Penelitian Reseptor c-Met tirosin kinase inhibitor MP470 radiosensitizes sel glioblastoma James W Welsh * 1, Daruka Mahadevan2, Ron Ellsworth2, Laurence Cooke3, David Bearss4 dan Baldassarre Stea5 Alamat: 1Departmentr Radiasi Onkologi, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 1515 Holcombe Blvd, Houston, TX, USA,. 2Department Kedokteran, Universitas Arizona Cancer Center, 1515 Campbell Utara Avenue, Tucson, AZ 85724-5024, Amerika Serikat, 3University dari Arizona College of Medicine, 1501 Campbell Utara Avenue, Tucson, AZ 85724-5024, USA, Inc 4SuperGen, 4140 Dublin Boulevard, Dublin, CA 94568-7757, Amerika Serikat dan 5Department Radiasi Onkologi, University of Arizona Cancer Center, 1515 Campbell Utara Avenue, Tucson, AZ 85724-5024, Amerika Serikat Email: James W Welsh * - jwelsh@mdanderson.org; Daruka Mahadevan DMahadevan@azcc.arizona.edu; Ron Ellsworth - rellswo@email.arizona.edu; Laurence Cooke - lcooke@azcc.arizona.edu, David Bearss - david.bearss @ supergen.com; Baldassarre Stea - bstea@azcc.arizona.edu * Sesuai penulis Abstrak Tujuan: glioblastoma multiforme (GBM) adalah resisten terhadap terapi sitotoksik saat ini, sebagian karena perbaikan DNA ditingkatkan. Aktivasi reseptor tirosin kinase c-Met telah terbukti untuk melindungi sel-sel kanker dari kerusakan DNA. Kami berhipotesis bahwa menghambat cMet akan menurun ini perlindungan dan dengan demikian peka sel-sel tumor resisten terhadap efek dari terapi radiasi. Bahan dan metode: Delapan baris GBM sel manusia disaring untuk radiosensitivity ke kecil-molekul inhibitor c-Met MP470 dengan koloni-hitungan tes. Untai ganda (ds) DNA rusak (karena sinar radiasi) dihitung dengan menggunakan antibodi untuk gamma H2AX. Western blotting menunjukkan ekspresi RAD51, glikogen sintase kinase (GSK)-3, dan protein lainnya. Sebuah sisi tumor Tikus xenograft Model ini digunakan untuk dalam studi radiosensitization in vivo. Hasil: MP470 mengurangi c-Met fosforilasi dan ditingkatkan radiasi membunuh sel sebesar 0,4 log di SF767 sel. Sel pretreated dengan MP470 memiliki lebih ds kerusakan DNA dari sel diperlakukan dengan radiasi saja. Mekanis, MP470 ditunjukkan untuk menghambat perbaikan rusak dsDNA dan meningkatkan apoptosis. MP470 pengaruh berbagai kelangsungan hidup dan protein perbaikan DNA terkait seperti pAKT, RAD51 dan GSK3. In vivo, penambahan MP470 radiasi menghasilkan tumor-keterlambatan pertumbuhanpeningkatan rasio lebih dari 2,9 radiasi saja dan waktu kelangsungan hidup diperpanjang.

Kesimpulan: GBM adalah sebuah situs penyakit dimana radiasi sering digunakan untuk mengatasi kedua makroskopik dan penyakit mikroskopis. Meskipun upaya hasil eskalasi dosis tetap miskin. MP470, sebuah ampuh molekul kecil tyrosine kinase inhibitor c-Met, beberapa baris sel GBM radiosensitized baik in vitro dan in vivo, dan dapat membantu meningkatkan hasil bagi pasien dengan GBM.Pengantar Pengelolaan glioma ganas terus menimbulkan tantangan terapeutik sulit. Penggunaan terapi radiasi dan kemoterapi setelah tumor debulking maksimal dapat meningkatkan baik kontrol lokal dan kelangsungan hidup untuk beberapa pasien dengan glioma ganas [1]. Sayangnya, meskipun adju-vant terapi hampir semua pasien dengan glioblastoma multi forme (GBM) akhirnya akan mengembangkan kembali tumor dan mati dari penyakit. Pola-kegagalan studi con-menyalurkan setelah terapi utama untuk GBM telah menunjukkan bahwa 75% -90% dari pasien mengalami kekambuhan tumor dalam 2 cm dari margin reseksi [2]. Upaya untuk meningkatkan dosis radiasi lokal tidak menyebabkan setiap bermakna peningkatan dalam kelangsungan hidup saat diuji dalam percobaan acak [3]. Penyebab yang paling mungkin kambuh diyakini intrinsik radioresistance, dimediasi sebagian oleh yang efisien Perbaikan DNA. Hal ini menunjukkan bahwa intervensi