LJ’F

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RIA

EA

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OLISI

ENZIM

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TTOSIO

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nergiae

InnovazioneD

ipartimento

Processi

Chim

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Materiali

Centro

Rtcerche

Energia

Casacia,

Rom

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G.

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AFO

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Ospiti

EN

EA

Ahsi

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1oreato

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Hchtainc

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nr r

i le11 m

til

iu

man

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olnpaid

itIP

enz

‘me

ntac

cdi

yster’or

oth

e

hocataly

stsT

hus,m

ar

atternptslw

veboen

made

todesign

anduse

newtypes

ofbiorcaetor

sytem

sin

ordertu

improve

perforinanceand

toep

han

c

PI oductiv

it3

Mem

branehioreactors,

ohtainedbv

phisicalim

mnbiliiatio

nO

bìncatalystsin

polymeric

nein

hran

esupport

offersuch

practicaiad

van

taes

ascontinuous

separationand

trasformation

processw

th10w

roduct

inhibition,suitable

hydiaulicconfiguration

(backflushingreeyciing,

ultrafiltrating).S

pecificm

embrane

modu!es

Am

iconV

itaFiber),

forbioreactoi

applicationsare

comm

ercialized,j3-galctosidase

enzyme

hassuccesfully

been

imm

obilizedin

ahollow

fiberand

ina

ceiamic

rnodulesio

hydroiizeiactose

in

waste

whey.

The

generaiproblem

ofthe

waste

whey

treatment

isconsidered

by

differentpoints

ofview

:environm

entalpollution

andincrease

ofproduct

quality.In

thistechnical

reportm

epresen

tdthe

geneialproperties

and

perform

ances

(perrneability.w

ashingprocedures.

idraulicco

nfig

uratio

ns

physicalndc1ie

niic

al

properties)of

hoth,polvm

ericand

ceramic,

supports

theenzym

ekinetic,

itsphisical

andeo

a1en

tim

mobilization

rnathematic

model

ofthe

bioreaciorand

online

morneoring

ofthe

process

Riassu

nto

Ibioreattori

am

embrana.

ottenutiper

imm

obilizzazionedi

enzimi

o

cellulein

supportipolim

erici(m

embrane)

oinorganici

offronom

oltivantaggi

rispettoai

processiin

batch.C

onsentonodi

accoppiareun

processoseparativo

conuna

trasformazione

enzimatica

iiicontinuo,

riducendoin

talm

odogh

effettodi

inibizioneenzim

aticada

prodotto.I

bioreattoriconsentono

inoltre

unavasta

sceltadi

configurazioniidrauliche

perottenere

Uottim

izzazionedel

processo.L

osviluppo

delbioreattore

richiedeun

adeguatom

etododi

imm

obilizzazionee

lacorrelazione

frapaiam

etricinetici.

chimico

fisicie

idrodinamici,

Moduli

am

embrana

polirnerica,com

ele

fibrecave

asinimetriche

sonocom

mercializzate

anchecom

esistem

ireattoristici

dalaboratorio

(Am

icon

Vitafiber).

Oggetto

diquesto

lavoroe

l’idrolisidel

lattosionel

sierodi

lattecon

un

bioreattorea

mem

branaad

attivita’lattasica

nelquadro

deiproblem

apiu

generaledel

trattamento

diquesto

effluentedell’industria

iatierocasearia.

Lenzim

ab-galattosidasi

e’stato

imm

obilizzatosu

duedifferenti

supporti:uno

polirnerico(polisolfone)

el’altro

inorganico(allum

inaLIn

questorapporto

vengonoconsiderate

leproprieta’

generalidi

entiambi

isupporti

(permeabilita’,

configurazioniidrauliche,

proceduredi

lavaggioe

ste

Iiiz

zaL

ione\

lacinetica

dell’enzima

utilizzatoFi

suanvnobilìzz

izFineie

acovalente,

ilm

odello

IPi

em

rt’c1

Ioratj

eil

run,

,rgg,

oI

dep

C-

iaiii

n

i.1N

TR

OD

LZ

ION

E

liIii

pro

cess’in

LiU

tIF1U

i.2im

mnbill7zazinne

tnzn

na:ica

13

Processi

separativia

mem

han

i1.4

Industriaagroalim

entaretino

azine

1c.ogi

rct

ne

1.5F

razionamento

deisiero:

