VALIDASI METODE IDENTIFIKASI DAN PENETAPAN KADAR TADALAFIL DALAM SEDIAAN PERMEN KARET CINTASECARA KLT-DENSITOMETRI

Angela Diana Dhuy Nyaga1,*, Henry Kurnia Setiawan1, Senny Yesery Esar11Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya*Correspondence : 085283535375., angela_nyaga@ymail.com

Abstrak

Sebuah metode kromatografi lapis tipis (KLT) densitometri yang sederhana dan sensitif telah dikembangkan untuk identifikasi dan penetapan kadar tadalafil dalam sediaan permen karet cinta. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memvalidasi metode yang akan digunakan dalam penelitian terkait identifikasi dan penetapan kadar tadalafil tersebut. Tadalafil dieluasi pada fase diam silika gel 60 GF254 dan fase gerak campuran kloroform : metanol : asam asetat glasial (70:3:0,2 v/v) sehingga memperoleh harga Rf dan Rs (0,53 dan 5,71) pada panjang gelombang 286 nm. Hasil dari validasi metode yang dilakukan adalah sebagai berikut, Uji linearitas menunjukkan korelasi yang linear dimana r hitung (0,998) > r tabel (0,878). Dari uji akurasi diperoleh nilai % recovery rata-rata secara berurutan 99,86; 99,66; dan 99,53 (%) pada konsentrasi 25, 50 dan 75 (ppm). Terkait uji presisi nilai KV dari masing-masing konsentrasi adalah 3,315; 2,779 dan 1,316 %, 5%. Untuk uji LOD dan LOQ yang diperoleh masing-masingnya adalah 1,339 g/ml dan 4,464 g/ml. Kesimpulan metode ini dapat digunakan untuk identifikasi dan penetapan kadar tadalafil dalam permen karet cinta karena memiliki akurasi dan presisi yang baik sera sensitifitas yang baik.

Kata kunci : Validasi Metode, Tadalafil, Permen Karet Cinta, KLT-Densitometri

TLC-DENSITOMETRY METHOD VALIDATION OF IDENTIFICATION AND ASSAY OF TADALAFIL IN LOVE CHEWING GUM

Abstrack

A simple and sensitive thin layer chromatography (TLC) densitometry method has been developed for identification and assay of tadalafil in love chewing gum. The aim of this research is to validate the method used in the identification and assay of the tadalafil. Tadalafil was eluated on silica gel 60 GF254 and mobile phase mixture of chloroform: methanol: glacial acetic acid (70:3:0.2 v/v), to obtain Rf and Rs (0.53 and 5.71); at wavelength of 286 nm. The results of the validation method showed a linear correlation where r value (0.998)> r table (0.878), The test of accuracy obtain the % recoveryaverage 99.86; 99.66; and 99.53 (%) on the consentration 25, 50 and 75 (ppm). The precision test has a variation each concentration of 3.315; 2.779 and 1.316%, 5%. For the limit of detection and limit of quantification for Tadalafil were found to be 1.339 g/ml and 4.464 g/ml, respectively. For the conclusion TLC method can be used for the identification and assay of tadalafil in love chewing gum because it has good accuracy and precision.

