June 15, 2014© 2001 - Fernán Agüero Análisis y anotación de genomas Fernán Agüero.
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April 10, 2023 © 2001 - Fernán Agüero
Análisis y anotación de genomas
Fernán Agüero
April 10, 2023 © 2001 - Fernán Agüero
Historia
• Primer proyecto de secuenciación de un genoma: Escherichia coli (US + Japón). Comenzó en 1992 y terminó en 1997. 4.6 MB
• Primer genoma (eubacteria): Haemophilus influenzae (1995). 1.83 MB
• Primer genoma (archaea): Metanococcus jannaschii (1996). 1.6 MB
• Primer genoma (eukarya): Caenorhabditis elegans (). XXX MB
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Qué es un genoma?
• Una colección de– genes
• que codifican productos proteicos• que codifican RNAs
– pseudogenes– regiones no codificantes
• regulatorias (expresión)• estructurales
– attachment a matriz nuclear– mitosis / meiosis– elementos repetitivos
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Qué es anotar?
• Agregar información, de la manera más confiable y actualizada que se pueda para describir una secuencia
• Información asociada a coordenadas
genómicas (comienzo..fin), a distintos
niveles
• Interpretar la información cruda de secuencia en un marco biológico
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Anotación genómica
• Dos niveles de anotación– Estructural: encontrar genes y otros sitios con
relevancia biológica. Armar un modelo del genoma: cada gen/sitio es un objecto asociado a una posición en el genoma
– Funcional: los objetos son utilizados en búsquedas (y experimentos). El objetivo es atribuir información biológica relevante a los objetos.
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Más niveles de anotación
• Organismo: fenotipo: morfología, fisiología, comportamiento, respuestas ambientales
• Celula: vías metabólicas, cascadas de señalización, localización subcelular.
• Molecula: sitios de binding, actividad catalítica, estructura tridimensional
• Dominio
• Motif
• Residuo
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De donde proviene la anotación?
• Fuentes utilizadas en la anotación:– publicaciones que reportan nuevas secuencias
– reviews que actualizan periódicamente la anotación de familias o grupos de proteínas
– expertos externos
– análisis de secuencia
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Anotación genómica
transcription
RNA processing
translation
AAAAAAA
Genomic DNA
Unprocessed RNA
Mature mRNA
Nascent polypeptide
folding
Reactant A Product BFunction
Active enzyme
ab initio gene prediction
Functional identification
Gm3
Comparative gene prediction
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Annotation & functional genomics
Gene Knockout
Expression Microarray
RNAi phenotypes
proteome based functional genomics
La anotación del genoma es esencial en el desarrollo de estrategias funcionales (functional genomics)
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Anotación: busqueda de genes
• Buscar genes en el genoma– RNA
• ribosomal RNAs BLASTN• tRNAs tRNAscan
– protein coding• ab initio gene prediction ORFs, codon usage, frecuencia de
hexámeros, modelos, etc.)• similarity BLASTX, otros
• Buscar regiones no codificantes– regulatorias
• ab initio Gibbs sampling• similarity patterns, profiles
– repetitivas• similarity• ab initio
• En todos los casos literatura!
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Integrar resultados
Secuenciagenoma
BLASTX
BLASTN
RepeatMasker
tRNASCan
gene prediction
DB
flatfiles
Visualización
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Genome annotation: C. elegans
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Resumir resultados de análisis
• Guardar el reporte crudo de un BLAST (lista de hits, alineamientos) es demasiado
• Prácticamente cualquiera de los análisis que se realizan sobre DNA o proteínas para anotar un genoma pueden resumirse en:– secuencia start end– cromosoma1 1723 3456
• Este formato básico es la base del formato GFF (Sanger)
secuencia metodo programa start end frame score extra
Contig1 similarity blastx 100 1000 +1 132 gi|12345|AF34093 casein kinase ...
Contig1 cds glimmer 85 1201 +1 1321 ORF0001; overlap with ORF0002
Contig1 similarity blastn 80 1300 . 136 gi|54321|AF09990 complete genome
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Anotación: herramientas
• Artemis– http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis
– Permite visualizar• secuencia, con sus traducciones virtuales (6)• tracks de anotación (entries)• plots (built-ins y creados por el usuario)
– Lee secuencias en formato FASTA, EMBL, GenBank– Lee features en formato EMBL, GenBank, GFF,
MSPcrunch, BLAST
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Artemis: main window
Feature list
Sequence view
Sequence view
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Artemis: plots
%GC plot
AA properties plot para un CDS
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Artemis: display de análisis
Frameplot
BLASTX
BLASTN
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Artemis:
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Artemis: zoom
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Artemis: spliced genes
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Artemis: comparar análisis
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Otras estrategias
• Artemis se usa para anotar genomas bacterianos o para pequeños proyectos (cósmidos, BACs, etc.)