Procr’;sc

n’te

gra

toa

:iiacto

zero

i6

Materiali,

metodi

erru

men

iazon

e

17

Bibliogiafia

2S

UP

PO

RT

IE

MO

DU

LI

AM

EN

IBk

NA

2.1B

arriereceram

iche2

Mem

branea

fibrecae

OIi5O

lm

ichea.3

Schem

adel

processoe

appatecchiaturedi

2.4P

ermeabilitadi

mem

brana2

qR

igen

era

zio

ne

este

rIiiz

az

ne

‘lem

)dul

2.6C

onclusioni2.7

Bibliografia

3L

AG

AL

AT

TO

S1D

AS

I

3.1M

eccanismo

direazione

3.2F

ontidella

f3-galartosidasi

3.3L

acinetica

della[3

gala

ttosid

asi

3.4D

eterminazione

dell’attix’it’en

zjmatca

3.5D

eterminazione

dellecostanti

cinetichc3

6E

ffettodello

kne

calciosull’a

tivi

ciziin

at

ca

4JM

’!OB

ILIZ

Z\J1

OY

EFJ’%

ZIM

AT

ICA

SUF

IBR

AP

OL

1ME

RIC

A

ila

idii

nn

iob

ilinaz

oe

cui

m6v

i.11egam

eco

alentc

4i.2

Crossiinking

41.3

AdN

oiiiimeuto

4.14

Intrappoiamento

4.1.5im

mobilizzazione

dellaf3-galattosdasi

4.1.5.1Im

mobiiziazione

conaliuinina

41.5.2

irnrnobilizzazioncper

reticolazione4.2

kastazionjdel

bioreattorelattasico

4.2.1T

empo

divita

medio

delbioreattoie

4.2.2E

ffettodel

caricamento

enzimatico

4.2.3E

ffettodella

concentrazionedi

substrato4

24

Effetto

dellaportata

sullaconversione

42.5

Effetto

termico

4.26

Impiego

deisiero

dilatte

-1.3C

onclusioni4

4B

ibliogiafia

5M

OD

EL

LO

MA

TE

MA

TIC

OD

EL

BIO

RE

AT

TO

RE

5.1T

empo

diperm

anenzadegli

elementi

difluido.

25

2M

odellom

atematico

econfronto

conidati

sperimentali

45

53

Determ

inazionedello

stadiocontroliante

6IM

MO

BiL

IZZ

AZ

ION

EE

NZ

IMA

TIC

ASU

BA

RR

IER

EC

ER

AM

ICH

E

61

Imm

obilizzazioneenzim

atica6.1.1

Procedura

diim

mobilizzazione

6.1.2C

ontrollodellilnm

ohilizzazione6,

.3Influenza

deilimm

obihzzazionesulla

permeabiiita4

6.2T

empo

diresidenza

em

odellofluidodinam

ico6

3P

resta»tmt

delbicn’eatto,c

63

1C

’wvcsione

ev

eìcitadi

produzioneffe

od

elio

ri,i

v‘

rclet

nrlla-n

piv

nll(S

i..4

.1Q

ua’niti

“11cm: le

di%

bfl1

flIa

-a

Cneto

a..;

C’incavain

batchdella

[3galaunidasi

o..

2C

nfrontodelle

costanti cinetichtin

bali

i. reiie

ttci

6.5C

onfrontofra

supportipolisolfonici e

ceramici

65.1Perm

eabilita’ di mem

brana6.5

2P

arametridi processo

6.6C

onclusioni6.7

Bibliografia

7SV

ILU

PPOD

IB

1OSE

NSO

RI

PE

RIL

CO

NT

RO

LL

OIN

LIN

EA

DE

L

PRO

CE

SSO

7.111sistem

abiosensore

7.2B

iosensoria

glucosioe

lattosio7.3

Sistema

elettrochimico

dim

isura

7.4Interferenze

chimiche

7.5Procedim

entodiim

mobilizzazione

enzimatica

7.6FIow

lnjectionA

nalysis(H

A)

7.7R

igenerazionedel tam

pone7.8

Autom

azionedel

sensore

7.9C

onclusioni7.10

Bibliografia

leat

it‘n

‘T

iT

e

PJOiJ

iì(’

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e‘e

oebaeree

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il

1te.

C5

3t

migliorare

iroce

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Arecu

peitelie

materie

prime

seco

nu

e,

Bioreattori

ebose

nso

iii’

‘4stC

’OFT

LcJV

1rtuitturalrnente

eoperativam

enteci itici

pciC

LII

debit. d

ue

‘inaetcvulc

srorzo

dlricerca

peressere

concretamente

apphcatia

citurIm

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hacercato.

inquesto

ararm

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Ironderae

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ereiteid

isciplin

rredi

coinvolgerecli

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51

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“Bioeatalizzato

era

ecce,e’

ecnr’

eam

ica/Io

ni

‘_

‘a’rnate

distudio.

seminari

coinvu!genPo

ma

viaen

1n

t,‘r’hbiic

ditic

eca

eie

principali

universita’Italiane

(Universi.ia

diPa

ma

:E.

i:.;eaze,M

cianaiic

cig

na

e

L’A

quila).F

rai

docentid

irettanen

terin

voli

nIl

ii d’ere

iui

bwcaù

lizzatuii

citiamo,

ringiaziandoliper

illi

roaleziosissinie

eiiri

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ella,il

Prof,

Bec

ar,

ilP

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assetti,il

Proi.

