЧВАНЕ-

ТО НА 3Н-

ТИМИДИН

Група І TS26 Най-силно изразен!При всички изслед-вани туморни клетъ-

чни линииЦК50 (на 24 h) стой-

ностите варират от 1до 33 mg/ml

ГРУПА ³ 5 mg/ml

При всички из-следвани туморни

клетъчни линии

+++ ++

ГрупаІІ

TS23 Умерено изразенцитотоксичен ефектЦК50 стойностите (24h) варират от 8 mg/ml(P3U1) до 100 mg/ml

(8 MG BA)

³ 100 mg/ml

Всички изслед-вани туморни

линии

³ 50 mg/ml

LSCC-SF(Mc29)б,8 MG BA, P3U1

+ +

ГрупаІІІ

TS21TS22 TS27TS28

Слабо токсичниЦК50 стойностите сависоки и са опреде-

лени само приLSCC-SF(Mc29)

Само TS27³ 200 mg/mlПри 2 от 4

изследавнитуморни линии

Само TS27100, 200 mg/ml

LSCC-SF(Mc29) н.д. н.д.

а - Концентрация, в която металният комплекс е ефективен; б - Клетъчни линии, при които е наблюдаван ефектът на съответното вещество; н.д. = няма данни

Приложени самостоятелно, лигандите BAMP и TAMEN не повлияват съществено преживяемостта на клетките от включените в експе-риментите туморни линии. Повече от 95% (р > 0.05 в сравнение с контролата) от клетките от линии LSR-SF(SR), Hep-2, MCF-7 и 8 MG-BA и > 90% (р > 0.05 в сравнение с контролата) от клетките от линии LSCC-SF(Mc29), K562, А431 (и получените от нея клонове) и NCI-H1650 (и полученитеот нея клонове) поемат неутрално червено след култивиране в присъствие на BAMP и TAMEN, приложени в концентрации от 1 до 200 mg/ml впродължение на 24 и 48 часа. При самостоятелно прилагане на лигандите ВАМP и TAMEN не беше установено наличие на ДНК увреждания вядрата на третираните клетки.

4. ДиметилсулфоксидДобавен към културалната среда в концентрации аналогични на тези в разтворите на изследваните от нас вещества, диметилсулфок-

сидът не доведе до забележими промени в преживяемостта на култивираните в негово приъствие клетки (p > 0.05 в сравнение с контролата) .

VI. О Б С Ъ Ж Д А Н Е

Предимствата на постоянните клетъчни линии и ролята им на експериментални модели са добре известни. С тяхна помощ например,при стандартни условия могат да бъдат провеждани разнообразни проучвания върху клетъчните метаболизъм и регулация, върху вируснатарепликация и канцерогенезата. Въпреки че трансформирането in vivo и в култура на птичи клетки с различни птичи ретровируси е много честобиологично явление, получаването на постоянни клетъчни линии среща редица затруднения (Witter, 1979).

При разработването на представения дисертационен труд беше създадена постоянна клетъчна линия от предизвикан с миелоцитома-тозния вирус Мс29 трансплантируем хепатом у пиле (LSCT-BPO, хепатом Мс29), означена като LSCC-SF(Mc29). След успешното й клониране иреклониране бяха получени 4 сублинии (клона): E7, D6E10, E10 и G9B4.

Неопластичната природа на клетките от тези линии се потвърждава от техния туморен произход, както и от наблюдаваните в тях беле-зи характерни за злокачествено трансформираните клетки, а именно:

- особености в морфологията (наличие на атипизъм, проявяващ се в клетъчен полиморфизъм, полихромазия, атипични митози) (Фиг.3-6);

- изменения в хромозомния набор (Фиг. 9);- растежните свойства в култура (липса на контактна инхибиция, образуване на колонии в полутечна среда) (Фиг. 8);- в тях се открива интегриран характерния за миелоцитоматозния вирус онкоген v-myc (gag-myc), както и негови транскрипти (Фиг. 15,

16/17);- подкожното им имплантиране при пилета, а в някои случаи и при голи мишки (E7) води до развитие на туморни образувания на мястото

на трансплантацията, а понякога и в един или повече вътрешни органи (Табл. 5-7, Фиг. 10 и 11).

За да определим (поне отчасти) мястото и значението на линия LSCC-SF(Mc29) и изведените от нея клонове сред останалите познати тумор-ни модели, ще се спрем последователно на две теми:

1. Обсъждане на основните биологични характеристики на получените от нас клетъчни линии, сравнени с подобни експерименталнимодели;

2. Възможните приложения на клетъчна линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове при провеждане на различни медико-биологични проучвания.

1. Морфология и растежни свойства

Характерно за трансформираните с вирус Мс29 клетки (Младенов, 1974; Langlois et al., 1974), включително и за тези от линия LSCC-SF-Mc29 и нейните клонове, e наличието на няколко проминиращи нуклеоли. Присъствие на няколко ядърца е отбелязано и в ядрата на клетките отсъздадената от Алекснадров (1996) клетъчна линия от трансплантируем сарком у плъх, предизвикан с SR–RSV. Иванов (1989) наблюдава отно-сително големи ядърца в трансформирани с миелоцитоматозния вирус Мс31 пуйчи клетки. Установено е, че наличието на по-голям брой ядърца,респективно ядърца с по-големи размери, са белег за активна клетъчна пролиферация и в някои случаи се свързват с по-висок метастатиченпотенциал (Derenzini et al., 2000; Li et al., 2001).

Активният метаболизъм и бързият растеж на клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове (най-вече Е7) могат понеотчасти да бъдат обяснени с някои от характеристиките на предизвикания с вирус Мс29 трансплантируемия хепатом у пиле, от който те са полу-чени. В това отношение трябва да бъдат споменати следните факти:59- В клетките на трансплантируемия тумор и създадените от него линии са интегрирани провирусни копия на вирус Мс29, съответно съдържа-щите се в него дълги крайни повтори (LTR, с мощни промоторни и енхансерни функции), както и онкогена v-myc (транскрипционен фактор).- Между хепатомните и нормалните пилешки чернодробни клетки са установени различия в редица биохимични показатели. Особено внимание втова отношение заслужават митохондриите при хепатом Мс29, които се отличават съществено не само от тези в нормалните клетки, но и от тезив други тумори, по редица метаболитни особености (повишена активност на фосфат-зависимата и фосфат-независимата глутаминази, дефицит-ни са по отношение на глутамат дехидрогеназата, реакции към малат и пируват) (Matsuno et al., 1986 a, b; Matsuno, 1989). Напълно е възможнопоне някои от измененята в биохимичния профил на хепатомните клетки, особено промените в окислително-редукционните процеси, да благоп-риятстват по един или друг начин биоенергетиката на този бързо растящ тумор и получените от него клетъчни линии.- Не бива да се подценява и възможността в хода на поддържането на трансплантируемия хепатом in vivo, както и на култивирането на клетките влабораторни условия, да са настъпили и някои генетични изменения, подпомагащи бързия им растеж и метаболизъм. Цитогенетичните изслед-вания показаха, че при всички изследвани от нас линии – LSCC-SF(MC29) и получените от нея клонове са налице бройни хромозомни отклонения(Фиг. 9) – факт, който позволява да се приеме, че трансформацията на клетките е свързана със сериозни промени в хромозомния им апарат.

2. Вирус-продуциращи свойства

Клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове са вирус-продуциращи както при култивиране в лабораторни условия,така и при растеж в пилета in vivo. Основание за това твърдение ни дават следните факти:

- Доказване присъствието на специфичния за ретровирусите ензим обратна транскриптаза в културалните течности от описаните ли-нии; - Идентифициране на характерния за миелоцитоматозния вирус Мс29 gag-myc (v-myc) ген и негови транскрипти в клетките от линияLSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове;

- Установените при електронно-микроскопски проучвания ретровирусни частици тип С в материали от клетъчните култури и предизви-каните с тях тумори у пилета;

- Развитие на характерна за вирус Мс29 клинична картина след i.v. инжектиране на еднодневни пилета Бял легхорн линия 15І както скултурални течности от изследваните от нас линии, така и с плазма от опитни животни с тумори, предизвикани от трансплантирането на клетки оттези линии.

2.1. Наличието на ензима обратна транскриптаза (кодиран от структурния ген pol), притежаващ уникалното свойство да осъществява синте-зиране на ДНК върху матрица от РНК, е една от най-характерните особености на представителите на семейство Retroviridae. В представените вТабл. 12 експериментални данни правят впeчатление две особености, които се нуждаят от малък коментар:

1. Стойностите на екстинкцията (A405) за пробите от всички изследвани линии – LSCC-SF(Mc29), получените от нея клонове, както и LSCC-PR2(Mc29), са съвсем близки, независимо, че проведеният полуколичествен PCR анализ показа наличие на добре изразени различия в провиру-сното съдържание на клетките от тези линии. Тук е моментът да напомним, че с провеждането на теста за доказване на обратнотранскриптазнаактивност си поставихме за цел качественото, а не количественото определяне на този ензим, което се дължеше на следните два основни фак-тора:

- Използваният от нас метод (търговски тест на НS-kit Lenti RT – Cavidi, Швеция) e оптимизиран за приложение на HIV-1. В същотовреме обаче, китът практически определя всички транскриптази, за чието действие е необходим Mg2+ (Както е и при птичите левкозни и саркомнивируси), което именно ни позволи да го използваме за нашите цели.

- Миелоцитоматозният вирус Мс29 е дефектен и не съдържа гена pol, който кодира обратната транскриптаза. Ето защо, чрез провежда-нето на този тест ние всъщност доказваме обратната транскриптаза синтезирана от вируса-помощник.

2. Стойността на екстинкцията (A405) получена при пилешките ембрионални клетки (A405EK) е значително по-висока от А405 на съдържащата самохранителна среда отрицателна контрола (A405XC), но в същото време е много по-ниска от А405 за описаните по-горе туморни клетъчни линии(A405TKЛ):

A405XC < A405EK < A405TKЛ

Най-вероятно това се дължи на наличието на ендогенни вирусни последователности в използваните пилешки ембрионални клетки, респективно впилетата, от които те са получени (Бял легхорн, линия 15І) (Tereba, Astrin, 1980; Johnson, Heneine, 2001).

Присъствието на ензима обратна транскриптаза е необходимо, но не и достатъчно условие, за доказване наличието на зрели ретровирусничастици. Само по себе си такова откритие говори, че е осъществена експресията на гена pol (в случая този ген принадлежи на вируса-помощник),но това все още не означава, че е протекла цялостната репликация и морфогенеза на вируса.

2.2. Електронно-микроскопските проучвания върху клетки от линия LSCC-SF(Mc29), получените от нея клонове, както и предизвиканитес тези клетки туморни образувания в пилета, показаха не просто наличието, но и отделни етапи от морфогенезата на ретровирус от тип С, какви-то са птичите левкозни и саркомни вируси, включително миелоцитоматозния вирус Мс29 (Младенов, 1974; Ivanov et al., 1865, Podmaniczky et al.,1976; Payne, 1992). В същото време морфогенезата на вирус Мс29 в изследваните от нас клетки се отличава и с някои особености – вътреклетъ-чно формиране на вирусни частици и вирусоподобни структури в митохондриите, което би могло да е резултат от особеностите на клетките, вкоито се осъществява репликацията на вируса (Фиг. 18-25). Както вече споменахме, по данни на Matsuno и сътр. (1986 а, b; 1989) митохондриитепри хепатом Мс29 се отличават съществено не само от тези в нормалните клетки, но и от тези в редица други експериментални туморни моделипо някои биохимични показатели. Не е ясно дали особеностите в метаболизма на тези органели по някакъв начин допринасят за осъществяванеморфогенезата на ретровируси в тях. Безспорно този феномен заслужава по-нататъшно проучване и изясняване с участието на специалисти вобластта на ретровирусната морфогенеза. Любопитно би било и провеждането на проучвания върху митохондриална ДНК, изолирана от транс-формирани с вирус Мс29 клетки, за да бъде установено евентуалното наличие на интегриран провирус.

2.3. Известно е, че ретровирусите от тип С, каквито са всички птичи левкозни и саркомни вируси, имат доста сходна ултраструктура. Етозащо, за да сме сигурни, че продуцираният от клетките на линии LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове вирус е именно миелоцитоматозният вирусМс29, проведохме още две групи експрерименти:

2.3.1. С помощта на специфични, създадени от нас праймери, бяха осъществени PCR и RT-PCR, доказващи наличието и експресиятана характерния за миелоцитоматозния вирус Мс29 gag–myc ген в клетктите от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове (Фиг. 15, 16/17);

2.3.2. Инокулиране (i.v.) на вирус-съдържащ материал (културална течност, плазма) в еднодневни пиленца Бял легхорн линия 15І(силно чувствителни към птичите левкозни и саркомни вируси) и проследяване на клиничната картина. Появата на тумори в различни вътрешниоргани (най-вече черен дроб, бъбрек, тимус) след i.v. инжектиране на 48-часови културални течности от линии LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове,както и използваната за сравнение линия LSCC-PR2(Mc29), не беше изненада. Не е необичайно и наблюдаваното в повече от половината случаиразвитие на неопластични образувания с повече от една локализация (Фиг. 26). Отдавна е известно, че дивият тип Мс29 предизвиква широкспектър от неопластични заболявания при птици: не само миелоцитоматоза (от където идва наименованието му), но и карциноми на бъбрек,черен дроб и панкреас, ендотелиоми, мезотелиоми, саркоми и др. (Иванов и сътр., 1964, 1967; Младенов, 1974; Payne, 1992).Резултатите от проведените от нас експерименти показаха, че:

1) Установените при електронно-микроскопските изследвания частици от тип С действително са вирус Мс29, което се потвърждава и отмолекулярно-биологичните изследвания (присъствието на гена gag-myc).

2) В основни линии, отделеният от линия LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове вирус Мс29 е запазил своя онкогенен спектър, независимоот това, че клетките, в които е интегриран неговият провирус и се осъществяват репликацията и морфогенезата му, са претърпели голям бройпасажи в лабораторни условия. От откриването му през 1911 година саркомният вирус на Раус предизвиква основно същата клинична картина

(Rous, Murphy, 1913; Woll, 1948; Lo et al., 1955, Ponten, 1956, Haguenau, Beard, 1962; Beard, 1963) както онази, констатирана първоначално. Клини-чната картина на известните при човека вирусни инфекции, някои от които са описани преди стотици години, също не се е променила от моментана откриването и описването им до днес (Цилинский, 1988).

3) Високата честота на предизвиканите с вирус Мс29 тумори в черния дроб не е изненадваща, тъй като клетъчна линия LSCC-SF(Mc29)и съответно изведените от нея клонове, са получени от трансплантируем хепатом у пиле. Известно е, туморният спектър на вируса може да семодифицира в хода на пасирането му в зависимост от това от какъв тип неоплазия се изолира вирусния материал (Burmester, 1959 a; Payne,1992).

4) Прави впечатление, че в голям процент от реагиралите птици бяха намерени неопластични образувания в бъбрека (понякога засяга-нето беше двустранно). По данни на Младенов и Недялков (1972) честото засягане на бъбреците вследствие инфектиране с вирус Мс29 е харак-терно най-вече за фазанчета, докато при пилета е значително по-рядко явление.

5) Миелоцитоматозни изменения в кръвта и костния мозък бяха наблюдавани изключително рядко (в около 10% от случаите), коетонай-вероятно се дължи на факта, че клетъчните линии са получени от трансплантируем хепатом у пиле.

6) Поради липса на достъпни методи за ранно откриване на туморни образувания на вътрешните органи, третираните опитни животнибяха убивани при проява на видими белези на заболяване (промени във външния вид и поведението), които са изява на по-напреднал неоплас-тичен процес. Ето защо, получените от нас данни не позволиха да определим точния латентен период (времето на появата) на вирус-обусловените тумори.