yang bertujuan memodifikasi resistensi seluler radiasi atau chemother-APY dapat memberikan manfaat kelangsungan hidup. Faktor pertumbuhan hepatosit (HGF) adalah protein het-erodimeric multifungsi biasanya diproduksi oleh mesenchymal sel. Kegiatan pleiotropic Its dimediasi melalui cel-lular reseptor, suatu tirosin kinase transmembran dikodekan oleh proto-onkogen c-Met. Dalam sel-sel ganas, HGF telah telah ditunjukkan untuk melindungi sel dari kematian yang disebabkan oleh variabel-Ety merusak DNAagen, termasuk radiasi dan inhibitor topoisomerase [4]. Menariknya HGF / SF tidak hanya diblokir DNA kerusakan-induksi apoptosis tetapi juga meningkatkan laju perbaikan istirahat untai DNA [5]. HGF juga berfungsi sebagai faktor pertumbuhan autokrin atau parakrin dan mengaktifkan sebuah program disosiasi sel dan motilitas ditambah dengan peningkatan produksi protease yang telah ditunjukkan untuk mempromosikan invasi selular [6,7]. HGF dan c-Met adalah co-disajikan dan sering diekspresikan dalam spektrum yang luas dari spesifikasi-tumor padat manusia termasuk paru-paru, payudara, dan keganasan otak [7,8]. Oleh karena itu, overekspresi c-Met oleh sel-sel GBM menunjukkan bahwa memblokir HGF atau yang reseptor c-Met mungkin merupakan strategi yang menarik ketika dikombinasikan com dengan

pengobatan konvensional untuk pengobatan GBM. Sebuah tinjauan baru-baru ini menunjukkan bahwa pendekatan ini inhibitor baru sev-eral dari aktivitas tyrosine kinase dari c-Met telah dikembangkan dan diuji sebagai agen tunggal atau dalam kombinasi dengan kemoterapi sitotoksik [9]. Meskipun sebelumnya telah menunjukkan bahwa penargetan HGF atau c-Met ekspresi menggunakan radiosensitizers ribozim dalam sel GBM in vitro dan in vivo tumor xenograft [10], demonstrasi inhibitor klinis yang berguna dari kinase tirosin activ-dasarkan c-Met dikombinasikan dengan radiasi belum previ-menerus diuji dalam model GBM. Dalam karya yang disajikan di sini, inhibitor novel c-Met tirosin kinase, MP470 [11], diuji kemampuannya untuk radiosensitize sel GBM baik in vitro dan in vivo. Bahan dan metode Kultur sel Semua garis sel GBM manusia diuji (SF763, SF268, SF295, SF126, SF188, SF767, U-87, dan SF210) yang diperoleh dari University of California, San Francisco, dan dipelihara dalam Dulbecco yang Dimodifikasi Elang Menengah dilengkapi dengan serum janin anak sapi 10% dan 1% penicillin-lin-streptomisin [12]. Sel diinkubasi pada suhu 37 C dalam 5% CO2 inkubator. MP470 (Supergen, Dublin, CA) adalah disimpan dalam gelap pada 4 C sampai digunakan, ketika dilarutkan di sulfoxide dimetil dan digunakan pada konsentrasi akhir 5,0-10 uM. Obat itu ditambahkan ke sel 1 jam sebelum irra-diation kecuali dinyatakan lain. Kontrol sel diperlakukan dengan volume yang sama dimetilsulfoksida. Sebuah teleterapi cobalt-60 unit (Energi Atom Kanada Lim-ited Theratron-80) digunakan untuk menyinari sel-sel GBM di tingkat dosis 2 Gy / menit. Proliferasi sel uji Cytotoxicity dari MP470 dinilai secara in vitro di semua delapan baris sel dengan menggunakan uji MTS dilakukan dalam 96-baik Format piring. Sel dilapisi dengan multichannel pipet-ter dan MP470 (hingga konsentrasi akhir dari 5 M) adalah ditambahkan ke sumur rangkap tiga 24-48 jam kemudian, setelah itu piring diinkubasi sampai 4 hari. Pengujian MTS adalah dilakukan dengan 96 CellTiter your berair non-radioaktif Proliferasi Assay kit sesuai dengan memproduksi direkomendasikan-mendations (Cat # G5421, Promega, Madison, WI). Para IC50 (konsentrasi yang menghambat proliferasi di 50% dari sampel) ditentukan dari standar kurva. Uji in vitro clonogenic

