Hugo, A. A. 2007. Tesis Doctoral Capacidad probiótica de la cepa CIDCA 133 (Lactobacillus delbrueckii subsp lactis): un recorrido desde modelos in vitro a in vivo

Kakisu, E. 2010. Tesis Doctoral. Desarrollo y optimización del proceso para la elaboración de leches fermentadas con microorganismos aislados de gránulos de kefir con características tecnológicas y probióticas definidas.

Hugo, A. A.; Kakisu, E.J.; De Antoni G.L y Pérez, P.F. 2008. “Lactobacilli antagonize biological effects of enterohaemorrhagic Escherichia coli in vitro”. Trabajo publicado en Letters in Applied Microbiology. 46: 613-619.

Kakisu, E; Abraham, A. G; Tironi Farinati, C, Ibarra, C y De Antoni, G.L. Lactobacillus plantarum isolated from kefir protects from damage induced by shiga toxin type II- produced by enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Trabajo en prensa en el Journal of Dairy Research.

INTERACCIÓN DE LACTOBACILOS PROBIÓTICOS

CON Escherichia coli ENTEROHEMORRÁGICA

•“Los probióticos son microorganismos vivos que administrados en cantidades apropiadas confieren un beneficio en la salud del hospedador” (FAO y WHO, 2001).

• Generalmente se trata de bacterias de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium.

• El género Lactobacillus conforma un grupo heterogéneo de microorganismos, perteneciente al grupo de las bacterias ácido lácticas (BAL).

• La cepa CIDCA 133 (Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis) constituye un aislado de leche cruda. La cepa CIDCA 83114 (Lactobacillus plantarum) constituye un aislado de gránulos de kefir. Ambos pertenecen al grupo de lactobacilos homofermentativos.

PROBIÓTICOS

¿Qué hacen los probióticos?

PROBIÓTICOS

Inmuno modulación

Alivio de alergia

alimentaria

Mejora de la rta

inmune innata

Normalización de la microbiota

intestinal

Resistencia a la colonización

Supresión de patógenos

Efectos metabólicos

Deconjugación y secreción de sales biliares

Hidrólisis de lactosa

Mejora de la tolerancia a la lactosa

Disminución de las reacciones químicas mutagénicas a nivel

intestinal

Reducción del riesgo de cáncer de

colon

Fuente de SCFA y vitaminas

Balance de la rta inmune

Control de la inflamación intestinal

Disminución del colesterol

Interacción entre lactobacilos probióticos y E. coli EHEC: modelos in vitro

• E. coli enterohemorrágica (EHEC) es un conjunto de cepas patógenas que producen diarrea, colitis hemorrágica (CH) o síndrome urémico hemolítico (SUH) en el hombre.

• El SUH complica el 10% de los casos de infección por E. coli EHEC, con una tasa de mortalidad entre el 2-10%, siendo los niños menores de 5 años especialmente susceptibles

• En Argentina el SUH es endémico con aproximadamente 300 nuevos casos anuales reportados.

• La transmisión de EHEC se realiza principalmente través de alimentos contaminados con materia fecal, particularmente de origen bovino.

Epidemiología

Principales factores de virulencia de EHEC

Shiga toxinas Región LEE

TTSS Tir Intimina

Lesión A/E

Stx1 Stx2

Interrupción de la síntesis proteica

Patogenia

Células Vero

Células Hep-2

Diseño experimental

EHEC 0157:H7 (Stx2+;eae+)

y/o sobrenadantes

+ Lactobacilos

Daño celular

Efecto de sobrenadantes de EHEC sobre células Vero

Concentración de sobrenadante de EHEC

Po

rce

nta

je d

e c

élu

las

sob

revi

vie

nte

s

0

20

40

60

80

100

120

140sn EHEC 133 GEN+sn EHEC LBR GEN+sn EHEC control

a

b

a a

b

a

b

a

b

a

bb

1/5 1/30 1/180

Rojo Neutro

La presencia de la cepa CIDCA 133 (Lb delbrueckii subsp lactis) protegió

a las células Vero del daño provocado por los sbdtes de EHEC.