Кръвни показателиОтсъствието на промени в кръвните показатели при тумор-носещите, както и при нереагиралите с образуване на тумори експеримен-

тални животни (пилета Бял легхорн линия 15І и Джилинг), на които бяха инокулирани клетки от линия LSCC-SF(Mc29), получените от нея клоновеи линия LSCC-PR2(Mc29) може да се обясни основно с факта, че:

- Пилетата са убивани скоро (най-често до 14ия ден) след имплантирането на туморните клетки, докато характерните за вируса промениизискват по-дълъг период от време (Табл. 5 и 6);

- В експериментите са използвани 7-14 дневни пилета – възраст, в която те са по-слабо възприемчиви към действието на миелоцито-матозния вирус Мс29 (Табл. 5 и 6);

- Линия LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове, както и линия LSCC-PR2(Mc29), са получени от трансплантируем хепатом – т.е., възможное в хода на пасирането му in vivo, а също и при култивирането на клетките в лабораторни условия, да е настъпила известа „модификация” вонкогенния спектър на вируса (Payne, 1993).

Наблюдаваните в отделни случаи анемия или левкоцитоза най-вероятно се дължат на напреднал туморен процес и силно изразена ка-хексия или на реакция от страна на имунната система, но тези редки случаи не бяха обект на нашите проучвания.

3. Трансплантационна способност (Туморогенен потенциал in vivo)

3.1. Туморогенност in vivo при пилета Проведените от нас проучвания показаха, че при подкожното имплантиране на клетки от изследваните линии се наблюдават няколко

типа реакции (Табл. 5 и 6):- Образуване на тумори на мястото на въвеждането на клетките (най-вече при линии LSCC-SF-Mc29, E7 и D6E10), които растяха про-

гресивно до смъртта на реципиентите;- Поява на неопластични образувания в тъкани и органи различни от областта, където са трансплантирани клеткте. Този тип реакция

беше наблюдавана основно при пилетата Бял легхорн линия 15І (но не и при пилета от порода Джилинг), на които бяха импланти-рани подкожно клетки от линия LSCC-PR2(Mc29). Подобни находки бяха установени и при някои пилета Бял легхорн линия 15І, накоито бяха трансплантирани клетки от линии LSCC-SF(Mc29) и Е7, но (за разлика от LSCC-PR2-Mc29) те бяха съчетани с туморниразраствания в мястото на въвеждането;

- Развитие на тумори на мястото на трансплантацията на клетките, които растяха до определено време, след което започваха спон-танно да намаляват до пълното им изчезване (Спонтанна регресия). Регистрираните случаи на спонтанна регресия бяха малко наброй и то главно при пилета от порода Джилинг, на които бяха имплантирани клетки от линия Е10 (Табл. 6);

- При някои реципиенти изобщо не бяха открити видими туморни образувания. Това се отнасяше най-вече за пилетата (Бял легхорнлиния 15І и Джилинг), на които бяха трансплантирани клетки от линия G9B4 (Табл. 5 и 6).

Подобни наблюдения са описани и при подкожното имплантиране у плъхове на клетки от линия, получена от трансплантируем сарком уплъх, предизвикан с птичия Rous sarcoma virus, щам Schmidt-Ruppin (SR–RSV) (Александров, 1996).

При проведените от нас експерименти поява на видими туморни образувания беше регистрирана след s.c. имплантиране на ≥ 2.5 x 106

клетки. Изключение в това отношение прави линия E7 – при нея туморни разраствания бяха констатирани и при s.c. въвеждане в 7-дневни пилен-ца Бял легхорн линия 15І на 1.0 х 106 (в 60% от случаите) и 5.0 х 105 (в 33% от случаите) клетки. Подобен на използвания от нас бройклетки е прилаган и при трансплантирането на други експериментални тумори, сред които е саркомът на Молони у плъх (5.0 х 106 клетки) (Veit,Feldman, 1976). За възбуждане на неопластичен процес при някои експериментални модели обаче, е достатъчен по-малък брой клетки: транс-формирани с RSV плъши саркомни клетки - 1.0 х 102 (Bubenik et al., 1972), 2.5 х 104 до 5.0 х 105 (Александров, 1996); трансплантируем миелоидентумор у хамстер, предизвикан с мишия левкемичен вирус на Graff (1.0 – 2.0 х 105) (Тошкова, 1995); сублиния G3.12 от меланом В16 при мишки (1.0х 104) (Staib et al., 1993) и др. Познати са обаче и експериментални тумори, за чието in vivo поддържане е необходимо значително количествозлокачествено трансформирани клетки. Такива са лимфомът у мишки, предизвикан от левкемичния вирус на Грос (1.0 х 109) (Glasser et al., 1975),левкемия L2C у морски свинчета (1.0 х 107 клетки) (Collins et al., 1987) и т.н. Смята се, че инжектирането дори на единични ракови стволови клеткиводи до развитие на туморни образувания в експерименталните животни. В същото време клетки, показващи белези на злокачествена трансфор-мация в култура, могат да проявят туморогенни свойства in vivo само ако се въведат в много голям брой (105 – 107 клетки) в опитните животни(Rak, 2006).

3.1.1. Зависимост между броя инокулирани клетки, възрастта на птиците и появата на тумори С увеличаване броя на инокулираните клетки и/или намаляване възрастта на третираните с тях пилета нараства процентът на реаги-

ралите опитни животни и/или се скъсява латентният период. Така например, s.c. имплантиране на 1.0 х 106, 2.5 х 106 и 5.0 х 106 клетки от линияЕ7 в двуседмични пилета Бял легхон линия 15І води до поява на туморни образувания съответно в 60% (след 9 – 14 дена), 80% (след 8-10 дена)и 100% (след 4-5 дена) от случаите. Докато при трансплантирането на 7.0 х 106 клетки от тази линия в 8-дневни пиленца Бял легхорн линия 15Ітуморни образувания се появяват след 5 – 8 дена, то при 60-дневните пилета са нужни 25-31 дена. Аналогична зависимост е установена и припредизвикан с SR-RSV трансплантируем сарком у плъх (Александров, 1996). Намаляването на броя на подкожно инокулираните туморни клетки

води до удължаване на времето, необходимо за растежа на трансплантируемия миелоиден тумор у хамстер, предизвикан с мишия левкемиченвирус на Graffi (Тошкова, 1995).

3.1.2. Чувствителност на породи птици към клетките от линия LSCC-SF-Mc29 и получените от нея клонове В проведените от нас експерименти беше установено, че инбредните пилета Бял легхорн линия 15І и комерсиалните пилета порода

Джилинг проявяват близка, но не еднаква, чувствителност към туморогенното действие на клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от неяклонове (Виж Табл. 5 и 6). От една страна и при двете породи пилета изследваните от нас линии се подреждат в една и съща последователностспоред туморогенния си потенциал: E7 ≥ LSCC-SF(Mc29) > D6E10 > E10 > G9B4. В същото време в реакциите на тези пилета бяха забелязани иизвестни различия. Така например, при пилетата Джилинг бяха отбелязани сравнително повече случаи на спонтанна регресия и не бяха намере-ни туморни образувания извън мястото на имплантиране на туморните клетки. Това би могло да се обясни със: 1) съществуващите генетичниразличия между двете породи птици, както и с 2) високата чувствителност на пилетата от линия 15І към онкогенното действие на птичи саркомнии левкозни вируси – допуска се възможността появата на „метастази” да се дължи не на пренос на клетки от първичния тумор към далечни орга-ни и тъкани, а на вируса, отделян от трансплантираните и растящи на мястото на инокулацията хепатомни клетки. Като цяло обаче, наблюдава-ните от нас случаи на спонтанна регресия и метастазиране бяха доста редки и не позволяват категорични заключения.

3.1.3. Едновременно инокулиране на клетки от различни линииЕдновременното подкожно инокулиране на равен брой клетки ( по 2.5 х 106) от линия Е7 (отличаващ се с висок туморогенен потенциал)

и линия G9B4 (нисък туморогенен потенциал) води до развитие на неопластичен процес в 100% от реципиентите и то след 6-дневен латентенпериод. Този резултат показва доминиращото влияние на клетките от линия Е7 по отношение на тези от линия G9B4 (Табл. 5). За подобно доми-ниране на една клетъчна субпопулация върху друга при различни експериментални туморни модели е съобщено от редица автори (Staroselsky etal., 1990, 1992; Samiei, Waghorne, 1991; Aabo et al., 1994, 1995). Освен това са натрупани данни както за влияние на „по-агресивната” клетъчнасубпопулация над „по-слабо агресивната”, така и обратно.

Механизмите на клоналното доминиране все още не са напълно изяснени (Aabo, 1996). Предполага се, че те са свързани със: секрети-ране на фактори потискащи, респ. стимулиращи клетъчния растеж (Horvath et al., 1993; Jouanneau et al., 1994); синтезирането от клетките на еднапопулация на ензими и други биологично активни вещества, които улесняват преживяването и/или инвазията на друга клетъчна популация(Biswas et al., 1978; Newcomb et al., 1978); въздействието, което една популация оказва върху процесите на ангиогенеза и/или некроза/апоптоза,което на свой ред повлиява установяването на втората популация (Ichikawa et al., 1989; Good et al., 1990; Heppner, Miller, 1998) и др. Според едниавтори механизмът на тези взаимодействия е свързан с участието на имунната система (Staroselsky et al., 1990), но според други изследователиполучените доказателства в тази посока не са достатъчно убедителни (Ichikawa et al., 1989, Heppner, Miller, 1998). Безспорно интерес представ-лява и хипотезата за възможността клетките на многоклетъчните организми да се "състезават" помежду си за необходимите за съществуванетоим ресурси (Diaz, Moreno, 2005), което би могло да се отнася и за туморните клетки.

3.1.4. Клетки или вирус предизвикват туморитеИнтерпретирането на данните за туморогенния потенциал in vivo на продуциращи вирус птичи туморни линии е силно затруднено по-

ради съществуващата потенциална възможност отделяният от тях вирус да инфектира и трансформира клетки на гостоприемника (т. нар. лате-рална трансформация).

Теоретично, туморите, които се развиват след инжектиране на продуциращи вирус клетки могат да се дължат на:1) Пролиферация на инокулираните клетки, т.е на самата трансплантация;2) Вирусна индукция - трансформиране на клетките на гостоприемника с освободен от имплантираните клетки вирус;3) Комбинация от двата процеса (Ponten, 1962).Коя от тези възможности е отговорна за наблюдаваната при пилета туморогенна активност на линия LSCC-SF(Mс29) и получените от нея клоно-ве?Безспорно, най-точният отговор на този въпрос може да бъде даден ако инжектираните в опитните животни клетки предварително бъдат беляза-ни с някакъв маркер – флуоресцентен, радиобиологичен, ген за устойчивост към вещества и др., който дава възможност за проследяване на по-нататъшната им „съдба”. Подобни експерименти не бяха проведени при разработването на представения дисертационен труд. Получените от насрезултати обаче позволяват да бъдат изказани някои предположения. Така например, в полза на трансплантационната способност на тези клеткиговорят следните факти:1. Възрастта на третираните пилета – Известно е, че пилетата са най-силно чувствителни към онкогенното действие на вирус Мс29 веднага следизлюпването си, като с напредване на възрастта те стават все по-устойчиви (Недялков, 1967; Тодоров, Якимов, 1967). При проведените от насексперименти за установяване на туморогенния потенциал на изследваните линии бяха използвани пилета на възраст ≥ 7 дена, а в някои случаи(при линия Е7) и на 1-2 месеца (Табл. 5 и 6).2. Времето на поява (Латентният период) на туморите. Както вече беше посочено в т. 3.1.1. времето на поява на туморите зависи правопорцио-нално от възрастта на опитните животни и обратно пропорционално от броя на инокулираните клетки. В почти всички случаи обаче то бешезначително по-кратко от латентния период, необходим за изява на неопластичното действие на вируса.3. Местоположението на туморите. Подкожното имплантиране на клетки от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове се следваше отпоява на тумори в мястото на имплантацията. Макар и доста по-рядко наред с тях се наблюдаваха и неопластични разраствания в някои вътреш-ни органи (черен дроб, панкреас, бъбрек) (Табл. 5 и 6).4. Начинът на въвеждане на клетките (във всички случаи те бяха трансплантирани подкожно), а съответно и на инокулирания заедно стях/отделяния от тях вирус. Съобщено е, че интравенозното и интраперитонеалното инжектиране на вирус Мс29 води до поява на туморни обра-зувания, докато при подкожното инжектиране на птиците неопластични процеси не се наблюдават (Mladenov et al., 1980).5. Непряко доказателство за трансплантационната активност на клетките от линия Е7 е и способността им да предизвикват образуване натумори в безтимусни мишки (Виж т. 3.2. и Табл. 7) при подкожно имплантиране в областта на гърба. Zinkewich-Peotti и сътр. (1990) инжектиратклетки от линия ОВ-1 (клон на линия D.U.249, създадена от предизвикан с вирус Мс29 тумор на черния дроб у пиле) именно с цел да избегнатпроблема с латералната трансформация на клетките на гостоприемника с вирус Мс29 (т.е. трансформирането им от отделените от имплантира-ните клетки вирусни частици). В техния случай обаче, наличие на туморни образувания не е регистрирано.

От друга страна, не бива да се пренебрегва и онкогенният потенциал на отделения от трансплантираните клетки вирус Мс29. Спореднас обаче, той е водещата причина за появилите се след имплантиране на клетки от линия LSCC-PR2(Mc29) туморни образувания в пилета, вподкрепа на което говорят следните факти: неопластичните формации не се развиват в мястото на имплантирането на хепатомните клетки, асамо извън него (в тимуса и черния дроб). Те бяха открити след сравнително дълъг латентен период (≥ 34 дена) и то в пилета Бял легхорн линия15І, които са известни с високата си чувствителност към птичи левкозни и саркомни вируси. Онкогенното действие на вируса трябва да се имапредвид и при обсъждането на метастатичната способност на клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове (Виж т. т. 4).

3.2. Туморогенност за голи мишки Освен при пилета, клетките от линия Е7 проявяват трансплантационна способност и при голи мишки – подкожното въвеждане на 5.0 –

20.0 х 106 клетки от тази линия води до поява на туморни образувания на мястото на инокулацията след 10-20 дневен период (Табл. 7). Приподкожно трансплантиране на клетки от останалите линии (LSCC-SF-Mc29, D6E10, E10, G9B4) обаче, развитие на туморен процес беше наблю-давано само при линия LSCC-SF(Mc29) и то в един единствен случай. Инжектирането на клетки от линия LSCC-PR2(Mc29) също не доведе допоява на злокачествени новообразувания на мястото на въвеждането им. Тук е мястото да обърнем внимание на обстоятелството, че в проведе-ните от нас експерименти бяха включени ограничен брой голи мишки (в някои случаи 2-3, инжектирани двустранно). Напълно е възможно приувеличаване на броя на опитните животни наличие на туморни образувания да бъде намерено и след подкожното (s.c.) имплантиране на клеткиот останалите линии – G9B4, E10, D6E10 и LSCC-PR2(Mc29).Във връзка с получените резултати съвсем естествено е да бъдат зададени следните въпроси:

1) Защо трансплантационна способност при голи мишки беше наблюдавана само при клетките от линия Е7, след като клетките на всичкисъздадени от нас линии (LSCC-SF-Mc29 и нейните клонове) са злокачествено трансформирани и проявяват (макар и проявен в разли-чна степен) туморогенен потенциал при пилета?

2) Само пролиферацията на имплантираните клетки ли е отговорна за появата на туморни образувания? Възможно ли е въведеният заеднос клетките или отделен при пролиферацията им вирус също да оказва своето онкогенно действие?