Delapan jalur GBM sel manusia dikultur sebagai dijelaskan di atas, dipanen, dihitung, dan unggulan ke 60-mm cawan petri pada kepadatan sel tertentu. MP470 (5 M) ditambahkan 1 jam sebelum sel-sel diiradiasi dengan dosis dosa-gle berkisar 2-8 Gy, setelah sel-sel kembali ke 37 C inkubator dan dibudidayakan selama 14 hari di kehadiran MP470 sebelum fiksasi. Sel-sel yang larutan asam asetat: tetap selama 5 menit dengan metanol 03:01 dan bernoda selama 5 menit dengan kristal violet 0,5% (Sigma, St Louis, MO) dalam metanol. Koloni dihitung dengan koloni kontra Colcount otomatis (Optronix, Milton Port, Oxford, Inggris) dengan menggunakan modus koloni diskrit. Para fraksi yang masih hidup dihitung sebagai (rata-rata koloni jumlah) / (sel berlapis) (efisiensi plating), dimana pelapisan Efisiensi didefinisikan sebagai (rata-rata jumlah koloni) / (sel berlapis untuk kontrol tidak disinari). Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap dua dalam 3 percobaan independen dan berusia rata-titik data mewakili berarti standar deviasi-pertanyaan (SD). Radiasi Onkologi 2009, 4:69 http://www.ro-journal.com/content/4/1/69 Halaman 3 dari 10 (Nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan) Apoptosis uji Dekat-anak sungai SF767 sel pra-perawatan dengan 5 uM MP470 diiradiasi (8 Gy), dan dianalisis 4 jam kemudian sebagai berikut. Singkatnya, setelah perlakuan awal dengan MP470 selama 5 jam, sel disuspensikan dalam phosphate-buffered saline (PBS, dibuat dengan melarutkan 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, dan 0,24 g KH2PO4 dalam 800 mL H2O) (pH 7.2) yang mengandung akridin oranye (1 mg mL-1) dan RNAse A dan kemudian bersama-diwarnai dengan 1 mg mL-1 etidium bromida (Semua reagen dari Sigma), sel kemudian dicuci dan diperiksa di bawah mikroskop fluoresensi ( 150, OLYM-nanah, Pusat Valley, PA; menarik menyaring BG12, penghalang saringan 0-5,30). Untuk analisis kuantitatif, 200 sel dihitung dan persentase sel nekrotik dan apoptosis dihitung berdasarkan lated. -H2AX uji Beruntai ganda (ds) istirahat DNA menyebabkan pembentukan dari -H2AX, sebuah kompleks histon yang unik. Kami menggunakan -H2AX antibodi (Upstate Cat # 05-636, Millipore, Billerica, MA) untuk memvisualisasikan istirahat dsDNA sebagai berikut. Sel berlapis di slide ruang, tumbuh selama 48 jam, dan diperlakukan dengan 5 uM MP470, satu jam kemudian, sel-sel diiradiasi dengan 4 Gy dan diproses baik 1 jam atau 8 jam kemudian. Sel pertama tetap di paraformaldehyde 4% dan diinkubasi

dengan antibodi primer terhadap -H2AX. Utama antibodi kemudian dicuci off, dan antibodi sekunder konjugasi fluorescein isothiocyanate (FITC) adalah ditambahkan ke slide. Kerusakan DNA divisualisasikan dengan menggunakan confocal mikroskop. Intensitas rata-rata setiap sel dihitung menggunakan Photoshop dan uji t 2 sisi digunakan untuk menghitung perbedaan. Comet assay istirahat dsDNA divisualisasikan dengan menggunakan sebuah komet netral uji (Cat # 4250-050-K, Trevigen, Gaithersburg, MD). Sel yang disebar pada 10-cm Pelat your Budaya Falcon BD (BD, Franklin Lakes, NJ), diinkubasi selama 2 hari, diperlakukan dengan 10 uM MP470 atau dimetilsulfoksida (kontrol) untuk 1 jam, dan kemudian diiradiasi dengan 8 Gy. Sel kemudian trypsinized, ditempatkan pada slide kaca, dan mengalami elec-trophoresis sesuai dengan instruksi produsen. dsDNA istirahat diukur dengan gerakan ekor zaitun, (OTM), didefinisikan sebagai (panjang ekor) (fraksi dari total DNA dalam ekor) [13]. OTM nilai dihitung dengan TriTek Komet Skor V 1,5 perangkat lunak (The TriTek Corpora-tion, Sumerduck, VA). Titik data mewakili berarti SD dari percobaan rangkap tiga. Western blotting Sel yang disebar pada 10-cm piring petri dan tumbuh selama 24-48 jam. MP470 kemudian ditambahkan pada konsentrasi 10 uM (dalam 100 dimethlysulfoxide%) untuk maksimum inhibi-tion. Sel diinkubasi dengan MP470 selama 24 jam (Kecuali ditentukan) sebelum diiradiasi dengan 4 Gy. Setelah iradiasi, sel-sel yang segaris pada pelat