PalP

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Piof,

Fronnili

IP

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ascini,il

Dr,P

alleschi,il

Prof,V

iolante,il

irof.A

viglianoIl

Prof.M

iianda,L

’oggettodel

piesentelavoro.

svoltosm

erimcnttdniente

piessoi

iaboratoiiE

NE

A,

CR

EC

asaccia.A

reaInnovazione

Tecnologica.

Dip

aitimen

toP

rocessi

chimici

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ateriali,P

rogettoF

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svolgimento

disei

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Chim

ica,C

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cienzeB

iologiche.li

rapportocon

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particolarecon

ilaureandi

estato

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estim

olointellettuale

eW

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eniotiv’per

lari erca

Un

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particolaieal

Dott

Claudio

Iahiani

(EN

E/)

che

conla

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supe-

ision’a

on

seniifl

sviu

pd

lan

ceica

Nei

bio

pro

cesizneere

celluletcssuti

ocom

ponentiattive

(enzimi,

cloropiasti.eLc)

sonousate

ocrprodurre

tasformazioni

chimiche

diinteresse

comm

erciale,N

egliL

SA

attualmente

leeg

uen

ticategorie

diprodotti

sonocorrentem

enteottenute

conbioprocessi:

materiale

biologico8celIuie)

come

fontedi

proteine,lieviti

pertrasform

azioni(am

iiai.celiulasi,

lattasi):com

ponenticellulari

(enzimi,

acidinucieici’i

pro

dotti

delm

etabolismo

cellulare(ac.

lattico,etanolo,

antibiotici)N

atiinizialm

entesul

modello

operativoche

impiega

letecnologie

chimiche

tradizionali,i

bioprocessisi

vannoevolvendo

dallafilosofia

direazione

inbatch

aquella

diprocesso

continuoallo

statostazionario.

Nel

processoin

batchil

recipientedi

reazionecontiene

oltreal

substratoda

trasformare,

lespecie

nutrienti,tam

poni,in

unm

ezzosterilizzato

nelquale

siaggiunge

ilbiocatalizzatore.

Ilprocesso

puo’durare

daqualche

oraa

diversigiorni.

Durante

questoperiodo,

lavasca

direazione

vienealim

entatacon

lesostanze

necessariealla

reazionecataliztata

mentre

vengonorim

ossii

prodottidi

reazionecom

egas,

precipitatiQ

uandola

reazionee

completa

ilrecipiente

direazione

vienesvuotato

einizia

lafase

dipurificazione

deiprodotti.

Tutte

questefasi

impegnano

unturn

overdi

processopiuttosto

lungo.A

lcunidegli

inconvenientidei

processiin

batdhpossono

essereridotti

conl’im

mobilizzazione

delcatalizzatore

susupporti

divaria

naturaconsentendo

diottenere

unaunita’

specifica(bioreattore)

perrealizzare

processicontinui.

Cio’

comporta

evidentivantaggi

pratici:-uso

razionaledel

catalizzatore(m

inoriquantita’separazione

daiprodotti,riuso)

agevolecontrollo

deiparam

etridi

processoin

unita’m

odulari-com

posizionedel

prodottostabile

neltem

po-uso

dim

inoriquantita’

direattivi

(minore

impatto

ambientale)

modularita’

impiantistica,

minore

investimento

dicapitale

impiego

piu’efficace

ditecnologie

aD

NA

rper

svilupparenuovi

prodottiA

favoredei

processicontinui

abiocatalizzatore

inimobilizzato

sonoanche

altrifattori

dicarattere

cineticoe

termodinam

ico:-possibile

attivazioneenzim

aticada

partedel

supporto-possibile

trasformazione

distato

fisicodel

catalizzatore(gel)

acui

possonoessere

associatem

inorienergie

diattivazione

-spostamento

dell’equilibrioverso

laform

azionedel

prodottoche

vienecostantem

enterim

osso-nel

casodi

unainibizione

daprodotto,

larim

ozionedi

quest’ultimo

interiene

anchesulla

cineticadella

reazione

i2

nnio

bilz

azun-

del“atuE

iaore

E:

ìobiz

ai

neci

cui

mi

puriliLa

oco

nplcsienzim

atici111

matrie

LX

Fse

sil;de.

geiefi:ateo

polimeriche

euna

tecnicaorm

aiafferm

atae

incasi

specificiapplicata

comm

eicialmente.