"Малигнено трансформираните клетки растат в голи мишки, а нормалните - не". Това определение на злокачествеността на клетките е дадено отGiovanella още през 1974 г. въз основа на серия от експерименти, показващи липсата на растеж от активно пролифериращи клетки при имплан-тиране в голи мишки на култури получени от здрави органи и тъкани, и обратно - растеж на клетъчни линии, получени от злокачествени новооб-разувания при хора. Натрупаният по-късно богат експериментален опит убедително показа, че то не бива да се приема прекалено буквално. Акоподкожното инжектиране на клетки от дадена линия в безтимусни мишки предизвиква развитието на туморни образувания, то тези клетки съссигурност са злокачествено трансформирани. Обратното твърдение обаче не винаги е вярно (Giovanella, 1999). Доказано е, че клетки изолираниот различни малигнени неоплазии растат добре в клетъчна култура, но инокулирането им в голи мишки не се последва от поява на туморнаформация (Cailleau et al., 1974; 1978; Giovanella et al., 1991, 1999; Sing et al., 1994; Kawarai et al., 2006), Изложените факти показват, че полученитеот нас резултати – липса на туморогенен потенциал за голи мишки при клетките от едни линии (D6E10, E10, G9B4, LSCC-PR2-Mc29) и прояватаму при други линии (E7, LSCC-SF-Mc29) съвсем не са изненадващи. Наличните експериментални данни не позволяват да бъдат посочени меха-низмите, обуславящи тези различия. Прави впечатление обаче, че биологичното поведение на клетките от описаните линии при голи мишкиповтаря само до известна степен картината, която се наблюдава след имплантирането им в пилета. Така например, туморни образувания вбезтимусни мишки бяха намерени само при имплантиране на клетки от отличаващите се с най-висок туморогенен потенциал при пилета линии –LSCC-SF(Mc29) и Е7. От друга страна обаче, независимо че клетките от тези линии си приличат по редица биологични показатели, като кариотип,растежни свойства при култивиране в лабораторни условия, провирусно съдържание, експресия на тумор-свързани антигени, туморогенен потен-циал за пилета, те се различават по трансплантационната си способност при безтимусни мишки. Докато клетките от линия Е7 предизвикахатумори в 60% от третираните опитни мишки, то при инокулирането на клетки от линия LSCC-SF(Mc29) развитие на туморен процес беше забеля-зано само в един случай (16%).

Zinkewich-Peotti и сътр. (1990) изследват туморогенността на клетките от линия ОВ-1 (сублиния, получена от създадената от предизви-кан с вирус Мс29 тумор на черния дроб у пиле линия D.U.249) при 21 голи мишки (CRL: nu/nu (CD-1) и C57B1/6Jbom nu/nu) на възраст от 2 денадо 3 месеца. Мишките са инокулирани подкожно в областта на гърба и/или хълбока с 0.5 68до 2.0 х 107 трипсинизирани клетки от линия ОВ-1суспендирани в 0.1 ml PBS. Част от мишките (7 на брой) са реинжектирани повторно с 1.0 х 107 от същите клетки един месец след първата иноку-лация. Друга част от експерименталните животни (9 на брой) са инжектирани интравенозно (3 мишки) или интраперитонеално (6 мишки) с монок-лоналното антитяло асиало GM1, за да бъде намалена активността на NK клетките и съответно да бъде увеличена вероятността за развитие натумори. Всички мишки са наблюдавани в продължение на повече от 4 месеца, но туморен растеж не е бил отбелязан при никоя от тях (Zinkewich-Peotti rt al., 1990). Подобни резултати (липса на туморен растеж) са докладвани и от Palmieri и др. (1983) при инокулиране на трансформирани свирус Мс29 пъдпъдъчи ембрионални фибробласти в голи мишки. В същото време в литературата е описано успешно трансплантиране в голимишки на птичи клетки трансформирани с химически канцероген (Kawaguchi et al., 1987) или REV (Kanh et al., 1982). Това показва, че наблюдава-ната от Zinkewich-Peotti и сътр. (1990) и Palmieri и сътр. (1983) неспособност на трансформирани с вирус Мс29 птичи клетки да растат в голимишки не се дължи на птичия им произход.

Внимание заслужава и въпросът за евентуалното участие на инжектирания заедно с клетките вирус Мс29 при развитие на тумори уголи мишки. Докато за RSV (особено от субгрупи B и D) е установено, че може да трансформира бозайнически клетки в култура и да придизвикваразвитие на тумори in vivo при много видове бозайници, включително и при примати (Александров, 1996; Svoboda, 1964, Marszynska, Massey,1986; Payne, 1992 и др.), то за вирус Мс29 сведенията в това отношение са оскъдни и противоречиви (Иванов, 1967; Quade, 1979; Quade et al.,1983; Altanerova, 1983).

За съжаление, по технически причини (недостиг на време и експериментални животни) туморогенната активност на вирус Мс29 у голимишки не беше проучена в хода на проведените от нас експерименти. Сравнително краткият период от време, необходим за развитие на тумори-те (10-20 дена) и появата им в областта на трансплантацията на клетките, ни дават основание да предположим, че наблюдаваните от нас неоп-ластични образувания се дължат на пролиферацията на инжектираните клетки.

4. Метастазиране При проведените от нас експерименти в малка част от пилетата, на които бяха трансплантирани подкожно клетки от линия LSCC-

SF(Mc29) и Е7, наред с туморните разраствания появили се на мястото на инокулацията на клетките, бяха открити и неопластични образувания внякои вътрешни органи (бъбрек, черен дроб, панкреас, слезка и тимус) (Табл. 5). При обсъждането на получените резултати внимание заслужа-ват следните въпроси:

1. Кое обуславя относително ниската честота на наблюдаваните от нас метастази?2. Дали наистина става дума за метастази, т.е. за пренос, поселване и пролиферация на клетки от първичния тумор в далечни тъкани и

органи или се проявява онкогенното действие на самия вирус?3. Случаен ли е фактът, че неопластични образувания извън мястото на инокулиране на туморните клетки бяха наблюдавани само при

линии LSCC-SF(Mc29) и Е7? Способността на предизвиканите с миелоцитоматозния вирус Мс29 чернодробни тумори у пилета да предизвикват метастази в далечни

органи (бял дроб, черен дроб, бъбрек, слезка и др.) е отдавна известна. По данни на Lapis (1979) около 25% от пилетата с хепатом Мс29 развиватвъзли и в черния дроб. Съобщено е, че при инокулиране на клетки от хепатом Мс29 в японски пъдпъдъци (както в двуседмични, така и във възра-стни птици) се наблюдава развитие на прогресивно растящи тумори и значително увеличаване честотата на неопластичните разраствания в

черния дроб (Minarovits et al., 1984). Според авторите обаче, не е ясно дали става дума за метастази или за първични чернодробни тумори, пре-дизвикани от освободените от трансплантираните туморни клетки вируси (Lapis, 1979). При провеждане на сходни експерименти, наред с подкож-ните тумори в сравнително висок процент от пъдпъдъчетата (особено в случаите с по-дълъг период на развитие на подкожните тумори) са регис-трирани неопластични образувания в тимуса и черния дроб. Характерът на хистологичните изменения във вътрешните органи дава основание наавторите да приемат, че туморните огнища в черния дроб, слезката, тимуса и Фабрициевата бурза са резултат от метастазиране (Филчев и сътр.,1985 а).

За да се намери най-точния отговор на въпроса какво (клетки или вирус) стои в основата на туморните разраствания извън зоната натрансплантацията, злокачествено трансформираните клетки трябва да бъдат белязани (с изотоп, флуоресцентен или друг маркер) преди дабъдат въведени в опитните животни. Подобни експерименти не бяха обект на представения дисертационен труд, поради което при обсъжданетона тази тема са възможни само теоретични спекулации. Така например, в подкрепа на вероятността клетките от първичния тумор да метастази-рат в различни тъкани и органи могат да бъдат изложени същите съображения, които бяха посочени в т 3.1.4., а именно: клетките са инокулираниподкожно (а не i.v. или i.p.) в пилета на възраст ≥ 7 дена (когато са сравнително по-слабо чувствителни към онкогенното действие на вирус Мс29).От друга страна обаче, трябва да се отбележи, че метастази бяха наблюдавани само в пилетата Бял легхорн линия 15І (но не и тези от породаДжилинг), които са силно чувствителни към птичите левкозни и саркомни вируси.

Според нас по-рядкото откриване на неопластични процеси извън мястото на имплантиране на клетките (първичния тумор) от линияLSCC-SF(Mc29) и нейните клонове би могло да се дължи на:

1. Бързо развитие на първичния тумор, в резултат на което пилетата умираха или биваха убивани сравнително скоро след импланти-рането на хепатомните клетки, т.е. преди да са се появили неопластични образувания във вътрешните органи;

2. Не е изключено значението на евентуални промени в клетките, настъпили в хода на култивирането им в лабораторни условия. Освен това, не бива да се забравя, че появата на метастази е резултат от комплексните взаимодействия между туморните клетки и вътреш-ната среда на гостоприемника. Предполага се, че това е високоселективен и нискоефективен процес и само малка част от клетките навлезли вциркулацията успяват да преживеят и евентуално да доведат до поява на метастатични лезии (Милчев, 2007; Timar et al., 2001; Fidler, 2002 a,b;Fidler et al., 2002).

Малкият брой случаи, при които бяха наблюдавани метастази при проведените от нас опити, не ни позволяват да направим заключе-ние за метастатичния потенциал на отделните туморни линии, които изследвахме. Все пак, трябва да се отбележи фактът, че неопластичниобразувания извън първичния тумор бяха намерени само при пилета Бял легхорн линия 15І третирани с клетки от линии LSCC-SF(Mc29) и Е7, т.е.от отличаващите се с най-високо провирусно съдържание и най-силно изразени растежни свойства в култура и in vivo (за пилета, а при Е7 и заголи мишки) клетки.

5. Спонтанна регресия на тумори

Спонтанната регресия на злокачествени новообразувания е рядък, но категорично доказан феномен (Markowska, Markowska, 1998). Подспонтанна регресия или ремисия на раковите заболявания се разбира изчезване на туморните образувания без лечение или при провеждане нанеадекватно лечение. Сега се приема, че спонтанна регресия настъпва по-рядко (в 1 на 140 000 случая) отколкото се е смятало по-рано (в 1 на60 000 или 100 000 случая) (Markowska, Markowska, 1998; Chang, 2000). Ежегодно в научната литература се съобщава за около 20 случая наспонтанна регресия (Gonlugur, Akkurt, 2004).

Спонтанна регресия е наблюдавана при почти всички типове злокачествени заболявания при хората. Най-много случаи са докладванипри невробластом, бъбречноклетъчен карцином, злокачествен меланом, както и лимфоми/левкемии. Допуска се участието на различни механиз-ми в осъществяването на този биологичен феномен, като: намеса на имунната система, роля на растежни фактори и/или цитокини, стимулиранена клетъчна диференциация, участие на хормони, елиминиране на канцероген, „отключване” на апоптоза, възпрепятстване на ангиогенезата,некротизиране на тумора, потискане на теломеразната активност, епигенетични механизми, невропсихически фактори. Тези предположения сеподкрепят в една или друга степен от клиничните наблюдения и експерименталните данни (Bodey, 2002; Phipps, 2005). И макар спонтаннатарегресия да включва много и различни механизми, крайният резултат е винаги един и същ - диференциация или гибел на злокачествено транс-формираните клетки (Papac, 1998).

Освен при човека, спонтанна регресия е описана и при редица експериментални туморни модели, като карцином Waker 256 (W256) (Ja-ganjac et al., 2008), сарком RB-28 (Strnadel et al., 2007), хистиоцитом АК-5 (Khar, Anjum, 2001), карцином на дебелото черво (Miyamoto et al., 1989) уплъх и др. Спонтанна регресия, най-вероятно с имунологична природа, е наблюдавана и при вирус-индуцирани тумори, включително еритроблас-тоза у пиле (Сотиров, 1981 а), трансплантируем хепатом у пиле, предизвикан с миелоцитоматозния вирус Мс29 (Трифонов и сътр., 1985; Филчев,1991), трансплантируем сарком у плъх, дължащ се на онкогенното действие на SR-RSV (Александров, 1996), индуциран с вируса на Молонисарком (Fefer et al., 1967 a, b; 1968; Russell, Cochrane, 1974) и др.

Според Minarovits и сътр (1984) характерът на туморния растеж (прогресивен или регресивен) на хепатом Мс29 зависи от възрастта нагостопиремника. Авторите съобщават, че при подкожното инжектиране на 3.0 х 106 хепатомни клетки в новородени пиленца, в 80% от случаите серазвиват прогресивно растящи тумори. При инжектирането на същия брой клетки в 7-дневни пилета обаче е наблюдаван регресивен туморенрастеж. За разлика от това, при проведените от нас експерименти спонтанната регресия се срещаше много рядко (включително и при подкожнотоимплантиране на 2.5 х 106 клетки от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове) и то предимно при имплантирането на клетки от линияЕ10 в пилета порода Джилинг (Табл. 6). Това би могло да се дължи както на използването на различни линии пилета, така и на промени в хепа-томните клетки, настъпили в хода на култивирането им в лабораторни условия. Експерименти проведени с високоинбредни линии пилета показ-ват, че главният комплекс за тъканна съвместимост играе решаваща роля за прогресивния или регресивния растеж на тумори, предизвикани сRSV (Plachy et al., 1979, 1992; Plachy, 1984; Taylor Jr, 2004 и др.).

6. Промени в имунния отговор на тумор-носещи пилета

При проведените от нас експерименти беше отчетено потискане на някои прояви на клетъчния и хуморалния имунен отговор на тумор-носещите пилета (Табл. 8 и 9). Според нас тази реакция може да се дължи на различни фактори, които най-общо се свеждат до: 1) Имуносупре-сивния ефект на птичите левкозни и саркомни вируси и 2) Способността на туморните клетки да повлияват (отслабват) имунния отговор на госто-приемника.

1. Ранната поява на имуносупресия в гостоприемниците е характерна черта на инфекциите с акутни птичи левкозни вируси (Scofield, Bose Jr,1978; Carpenter et al., 1978; Rup et al., 1982; Rao et al., 1990). Хелперните вируси също могат да допринесат за имуносупресивния ефект (Rup et al.,1982). Според други автори обаче, пилета инфектирани с хронични левкозни вируси имат нормален клетъчен имунен отговор (Dent et al., 1968;Purchase et al., 1968; Meyers et al., 1976). Състоянието на хуморалния имунен отговор късно след инфекцията с хроничен левкозен вирус (нопреди развитието на тумори) според едни изследователи е потиснато (Dent et al., 1968; Purchase et al., 1968), докато според други се наблюдава

нормално антитялообразуване (Meyers, Dougherty, 1971). Любопитно е да се отбележи, че имуносупресивният ефект на птичите левкозни исаркомни вируси (ALSV) изглежда зависи от субгруповата им специфичност – изолати, съдържащи вируси от субгрупа В са имуносупресивни(RAV-2), а вирусите от субгрупа А – не са (RAV-1, RAV-2) (Rup et al., 1982).

В хода на проведените от нас експерименти беше показано, че клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове савирус-продуциращи както в култура, така и in vivo. Напълно допустимо е заедно с инокулираните клетки в организма на опитните животни дапопадат и зрели вирусни частици. Нещо повече, вирусни частици се отделят и от активно пролифериращите злокачествено трансформираниклетки в тумор-носещите животни. В нереагиралите с неопластични разраствания пилета обаче, такъв процес не се наблюдава и може би това еедно от обясненията за по-слабото потискане на изследваните от нас имунни показатели в тези случаи.

2. Известни са различни механизми, чрез които туморите потискат нормалното функциониране на имунната система на гостоприемника: смуще-ния в процеса на представяне на антигените (силно намалена в резултат на имуноселекция експресия на антигените от клас І на МНС); активира-не на отрицателни костимулаторни сигнали (напр. отсъствие на костимулаторни молекули В7); отделяне на имуносупресивни фактори като цито-кини (напр. интерлевкин-10), растежни фактори (напр. васкуларен ендотелиален растежен фактор – VEGF; трансформиращ растежен фактор –бета, TGF-β), простагландини (простагландин Е2 ) и др.; предизвикване на устойчивост към апоптоза и др. (Seliger, 2005; Kim et al., 2006; Rabino-vich et al., 2007).