• En genomas más grandes, la tendencia es a distribuir la anotación
• Los tracks de anotación son generados en distintos centros
• Ejemplo: UCSC Genome Browser (genoma humano, ratón).
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Anotación automática: TrEMBL
• La anotación de TrEMBL (translated EMBL) se hace por métodos automáticos.– Requerimientos para anotar automáticamente
• Una base de datos de referencia bien anotada (ej.
Swissprot)
• Una base de datos que sea altamente confiable (en el
sentido diagnóstico) en la asignación de proteínas a
grupos o familias (ej CDD, InterPro)
• Una serie de reglas de anotación
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Transferencia directa de anotación
• Realizar una búsqueda en la base de datos de referencia y transferir la anotación
• Ejemplo: FASTA contra una base de datos de secuencias y transferencia de la línea DE del mejor hit
TargetTarget
XDBXDB
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Anotación a partir de múltiples fuentes
• Generalmente se usa más de una base de datos externa
• Hay que combinar los resultados
TargetTarget
XDBXDB
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Conflictos
• Contradicción
• Inconsistencia
• Sinónimos
• Redundancia
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Traducción de anotaciones
• Es necesario utilizar un traductor para mapear el lenguaje utilizado en la base de datos externa (XDB) al lenguaje utilizado en la base de datos target que queremos anotar
TargetTarget
XDBXDB
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Traducciones: algunos ejemplos
ENZYME TrEMBL CA L-ALANINE=D-ALANINECC -!- CATALYTIC ACTIVITY: L-ALANINE=CC D-ALANINE.
PROSITE TrEMBL/SITE=3,heme_ironFT METAL IRON
Pfam TrEMBL FT DOMAIN zf_C3HC4FT ZN_FING C3HC4-TYPE
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Requerimientos de un sistema de anotación automática
• Corrección• Escalable• Actualizable• Poco redundante• Completo• Vocabulario controlado
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Cómo funciona?
• Una proteína en TrEMBL es reconocida como un miembro de cierto grupo o familia de proteínas
• Este grupo de proteínas en Swissprot comparten entre sí partes de la anotación
• La anotación común es transferida automáticamente a la proteína en TrEMBL y marcada como ‘annotated by similarity’
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Anotación: evidencias
• Las anotaciones suelen estar acompañadas de TAGS que indican la evidencia en la que se basa la anotación
• Ejemplos de algunos TAGS utilizados en TrEMBL:– EMBL: la información fue copiada del original (EMBL/GenBank/DDBJ)– TrEMBL: anotación modificada para corregir errores o para adecuarse a
la sintaxis propia de Swissprot– Curator: juicio del curador– Similarity: por similitud con otra secuencia, a juicio del curador– Experimental: evidencia experimental de acuerdo a una referencia, que
usualmente es un paper.– Opinion: opinión emitida por el autor de una referencia, usualmente con
poca o ninguna evidencia experimental– Rulebase: información derivada del uso de una regla de anotación
automática– SignalP: programa de predicción
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Anotación: manual vs automática
• La anotación de un genoma ocurre en etapas– anotación automática
• correr todos los análisis sobre el genoma• generar un primer borrador con todos los datos
organizados. Por ejemplo en páginas web o integrando todos los datos en un display unificado (Artemis)
– anotación manual: cura de los datos• una persona (curador) revisa la anotación, gen por gen,
verificando la anotación automática, agregando anotaciones manuales, corriendo eventualmente algún programa particular
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Qué herramientas se usan?