Questa

tecnicaha

avutonegli

ultimi

diecianr

ipaiticolarm

enk.negli

US

Auno

svilupposenza

precedentinell’industria

biochimica,

neisettore

alimentare

efarm

aceutico.I2im

mobilizzazione

dell’enzima

consisteceneralm

entenell

adsorbimento

oingiobarnento

dellasua

comolessa

moiecoia

protFira.

insupporto

inerteche

neconsenta

l’azionespecifica

incontinuo

pertem

pipossibilm

entelunghi

esenza

perditerilevanti

dell’attivita’

originaria.A

questoscopo

sonostate

messe

apunto

numerose

metodologie

etecniche

diim

mobilizzazione

comprendenti

siaun

largospettro

dienzim

iche

dim

atricidì

supporto.L

’imm

obilizzazionedei

biocatalizzatoreconsente

direalizzare

unbioprocesso

connotevoli

vantaggieconom

icisia

perla

semplificazione

ela

riduzionedelle

dimensioni

impiantistiche.

cheper

ilm

inorim

piegoe

lapossibilita’

direcupero

de!biocatalizzatore

(Pizzichini,

1985).A

lcuneapplicazioni

sularga

scaladei

biopiocessibasati

suglienzim

iim

mobilizzati

sonorip

rtatein

tabella

Enzim

a(I=

’imrnobilizzato)

Applicazioni

Penicillina

acilasi(I)

Produzione

di6-A

PA

dapenicillina

Go

VG

lucosioisom

erasi(1)

Produzione

difruttosio

Lattasi

(i)Idrolisi

dellattosio

nellatte

enel

sieroM

elibiasi(I)

Idrolisidel

raffinosionella

melassa

Aspartasi

Produzione

diacido

L-

asparticoda

acidofum

aricoF

umarasi

(I)P

roduzionedi

acidoL

-malico

daacido

fumarico

Nel

capitolosuccessivo

verrannodescritte

letecniche

diim

mobilizzazione

chimica

efisica

deibiocatalizzatori,

isupporti

utilizzatie

leperform

ancesdei

sistemi

imm

obilizzati,

Irsptim

em

brana

:pro

(’es(separativm

am

embrana

siha.a

sullepoL

)rieta’perm

seiettivei

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1’erla

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p-ehkmat’

Fin

‘si’

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ri..c.uper

.j:‘aioii

n’Jti.z!onah(prott

1n.

•.ttosi.

‘ers

i.j:O

tC’il.

aI.qua.etc.).

comporta

aflchela

dimiw

;zioit

deieanc»nq

ika

tcB

’)D‘O

)’i

etecnologic

di nie

rn

5srana

si posrn-‘nstrh;

..elprc

-csu

d’e”olnnone

eianovazione

dell’iqdusiar1im

entv

e.prio

ac

nteinn

ra’e

Sipii’

affe

irnare

invi

u’principio

chettt;

.c.. e

s-Ic

:- n

4’iitado

lalavonzio’e

iJ°i rrodcttialine’ìtan

tonosii

ses

‘l’

ieciiI

ittr

r

tSln

z&

nauiv

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i sxcro:.trtsts

nin

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iQTStD

hveilor’u’—

’nue

“E\F

ia

wilupp’inir’

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Pecitio

pnEettu

ilur’ennahsulle

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ii

io’“.

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raren

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sierodi

tatt,?

rnos’ia

loin

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rì;elle

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’FC

LZ

kli.lalc

processojre

dr

csoali

iipzc

-li-li.tecn

uie

d‘n

emt’r

in-j.i

ascesi,

seiara

tic,

liedi

ua4oi-iazi»ne

ennmatira

(bioreaScie

l4tasi€1.

Questo

schema

dipiocesso

haun-i

notevole‘m

postas’za

apphcativapoiche’

puo’esserc

impiegato

siapa

la‘alciinazioni.

deio

tituentidel

Jatt

quandosi

parteda

questam

ateriaprim

aper

scopialim

entari,sia

peril

tratta

mta

todel

sieroe

dialtri

reflu

ia

scopo

depurativo.Infatti

oltreal

sierol’industria

lattiero-caseariaproduce

tefluia

compoi7ione

variabilem

aad

altocarico

inqimanie

chepi ssono

cssereii&

ualmente

depuratisecondo

questo

schema.

Iaspeto

signi...catiso

dellos..he

flad

t,atta.iIcntc.dcl

s.emon

letecnologie

dim

embrana

consisterei

-lepuraìeil

reflrattraverso

unre

cupero

differenziatodei

singlicom

poneni.«‘n’eero

pro

.ein.

sai

irtina1i,sciroppo

di glucidie

acquaterila

EI

dtt

[[aouItQ

ro&

j

rtto

re

I8ttka

eettr

odU

s

cfroppo

d

Di

seguitosono

discussele

singoleoperazioni

unitariepreviste

dalloschem

adi

trattamento

delsiero.