При пилета с хепатом Мс29 са установени значителни промени, както в лимфоидната система, така и в протеиновия синтез и в систе-мата от стероидни рецептори, което също оказва влияние върху имунните механизми на канцерогенезата (Földes, 1979).

7. Тумор-свързани антигениВ нормалната клетка (тъкан) се различават видовоспецифични, органно (тъканно) специфични, междуорганни, органоидни, изоантиге-

ни, хетероантигени, ембрионални антигени (Вязов, 1967; Deckere, 1964). В малигнените клетки настъпват сложни антигенни изменения,изразяващи се в появата на нови антигени (антигенно усложняване), както и в изчезване или намаляване концентрацията на някои от антигените(антигенно опростяване) (Зильбер, Абелев, 1962; Roit, 1994). Тумор-свързаните антигени (ТСА) са молекули, които се откриват в или върху злока-чествено трансформираните клетки, но липсват или са в много по-малко количество в нормалните тъкани. Появата на тумор-свързанитеантигени в неопластичната клетка (туморна или левкемична) е причина за имунния отговор на организма спрямо злокачествените новообразува-ния (Милчев, 2007; Lampson, 2003).

ТСА могат да бъзат разделени на 3 типа:1) ТСА, които се експресират върху повърхността на туморната клетка и могат да бъдат идентифицирани чрез хетеро- или автоантитела, т.е.

от хуморалния имунитет;2) Тумор-свързани пептиди, които се предоставят от молекулите на главния комплекс за тъканна съвместимост от тип І (MHC-1) върху повърх-

ността на туморните клетки и могат да провокират клетъчен имунен отговор, по-специално реакция от страна на цитотоксичните Т клетки;3) Молекули или лиганди, разпознавани от рецепторите на NK клетките.

Повечето от известните в момента ТСА принадлежат към първите две групи (Groen, 1987; Kuroki et al., 2002, 2004).Идентифицирани са различни категории туморни антигени, като:1) "Cancer testis antigens" ;2) Диференциационни антигени;3) Антигени, получени в резултат на точкови мутации в нормални гени;4) Собствени антигени, които са свръхекспресирани в злокачествено трансформираните тъкани;5) Вирусни антигени (Милчев, 2007; Jägеr et al., 2001; Novellino et al., 2005).Освен при човека, ТСА са доказани и при злокачествени новообразувания у животни, включително в трансформирани в култура или in

vivo с ретровируси клетки (Onuma et al., 1978, 1985; Aida et al., 1985 a, b, 1993; Flyer, Susheski, 1993; Alexandrov et al., 1996 a, b , 1997, 2001 a, b;Toshkova et al., 2001 и др.).

Открити са специфични туморни антигени върху хемоцитобласти, трансформирани с вируси Мс29 и Мс31, както и при хепатом Мс29(Филчев, Трифонов, 1982; Филчев, Иванов, 1986; Филчев, 1991; Веселинова, 1989; Wesselinova, 1994, 1995 и др.).

При разработването на представения дисертационен труд с помощта на създадени от нас моноклонални антитела в трансформиранитес вирус Мс29 клетки (линия LSCC-SF-Mc29, нейните клонове и предизвиканите с тях тумори) беше идентифициран ТСА (интрацелуларно и върхуклетъчната повърхност) с молекулна маса около 25 kDa.

Известни са различни средства и методи за екстрахиране на мембранносвързани антигени от туморните клетки. В нашите изследванияза тази цел беше използван три моларен разтвор на калиев хлорид (3M KCl), който позволява изолирането на повърностноклетъчни водоразтво-рими белтъци (Ignjatovic et al., 1978). Спряхме се на този подход, тъй като преди нас са изпробвани различни методи за извличане на антигенипри трансплантируем хепатом у пиле, предизвикан с миелоцитоматозния вирус Мс29, но въпроизводими резултати при този (Филчев, 1991) и придруги експериментални модели (Alexandrov, 1996) са получени именно по описания от Ignjatovic и сътр. (1978) начин.

Известно е, че на повърхността на трансформирани с птичи ретровируси клетки се различават три вида антигени (Kurth, Bayer, 1975): 1)Ve (virus-envelope) антигени, които са специфични за дадена подгрупа вируси; 2) Ембрионални антигени; 3) Тумор-асоциирани антигени. Тозифакт (както и някои други съображения, които ще бъдат изложени по-долу) наложи при определянето на клетъчната специфичност на ТСА, скойто реагира моноклоналното антитяло от хибридомен клон 1А6, да бъдат използвани различни контроли:

- Клетъчни култури и екстракти с 3М KCl от ембриони на пилета Бял легхорн линия 15І. При предишни изследвания проведени с поли-клонален серум е установено, че в над 60% от клетките от трансплантируемия хепатом у пиле, предизвикан с вирус Мс29, се експресират антиге-ни характерни за ранните стадии (5-11 ден) от развитието на пилешкия ембрион (Филчев, 1991).

- Пречистен и концентриран вирус Mc29 от 48-часови култури на линия LSCC-SF(Mc29). - Клетки от линия LSTC-SF(Mc31), получена от ембрионални клетки на пуйка, трансформирани с миелоцитоматозния вирус Мс29.

Известно е, че туморите, предизвикани от един и същ вирус дори и при различни по вид животни, съдържат общи или кръстосано реагиращиантигени. Вирус Мс29 е с широк онкогенен спектър и предизвиква неопластични изменения в различни органи не само при пилета, но и при някоидруги видове птици. Освен това близък с него по онкогенни свойства е щам Мс31. Още повече, че проведени преди нас експерименти са показалиналичие на общи антигени между туморни клетки, трансформирани с щамовете Мс29 и Мс31 (Веселинова 1989, 1991; Филчев, 1991).

- Клетки от линия LSCC-PR2(Mc29), получена от същия експериментален туморен модел, както и LSCC-SF(Mc29) – хепатом Мс29. - Клетки от различни линии и експериментални тумори, някои от които са получени от тумори на черния дроб у човек (HepG2) и плъх

(Хепатом на Заждела), както и от предизвикан с SR-RSV сарком у плъх. Elek и сътр. (1979a) намират общи тумор-специфични трансплантационниантигени при хепатом Мс29 и саркома на Rous.

Проведените от нас проучвания показаха съществуването на ТСА (25 kDa), който се експресира във и върху клетките от линия LSCC-SF(Mc29), получените от нея клонове и предизвиканите с тях тумори в пилета. Антигенът не се изявява върху използваните като контроли клетъ-чни култури, включително при ембрионални клетки и клетки от здраво възрастно пиле, както и при трансформираните с миелоцитоматозни вируси(Mc29, Mc31) клетки от линии LSCC-PR2(Mc29) и LSТС-SF(Mc31). Използваното при изпълнението на тези експерименти моноклонално антитяло(секретирано от хибридомен клон 1А6) не взаимодейства с пречистен и концентриран вирус Мс29 (Табл. 10).

Прави впечатление, че при провеждането на имунофлуоресцентната техника ТСА беше наблюдаван при всички клонове на линияLSCC-SF(Mc29), както и в предизвиканите с тях тумори в пилета. За разлика от това обаче, при изпълнението на имуноточков метод и електрои-муноблот, ТСА не беше отчетен в клетките от линии G9B4 и E10. Обясненията на това „разминаване” могат да се търсят в различни посоки –например използваните методи имат различен механизъм на действие. Интересно е да се припомни обаче, че това са линиите с най-нисък тумо-рогенен потенциал. Дали обаче съществува зависимост между степента на изява на ТСА и способността на клетките да предизвикват злокачест-вени новообразувания в опитни животни? Това е една любопитна хипотеза, която заслужава да бъде разработена.

В Табл. 26 са обобщени данните за туморни антигени при предизвикан с вирус Мс29 трансплантируем хепатом у пиле (установени отФилчев, 1991) и получената от този експериментален модел постоянна клетъчна линия LSCC-SF(Mc29) (Наши собствени резултати). Анализира-нето на представената информация показва, че идентифицираните в тези два случая антигени не са идентични помежду си. Според нас наблю-даваните различия (в брой, молекулна маса, локализация, наличие/отсъствие на кръстосана реакция с трансформирани с вируси Мс29 и Мс31клетки от линии LSCC-PR2-Mc29 и LSTC-SF-Mc31) най-вероятно се дължат на:

1. Постоянната линия LSCC-SF(Mc29) е получена от трансплантационен хепатом Мс29, но при приспособяването й към растеж в лабо-раторни условия е напълно възможно в клетките да са настъпили различни изменения, включително и в антигенния им спектър.

2. Идентифицирането на ТСА при хепатом Мс29 е проведено с поликлонален серум (Филчев, 1991), докато ние използвахме секрети-рани от хибридомния клон 1А6 моноклонални 74антитела.

3. Не е изключено клетките на хепатом Мс29 и получените от него линии да изявяват и други ТСА, чието установяване е въпрос набъдещи изследвания.

Таблица 26. Данни за туморни антигени при трансплантируем хепатом у пиле, предизвикан с миелоцитоматозния вирус Мс29 и получена от негопостоянна клетъчна линия LSCC-SF(Mc29)

Показатели Трансплантируемхепатом*

Линия LSCC-SF(Mc29)

Брой установениантигени

2 1

Молекулна маса < 12 kDa и < 68 kDa 25 kDaЛокализация Върху клетъчната

повърхностЕкстра- и

интрацелуларноКръстосана реакцияс LSCC-PR2(Mc29) LSTC-SF(Mc31)

ДаДа

НеНе

Вирусен произход Не НеЕмбрионаленпроизход

Не Не

Изолирани чрез Екстракция с 3M KCl Екстракция с 3MKCl

Идентифицирани сПоликлонален серум

МоAb секретираноот хибридомен

клон 1А6

* Данните за трансплантируемия хепатом у пиле, предизвикан с вирус Мс29, са установени от Филчев (1991); MoAb – моноклонално антитялоИнтересно би било също така да се потърси начин за количествено измерване на нивото на експресия на идентифицирания при проведените отнас експерименти ТСА при отделните клонове на линия LSCC-SF-Mc29 (E7, D6, E10, G9B4), както и определянето на аминокиселинния му състав.Любопитно е да се провери и дали установеният от нас антиген има способност да предизвиква антитуморен (антихепатомен) имунитет привъвеждане в опитни животни и дали реагиращите с него антитела могат да се използват за „насочено лечение” при този експериментален модел.Изясняването на тези, а и на други, въпроси изисква провеждане на задълбочени допълнителни проучвания.

8. ХетерогенностИзолирането от една и съща линия на дъщерни клонове с различни биологични свойства съвсем не е необичайно явление. Това се

дължи на добре познатия и отдавна възприет в медико-биологичните науки и клиничната онкология феномен, известен като „хетерогенност натуморните клетки” (Heppner, Miller, 1998; Alexandrova, 2001).

При разработването на представения дисертационен труд за пръв път бяха получени и характеризирани клонове с различни биологич-ни характеристики от клетъчна линия, създадена от хепатом Мс29.

Общоприето е схващането, че злокачествените новообразувания водят началото си от една единствена малигнено трансформиранаклетка. Логично е да си зададем въпроса кои са факторите, които обуславят възникването на различни клетъчни субпопулации в един и същитумор, респективно получена от него клетъчна линия? Според съвременните схващания на първо място това е генетичната нестабилност нараковите клетки (Prehn, 1994; Coleman, Tsongalis, 1999; Bielas. Loeb, 2005). Именно повишената им склонност към мутации води до поява наразлични клетъчни субпопулации в тумора, което в крайна сметка благоприятства неговата прогресия (Nowell, 1976). В малигнените неоплазии сесрещат и клетъчни субпопулации, чиито фенотипни изменения са следствие на епигенетични промени (Швембергер, 1987). Безспорно, за възник-ване на хетерогенността значение имат и т.нар. ракови стволови клетки (Soltysova et al., 2005). Смята се, че хетерогенността на малигнено тран-

сформираните клетки от една страна е отражение на нормалните свойства на тъканта, от която те произлизат, а от друга - на специфичнитеособености на злокачествените новообразувания (Швембергер, 1987).

Получените експериментални резултати показаха, че изолираните от линия LSCC-SF(Mc29) клонове (E7, D6E10, E10, G9B4) се разли-чават значително по своите биологични характеристики. Тези клонове са получени от изходната линия LSCC-SF(Mc29) след продължителното йподдържане в лабораторни условия, самите те също са претърпели голям брой пасажи in vitro. Ето защо е трудно да се определи дали наблюда-ваните между тях различия директно пресъздават свойствата на съществуващи in vivo в трансплантируемия хепатом Мс29 клетъчни субпопула-ции или различията между тях са възникнали в хода на лабораторното им култивиране. Независимо кога точно е станало това обаче, важно е дасе отбележи, че:

1) Отделнте клонове (E7, D6E10, E10 и G9B4) са получени от един и същ експериментален модел – линия LSCC-SF(Mc29), съответнотрансплантируем хепатом у пиле, предизвикан с миелоцитоматозния вирус Мс29 (LSCT-BPO, Хепатом Мс29). Именно общият им произход отедна страна и наблюдаваните между тях отличия в биологичните отнасяния (независимо от момента на възникването им) от друга, ги превръщатв изключително подходяща система за проучвания върху различни аспекти на канцерогенезата (например механизми обуславящи прогресивния,респ. регресивния растеж на туморните образувания, склонност към метастазиране, роля на онкогени, тумор-супресорни гени, тумор-свързаниантигени и др.), антитуморния имунитет, разработването на нови методи и средства за профилактика и лечение на злокачествените заболявания.

2) Независимо от продължителното им поддържане в лабораторни условия клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове запа-зиха стабилни основните си биологични характеристики, включително морфология, растежни свойства в култура и туморогенност in vivo, вируснапродукция, влияние върху имунния отговор на опитните животни.

9. Как се обясява различната туморогенност

Без съмнение, най-голям интерес представлява изясняването на механизмите, обуславящи различната туморогенност на клетките отизследваните от нас туморни линии. Задълбоченият отговор на този въпрос изисква провеждането на редица допълнителни експерименти, вклю-чително секвениране на гени, идентифициране на мутации, определяне местата на интегриране на провирусните копия и др., които не бяха обектна представения дисертационен труд. Все пак, получените до момента резултати насочват вниманието ни към следните факти:

1. Различното провирусно съдържание на отделните клетъчни линии;2. Промени в хромозомния набор;3. Корелация между растежните свойства в култура и туморогенния потенциал in vivo.

9.1. Провирусно съдържание

Проведеният полуколичествен анализ (PCR, RT-PCR) показа, че провирусното съдържание на миелоцитоматозния вирус Мс29 е най-високо в отличаващите се с най-силно изразен туморогенен потенциал in vivo клетки от линии LSCC-SF(MC29) и E7, а най-ниско при проявяваща-та най-слабо изявена трансплантационна способност линия G9B4. Останалите три клетъчни линии D6E10, E10 и LSCC-PR2(Mc29) заемат меж-динно положение и имат близко провирусно съдържание.

Наличие на зависимост между (про)вирусното съдържание и риска от развитие на злокачествен процес е установена от редица авторипри човешкия папиломен вирус тип 16 (HPV 16) (Sun et al., 2001; van Duin et al., 2002; Dalstein et al., 2003; Wang, Hildesheim, 2003); вируса напридобитата имунна недостатъчност (HIV) (Verhofstede et al., 1994; Conway et al., 1995); вируса на човешката Т-клетъчна левкемия (HTLV-1 и 2)(Manns et al., 1999; Kamihira et al., 2003). В същото време обаче, Кisseleva и сътр. (1991) не установяват корелация между броя на провируснитекопия и метастатичния потенциал на клетъчни линии, получени от предизвикани с птичия саркомен вирус В77 тумори у хамстер.