Keywords: Validation Methods, Tadalafil, Love Chewing Gum, TLC-densitometry

PENDAHULUAN Berita mengenai bahaya dan keresahan dari masyarakat terkait beredarnya permen karet cinta membuat beberapa laboratorium mengadakan penelitian untuk mengidentifikasi senyawa apa yang terkandung dalam permen peningkat libido. Salah satu laboratorium dari universitas di Surabaya telah dilaporkan mengadakan penelitian untuk identifikasi bahan aktif di dalam permen cinta menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) densitometri dan hasilnya negatif dimana tidak menunjukan adanya kandungan bahan penyusun Viagra yakni Sildenafil Sitrat, Tadalafil maupun Verdenafil HCl (Surabaya Tribun.com, 9 Februari 2013). Selain laboratorium tersebut sebuah Laboratorium swasta di Indonesia telah berhasil mengidentifikasi dan menganalisis kandungan tadalafil di dalam sediaan permen karet cinta tersebut dengan menggunakan metode LC-MS sehingga memperoleh hasil yang menyatakan bahwa zat berkhasiat yang terdapat dalam permen karet cinta tersebut adalah tadalafil 5,4 mg dan Sildenafil sitrat 27,4 mg (Redaksi, Februari 2013). Terkait penelitian sebelumnya yang memiliki hasil yang berbeda maka perlu diadakan penelitian lebih lanjut untuk memastikan senyawa apakah yang terkandung di dalam permen karet cinta tersebut. Beberapa penelitian yang telah dilakukan yakni Patel and Natvarlal (2011) melakukan analisis terhadap sediaan farmasetik tadalafil menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi, Setiawan, et al (2011) melakukan analisis terhadap tadalafil dalam sediaan jamu kuat secara KLT-Densitometri. Setiawan, et al (2012) melakukan analisis tadalafil dalam kopi greng dan minuman herbal peningkat vitalitas dengan metode KLT. Tadalafil merupakan salah satu bahan kimia obat berkhasiat untuk meningkatkan libido pada pria. Dalam dunia medis dan pengobatan Tadalafil adalah suatu senyawa yang selektif, dan merupakan inhibitor reversibel dari Phospodiester tipe 5 yang digunakan sebagai terapi oral untuk disfungsi ereksi (Giuliano,F and L,Varanese., 2002). Tadalafil meningkatkan fungsi ereksi yakni dengan cara meningkatkan jumlah cGMP (Thomas, 2000). Penggunaan tadalafil seharusnya di bawah pengawasan dokter dan berdasarkan resep dokter. Dalam terapi disfungsi ereksi dosis yang biasanya digunakan yakni tadalafil diberikan secara oral dengan dosis 10-20 mg dan digunakan minimal 30 menit sebelum melakukan hubungan seksual (Martindale 36th ed, 2009). Tadalafil dibatasi karena banyak menimbulkan efek samping yang merugikan seperti sakit kepala, muka memerah, pusing, gangguan pencernaan, insomnia, vertigo, hidung berdarah, demam, anemia, mual, nyeri perut, gangguan penglihatan, gangguan otot jantung, nyeri dada, jantung berdebar dan kematian (Martindale 36thed, 2009).Untuk mengetahui Apakah metode KLT-densitometri dapat digunakan secara tepat dan teliti untuk identifikasi dan penetapan kadar Tadalafil dalam sediaan permen karet cinta merek A,B dan C yang beredar di pasaran maka perlu dilakukan validasi metode analisis KLT-Densitometri dalam mengidentifikasi dan menetapkan kadar tadalafil dalam sediaan permen karet cinta merek A,B dan C yang beredar di pasaran.

METODE PENELITIANAlatAlat yang digunakan dalam penelitian adalah TLC scaner (Camag), chamber, pipa kapiler berbagai volume, mikropipet Socorex berbagai volume, timbangan analitik Denver Instrument M220, vortex, alat fotografi, labu takar berbagai volume, kertas saring whatmann.Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini tablet Cialis (tadalafil 20mg), metanol p.a (E,Merck), asam asetat glasial p.a (E,Merck), amoniak p.a (E,Merck), kloroform p.a (E,Merck), pelat silika gel 60 GF254 (E,Merck).Tahapan PenelitianPenelitian ini dimulai pada bulan September hingga Desember 2013 di Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya.a. penyiapan 1. Formula Matriks Permen Karet Matriks dalam penelitian adalah permen karet rasa buah yang beredar di pasaran. Ditimbang matriks sebanyak 1/10 bagian permen karet (300 mg). Penggunaan matriks didasarkan pada penelitian terdahulu yang dilakukan oleh laboratorium swasta di Indonesia yang menyatakan bahwa kandungan tadalafil 5 mg/ permen.2. Penyiapan Fase GerakPada penelitian ini digunakan tiga macam fase gerak yaitu campuran (1) Kloroform : Metanol (9:1 v/v); (2) Kloroform : Metanol : Asam asetat glasial (70:3:0,2, v/v); (3) Kloroform : Metanol : Amoniak pekat (75:2:5 v/v). Masing-masing campuran tersebut diaduk kemudian dituangkan ke dalam chamber dan didiamkan selama 30 menit hingga jenuh.3. Larutan Baku Induk Tadalafil dalam Metanol Tablet cialis digerus halus kemudian ditimbang dengan teliti setara dengan 5 mg tadalafil, dilarutkan dalam 10,0 ml metanol (500 ppm). 4. Larutan Matriks dalam MetanolDitimbang matriks sebanyak 1/10 bagian (300 mg). Kemudian diekstraksi dengan 4 ml metanol dan divorteks selama 10 menit. Filtrat diambil dan dimasukkan labu ukur 10,0 ml. Ekstraksi dilakukan dua kali dengan tahapan yang sama. Larutan ekstraksi ditambahkan metanol sampai 10,0 ml.5. Larutan Campuran Bahan Aktif dan Matriks Ditimbang secara teliti sebanyak 1/10 matriks, kemudian diekstraksi dengan 4 ml metanol dan divorteks selama 10 menit. Filtrat diambil dan dimasukkan labu ukur 10,0 ml. ekstraksi dilakukan dua kali dengan tahapan yang sama tambahkan 1 ml larutan baku tadalafil (500 ppm), kemudian ditambah metanol hingga 10,0 ml.