• Oakridge Genome Annotation Channel– http://compbio.ornl.gov/channel
• ENSEMBL– http://ensembl.ebi.ac.uk
• Artemis– http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis
• GeneQuiz– http://www.sander.ebi.ac.uk/genequiz
• Genome browsers: varios– cada consorcio/proyecto desarrolló el suyo: Apollo
(FlyBase, Drosophila), AceDB (C. elegans),
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Anotación: fuentes de error
• Transferencia transitiva de anotaciones– gen1 mal anotado como ‘casein kinase’ presente en
los bancos de datos– gen2 con alta similitud con gen1, resulta anotado
como casein kinase
• Solución:– usar bases de datos curadas: por ejemplo Swissprot– revisar la anotación de más de un hit– verificar que las anotaciones de todos los hits
concuerden
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Anotación confiable: proyecto HAMAP
• High-quality Automated Microbial Annotation of Proteomes– Swissprot (Swiss Bioinformatics Institute-European
Bioinformatics Institute)– CNRS Lyon– INRIA Grenoble– INRA Toulouse– CNRS Marseille– Pasteur Institute
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HAMAP
• Hay muchos genomas bacterianos terminados, pero va a haber muchos más en los próximos años
• El número de proteínas bacterianas proveniente de estos genomas llegará al millón muy rápidamente
• Pero el análisis funcional y una caracterización detallada van a exsitir sólo en unos pocos casos:– todas las proteínas de organismos modelo (E. coli, B.
subtilis)– proteínas involucradas en patogénesis (interés médico e
industrial)– proteínas involucradas en vías metabólicas específicas
(interés biotecnológico)
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Prioridades del proyecto HAMAP
• Anotación de proteínas huérfanas• Pre-anotación de proteínas pertenecientes a
familias grandes/complejas (transportadores ABC, HTH, sistemas de dos componentes, SDH)
• Anotación de alta calidad de proteínas pertenecientes a familias bien caracterizadas
• Anotación manual de proteínas caracterizadas experimentalmente en ese organismo
• Anotación manual de proteínas no caracterizadas que muestren similitud con otras proteínas
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Estrategia HAMAP
ORFans
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HAMAP: ORFans
• No tienen similitud con otras proteínas (excepto tal vez otras proteínas de organismos muy cercanos)
• No tienen hits contra InterPro (Prosite, PRINTS, Pfam, ProDom, SMART)
• Qué se hace:– Predicción de señales – Predicción de regiones trans-membrana– Predicción de coiled-coils– Anotación de repeticiones
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HAMAP: ORFan antes
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HAMAP: ORFan después
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HAMAP: large/complex families
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HAMAP: anotación automática
• Transferencia automática de anotación– Usando reglas específicas para cada famila de
proteínas– Usando reglas específicas para un organismo
particular
• La transferencia de anotación puede ir acompañada de advertencias para el curador– Por ejemplo:
• WARNING: this genome contains MF_00031 (ruvA) but not MF_00016 (ruvB)
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HAMAP: ejemplo reglas
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HAMAP: Escherichia coli
• De acuerdo al análisis original: 4286 proteínas
– 60 proteínas no detectadas (casi todas < 100 aa)– 120 muy probablemente no existan– 50 pares o tripletes de ORFs tuvieron que ser
fusionados– 719 con errores en la asignación del codón de inicio– ~1800 todavía sin caracterización bioquímica
(aproximadamente una asignación funcional por semana)
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Chromosome browsers
• UCSC Genome Browser– provee un display rápido de cualquier región genómica– con varios “tracks” de anotación alineados al genoma– Por el momento sólo: Human & Mouse
• Annotation tracks– genes conocidos (RefSeq, GenBank)– predicted genes (Genscan, FGENESH, GeneID, Acembly)– spliced ESTs– CpG islands– assembly gaps– cobertura– bandas cromosómicas– elementos repetitivos – etc
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UCSC Genome browser
• UCSC sólo genera la mitad de los tracks• El resto proviene de la comunidad biomédica
• El Genome Browser es una herramienta de visualización
• No saca conclusiones! Simplemente integra en forma gráfica toda la información que posee sobre una región, dejando la exploración y la interpretación al usuario.
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UCSC Genome Browser: gene expression
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UCSC Genome browser: alternative splicing
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UCSC Genome browser: complex transcription
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UCSC Genoma browser: user tracks
• Ustedes pueden agregar sus propios tracks• Pueden ser públicos o privados• No necesitan saber programar• Tienen que proveer información en formato
GFF (u otros similares: GTF, BED)
chrom start end [name strand score]
chr1 1302347 1302357 SP1 + 800
chr1 1504778 1504787 SP2 – 980
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Acknowledgements
• Nicola Mulder, EBI• Daniel Lawson, Sanger Centre