Клетките на създадените от нас линии – LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове, съдържат интегриран провирус Мс29, а това значи и съ-държащия се в него онкоген gag-myc (v-myc) – факт, който беше доказан с проведените от нас PCR и RT-PCR. Нещо повече, установено бешеналичието на права зависимост между провирусното съдържание (следователно съдържание на v-myc) и туморогенния потенциал на клетките(Табл. 11, Фиг. 15, 16/17). Освен, че сам по себе си генът v-myc е отговорен за широкия онкогенен спектър на вирус Мс29, не бива да се забравя,че той е член на семейството на гените MYC, където освен него влизат и клетъчните протоонкогени c-myc, N-myc и L-myc. Тези гени са с доказаноучастие в патогенезата на редица злокачествени заболявания у животните (c-myc) и човека (c-myc, L-myc, N-myc) (Nesbit et al., 1999; Alexandrova,2005; Hooker, Hurlin, 2005). Достатъчно е да споменем, че c-MYC e „въвлечен” в > 80% от неоплазиите при хората, сред които са и злокачестве-ните новообразувания на черния дроб (Popescu, Zimonjic, 2002; Robson et al., 2006).

Съобщено е, че инактивирането на гена myc може да доведе до реверсия на туморогенезата посредством потискане процесите напролиферация, стимулиране на клетъчна диференциация и/или апоптоза. В резултат, клетките възвръщат обичайните си биологични структура ифункция. При реактивация на myc обаче, те бързо възстановяват неопластичната си природа (Shachaf et al., 2004; Shachaf, Felsher, 2005 a,b).Клетъчна линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клонове, могат да послужат като модел за изучаване на процесите, обуславящи диференци-ацията на трансформираните с v-myc клетки. Пример в това отношение са проучванията върху някои молекулни и биохимични събития, съпътс-тващи диференцията на пилешката еритробластозна клетъчна линия HD3 (Grdisa, White, 2003).

9.2. Промени в хромозомния набор

Възможно е една от причините за различната туморогенност на изследваните от нас линии да е свързана с особеностите на кариотип-ната им характеристика (Фиг. 9). Различия в броя на хромозомите са намерени и между клетъчни линии, отличаващи се с нееднакъв метастати-чен потенциал - MHCC97-H и MHCC97-L, получени от трансплантиран на гола мишка човешки хепатоцелуларен карцином (Li et al., 2001), линииизолирани от химически индуциран сквамозноклетъчен карцином на езика у плъх (Тakeuchi al., 2000). Полянова и Йорданова (1996) съобщаватза наличие на връзка между наблюдаваните от тях промени в хромозомния апарат от една страна и експресията на v-src, съответно тумороген-ността на трансформираните с RSV плъши клетки от линия LSR-SF-SR, от друга (Polianova, Jordanova, 1996). Установено е, че някои хромозомнипромени (по специално в 4q, 9p, 11q, 16p, 17q) играят важна роля в хепатоканцерогенезата при човека (Raidl et al., 2004). Изясняването на зави-симостта между кариотипната характеристика и биологичните свойства на получените от нас клетъчни линии изисква провеждането на задълбо-чени допълнителни изследвания с участието на специалисти по цитогенетка.

9.3. Зависимост между растежните свойства в култура и туморогенния потенциал in vivoПроведените от нас експерименти показаха, че клетъчните линии (LSCC-SF-Mc29, E7) с по-силно изразени растежни свойства в култу-

ра (по-кратко време на удвояване, по-добре изразена способност за образуване на колонии в полутечна среда) проявяват и по-висок туморогененпотенциал in vivo (Табл. 4 - 7; Фиг. 8). Прави впечатление и фактът, че туморни образувания във вътрешните органи (метастази) бяха намерени

само при пилета Бял легхорн линия 15I, на които бяха имплантирани подкожно клетки от линии LSCC-SF-Mc29 и E7 (Табл. 5). В същото времеклетъчни линии E10 и особено G9B4 се отличават с по-слабо изразен растеж, както при култивиране в лабораторни условия, така и при транс-плантиране в опитни животни (пилета, голи мишки). Най-голям брой случаи на спонтанна регресия бяха отбелязани при пилета Джилинг, на коитобяха инокулирани подкожно клетки от линия Е10 (Табл. 6). Подобни резултати съобщават и Yano и сътр. (1993). Създадените от тези авториклетъчни линии HAK-1A и HAK-1B са получени от един и същ чернодробноклетъчен карцином у човек, но се различават по морфология, кариотипи растежни свойства. HAK-1B се характеризира с по-кратко време на удвояване на клетките и с по-висок туморогенен потенциал (Yano et al.,1993).

10. Сравняване с други клетъчни линии Клетъчна линия LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове са създадени от трансплантируем хепатом у пиле, предизвикан с вирус Мс29,

което позволява да бъдат сравнявани (по един или друг показател) с клетъчни линии получени от:- клетки трансформирани в култура или in vivo с птичи левкозни и саркомни вируси, най-вече с миелоцитоматозните вируси

Мс29 и Мс31;- неопластични образувания на черния дроб с човешки и животински поризход.

Особен интерес представлява сравняването на биологичните характеристики на линия LSCC-SF(Мс29) и нейните клонове с известнитеот достъпната литература клетъчни линии получени от тумор на черния дроб у пиле, предизвикан както с вирус Мс29 – линии D.U. 249 (Langlois etal., 1974, 1976) и LSCC-PR2(Mc29) (Sovova et al., 1981), така и чрез въздействие с химически канцероген – линия LMH (Kawaguchi et al., 1987).Част от основните биологични характеристики на тези линии са обобщени в Табл. 27. Благодарение на любезното съдействие на проф. ВластаСовова от Института по молекулярна генетика към Чешката академия на науките в Прага, Чехия, клетките от линия LSCC-PR2(Mc29) бяха вклю-чени за сравнителен анализ в голяма част от проведените от нас експерименти.

Внимателното съпоставяне на обобщената в Табл. 27 информация показва, че клетките от линии D.U.249 (създадена от тумор у пилепоявил се след инокулиране на 20% клетъчна суспензия от предизвикан с вирус Мс29 чернодробен тумор), LSCC-PR2(Mc29) (получена от транс-плантируем хепатом у пиле, предизвикан с вирус Мс29) и LMH (индуциран с диетилнитрозамин чернодробноклетъчен карцином у пиле) иматсходни растежни характеристики - близки времена на удвояване и способност да образуват колонии в полутечна среда. Всички те (с изключениена линия LMH, която е получена от химически-индуциран тумор) са вирус-продуциращи. Между клетките от отделните линии обаче се забелязвати някои различия, изразяващи се най-вече в:

- Кариотипа – Въпреки че кариологичният анализ при всички тях е доказал наличието на типичните за вида Gallus domesticus клетки, саналице някои количествени и качествени различия в хромозомния набор;

- Туморогенния потенциал при пилета и безтимусни мишки – Докато клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и получените от нея клоновемогат успешно да бъдат трансплантирани при подкожно инокулиране в пилета, а някои от тях и в голи мишки (E7), а клетките от линия D.U 249проявяват туморогенен потенциал само при пилета (Langlois et al., 1976), но не и при безтимусни мишки (Zinkewich-Peotti et al., 1990), то клеткитеот линия LSCC-PR2(Mc29) не могат да растат in vivo в пилета (Sovova et al., 1981; собствени резултати), а според първоначалните резултати(които обаче са проведени с ограничен брой опитни животни, Табл. 7) и в голи мишки (собствени резултати).

Прави впечатление, че макар да ползват по-малки пиленца - 1-2 дневни (включените в нашите експерименти пилета бяха на възраст ≥7 дена) и да инокулират клетките (2.5 х 106) интравенозно в крилната вена (в нашия случай те бяха имплантирани подкожно в областта на колян-ната гънка) Langlois и сътр. (1976) съобщават доста близки до описаните от нас резултати – авторите наблюдават поява на тумори в мястото натрансплантираните клетки в 16 от 21 пилета (76.2%) след 4-7, а понякога и по-късно. За сравнение с данните за туморогенния потенциал наклетките от линия LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове при пилета Бял легхорн 15І и Джилинг виж Табл. 5 и 6. При част от пилетата Langlois и сътр.(1974, 1976) регистрират спонтанна регресия на туморите, която настъпва между 15 и 24 ден.

В Табл. 28 са обобщени основните биологични характеристики на клетките от линии LSCC-PR2(Mc29) и LSCC-SF(Mc29). Според нас различните отнасяния на клетките от тези две линии (кариотип, провирусно съдържание, наличие на туморни антигени,

туморогенни свойства in vivo) биха могли да бъдат обяснени поне отчасти с:1) Различния подход при получаването на клетъчните линии - с и без ензимна обработка – във втория случай може да е станал подбор

на отделни субпопулации клетки;2) Двете линии са създадени независимо една от друга по различно време и в различни лаборатории от претърпели голям брой пасажи

in vivo трансплантируеми хепатоми у пиле. В хода на тези пасажи под влияние на различни фактори (например взаимоотношенията тумор-гостоприемник) може да е станала селекция на различни клетъчни субпопулации;

3) Високата мутационна способност на раковите клетки и феноменът "хетерогенност на туморните клетки", който превръща всяко зло-качествено новообразувание (респ. туморна клетъчна линия) в уникална система.

Кои са предимствата на линия LSCC-SF(Mc29) в сравнение с останалите животински и човешки клетъчни линии?

До средата на 1960те години в литературата има ограничени съобщения за установяване на спонтанно възникнали чернодробноклетъч-ни тумори при птици. Откриването на вирус Мс29 и способността му да предизвиква карциноми на черния дроб и най-вече получаването на тран-сплантируемия хепатом у пиле, предизвикан с този вирус, дадоха сериозен тласък на проучванията в тази посока. В този смисъл, постояннатаклетачна линия LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове са изключително удобна система за провеждане на различни проучвания върху вирус-индуциранта (хепато)канцерогенеза.

Хепатом Мс29, от който са получени линия LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове, е оригинален експериментален модел, тъй като е един-ственият при птиците клетъчно-преносим тумор от епителен произход, предизвикан с акутен левкемичен вирус и поддържан повече от 30 години.Направено му е сравнително пълно патоморфологично, електронномикроскопско и биохимично охарактеризиране, проведени са и някои имуно-логични проучвания. Докато при бозайниците (мишки, плъхове, хамстери, морски свинчета) са познати много клетъчно-преносими туморни моде-ли с разнообразна етиология (вирус, химически канцероген, лъчева енергия), то при птиците техният брой е доста ограничен - това са трансплан-тируемите тумори, предизвикани с Мс29, птичи левкозен вирус (ALV), някои Раус-асоциирани вируси (RAVs) и вируса на Марековата болест MDV(Nazerian, 1987). Експерименталните туморни модели при птиците са особено подходящи за изследване ролята на имунната система при туморо-генезата, тъй като първичните лимфоидни органи, където узряват Т- и В- клетките, са ясно разграничени. Устойчивостта на птиците към опортю-нистични бактериални инфекции позволява провеждането на експерименти с тимектомирани пилета (като аналог на "голите" мишки). Не на пос-ледно място, не бива да забравяме, че: 1) Ракът на черния дроб е една от най-често срещаните и отличаващи се с висока злокачественост илоша прогноза неоплазии при хората (Tabor, 2001; Yu, Keeffe, 2003; Trevisani et al., 2008). Индуцираният с вирус Мс29 хепатом у пиле е един отживотинските модели на това заболяване (Schaff et al., 1998); 2) Съдържащият се във вирус Мс29 онкоген v-myc принадлежи на фамилията mycонкогени, към която спадат и човешките протоонкогени c-myc, N-myc, L-myc, взимащи участие в патогенезата на редица злокачествени заболя-вания при човека (Nesbit et al., 1999; Hooker, Hurlin, 2005). Птичите системи са удобни модели за изучаване ролята на гените myc в процесите назлокачествена трансформация, пролиферация, апоптоза и диференциация, тъй като позволяват трансформацията с v-myc да бъде изучаванакато one hit event, докато за трансформацията на бозайническите клетки с myc е необходимо участието на втори онкоген (например ras или pim-1)

(Land et al., 1983; Selten et al., 1985, Law, Linial, 2001); 3) Проучванията върху механизмите довели до трансформирането на клетките под влияниена вирус Мс29 се улеснява значително от наличието на подходящи и достъпни контроли – клетъчни култури от тъкани и органи на здраво пиле.

Табл. 28. Някои биологични характеристики на клетките от пилешки туморни линии LSCC-PR2(Mc29) и LSCC-SF(Mc29)

LSCC-PR2(Mc29) LSCC-SF(Mc29)Обработка на изходния туморенматериал при получаването на

линията

Механичнораздробяване*

Механично раздробяванеи ензимна обработка

Кариотип Хиподиплоидниклетки*

Диплоидни (87%) и триплоидни (13%) клетки

Време на удвояване 27 h 24 hОбразуване на колонии

в полутечна cреда Да Да

Наличие на гена v-myc Да ДаПровирусно съдържание По-високо

Вирусна продукция Да ДаНаличие на тумори на мястото

на s.c. трансплантираните впилета клетки

Не Да

Наличие на тумори извънмястото на трансплантация на

клетките

Да Много рядко

* По данни на Sovova и сътр. (1981)

12. Приложение на клетъчна линия LSCC-SF(Mc29) при изпитване на потенциалната антинеопладстична активност на металнисъединения и алкалоиди

Независимо от големия напредък в лечението и диагностиката на малигнените неоплазии, те продължават да бъдат един от основнитепроблеми пред съвременната медико-биологична наука и клинична практика (Cozzi et al., 2004). Нещо повече - предвижданията на специалиститесочат, че значението на злокачествените заболявания ще нарастне през следващите десетилетия. Очаква се през 2020 г. новорегистриранитеслучаи да бъдат с 50% повече в сравнение с 2000 г. (WHO, 2002). Лечението на раковите заболявания е силно затруднено, тъй като злокачестве-но трансформираните клетки не са чужди за организма патогени (за които съществува специфично лечение), а видоизменени собствени клетки,които трябва да бъдат убити или физически отстранени (Levi et al., 2001). В момента лечението на неопластичните заболявания включва опера-тивна намеса, лъче- и химиотерапия, а напоследък и имунотерапия. Въпреки постигнатите успехи в изясняването на молекулните основи наканцерогенезата, цитотоксичните препарати продължават да бъдат основното средство на съвременната антитуморна терапия. Нещо повече,докато лечебните резултати получени чрез оперативна намеса и облъчване (локорегионални интервенции) почти са достигнали своята макси-мална ефективност, то лекарствената терапия (единственото системно въздействие) все още не е разкрила пълния си капацитет (Levi et al., 2001;Gonzalez-Nicolini, Fussenegger, 2005; Kostova, 2006 a). Не бива да се забравя и фактът, че успешната химиотерапия на злокачествените заболя-вания може да се възпрепятства от редица проблеми, сред които особено внимание заслужават: 1) Хетерогенността на туморните клетки (Hepp-ner. Miller, 1998; Alexandrova, 2001); 2) Феноменът множествена лекарствена устойчивост (Sarkadi et al., 2004; Leslie et al., 2005); 3) Нежеланитестранични ефекти (Repetto, 2003; Ocean, Vohdat, 2004). Ето защо, необходимостта от откриването на нови, високоефективни и добре поносимисредства за лечение на неопластичните заболявания продължава да бъде сред водещите предизвикателства пред съвременната медико-биологична наука (Levi et al., 2001; Gonzalez-Nicolini, Fussenegger, 2005; Kostova, 2006)

Антинеопластична активност на металите и техните съединения Известно е, че металите играят важна роля в медицината от хилядолетия, още от зората на човешката история. Съдържащи метали

лекарства се споменават в Папируса на Ebers (1500 г.п.н.е) - своеобразна египетска фармакопея и един от най-древните писмени документидостигнали до нас (Haward-Lock, Lock, 1993). Значението на металните съединения за медицината се потвърждава от редица примери за прило-жение на метали с различни терапевтични свойства - антимон (антипротозойни), бисмут (противоязвени), злато (антиартритни), желязо (противо-маларийни), сребро (антимикробни), платина (антитуморни) (Kopf-Maier, 1994; Desoize, 2004). Интересът към биологичната активност на металитеи техните съединеия, и особено към възможността да бъдат използвани като антинеопластични агенти, нарастна значително пред последнитегодини. Причините за това са основно две: 1) Установено е, че нарушеният баланс в обмяната на есенциалните метали при бозайниците води доувеличена чувствителност към инфекциозни и злокачествени заболявания; 2) Участвайки в регулацията на редица ключови физиологични проце-си, много метали са модификатори на биологичния отговор (Haward-Lock, Lock, 1993). Най-ранните съобщения за лечение на левкемии и солиднитумори с метали или метални съединения датират от 16 век (Desoize, 2004). Сis- diaminodochloro-platinum(II) (cisplatin) е първият навлязъл вонкологичната практика противотуморен препарат (Rosenberg et al., 1965; Desoize, 2004). Наред с него днес се използват също карбоплатина иоксалиплатина (разрешени за клинична употреба в цял свят), недаплатина (в Япония), лобаплатина (в Китай) и хептаплатина (в Южна Корея).Някои комплекси на платината са все още обект на клинични изпитания, сред тях са създадените за орално приложение (например сатраплатина)(Desoize, Madoulet, 2002; Desoize, 2004; Abu-Surrah-Kettunen, 2006; Choy, 2008). В момента цисплатината е най-широко прилаганият в онкологич-ната практика антитуморен препарат - тя се използва при 50%-70% от пациентите с ракови заболявания (Wong, Giandomenico, 1999; Abu-Surrah,Kettunen, 2006).