Las células coincubadas con la cepa LBR, (Lb delbrueckii subsp.

bulgaricus) mostraron un daño semejante al control.

Efecto de sobrenadantes de EHEC sobre células Vero

Por

cent

aje

de L

DH

libe

rado

0

5

10

15

20

25

30

a

b

b

b

c

inactiva

viable

paredes

Per

cen

tag

e L

DH

rel

ease

0

5

10

15

20

25

30

* *

sn EHEC

sn EHEC

Kakisu et al, 2012 (en prensa)

CIDCA 114

Paredes

LDHLb delbrueckii subsp lactis (CIDCA133) Lb plantarum (CIDCA 83114)

El efecto protector de los lactobacilos se verifica tanto con la bacteria entera, como

con sus paredes.

Efecto de sobrenadantes de EHEC sobre células Vero

Pe

rce

nta

ge

LD

H r

ele

as

e

0

5

10

15

20

25

30

*

*

1 2 3 4

94

67

43

3026.9

20.116.9

14.4

6.5

SN EHEC

Paredes de Lb plantarum

100 ºC

Prt KPep

α QuimP

Trip

SN EHEC + paredes

SN EHEC VLMW LMW

Paredes con tratamiento térmico y enzimático

LDH

SDS-PAGEPéptidos termosensibles de la superficie celular de Lb. plantarum CIDCA 83114 intervienen en la

captura o proteólisis de la Stx 2Kakisu et al, 2012 (en prensa)

Interacción de E. coli EHEC y lactobacilos con células Hep-2

EHEC

133 114

LBB LBR

133 UV

114 UV

control

Cristal violeta

Hugo et al, 2010

200X

200X

EHEC en sobrenadante

133 + EHEC en sobrenadante

MGG

Lb . delbrueckii susp lactis (CIDCA 133) y Lb. plantarum (CIDCA 83114)

protegieron las monocapas tratadas con EHEC resuspendida en su sobrenadante.

Control

Control

133 + EHEC

114 + EHEC

EHEC

EHEC

2500X2500X2500X

1000X1000X1000X

Microscopía electrónica de barrido (MEB)

Hugo et al, 2010

blebsMLP

EHEC

Log

(U

FC

/ml)

1e+3

1e+4

1e+5

1e+6

1e+7

EHEC en sn 133 + EHEC en sn

EHEC 108 EHEC 107EHEC 106

a a

bb

c

d

Interacción de E. coli EHEC y lactobacilos con células Hep-2

Asociación de EHEC a células Hep-2 en

presencia de la cepa 133

La disminución de la asociación de EHEC no sería el mecanismo que explica la

protección que ejerce el lactobacilo sobre las células

eucarióticas

CONCLUSIONES

• Los lactobacilos CIDCA 133 y CIDCA 83114 fueron capaces de antagonizar el efecto biológico de los distintos factores de virulencia de E. coli enterohemorrágica (EHEC) sobre células Vero y Hep-2.

• La viabilidad de los lactobacilos no es necesaria para ejercer el efecto protector tanto sobre la acción de la Shiga toxina en las células Vero como sobre la acción combinada de EHEC y su sobrenadante sobre las células Hep-2.

• La capacidad de ejercer un efecto antagónico sobre la Shiga toxina reside en las paredes del lactobacilo y estaría asociada al secuestro o proteólisis por parte de un componente proteico.

• El efecto protector observado en los sistemas ensayados no es una propiedad inherente a todos los lactobacilos sino que es cepa dependiente.

• La protección observada en las células Hep-2 infectadas con EHEC no se debe al desplazamiento del patógeno por el lactobacilo.

MUCHAS GRACIAS

POR SU ATENCIÓN