Micro

filtrazion

eT

aleprocesso

consistenell’im

piegodi

mem

branepolirneriche

oceram

ichecon

dimensioni

deipori

dil3

taventi

Ioscopo

ditrattenere

lefrazioni

dicoagulo

residuedel

siero.L

apressione

diesercizio

e’di

circa0.5-

1.0atm

atem

peraturaam

biente,L

’effluenteconcentrato

diquesto

processocontiene

grassoe

coaguliproteici

chepossono

essereriutilizzati

nelcaseificio

perincrem

entarele

resedi

caseificazione.Il

permeato

passaalla

fasedi

ultrafiltrazione.

Ulirafiltrazio

ne

Questa

operazione,com

portala

rimozione

edil

recuperodelle

sieroproteinedal

siero,con

conseguenteabbattim

entodel

caricoinquinante,

esoprattutto

permette

lavalorizzazione

economica

diquesta

componente

adelevatissim

ovalore

biologico.L

esieroproteine

trovanoinfatti

impiego

nell’industriaalim

entareper

iprodotti

dolciarie

dietetici,per

l’alimentazione

neonatalee

infantilee

come

additiviper

bevandegassate,

etc.11

permeato

diquesta

operazionee”

costitutop

r’nio

almen

teda

unasoluzione

dilattosio

48%

)al

minerali

bio

reattore

oatlitico

La

eonverio

ne

aalu

coe

e2aìateso

i;tt

horeattoreenzim

atcontin

uo

leahiL

Lato

imIlIZ

?afld

UI

‘n’u

na

galattosidasisu

una

nembrana

Tak

uattame

eonsente

diot

ere

unam

sceladi

lattosioglucosio

egelat

OS

I)1U

d’e

oe

meno

alo

1ica

conproprIeta

edoIcoranti

Elettro

dialisi

I‘obiettivo

diquesta

operazionee

lariv

oione

disali

minerali

dalperm

eato.E

ssaha

loscopo

diridurre

lapressione

osmotica

deisiero

perla

fasedi

concentrazionee

recuperodei

glucidi.T

alerim

ozionenuo’

essererealizzata

contecniche

cheim

pieganoIo

scambio

ionicoo

lelettrodiahisi.I

datisperim

entalidim

ostranoche

l’elettrodialisie

ingrado

dirim

uovereanche

il90%

disodio,

potassio.cloruri,

fosfati,

Osm

osiinversa

Mediante

l’osmosj

inversasi

ottieneacqua

demm

eralizzatautilizzabile

neicicli

sterilidi

lavorazionedel

lattee

contemporaneam

entela

separazionedi

unosciroppo

dìglucidi.

La

caratteristicaprincipale

dell’osmosi

inversaconsiste

nell’operarea

bassatem

peratura(4

07

0C

),nel

concentrarela

soluzioneglucidica

dicirca

20volte,

nelprodurre

acquasterile

conun

risparmio

energeticodi

circail90

rispettoalla

distil1azioneduo

stessotem

popreviefle

ladegradazione

termica

deiprodotti

(cararnellìzzazionedei

glucidiL

L’oggetto

diquesto

lavorosi

inseriscenei

quadrogenerale

appenadescritto

poiche’affronta

l’ottimizzazione

delbioreattore

lattasicoper

l’impiego.

inscala

pilota,nel

processodi

trasformazione

evalorizzazione

delsiero

djlatte,

Ilpresente

lavoroha

loscopo

didescrivere

edi

correlarei

parametri

operatividel

sistema

bioreattoreenzim

aticoa

mem

branaper

applicazioniin

campo

agro-alimentare,

biomedico

ein

generalenel

campo

dellebiotecnologie.

L6

Materiali

metodi

estru

men

tazion

e

Materiali

L’enzim

agalatto

sidasi,

estrattoda

Aspergillus

oryzae,e’

stabilizzatoin

amido

Viene

prodottoin

forma

liofilizzatadalla

Sigm

aC

h.Co,,

gradoXl.

lot25F

-0633.A

ttivita’specifica

cononitro

fenil

galattoside(O

NP

G)

5,3U

/mg,

conlattosio

4.U

/rnga

30°Ce

pH45.

eril

hiosensglucosio

ea

outiiii;ato

l’orim

a3glu

cos

oossidasi

otteneredd

;-soerij’T

\ioer

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u’d,hz7ataS

ieei

Lh

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e’al

25%.