С цел преодоляване на клиничните проблеми свързани с използването на цисплатината и карбоплатината (активни са срещу относителноограничен кръг неопластични заболявания; възникване на устойчивост към действието им; странични и токсични ефекти), усилено се търсят новиметални (платинови и неплатинови) съединения с антинеопластична активност (Galanski et al., 2003; Desoize, 2004; Alexandrova, Nikolova, 2004).Нараства броят на научните публикации, съобщаващи за проявяващи антитуморни свойства в култура и/или in vivo вещества съдържащиплатина, рутений, титан, галий, паладий, ванадий, злато, калай, лантаниди и др. Някои от тях (рутений, титан, галий) се намират в различнистадии на клинични изпитания.

При проведените от нас експерименти бяха изследвани цитотоксичните и антипролиферативните свойства на няколко различни групи съе-динеия (Виж раздел Материали и методи).

Изборът на тези вещества съвсем не беше случаен и беше продиктуван от следните обстоятелства:1. Медта, цинкът, кобалтът, желязото и никелът са едни от най-важните за живота на Земята химически елементи, без които нормалното

функциониране на организма на животните и човека е невъзможно. Натрупани са множество експериментални данни за антинеоплас-тичното действие в лабораторни условия и in vivo на различни съединения на тези метали (Barceloux, 1999 a, b, c, d; Alexandrova et al.,2002, 2003a, 2004, 2005a, 2006);

2. Биологичната роля на жлъчните киселини е добре известна. Доказана е антитуморната активност на някои синтетични жлъчни кисели-ни, а редица производни на холевата киселина се разглеждат като подходящи кандидати за създаване на конюгирани агенти при про-веждане на насочена антиракова терапия (Paschke et al., 2000; 2003 a,b).

3. Съобщено е за антинеопластичния ефект на редица съединения от типа на Маниховите бази (Gul et al., 2002; Shivarama Holla et al,2003).

4. Биологичната активност на алкалоидите отдавна и напълно оправдано привлича интереса на учените. Редица представители на тазиразнородна група съединения са с доказани антинеопластични, антимикробни, имуномодулиращи и други заслужаващи внимание сво-йства. Алкалоиди и/или техни (полу)синтетични аналози/производни са сред най-ефективните и широко използвани в съвременната он-кологична практика антитуморни препарати – Винка-алкалоиди (Bennouna et al., 2008; Jordan et al., 2008), Камптотекини (Топотекани,Иринотекан) (Sirikantaramas et al., 2007; Liew, Yang, 2008).

С цел по-задълбочено изясняване на биологичната активност на изпитваните вещества в експериментите бяха включени клетъчникултури, различаващи се по различни показатели:

- Птичи, миши, плъши, човешки клетки;- Туморни и нетуморни клетки;- Първични култури и постоянни клетъчни линии;- Култури от вирус- и химически-индуцирани и спонтанни тумори;- Култури от различни типове злокачествени заболявания – хепатоми, саркоми, карциноми, невробластом, левкемии, миелом;- Чувствителни и устойчиви към действието на антитуморни препарати клетки.

Подборът на използваните като експериментални модели клетъчни култури не беше произволен:

- Клетъчни линии LSCC-SF-Mc29 (трансплантируем хепатом у пиле, предизвикан с миелоцитоматозния вирус Мс29) и LSR-SF-SR (транспланти-руем сарком у плъх, индуциран с Rous sarcoma virus щам Schmidt-Ruppin) са създадени от предизвикани с птичи ретровируси трансплантируемитумори у животни. Според достъпната литература влиянието на метални съединения и алкалоиди върху трансформирани с вирус клетки все ощене е напълно проучено;- Човешките туморни линии са получени от едни от най-широко разпространените и характеризиращи се с висока склонност към метастазиране ирецидивиране злокачествени заболявания при хората – рак на гърдата (MCF-7, SК-BR-3), карцином на дебелото черво (Caco-2), мултиформенглиобластом (8 MG-BA), хепатом (HepG2), карцином на ларинкса (Hep-2), недребноклетъчен рак на белия дроб (NCI-H1650), сквамозноклетъченкарцином (А431) и еритролевкемия (К562);- Клетки от линии VERO (нормален маймунски бъбрек) и BALB/c 3T3 (миши фибробласти), както и първични пилешки ембрионални клетки (СЕС)бяха използвани за сравнителни изследвания съответно с човешките, мишите и пилешките туморни клетки.

Връзка между състава/структурата на веществата и тяхната биологична активност1. Метални комплексиИзвестно е, че биологичната активност на комплексните съединения се обуславя не само от съдържащите се в тях метален катион и

лиганд, но най-вече от структурата на комплекса като цяло и взаимното повлияване на изграждащите го единици. Получените от нас резултатипоказаха наличие на определени зависимости между състава/структурата на веществата и биологичната им акитвност:

1) При металните комплекси с холева киселина с по-висока активност се отличават Zn(Chol)2.3H2О и Cu(Chol)2.4H2O, докато кобалтовияткомплекс Co(Chol)2.5H2O показва най-слаб ефект. При комплексите на литохолевата киселина, със своите цитотоксични и антипролиферативнисвойства изпъкват ZnLH и CoLH, а при тези на дехидрохолева киселина – CuDHC.

2) Комплексите на Co(II) и Ni(II) с BAMP [Co2(BAMP)Cl4, Co(BAMP)(NCS)2, Ni2(BAMP)(CH3COO)2, Ni2(BAMP)Cl4] проявяват по-силно изразе-но цитотоксично и антипролиферативно действие в сравнение с TAMEN- съдържащите кобалтови и никелови съединения [Co2(TAMEN)Cl4,Co2(TAMEN)(NCS)4, Co(TAMEN)(ClO4)2, Ni(TAMEN)(ClO4)2, Ni(TAMEN)(NCS)2]. Присъствието на хлориден анион в молекулата на веществата оттази група също се свързва с усилване на антитуморните им свойства.

3) От всички изследвани от нас метални съединения, комплексите на Сu(I, II) (с Манихов тип лиганди и със смесени лиганди) притежаватнай-силно проявена способност да предизвикват ДНК увреждания (едноверижни скъсвания) в третираните клетки. В тази група вещества с най-висока антинеопластична активност при култивирани в лабораторни условия туморни клетки се отличава Cu2BAMPdipyCl4 (TS26) следван отCu2(BAMP)(NCS)4 (TS1) и Cu2(BAMP)I3 (TS2). Както при BAMP-, така и при TAMEN – съдържащите медни комплекси, наличие на перхлоратенанион (ClO4-) беше отбелязано при проявяващите най-слаб антитуморен потенциал вещества.

4) Комплексите на Fe(II, III) с TAMEN са значително по-активни по своето цитотоксично и антипролиферативно действие в сравнение сBAMP-съдържащите комплекси на този метал.

За да бъде оценен „приносът” на металния йон към биологичната активност (цитотоксична, антипролиферативна) на комплексите, в голя-ма част от експериментите бяха включени и съответните лиганди. Установено беше, че приложени самостоятелно в изпитваните концентрации,лигандите BAMP и TAMEN не проявяват цитотоксична и антипролиферативна активност и не придизвикват едноверижни скъсвания в ДНК моле-кулите. В сравнение със съответните метални комплекси, литохолевата и особено дехидрохолевата киселини понижават в много по-слаба степенпреживяемостта и растежните свойства на клетките от изследваните туморни линии.

2. АлкалоидиПроведените от нас експерименти разкриха наличието на зависимост между структурата и биологичната активност на изследваните алка-

лоиди, която се изразяваше в:1) Алкалоидите талидазин и талфетидин имат една и съща химична структура (Фиг. 2б). Единствената разлика между тах е в позиция С-12,където метоксилната група на талидазина е сменена с хидроксилна група при талфетидина. Тази промяна обаче оказва сериозно влияниевърху цитотоксичната активност на тези две вещества – талидазинът е значително по-силно токсичен за култивирани в лабораторни условияклетки в сравнение с талфетидина.2) Алкалоидът хернандезин има една и съща молекулна маса (652) с талидазина. В химичните им структури (Фиг. 2а) обаче има някои раз-лики. В структурата на хернандезина трите метоксилни групи са разположени в ароматния пръстен (в позиции С-5, С-6 и С-7), докато в стру-ктурата на талидазина има само две метоксилни групи – в С-6 и С-7. В структурата на талидазина кислороден мост свързва С-8 с С-5’, дока-то при хернандезина този мост е между С-8 и С-7’. Описаните разлики оказват влияние върху биологичната активност на двата алкалоида –талидазинът е по-силно токсичен от хернандезина.

Механизъм на действиеБезспорно един от най-важните въпроси при изследването на антитуморната активност на вещества е изясняването на техния механизъм надействие, както и уточняването на клетъчните им мишени. Известни са различни механизми, отговорни за антинеопластичните свойства на веще-ствата: 1) Влияние върху микротубулите; 2) Потискане дейността на топоизомеразите; 3) Алкилиране на ДНК; 4) Понижаване синтеза на ДНК; 5)Потискане на белтъчния синтез; 6) Инхибиране активността на липооксигеназата; 7) Активиране на чернодробните ензими, отговорни за транс-формиране на ксенобиотиците; 8) Активиране на системите отговорни за "поправянето" на ДНК молекулите; 9) Влияние върху имунната система(Chaterjee, Bishayee, 1998; Evangelou, 2002; Ancuceanu, Isidor, 2004). Напълно възможно е един или повече от описаните механизми да обуславятцитотоксичните и антипролиферативните свойства на изпитваните от нас съединения, в частност на проявилите най-висока активност веществаTS26 (Cu2BAMPdipyCl4) и талидазин. Отговорът на тези въпроси обаче е предмет на бъдещи изследвания.

Линия LSCC-SF(Mc29) като експериментален модел при първоначалното изпитване на вещества за антитуморна активностВ сравнение с останалите използвани като експериментални модели туморни клетъчни линии (LSR-SF-SR, BP6, P3U1, K562, 8 MG-BA,

Caco-2, Hep2, HepG2, SK-BR-3, MCF-7, A431 и NCI-H1650) пилешките хепатомни клетки от линия LSCC-SF(Mc29) проявява най-силно изразеначувствителност към цитотоксичното и антипролиферативното действие на всички изследвани от нас вещества – основни соли на цинк и мед,комплекси на метали с различни лиганди, изохинолинови алкалоиди. При проведени от нас експерименти (които не са включени в представениядисертационен труд) беше доказана и високата чувствителност на клетките от тази линия към цитотоксичния и антипролиферативния ефект наразлични фотосенсибилизатори (фталоцианини и техни метални комплекси) (Alexandrova et al., 2003; 2005; Stoykova et al., 2004, 2005). Натрупа-ният експериментален опит показа, че клетките от линия LSCC-SF(Mc29) са особено подходящи при провеждане на първоначални изследванияза идентифициране на нови вещества с антинеопластични свойства. Основание за това твърдение дават следните факти: 1) Добре изразенатачувствителност на пилешките хепатомни клетки към цитотоксичния и антипролиферативния ефект на разнообразни по структури и физико-химични свойства вещества; 2) Наличие на подходяща и леснодостъпна контрола (култури от тъкани и органи на здраво пиле, пилешки ембрио-

нални клетки) за проучвания върху селективността на действието им; 3) Присъствие на гена v-myc в клетките от тази линия, което дава възмож-ност не само за проучвания върху цитотоксичната и антипролиферативната активност на вещества, но и за търсене на начини и средства заинактивиране на този онкоген и за предизвикване диференциацията на трансформираните с него клетки; 4) Линията е получена от предизвикан смиелоцитоматозния ретровирус Мс29 трансплантируем хепатом у пиле и е приета като модел за изучаване на хепатокарциногенезата (Schaff etal., 1988); 5) Лесно поддържане в лабораторни условия (възможност за култивиране в различни клетъчни среди, върху различни повърхности –стъкло, пластмаса и др.); 6) Високата трансплантационна способност на клетките при пилета позволява показалите обещаваща антитуморнаисвойства в лабораторни условия вещества да бъдат изследвани и in vivo.

Натрупаните в литературата данни, както и получените от нас резултати, показват, че изследванията върху цитотоксичните и антипро-лиферативните свойства на металите и в частност на мед, цинк, кобалт, желязо и никел, както и на бисбензилизохинолиновите алкалоиди, трябвада бъдат продължени и задълбочени. Това не само ще допринесе за по-пълното изучаването на биологичната им активност и за изясняването намеханизмите, обуславящи антинеопластичните им свойства, но и ще помогне за откриването на най-успешната формула на евентуален бъдещантитуморен препарат.

И З В О Д И

1. Новата постоянна клетъчна линия (означена като LSCC-SF-Mc29) притежава характерни морфологични, функционални и молекулярно-биологични белези. Тя успешно може да се използва при проучвания върху вирус-индуцирана канцерогенеза, изясняване биологичната роля нагена v-myc и изпитване на потенциалните антинеопластична свойства на новосинтезирани съединения и природни продукти.

2. Клетките на получените от един и същ експриментален модел (Хепатом Мс29) клетъчни линии LSCC-SF(Mc29) и LSCC-PR2(Mc29) притежаватсходни белези - морфология, растежни свойства в култура, вирусна продукция, експресия на характерния за миелоцитоматозния вирус Мс29 v-myc (gag-myc) ген. В същото време обаче те се различават по хромозомен набор, провирурсно съдържание, експресия на някои туморни антигении трансплантационна способност при пилета.

3. Изолираните 4 сублинии от новосъздадената клетъчна линия LSCC-SF(Mc29) – E7, D6E10, G9B4 и Е10 притежават много от белезите на из-ходната линия. Едновременно с това те се отличават по редица показатели (морфология, кариотип), като според растежните си свойства в култу-ра, провирусното съдържание и туморогенността in vivo се подреждат както следва:

E7 > LSCC-SF(Mc29) > D6E10 > E10 > G9B4

4. Продуцираният от линия LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове вирус Мс29 в основни линии запазва своя онкогенен спектър, независимо отфакта, че клетките, в които е интегриран неговият провирус и се осъществяват репликацията и морфогенезата му, са претърпели голям бройпасажи в лабораторни условия, което при други експериментални модели води до изменения в онкогенния спектър.