b. Validasi Metode Penetapan Kadar secara KLT-Densitometri1. Selektivitas Larutan baku induk tadalafil (500 ppm) diencerkan sebanyak 10 kali untuk memperoleh hasil 50 ppm, larutan matriks permen karet serta simulasi permen karet cinta yang dibuat dengan cara mencampurkan matriks dengan bahan aktif tadalafil yang memiliki konsentrasi 50 ppm. Masing-masing larutan ditotolkan pada pelat KLT menggunakan pipa kapiler 10 l kemudian dieluasi dengan menggunakan ketiga fase gerak hingga batas eluasi. Pelat KLT yang telah dieluasi dikeringkan lalu diamati pada TLC scanner untuk menentukan panjang gelombang terpilih dan fase gerak yang akan digunakan.2. Linearitas Dari baku induk (500 ppm) dibuat lima macam konsentrasi dengan rentang 25-200% dalam metanol. Dipipet 0,125; 0,250; 0,500; 0,750 dan 1 ml kemudian ditambahkan metanol hingga 5,0 ml sehingga diperoleh 5 macam konsentrasi yakni 12,5; 25,0; 50,0; 75,0; dan 100,0 g/ml (ppm). Ditotolkan pada pelat KLT sebanyak 10 l kemudian dieluasi dengan menggunakan fase gerak terpilih sampai batas eluasi dengan menggunakan fase gerak terpilih. Area yang diperoleh didibuat persamaan regresi hubungan antara konsentrasi dengan area. 3. Ketepatan (Akurasi) dan Ketelitian (Presisi) matriks dengan bahan aktif dicampurkan pada konsentrasi 50, 100 dan 150 %. Uji ketepatan dilakukan dengan menimbang matriks sebanyak 1/10 bagian permen karet (300 mg). Kemudian diekstraksi dengan menggunakan 4 ml metanol dan divorteks selama 10 menit. Filtrat diambil dan dimasukkan ke labu takar 10,0 ml. ekstraksi dilakukan dua kali dengan tahapan yang sama lalu ditambahkan dan ditambahkan dengan 0,5 ml (50%); 1ml (100%) dan 1,5 ml (150%) baku induk tadalafil. Larutan di tambahkan metanol hingga 10,0 ml. Larutan ditotolkan pada pelat KLT menggunakan pipa kapiler 10 l, dieluasi dengan fase gerak terpilih sampai batas eluasi. Pada pelat KLT yang telah dieluasi dikeringkan lalu diamati menggunakan TLC scanner. Luas area dan profil spektra noda diukur dengan menggunakan densitometer pada panjang gelombang terpilih. Pengerjaan dilakukan replikasi 3 kali dengan 3 macam konsentrasi. Ketepatan dihitung dari persen perolehan kembali (% recovery). Ketelitian dapat diukur sebagai simpangan baku (SD) atau koefisien variasi (KV).4. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)Untuk uji LOD dan LOQ dibuat suatu kurva baku pada rentang 5 macam konsentrasi. Dari baku induk (500 ppm) dengan rentang 12-20% dalam metanol. Dipipet 0,06; 0,07; 0,08; 0,09 dan 0,10 ml kemudian ditambahkan metanol hingga 5,0 ml sehingga diperoleh 5 macam konsentrasi yakni 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; dan 10,0 g/ml (ppm). Larutan ditotolkan pada pelat KLT sebanyak 10 l kemudian dieluasi dengan menggunakan fase gerak terpilih sampai batas eluasi. Pelat KLT yang telah dieluasi dikeringkan lalu diamati pada TLC scanner pada panjang gelombang terpilih. Hasilnya dihitung LOD dan LOQnya.