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I-i;ka.;a!b’im

inasiericp

oovina(B

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dellesolua’ni

dilavoro

SSflta

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l(ArprP-una)

itat

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diir

ioo

nu

la,nduc’L

ilita’elctbicaeiw

tit4

.iCflC

einftrio,e

vl’is

Metodi

dianal!qstiu

iuen

tazont

din”nL

rollof

ItanQ

iir

JUC

i.ii:

‘..-cdiv

erc

ctecriche

analichea

‘vd

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n,alI

lt14

det1)11

!qe

ci

roI

Ile

,lin

dil

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a’

icpitii

til

L,V

av

i.

coi

pr2

nd

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pompa

perelu.jnpe

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“CU

).rlieflre

Rlt’d

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cnnkxp

da10

ul;nveia

tore

(Vanan

‘3i.

aziin

i’cc

liri;ranonc

sermostatato

a90°C

;cem

p.tei.degraV

’r‘ist’

42

coinma

i;npacrataspecf’ca

perla

cp

.i.a

“i,:

de;‘d

l‘cidrali

iIigo

accindi

po(.110

620.0

65X30cm

,co

Pect.d

ri

io

d%

fi%

i’)rSS

‘r‘n

iii:’:

i’c

t’i compIesi

cn

nla

inne(a+

piaente

iellafase

stazioneta(1’o

litii

rti

‘latoon

divinil-bcnzene).C

ontale

sstema

sioossono

esu,unet

campioni/ora.

2B

eckman

Gli’cose

Analyzer

—.

perle

ina1isidiscontinue

delglucosio

sucam

pioniraccolti.

Ilpnncipio

ditunzionam

entosi

basasulla

seguentereaziope:

K)i’

ji3

glucoa

¼gluconro

i-H202

Un

.!Iett»

&di

platin.’pe’Jaiinaio

r-70C)

mv

‘sA

g/AgC’1

misura

lat”locita’

c”tci’w

arsad

c%%

:pcqoq:ancir

w’

“olumc

n’godi

campione

(lOul)

ei&

etttto“JIa

sIi’a

twnm

ati‘st

Juu

no’sidasi

(600)

1)tem

podi

pos

‘i

ase

iiIn

si

‘trtczat

d)02g/l,

il2.

sScI

sS‘

‘al”

.ttii‘vk

a1

s;

aL

.I

‘a.

•I—

..

.4’

$1

1

cidoad

assigenata

)ncell

pi

deterunaz

nIi

fiuso

(Idiiaut

Bru

oo,M

i),registratore

lP7

13A

unapom

paG

ilscnM

rropu

k2.

Tale

sistema

consentesia

ilm

onnoraggioin

contlnuosia

lean

alISI

inbatch

4O

campioni/ora).

Ilcontrollo

dell’imm

obilizzazioneenzim

aticanei

reattoreien

eeffe

ttuato

on

duediverse

metodiche:

misure

diassorbanza

alI’UV

misure

diattivita’

idrohticaS

iale

misure

diassorbanza

chequelle

diattivita’

vengonoeffettuate

sufrazioni

diperm

eatoprelevate

durantela

fasedi

imm

obilizzazione.L

em

isuredi

assorbanzavengono

condotteallo

spemofotom

etroa

280nm

(leproteine

contenentiam

inoacidiarom

atici(T

irosina,T

riptofano.F

enilalanina)assorbono

nellaregione

da250

a300

nrn(U

V).

La

rettadi

taratura(fig.6)

vienecostruita

perdiluizioni

progressivedi

unaS

OiU

ZO

flC

enzimatica

(2g/I)

intam

ponecitrato.

Le

misure

sonocondotte

concuvette

in

quarzocon

camm

inoottico

di10

mm

Questo

tipodi

controllonon

&specifico

perl’enzim

ae

puo’dare

unnsultato

positivoper

qualsiasialtra

proteinacontenuta

nelpreparato

enzimatioco,

Le

misure

diattivita’

vengonoeffettuate

diluendo1:5

ilperm

eatoin

una

soluzionedi

lattosioal

5qce

misurando

dopo30

minuti

direazione

l’eventualeproduzione

diglucosio

cheindica

lapresenza

dell’enzima

flCi

perm

eato

.L

a

verificadell’attivita’

e’un

controllospecifico

perl’enzim

a

LZ

iblio

rafia

Fabiani

C.,

Pizzichini

M.,

EN

EA

,R

TliC

fli’83I22(1983)

Pizzichini

M.,

Le

biotecnologiein

campo

internazionale,E

NE

AR

T/T

IB/85/24

(1985)

Vism

araR

4D

epurazioneB

iologica,teoria

eprocessi.

Ed.