5. Анализът на цитотоксичното и антипролиферативното действие на алкалоиди и новосинтезирани метални съединения с използване на ново-синтезираната линия показва, че:

5.1. Според ефективността си тестираните бисбензилизохинолинови алкалоиди се подреждат както следва: Талидазин > Хернандезин > Талфе-тидин.

5.2. Основната медна сол CuCO3Cu(OH)2.nH2O понижава в по-висока степен преживяемостта и пролиферативната активност на използванитекато експриментални модели туморни клетъчни линии в сравенние с Zn5-xCux(OH)8Cl2.H2O.

5.3. Комплексите на Co(II) и Ni(II) с BAMP проявяват по-силно изразено цитотоксично и антипролиферативно действие в сравнение с TAMEN-съдържащите кобалтови и никелови съединения. В същото време при комплексите на Fe(II, III) с Манихов тип лиганди се наблюдава обратнатазависимост.

5.4. Комплексите на Сu(I, II) (с Манихов тип лиганди и със смесени лиганди) притежават най-силно проявена способност да предизвикват ДНКувреждания (едноверижни скъсвания) в третираните клетки.

5.5. Приложени самостоятелно, лигандите (BAMP, TAMEN, дехидрохолева и литохолева киселини) не проявяват или проявяват много по-слабоизразена цитотоксична и антипролиферативна активност в сравнение със съответните метални комплекси.

5.6. В сравнение с останалите включени в експриментите туморни клетъчни линии от човешки и животински произход пилешките хепатомниклетки (LSCC-SF-Mc29) проявява най-висока чувствителност към цитотоксичното и антипролиферативното действие на всички изследвани от насвещества – основни соли на цинк и мед, комплекси на метали с различни лиганди, изохинолинови алкалоиди.

5.7. Сред изследваните метални съединения с най-силно проявени цитотоксични и антипролиферативни свойства при култивирани в лабораторниусловия туморни клетки се отличава комплексът със смесени лиганди TS26 (Cu2BAMPdipyCl4), който е активен и по отношение на устойчиви къмдействието на антитуморни препарати клетки. TS26 намалява преживяемостта на пилешките хепатомни (LSCC-SF-Mc29) и мишите миеломни(P3U1) клетки в много по-висока степен, в сравнение с ембрионалните пилешки клетки (CEC) и мишите фибробласти от линия (BALB/c 3T3).

СПРАВКА ЗА ПРИНОСИТЕ В ДИСЕРТАЦИОННИЯ ТРУД

Оригинални приноси1. От трансплантируем хепатом у пиле, предизвикан с миелоцитоматозния вирус Мс29 е създаден експериментален модел (клетъчна линияLSCC-SF-Mc29 и получените от нея клонове) за провеждане на проучвания върху: хетерогенността на туморните клетки; механизмите на прогре-сия/регресия, метастазиране; ролята на гена myc във вирус-индуцираната канцерогенеза, както и за изпитване на потенциалната антинеопласти-чна активност на нови вещества. От особена важност е възможността за лесно и достъпно сравнение на резултатите, получени при линия LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове с клетъчни култури от тъкани и органи на здраво пиле, включително пилешки ембрионални клетки.

2. Получени са хибридомни клетъчни линии, секретиращи моноклонални антитела срещу тумор-свързан/и/ антиген/и/ в трансформирани с вирусМс29 клетки.

3. Показана е способността на трансформирани с миелоцитоматозния вирус Мс29 клетки от пиле да растат и предизвикват туморни образуванияв голи мишки след подкожна трансплантация.

4. Получени са данни за влиянието на 38 новосинтезирани метални съединения върху преживяемостта и пролиферативната активност на култи-вирани в лабораторни условия туморни и нетуморни клетки от животински и човешки произход.

5. Установено е, че бисбензилизохинолиновите алкалоиди талидазин, хернандезин и талфетидин намаляват преживяемостта и пролиферациятаи на трансформирани с ретровируси туморни клетки.

6. Доказано е наличието на зависимост между химичната структура на някои от изпитваните съединения (бисбензилизохинолиновите алкалоиди,комплексите на метали с BAMP и TAMEN) и тяхната цитотоксична активност, които ще подпомогнат създаването на нови вещества с повишенаантитуморна активност при по-слабо изразена цитотоксичност.

7. Доказано е, че комплексът на мед със смесени литанди (Cu2BAMPdipyCl4, TS26), проявява силно изразени цитотоксични и цитостатични свойс-тва при култивирани в лабораторни условия злокачествено трансформирани клетки, някои от които се характеризират с устойчивост към използ-вани в онкологичната практика антитуморни препарати.

Приноси с приложен характер

1. Конструирани са праймери и са уточнени условията за провеждане на полимеразни верижни реакции, при които се амплифицират гените gag-myc (v-myc) и пилешкият β актин.

2. Представена е схема за получаване, клониране и субклониране на постоянна клетъчна линия от предизвикан с вирус трансплантируем тумор упиле, която може да се приложи и при други експриментални модели.

3. Вирус-продуциращите свойства на клетките от линия LSCC-SF(Mc29) и нейните клонове вирус Мс29 ги превръщат в удобен и достъпен източ-ник на миелоцитоматозния вирус Мс29 в клетъчна култура.

СПИСЪК НА ПУБЛИКАЦИИТЕ ВЪВ ВРЪЗКА С ДИСЕРТАЦИОННИЯ ТРУД

1. Alexandrova, R., T. Varadinova, M. Velcheva. I. Sainova, P. Genova. Cytotoxic effect of isoquinoline alkaloids on tumour cell lines. Exp. Pathol. Parasi-tol., 4, 2000, 8 – 14.

Цитирана в:1) Kolev, T., B. Shivachev, R. Petrova, I. Ivanov, S. Atanasova, S. Statkova. 1,2,3,4-Tetrahydroisoquinolinum hydrogensquarate. Acta Crystal.,63, 2007, 3353-3354 (IF 2007 – 0.719).

2) Thomas, B., S. Prathapan, S. Sugunan. Beckman rearrangement of E,E-cinnamaldoxyme on rare earth exchanged (Ce3+, La3+, and Re3+)HFAU-Y zeolites: An efficient green process for the synthesis of isoquinoline. Microporous and Macroporous Materials, 84, 2005, 137-143.

3) Thomas, B., S. Prathapen, S. Sugunan. Towards a green synthesis of osoquinoline: Beckman rearrangement of E,E-Cinnamaldoxime overrare earth exchanged (Ce3+, La3+, Sm3+, and RE3+) NaFAU – Y zeolites. Studies in Surface Science and Catalysis, 158, B, 2005, 1899-1906(IF 2005 – 0.307).

4) Ivanov, I., S. Nikolova, S. Statkova-Abeghe. One pot synthesis of 1-(2-,3- or 4- aminophenyl) and 1-(4-aminobenzyl)-3,4-dihydroisoquinolines.Heterocyles, 2006, 68, 369-374 (IF 2006 – 1.077).

2. Alexandrova, R. Multidrug resistance and P-glycoprotein. Minireview. Experimental Pathology and Parasitology, 1, 1998, 62-66.

Цитирана в:5) Tashbaeva, R.E., D.N. Hwang, G.S. Song, N.H. Choi, J.H. Lee, Y.S. Lyoo, S.J. Lee, D.I. Jung, H.Y. Kim, J.H. Sur. Cellular characterization ofmultidrug resistance p-glycoprotein, alpha fetoprotein, and neovascular endothelium-associated antigens in canine hepatocellular carcinoma andcirrhotic liver. Veterinary Pathology, 44, 2007, 600-606 (IF 2006 – 1.188).

6) Kaestner, S.A., G.J. Sewell. Chemotherapy Dosing Part I: Scientific Basis for Current Practice and Use of Body Surgace area. Clin. Oncol., 19,2007, 23-37 (IF 2007 – 1.561).

7) Ofurum, U.K. Evaluation of acetonitrile precipitation as a method for separating small from high molecular mass proteins in cytosol from MCF-7breast cancer cells. Thesis, Faculty of the Graduate School of the University of Maryland, 2004.

3. Alexandrova, R., I. Alexandrov, M. Velcheva, T. Varadinova. Phytoproducts and cancer. Exp. Pathol. Parasitol., 4, 2000, 15 – 26.

8) Ancuceanu, R.V., V. Istudor. Pharmacologically active natural compounds for lung cancer. Altern. Med. Rev., 9, 2004, 402-419.

9) Monajemi, R., S. Oryan, A. Haeri-Roohani, A. Ghannadi, A. Jafarian. Cytotoxic effect of essential oils of some Iranian citrus peels. Iranian J.Pharm. Res., 3, 2005, 183-187.

10) Narasimhan, S., G.M. Nair. Cytotoxic effect of Coscinium fenestratum (Gaertn.) Colebr. And active principle on L929 cells. Medicinal Chem-istry Res., 14, 2005, 118-124. (IF 2005 – 0.286)

11) James, S.A., L. Bilbiss, B.Y. Muhammad. The effects of Cathranthus roseus (L.) G. Don 1938 aqueous leaf extract on some liver enzymes,serum proteins and vital organs. Sci. World J., 2, 2007, 5-9.

12) Tansuwanwong, S., H. Yamamoto, K. Imai, U. Vinitketkumnuen. Antiproliferative effect on colon cancer cell lines by aqueous extract from thebark of Millingtonia hortensis. Chiang. Med. Mol. J., 46, 2007, 61-66.

13) Braga, P.A.C., D.A.P. Dos Santos, M.F.D.G.F. Da Silva, P.C. Vieira, J.B. Fernandes, P.J. Houghton, R. Fang. In vitro cytotoxicity activity onseveral cancer cell lines of acridone and N-phenylethyl-benzamide derivatives from Swingles glutinosa (Bl.) Merr. Natural Product Research, 21,2007, 47-55 (IF 2007 – 0.683).

14) Ren, M., R.T. Reilly, N. Sacchi. Sasa Health exerts a protective effect on Her2/NeuN mammary tumorigenesis. Anticancer research, 24,2004, 2879-2884 (IF 2004 – 1.395).

4. Alexandrova, R. Tumour heterogeneity. Exp. Pathol. Parasitol., 2001, 4/6, 57-67.

15) Karev, G.P., A.S. Novozhilov, E.V. Koonin. Mathematical modeling of tumor therapy with oncolytic viruses: effects of parametric heterogene-ity on cell dynamics. Biology Direct, October, 2006, (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0)

16) Jin, H.W., P.Q. Peng, Pei, J.W., Wei, X.C., Xiu, H.Z., Wang, Y, Xiao, H.Z., Xin, Q.M. Dynamic CT evaluation of tumor vascularity in renal cellcarcinoma. AJR Am J. Roentgenol., 186, 2006, 1423-1430. (IF 2006 – 2.117)

17) Karacali, B., A. Tozeren. Automated detection of regions of interest for tissue microarray experiments: an image texture analysis. BMC Medi-cal Imaging, 7, 2007 (IF 2007 – 1.27).

18) Gerlee, P., A.R.A. Anderson. An evolutionary hybrid cellular automatonmodel of solid tumor growth. J. Theoret. Biol., 21, 2007, 583-603 (IF2007 – 2.323).

http://www.pubmedcentral.nih.gov/redirect3.cgi?&&auth=0xLzY4kKsMvJtYjk5E5kk5Vhpp0BBHbl38Q4iRQ24&reftype=extlink&artid=1622743&iid=128634&jid=390&FROM=Article%7CFront%20Matter&TO=External%7CLink%7CURI&article-id=1622743&journal-id=390&rendering-type=normal&&http://creativecommons.org/licenses/by/2.0

19) Gerlee, P., A.R.A. Anderson. A hybrid cellular automaton model of clonal evolution in cancer: The emergence of the glycolytic phenotype. J.Theoret. Biol., 4, 2008, 705-722 (IF 2007 – 2.323).

20) Kidd, E.A. P.W. Grigsby. Intratumoral metabolic heterogeneity of cervical cancer. Clinical Cancer Res., 14, 2008, 52-36-5252 (IF 2007 –6.250).

21) Grigsby, P.W. The prognostic value of PET and PET/CT in cervical cancer. Cancer Imaging, 8, 2008, 146-155.

22) Cheung, S.Y.A., E.N.D. Evans, M.J. Chappell, K.R. Godfrey, P.J. Smith, R.J. Errington. Exploration of the intercellular heterogeneity of topo-tecan uptake into human breast cancer cells through compartmental modelling. Mathematical Biosciences, 213, 2008, 119-134 (IF 2007 – 1.186).

5. Alexandrova, R. Myc genes – a short review. Exp. Pathol. Parasitol., 8/2, 2004, 76-92

6. Alexandrova, R., E. Nikolova. Metals as potential anticancer agents. J. Bulg. Acad. Sci., 2004, 1, 19-23.

ПУБЛИКАЦИИ В ПЪЛЕН ТЕКСТ В СБОРНИЦИ ОТ НАУЧНИ ФОРУМИ

НАЦИОНАЛНИ НАУЧНИ ФОРУМИ

7. Александрова, Р., В. Алтанерова. Проучвания върху провирусното съдържание и туморогенния потенциал in vivo на пилешки клетки, транс-формирани с вирус Mc29. Сборник доклади от научна конференция „10 години Факултет по ветеринарна медицина” при Лесотехничес-кия университет. София, 2005, стр. pp. 312-317.

8. Александрова, Р., Е. Шикова, П. Йорданова, И. Александров, М. Александров, В. Алтанерова. Сравнителни проучвания върху две постоянниклетъчни линии, получени от предизвикан с миелоцитоматозния вирус Мс29 хепатом у пиле. Сборник доклади от научната конфе-ренция „Традиции и съвременност във ветеринарната медицина”. София, 2006, стр. 94 – 101

МЕЖДУНАРОДНИ НАУЧНИ ФОРУМИ

9. Alexandrova, R., V. Ogneva. Transplantable chicken hepatoma as a model for tumor heterogeneity investigations. First Joint Meeting of departments ofanimal sciences of the Balkan countries. BALNIMALCON, 2-8 June 2001, Tekirdag, Turkey. Proceedings Book, pp. 127-131.

10. Alexandrova, R., M. Gabrashanska, Y. Martinova, T. Popova, S. Tepavitcharova, K. Hlubinova. Cytotoxic and antiproliferative activities of two basicsalts of zinc and copper on human and nonhuman tumor cell lines. 4th International Symposium on trace Elements in Human: New Perspectives.9-11 October 2003, Athenes, Greece. Proceeding Book (Eds. S. Ermidou-Pollet, S. Pollet), Part I, p.301-312.

11. Alexandrova, R.I., G. Rashkova, S. Slavov, E. Nikolova, M. Kirilova, G. Miloshev, E.M. Mosoarca, R. Tudose, O. Costisor. Cytotoxic and antiprolifera-tive effects in vitro of iron complexes with Mannich type ligands. 5th International Symposium on Trace Elements in Human: New Perspectives.October 13-15, 2005, Athens, Greece. Proceeding Book, pp. 242-250.

12. Alexandrova, R., T. Popova, G. Rashkova, S. Slavov, M. Alexandrov, M. Kirilova, G. Miloshev, Y. Martinova, E. Nikolova, D. Culita, L. Patron. Study onantitumor and antimicrobial effects of Zn(II), Cu(II), Co(II) and La(III) complexes with cholic acid in vitro. 5th International Symposium on TraceElements in Human: New Perspectives. October 13-15, 2005, Athens, Greece. Proceeding Book, pp. 233-241.

13. Alexandrova, R., T. Popova, D. Culita, M. Kirilova, I. Todorova, G. Miloshev, L. Patron. Newly synthesized Zn(II) and Co(II) complexes with lithocholicacid – antimicrobial activity and effect on tumour cell viability and proliferation. Proceeding of the International Symposium on Trace Elements inthe Food Chain. Budapest, May 25-27 2006, pp. 518-523.