c. Aplikasi Metode Identifikasi dan Penetapan Kadar Tadalafil dalam Sediaan Permen Karet Cinta Merek A,B dan C yang Beredar di Pasaran

Permen karet cinta A,B dan C di timbang masing-masing 1/10 bagian permen karet (300 mg) dan diekstraksi dengan 4 ml metanol kemudian divorteks selama 10 menit. Filtrat diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 ml. ekstraksi dilakukan dua kali dengan metanol 4 ml dengan tahapan yang sama. Larutan ekstraksi ditambahkan dengan metanol hingga 10,0 ml. Kemudian di totolkan pada pelat KLT sebanyak 10 l dan dieluasi menggunakan fase gerak terpilih sampai batas eluasi. Pelat KLT yang telah dieluasi dikeringkan kemudian diamati dibawah sinar UV. Luas area dan profil spektra dari noda yang diukur dengan densitometer pada panjang gelombang terpilih. Hasilnya dihitung persen perolehan kembali (% recovery).

HASIL DAN PEMBAHASANHasil uji selektivitas menetapkan campuran Kloroform : Metanol : Asam asetat glasial (70:3:0,2 v/v) sebagai fase gerak terpilih pada panjang gelombang 286 nm. Hasil keterpisahan dan gambar spektrum serapan tadalafil dapat dilihat pada gambar 1 dan 2. Dasar dari pemilihan fase gerak tersebut adalah harga Rf, Rs, K dan As yang memenuhi syarat. Hal ini dikarenakan fase gerak ini bersifat semi polar, dengan indeks polaritas (4,128) sehingga analit lebih sukar untuk terdistibusi ke dalam fase gerak dan tertahan pada fase diam, disamping itu penambahan asam asetat glasial menyebabkan analit yang bersifat basa lebih sukar terdistribusi dan mengikuti fase gerak, ini ditunjukkan dengan harga Rf (0,571) dan harga K (0,8867) yang lebih besar, sehingga pada fase gerak ini antara tadalafil dan matriks dapat terpisah dengan lebih baik (Rs=5,71), ionisasi sulit terjadi karena asam yang ditambahkan merupakan asam lemah sehingga noda yang dihasilkan bagus (tidak tailing) dan harga As yang diperoleh = 1 yang menunjukkan peak berbentuk lonceng.Hasil uji linearitas menunjukkan metode ini memilki signifikansi yang baik karena memiliki harga rhitung < rtabel (tabel 1) dan grafik linearitas dapat dilihat pada gambar 3. Berdasarkan uji ANAVA F hitung 0,7266 < F tabel (4,26). Hal tersebut menunjukan tidak adanya perbedaan yang bermakna dari masing-masing linearitas yang dilakukan pada tiga hari yang berbeda. Sehingga untuk perhitungan selanjutnya dapat digunakan linearitas dari ketiga hari tersebut.Pada uji akurasi yang tertera pada tabel 2 menunjukan akurasi dari ketiga macam konsentrasi tersebut memenuhi syarat dimana %recovery rata-rata berada pada rentang 95-105%. Disamping itu dari uji nilai t menggunakan metode one sample t test dimana harga t hitung < t tabel menunjukkan tidak ada perbedaan bermakna dari ketiga konsentrasi tersebut sehingga dapat disimpulkan akurasi/ketepatan yang dimiliki metode ini baik. Hasil uji presisi (tabel 2) menunjukkan harga KV yang memenuhi syarat 5% (Skoog and West, 1980). Hasil tersebut menunjukan metode ini memiliki variasi yang kecil sehingga dapat dikatakan metode tersebut memiliki presisi/ketelitian yang baik. Harga LOD/LOQ yang diperoleh masing-masingnya adalah 1,339 g/ml dan 4,464 g/ml.. Maka dari itu apabila sampel memiliki konsentrasi demikian masih bisa terditeksi. Grafik LOD/LOQ dapat dilihat pada gambar 4.Hasil dari pengujian terhadap sampel menunjukkan dari ketiga sampel merek A,B dan C tersebut yang menunjukkan adanya noda adalah sampel A(gambar 4) sedangkan sampel B dan C tidak menunjukkan adanya noda pada densitogram. Berdasarkan bentuk spektrum dan panjang gelombang yang dihasilkan pada scan terhadap noda (gambar 5), dapat disimpulkan bahwa zat yang diperoleh bukan merupakan tadalafil.