Hoepli

(1978)

2S

UP

PO

RT

IA

ME

MB

RA

NA

Ibioreattori

am

embrana

impiegano

come

supportodi

imm

obilizzazioneuna

mem

branapolim

ericao

inorganicada

micro

ou

ltrafiltra

zio

ne.

Inquesti

sistem

iparallelam

enteal

processodi

tiasformazione

enzimatica

sipU

O’

realizzarequello

separativoad

operadella

mem

branaA

ifini

dellim

mobilizzazione

ipohm

eriacetato

dicellulosa,

polisolfone,nylon

cellulca

t.oossono

eaerefunzioralizzati

en

radia

icarbossi

icam

mci

ossidci

ee

II

modo

o’ea1

iar

unie

gan

chimico

na

c. supportopor

asereuna

aiggior

stbi

ildel

catalizzatoreI

nilOdci

ntag

gi

prrticineli

uo

uu

rcib

rane

polirnerichee

quellodi

poteidisporre

diun

sistema

aL

ompcsizior

egeom

etria

(spessore.p

oro

sitasim

metria,

diametro

edistribuzione

deipoli,

reiezioneai

salio

allem

olecole)e

truitn

radefinite,

chimicam

entem

odificabile,L

adim

ensionedei

poriviene

espressain

micron

oalternativam

entein

daltonper

averedirettam

enteun

indicazione

delpeso

molecolare

dellesostanze

discriminate

dallam

embrana

(molecular

weight

cutoff:M

WC

O).

Lasim

metra

strutturaledella

mem

branacostituisce

unaltro

parametro

strutturaleim

pait

aifinì

diuna

migliore

condizionedi

imm

obilizzazione.Infatti

lastruttura

asimm

etrjcae’

caratterizzata,com

esi

vedra’sia

nellem

embrane

poiimeriche

chenelle

barrireceram

icheutilizzate

inquesto

lavoro,da

unaparte

spugnosadi

supportoe

dauno

stratodenso

chedeterm

inail

MW

COli

supportospugnoso

puo’intrappolare

invario

modo

ilbiocatalizzatore,

mentre

ioskin

densoassicura

lepecifiche

diM

WC

O.

Sono

disponibilisul

mercato

moduli

am

embrana

fabbricaticon

unavasta

gamm

adi

polimeri

econ

differentigeom

etrieidrauliche

checonsentono

discegliere

ilsupporto

piu’adatto

allespecifiche

delbiocatalizzatore.

Nella

seguentetabella

siriportano

alcuniesem

piappiicativi

deibiorcattori

am

embrana

neisettori

farmaceuitico

eagroalim

entare.In

questultimo

campo

Iostudio

deibioreattori

am

embrana

e’indirizzato

principalmente

allaproduzione

dibevande

zuccherine,succhi

difrutta,

dolcificantia

basedi

fruttosioe/o

glucosio.

Applicazione

enzima

osubstrato

tipodi

bioreattore

Farm

aceuticaL

ipasiH

FR

Catalasi

PPU

reasiT

CP

enicillinasiC

ST

RP

roteasiC

ST

RA

limentare

InvertasiH

FR

CS

TR

uami1asi

CS

TR

(iluc,isom

erasiH

FR

Maltoiasi

HFR

CS

TR

13-naiattosidasiH

FR

cellotdasiH

FR

arrnentt

dt

iion.

iL“

LoaL

ieO

aI

sCO

podi

iuioliz

ein

idic

ine,

it

aa

libi

dttC

C

rcndiana

adattivita

lattasicaconsente

dip

rdu

rrcinonosancaridi

ipocaIe;i

ca

Ialto

valoreaggiunto

8glucosioe

gahttosio)e

dielim

inare!

forteC

dric(

inquinantedel

lattosio(B

OD

=50.000

nìgilinei

ero

dilatte.

libioreattore

lattasico.oggetto

diquesto

1avoo,«

osd

tuito

ciaun

modulo

am

embrana

sucui

e’stato

imm

obilizzatocon

leprn

cednr

tratta

te

successivamente,

l’enzima

-ga1

attosid

asi.L

alattasi

e’stata

imm

obilizzatasu

diversisupporti

solidi.tra

i quali,vetro

poroso.resine

dìfenolo-form

aldeide,acciaio

inossidabileptdi acrilam

mide,

cellulosa,allum

inae

collagene(K

nopf,1979).

Nonostante

tuttiquesti

sup

po

rti

sianostati

impiegati

consuccesso

nell’imm

obilizzazionedePa

lattaio,

nessunodi

questisistem

ie

statoindustrialm

enteapplicato.

Inquesto

lavorosono

statiutilizzati

duetip

idi

supportop

er

l’imm

obilizzazionedella

[3-Galattosidasi.

unodi

rnate

iiale

ceiamico

edun

altro

polisolfonico.