14. Alexandrova, R., M. Kirilova, I. Todorova, G. Miloshev, Y. Martinova, R. Kalfin, D.-C. Culita, L. Patron. Study on cytotoxic and antiproliferative activitiesof metal complexes with lithocholic and dehydrocholic acids. Proceeding of the Symposium “New Trends and Strategies in the Chemistry of Ad-vanced Materials with Relevance in Biological Systems”. November 2007, Timisoara, Romania, p. 11-15

РЕЗЮМЕТА ОТ УЧАСТИЯ В НАУЧНИ ФОРУМИ:

НАЦИОНАЛНИ НАУЧНИ ФОРУМИ

1. Alexandrova, R., M. Velcheva, T. Varadinova, P. Genova, G. Nestorova, V. Ivanova. Isoquinoline alkaloids with antitumour properties. VII NationalCongress of Hygiene, 2-4 November 2000, Sofia, Bulgaria. Book of Abstracts, p. 159-160.

2. Alexandrova, R., W. Tsenova, I. Alexandrov, E. Shikova, I. Ivanov, V. Altanerova, C. Altaner. LSCC-SF(Mc29) and LSCC-PR2(Mc29) – two permanentcell lines established from Mc29 virus-induced transplantable chicken hepatoma. Days of Virology in Bulgaria. Biotechnology and Biotechnologi-cal Equipment, 3, 2004, 18. GV-P-13, p. 25 .

3. Alexandrova, R., W. Tsenova, I. Alexandrov, E. Shikova, I. Ivanov, P. Jordanova, V. Altanerova, C. Altaner. Mc29-virus-induced transplantable chickenhepatoma as a model for cancer investigations. National Conference of Oncology, 19-21 November 2004, Sofia, Bulgaria. Book of Abstracts, P. 9

4. Alexandrova, R., P. Genova, G. Nestorova, E. Nikolova, Z. Samdandhiin, Z. Yansanghiin, M. Velcheva. Investigations on cytotoxic and antiproliferativeeffects of five isoquinoline alkaloids on virus-transformed cells. National Conference of Oncology, 19-21 November 2004, Sofia, Bulgaria. Bookof Abstracts, P. 10.

5. Alexandrova, R., T. Varadiinova, T. Popova, E. Nikolova, Y. Martinova, M. Gabrashanska, S. Tepavitcharova, D. Kovala-Demertzi, U. Kalinowska, J.Ochochki, R. Tudose, O. Costisor. Investigations on cytotoxic and antiproliferative activities of newly synthesized metal compounds on tumor celllines. National Conference of Oncology, 19-21 November 2004, Sofia, Bulgaria. Book of Abstracts, P. 11.

6. Alexandrova, R., D.-C. Culita, M. Kirilova, E. Nikolova, I. Todorova, G. Miloshev, Y. Martinova, L. Patron. Newly synthesized Zn(II), Cu(II) and Co(II)complexes with cholic acids: effect on viability and proliferation of human tumour cell lines. XVIII National Congress of the Bulgarian AnatomicalSociety. Stara Zagora, June 1-3, 2007. Trakia Journal of Sciences, 5, Suppl. 2, 2007, p. 18.

7. Alexandrova, R., W. Tsenova, E. Shikova, R. Argirova. Morphological and functional characterization of a tumour cell line LSCC-SF(Mc29). Congress ofthe Bulgarian Anatomical Society. Stara Zagora, June 1-3, 2007. Trakia Journal of Sciences, 5, Suppl. 2, 2007, p. 18-19

МЕЖДУНАРОДНИ НАУЧНИ ФОРУМИ, ПРОВЕДЕНИ В БЪЛГАРИЯ

8. Alexandrova, R., T. Varadinova, M. Velcheva, P. Genova. Cytotoxic effects of bisbenzylisiquinoline alkaloids hernandesine and thalfoetidine on tumourcell lines. First Balkan Conference of Microbiology, October 5-9, 1999, Plovdiv, Bulgaria. Book of Abstracts, p. 158.

9. Alexandrova, R., W. Tsenova, I. Alexandrov, E. Shikova, I. Ivanov, P. Jordanova, V. Altanerova. Biological characterization of two cell lines establishedfrom Mc29 virus-induced transplantable chicken hepatoma and their potential application in tumor heterogeneity investigations. Balkan ScientificConference of Biology. Plovdiv, May 19-21 2005, Bulgaria. Program, p. 19.

10. Alexandrova, R., G. Rashkova, T. Popova, S. Slavov, E.-M. Mosoarca, R. Tudeose, O. Costisor. Effect of iron complexes with Mannich bases onviability of tumor cell lines. Balkan Scientific Conference of Biology. Plovdiv, May 19-21 2005, Bulgaria. Program, p. 21.

11. Alexandrova, R., G. Rashkova, S. Slavov, M. Kirilova, G. Miloshev, E. Nikolova, D. Culita, L. Patron. Cytotoxic and antiproliferative effects of Zn(II),Cu(II), Co(II) and La(III) complexes with cholic acid on human and animal tumor cell lines. XVII National Congress of Anatomy with InternationalParticipation. Hissar, 10-12 June, 2005.

12. Alexandrova, R., G. Rashkova, T. Popova, S. Slavov, E. Nikolova, R. Tudose, E.M. Mosoarca, O. Costisor. Cytotoxic and antiproliferative activities offour Ni(II) complexes with Mannich type ligands on tumor cell lines. XVII National Congress of Anatomy with International Participation. Hissar,10-12 June, 2005.

13. Alexandrova, R., I. Todorova, M. Kirilova, Y. Martinova, G. Miloshev, D.-C. Culita, L. Patron. Investigations on cytotoxic and antiproliferative propertiesof Zn(II) and Cu(II) complexes with dehydrocholic acid on virus transformed cells. Third International Conference “Bacterial, Viral and ParasiticDiseases in Human and Veterinary Medicine”, Sofia, 15-16 June 2007. Programme and Abstracts, pp. 38-39

14. Alexandrova, R., S. Shishkov, E. Nikolova, E.-M. Mosoarca, R. Tudose, O. Costisor. Effects of Fe(II, III) complexes with Mannich type ligands onviabil-ity and proliferation of virus-transformed cells and replication of Herpes simplex virus type-1. Third International Conference “Bacterial, Viral andParasitic Diseases in Human and Veterinary Medicine”, Sofia, 15-16 June 2007. Programme and Abstracts, pp.35-36

МЕЖДУНАРОДНИ НАУЧНИ ФОРУМИ, ПРОВЕДЕНИ В ЧУЖБИНА

15. Alexandrova, R., V. Ogneva, P. Yordanova. Establishment and characterization of permanent tumor cell line derived from a transplantable chickenhepatoma. 12 Balkan Biochemical and Biophysical Days, May 10-13, 2001, Bucharest, Romania. Book of Abstracts, p.130.

16. Alexandrova, R., V. Ogneva. P. Yordanova. Isolation and characterization of different clones from LSCC-SF(Mc29) tumor cell line. 12 BalkanBiochemical and Biophysical Days, May 10-13, 2001, Bucharest, Romania. Book of Abstracts, p. 130.

17. Alexandrova, R., P. Genova, M. Velcheva. Thalidasine – a bisbenzylisoquinoline alkaloid with promissing antitumor activity in vitro. 12 BalkanBiochemical and Biophysical Days, May 10-13, 2001, Bucharest, Romania. Book of Abstracts, p.131.

18. Alexandrova, R.I., V. Ogneva, P. Jordanova. Tumor heterogeneity investigations in virus-induced transplantable tumor. 18th UICC International cancerCongress. 30 June – 5 July 2002, Oslo, Norway. International Journal of Cancer, Suppl. 13, 2002, P. 563

19. Alexandrova, R., E. Shikova, P. Jordanova, W. Tzenova. Establishment and comparative study on different cell clones isolated from the same virus-induced transplantable tumour in chicken. Third Euroconference on Animal Models of Human Diseases: Cancer and Age Related Diseases. May16-18 2003, Prague, Czech Republic.

20. Alexandrova, R., T. Popova, Y. Martinova, M. Gabrashanska, S. Tepavitcharova. Investigation on in vitro antimicrobial activity of two basic salts of zincand copper and their effects on viability and proliferation of virus-transformed cells. 10th Scientific Meeting. European Society of Chemotherapy.Infectious Diseases. Folia Chemotherapeutica Austrica. Antibiotika Monitor. XIX, 3/4/2003, p. 57.

21. Alexandrova R., I. Alexandrov, E. Shikova, I. Ivanov, P. Jordanova, W. Tsenova, M. Poturnajova, K. Hlubinova, A. Pastorakova, V. Altanerova, C.Altaner. Biological Characterization of cell lines established from Mc29-induced transplantable hepatoma in chicken. 13th Balkan BiochemicalBiophysical Days, 12-15 October, 2003. Kushadasi, Turkey. Turkish J. Biochemistry, 2003, 28, 158.

22. Alexandrova, R.I., V. Altanerova, C. Altaner. Correlation between proviral load and tumorigenic potential of Mc29 virus transformed cells. 29th ESMOCongress 29 October- 2 November 2004, Vienna, Austria. Annals of Oncology, 15, Suppl. 3, 2004, 95P .

23. Alexandrova, R., G. Rashkova, M. Kirilova, G. Miloshev, S. Slavov, R. Kalfin, D. Culita, L. Patron. Investigations on cytotoxic and antiproliferative activi-ties of Zn(II), Cu(II) and La(III) complexes with cholic acid on tumor cell line. 3rd International Symposium on Targeted Anticancer Therapies, Am-sterdam, The Netherlands, 3-5 March 2005.Annals of Oncology, 16 (3 Suppl.), 2005, pp. 33.

24. Alexandrova, R., T. Popova, G. Rashkova, S. Slavov, M. Alexandrov, S. Lazarova, R. Tudose, E.M. Mosoarca, O. Costisor. Preliminary investigationson biological activity of complexes with Mannich type ligands. Academic Days of Timisoara, 26-27 May 2005, Timisoara, Romania. ProceedingBook, p. 5.

25. Alexandrova, R., G. Rashkova, T. Popova, M. Alexandrov, S. Slavov, M. Kirilova, G. Miloshev, D. Culita, L. Patron. Investigations on antitumour andantimicrobial activities in vitro of Zn(II), Cu(II), Co(II) and La(III) complexes with cholic acid. Academic Days of Timisoara, 26-27 May 2005, Timi-soara, Romania. Proceeding Book, p. 4.

26. Alexandrova, R.I., E. Nikolova, E.M. Mosoarca, R. Tudose, O. Costisor. Investigations on cytotoxic and antiproliferative effects of newly synthesizedcomplexes of Zn(II), Cu(I, II), Co(II), Ni(II) and Fe(II, III) with Mannich type ligands on tumor cell lines. UICC World Cancer Congress, July 8-12,2006, Washington, D.C., USA. Book of Abstractsр 167-20.

27. Alexandrova, R., T. Popova, M. Kirilova, S. Shishkov, G. Miloshev, A. Vacheva, E. Nikolova, Y. Martinova, E.-M. Mosoarca, R. Tudose, O. Costisor.Investigations on biological properties of seven copper (I, II) complexes with Mannich type ligands. Symposium “New Trends and Strategies inthe Chemistry of Advanced Materials with Relevance in Biological Systems”, Timisoara, Romania, 2007. Programme and Abstracts, pp. 11

28. Mosoarca, E.-M., R. Tudose, I. Rantenburg, G. Meyer, R. Alexandrova, T. Popova, O. Costisor. Structural Aspects and antimicrobial activity of binu-clear Cobalt (II) complexes with pyrazolonic Mannich bases as ligands. J. Biol. Inorg. Chem., 12 (Suppl. 1), 2007, S40.

ПРОУЧВАНИЯТА, ПРОВЕДЕНИ ПРИ РАЗРАБОТВАНЕТО НА ДИСЕРТАЦИОННИЯ ТРУД,СА ОСИГУРЕНИ ФИНАНСОВО ОТ:

Договор СС-1402/2004 с НФНИ при МОН на тема: “Вирус-индуциран хепатом у пиле – модел за изучаване на механизми на канцеро-генезата и антинеопластичния ефект на метални съединения” (Ръководител: Р. Александрова).

Договор MУ-СС-1/2000 с НФНИ при МОН на тема “Проучвания върху хетерогенността на туморните клетки и антинеопластичнияефект на алкалоиди и метални съединения.” (Ръководител: Р. Александрова). За изпълнението на този проект колективът получи Първа награ-да от НФНИ при МОН през декември 2003 г.

Договор за двустранно сътрудничество между Българска академия на науките (Институт по експериментална патология и паразитоло-гия) и Румънска академия на науките (Институт по физико-химия в Букурещ и Институт по химия в Тимишоара) на тема: “Investigations on antitumoractivity of newly synthesized metal complexes” (2003-2005) (Ръководител: Р. Александрова).

Договор за двустранно сътрудничество между Българска академия на науките (Институт по експериментална патология и паразитоло-гия) и Румънска академия на науките (Институт по физико-химия в Букурещ и Институт по химия в Тимишоара) на тема: “Investigations on antitu-mour and antimicrobial activities in vitro of newly synthesized metal complexes”(2006-2008) (Ръководител: Р. Александрова).

ИЗКАЗВАМ СЪРДЕЧНА БЛАГОДАРНОСТ НА:

Научния ми консултант проф. д-р Радка Аргирова, дмн – за ценните напътствия, за отзивчивостта и безре-зервната помощ не само при изработването на този труд;

Рецензентите ст.н.с. І ст. д-р Марин Диловски, двмн, и ст.н.с. ІІ ст. д-р Любка Думанова – за задълбочения идобронамерен прочит на дисертационния труд, за полезните съвети и препоръки;

Проф. Честмир Алтанер и колегите от Департамента по молекулярна вирусология при Института за изслед-ване на рака в Братислава, Словакия; на проф Катлин Немет и нейния колектив от Лабораторията поекспериментална генна терапия в Института по хематология и имунология към Националния меди-цински център в Будапеща, Унгария – за това, че разтвориха гостоприемно лабораториите си и меприеха в сърцата си, за възможностите, които ми предоставиха, за интересните дискусии и чудеснияпример, който ми дадоха;

Проф. Отилия Костишор, проф Луминица Патрон и всички колеги и приятели от Института по физико-химия вБукурещ и Института по химия в Тимишоара, Румъния – за гласуването доверие и ползотворното съ-трудничество, за безкрайното търпение и приятелското рамо, за това, че отдавна сме се превърналив едно голямо семейство;

Ст.н.с. ІІ ст. д-р Рени Калфин – за безценното приятелство, за разбирането и всеотдайната подкрепа;

Ръководството и колегите от ИЕПП – БАН, на всички приятели и съмишленици, които бяха и са до мен и втрудни, и в хубави дни; които оцветяват в пъстри багри иначе сивото ежедневие и непрекъснато мепредизвикват да давам най-доброто от себе си;

Моите Учители и на родителите ми, които ме научиха да разпознавам и ценя истинските неща, да не търсялесните пътища в живота и в науката, да не се страхувам да призная грешките си и да не спирам дамечтая, защото човешкият дух е най-могъщата съзидателна сила на Земята;

Моите студенти, чиито младежки ентусиазъм, критичен поглед към света, свежи идеи и неизчерпаема любоз-нателност ме поддържат будна, дават ми сили да продължа напред по пътя на „личната си легенда”,не ми позволяват да отстъпвам пред проблемите и ме даряват с невероятното усещане, че положе-ните усилия имат смисъл;

На д-р Даринка Боева (27 поликлиника); на доц. д-р Константа Тимчева, доц. д-р Иван Гаврилов, доц. д-рАнгел Милев и техните колеги от СБАЛО, без чиито висок професионализъм и всеотдайност в рабо-тата този труд никога нямаше да бъде завършен.

Авторът

K I ? P B : E B A B J : G G : M Q ? D J H ; B H E H = B Y ... Autoref Radi-… · Д-РЛЮБКА...

Documents

Transcript of K I ? P B : E B A B J : G G : M Q ? D J H ; B H E H = B Y ... Autoref Radi-… · Д-РЛЮБКА...