oleh add-ing 350 uL buffer lisis dodesil natrium sulfat (20 mM HEPES [pH 7,9], 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethylsulfo-nyl fluorida, 1 mg / mL aprotinin, 1 mg / mL leupeptin, 250 mg / mL benzamide, 50 mM NaF, dan 1 mM NaO3V4). Para lisat dipindahkan ke tabung microcentrifuge 1,5 mL, direbus selama 5 menit dengan vortexing intermiten, dan kemudian disentrifugasi selama 5 menit pada 10.000 rpm, setelah itu supernatan dipindahkan ke microcentrifuge baru tabung. Lisat menjadi sasaran elektroforesis pada 10% -20% HCl pra-menuangkan gel (Cat # 161-1108, Bio-Rad, nya-Cules, CA). Protein yang kemudian dipindahkan ke nitrocel-lulose kertas dan diselidiki dengan antibodi yang sesuai di bawah kondisi yang direkomendasikan oleh para pemasok. Para

antibodi berikut digunakan phospho-Akt (473 Ser Cat, # 4058), glikogen sintase kinase (GSK)-3 dengan Phospho-GSK-3 (Ser9, # 9336) your Signaling Technol-ogy, Danvers, MA), RAD51 H-92 (Santa Cruz Biotechnol-ogy, Santa Cruz, CA) dan c-Met phosphospecific Anti-c-Met [pY1003 ] (your Signaling Teknologi) [14]. siRNA percobaan siRNA ke c-Met (sc-29397) dan kontrol siRNA (sc-37007) yang dibeli dari Bioteknologi Santa Cruz. Para transfeksi reagen Lipofectamine berasal dari Invitrogen (Carlsbad, CA). U87 sel tumbuh 70% pertemuan dan transfected dengan siRNA pada konsentrasi akhir 100 nM. Tujuh puluh dua jam kemudian, sel-sel segaris barat-Ern untuk analisis blotting seperti dijelaskan di atas. Hewan percobaan Untuk membuat tumor subkutan, sel-sel (4 106 per hewan) ditanamkan di sisi-sisi 32 outbred telanjang athymic tikus, 8 per lengan (Taconic, Germantown, NY). U87 sel dipilih untuk tingkat tinggi dari c-Met ekspresi dan kemampuan untuk cepat menghasilkan tumor. Dua puluh lima hari setelah sel-sel disuntikkan, hewan-hewan itu pasangan-cocok (berdasarkan pada volume tumor) dan ditugaskan ke salah satu dari empat perlakuan kelompok: kontrol; MP470 (60 mg / kg) saja; radiasi saja (2 Gy per hari x 10 hari), dan MP470 + radiasi. MP470 disampaikan setiap hari oleh gavage dengan dosis 60 mg / kg pada minyak kacang mulai hari berturut-turut 25 untuk 14 hari. Radiasi dimulai pada hari 27 dan terdiri dari 2 Gy per hari dikirim ke tumor dengan irradiator kobalt-60 (Theratron-80). Radiasi itu disampaikan sehari, 5 hari per minggu untuk 2 minggu, pada 1 jam setelah pengobatan MP470. Total dosis kumulatif dikirim ke tumor dengan demikian 20 Gy. Hewan eutanasia oleh sesak napas CO2 ketika volume tumor mencapai 2.000 mm3, seperti yang dipersyaratkan oleh kami hewan kelembagaan komite perawatan dan menggunakan protokol # 07-029. Semua hewan sisanya eutanasia pada hari 48. Tumor diukur dengan kaliper setiap 5 hari dan Radiasi Onkologi 2009, 4:69 http://www.ro-journal.com/content/4/1/69 Halaman 4 dari 10 (Nomor halaman bukan untuk tujuan kutipan) volume dihitung menurut rumus (a2 - b / 2), di mana a adalah diameter terkecil dan b adalah yang terbesar diam-eter dari tumor. Keterlambatan pertumbuhan tumor dinyatakan dalam mutlak dan tidak-malized istilah sebagai berikut.

Pertumbuhan mutlak penundaan (AGD) didefinisikan sebagai jumlah hari untuk tumor di radhiyallahu-asi-satunya dan MP470 + kelompok radiasi untuk mencapai 1.500 mm3 dikurangi jumlah hari untuk tumor di kelompok kontrol untuk mencapai ukuran yang sama. Normalisasi pertumbuhan penundaan (NGD) dihitung sebagai jumlah hari untuk tumor pada kelompok-terapi kombinasi untuk mencapai 1.500 mm3 dikurangi jumlah hari untuk tumor pada kelompok MP470-satunya untuk mencapai 1.500 mm3. Faktor peningkatan kemudian ditentukan dengan membagi NGD untuk kelompok menerima MP470 radiasi ditambah oleh AGD untuk kelompok diberikan radiasi saja. Semua analisis statistik dilakukan dengan Stata 9.2 untuk Windows (College Station, TX), dan Nilai P