Gambar 1. Pemisahan Tadalafil dengan Matriks menggunakan fase gerak Kloroform : Metanol : Asam asetat glasial (70:3:0,2 v/v)

Gambar 2. Hasil scanning pemilihan panjang gelombang tadalafil menggunakan fase gerak terpilih Kloroform : Metanol : Asam asetat glasial (70:3:0,2 v/v)

Gambar 3. Grafik Kurva Linearitas Tadalafil pada Tiga Hari yang Berbeda

Gambar 4. Densitogram Sampel Permen Karet Cinta Merek A Menggunakan Fase Gerak Kloroform : Metanol : Asam asetat glasial ( 70 : 3 : 0,2 v/v )

Keterangan :Noda dari sampelNoda tadalafil

2

1

Gambar 5. Hasil Scanning Spektrum Noda Sampel Merek A Ditumpuk dengan Spektrum Tadalafil Murni menggunakan fase Gerak Terpilih Kloroform : Metanol : Asam Asetat Glasial ( 70 : 3 : 0,2 v/v )

Tabel 1. Ringkasan Hasil Perhitungan Regresi Linear Kurva Linearitas Tadalafil

HariKoefisien Korelasi (r)Persamaan Regresi (y= b.x +a)IIIIII0,99890,99710,9954Y = 76,547 x + 82,1743Y = 68,789 x + 310,207Y = 73,083 x + 227,566

Tabel 2. Hasil Uji Akurasi dan Presisi

ReplikasiKonsentrasi teoritis (ppm)Luas Area nodaKonsentrasi sebenarnya (ppm)% recovery% recovey rata-rata SDKVT hitungIIIIII24,3424,5026,131925,101997,202163,2023,4724,5226,9396,45100,09103,0699,86 % 3,313,31 %0,07IIIIII52,9052,7250,704050,703842,303743,8054,3751,3449,91102,7097,3898,2999,66 % 2,772,78 %0,33IIIIII79,278,6576,055808,705690,305453,8079,9378,2174,75100,9099,4098,2999,53 % 1,311,32 %0,62

KESIMPULAN Berdasarkan hasil analisis data dan interpretasi penemuan, maka dapat disimpulkan bahwa metode kromatografi lapis tipis yang digunakan dalam kondisi fase diam silika gel GF254 dengan fase gerak Kloroform : Metanol : Asam asetat glasial ( 70 : 3 : 0,2 v/v ) dapat digunakan untuk menetapkan kadar tadalafil dalam sediaan permen karet cinta karena memiliki ketepatan dan ketelitian yang baik. Setelah dilakukan aplikasi sampel dari ketiga merek permen karet cinta yang beredar di pasaran dapat disimpulkan bahwa permen karet cinta merek A,B dan C yang beredar di pasaran tidak mengandung tadalafil.DAFTAR PUSTAKAGiuliano, F., dan L, Varanese, 2002, Tadalafil:a novel treatment for erectile dysfunction, Eur Heart J Supplements, 4, 24-31

Martindale, 2009, The Complete Drug reference, 36nd ed, Pharmaceutical Press, London, 2196-2197

Patel, S. A., and P. J. Natvanal, 2011, High Performance Thin Layer Chromatographic Method For Determination Of Tadalafil In Tablet Dosage Form, American Journal of Pharmtech Recearch, 1(3), 138-146

Redaksi, 2013, Laporan Khas Redaksi: Kandungan Permen Cinta Sama Dengan Vigra, Trans 7, Jakarta, 14 Februari 2013.

Setiawan, H., S. Esar, E. Sukarti, 2007, Analisis Sildenafil Sitrat dan Tadalafil Dalam Sediaan Jamu Kuat Pria Secara KLT-Densitometri, Universitas Widya Mandala, Surabaya.

Setiawan, H., S. Esar, E. Sukarti, 2012, Analisis Sildenafil Sitrat Dalam Sediaan Jamu Kuat Pria Secara KLT-Densitometri, Universitas Widya Mandala, Surabaya.

Skoog, D.A., and D. M. West, 1980, Principles of Instrumental Analysis, Thomson Higher Education, London, 848-851.

Thomas, G., 2000, Medicinal Chemistry, Jhon Wiley & sons, new York, 456-457

1

5