2J

Barriere

ceramich

e

Ilsupporto

dim

aterialeceram

icoha

unageom

euiatubolare

cilindrica(i2m

mdiam

etroesterno.

400-600mm

lunghezza)com

esi

vedenella

fotoottenuta

a!m

icroscopioelettronico

ilm

aterialee’

costiwitr’

dauno

stratoesterno

di.-allu

nìin

a(spessore

1.5-20

mm

).e

dauno

internom

icroporosodi

y-allumina

(spessorei5-25prn

costtu

ioda

particelleda

2Onrn)

chedeterm

inale

carattenstichedi

selettivita’e

perineabilha’del

materIale,

Per

lapreparazione

delsupporto

sii m

and

aa

Fabiani,

Nannetti,

Vatteroni,

1989.11

supportoe’

caratterizzatod

unaporosit&

dei35-40%

eda

un

diametro

medio

deipori

dellostrato

microporoso

dicirca

l5-2Otm

.Q

uestim

oduli,che

ino

riine

eranostati

sviluppatiper

l’arricchimento

perdiffusione

gassosad

ell’U

F62

8(F

abiani,N

annetti,V

atteroni.1989),

orahanno

trovatoapplicazioni

come

moduli

dam

icrofiltrazionee

parzialmente

come

reatorien

zim

atic

i

:11m

lcrcoscopioelettronico

duna

sezionelongitudinale

delm

oduloccianhico

2_M

eiih

rane

afib

recae.p

oiiso

fonich

e

[1m

oduloa

fibreca

epolisoiloniche

eL

SttU

tOda

unfascio

dìfibre

a•.

dipolisolfone.

Lpolim

eroha

come

unitaripetitiva

ildifenil—

solfone:

iTgruppo

-SO

,risulta

stabilizzatoper

risonanzagrazie

allavicinanza

ded

ianelli

aromatici

Ibue

pairsdegli

atomi

diossigeno

garantisconobuoni

lcanìi

idrogenocon

lem

olecoledi

solutoe

solvente.L

apresenza

deglianelli

aromatici

edei

sostituentiR

,im

pediscela

rotazioneintorno

ailegam

iC

-C.

Questo

polimero

mostra

interessanticaratteristiche

diresistenza

allaT

rnax75

C),

eunottinia

tolleranzaalle

variazionidi

pI--I(1-13).

1m

odulico

mm

ercialcontengono

mem

branecon

undiam

etrom

ediodei

poriche

variada

10a

?OO

A,

corrispondentiad

uncut-off

(MW

CO

)da

1000a

500000.L

efihie

cavengono

prodtte

conla

tecnicdella

filabia

asecco

ead

umido

dise

Innincì1)n

ol

Cc

ta-.

982P

ìiLondo

unaoIu

zione

in‘1,m

tolic

eaanid

et

raea

adic

ia

dalla

ausore.

11consolidam

entodcli

19s’

rf

tIr

oa

1uiid

91d

l)irwk

trcsia

o.

ia.-

.t..

itt

o9.

i9

L‘O

flO

iiO:O

d5

dli

hh

fi.L

merib

ra1

rioìfb

ieh

ten

o:a

1u

rca.:

ri

t.cia

re.

splralaLi

eia

fibrea’

Qaeseuitim

aco

nfrt

aL

on

presema

limiti

operativ

dipressione

I7

Ban

etem

peratura(T

CM

odOi

aiinre

ave

adiversa

strutwra

delleb

ree

difrerentei

een

Lri

ei

nìid

ulo

.‘engono

conm

erc

iaìiz

zate

per

pro

cessi

diU

Fe

ancheper

applicazioniiiom

ediche.

Im

odulia

fibrecave,

essenzialmente

comm

ercializzatiper

ultrafiltrazione,possono

essereim

piegatiper

l’imm

obilizzazionedi

enzimi

ecellule.

Nell’utilizzare

im

odulia

fibrecave

come

reattorecatalitico

sipossono

adottarediversi

schem.i

diflusso

idraulici(ultrafiltrazione,

backflushing,ricircolo,

infig.)

aseconda

delleesigenze

Sezione

trasversadi

unafibra

cavapolisolfonica.

Ilm

ercatodelle

mem

braneoffre

unanotevole

gamm

adi

moduli

caratterizzatida

materiali

polimerici

diversi,struttura

egeom

etriadelle

mem

branevariabili.

permeabilta

esv

:uriro

superficialedifferente.

La

tabella6

riportale

caratteristicheprincipah

dialcuni

moduli

Am

icona

fibrecave

impiegati

come

supportodi

imm

obilizzazioneper

laJ3-galattosidasi.

Caratteristiche

fisichedi

alcunim

oduliA

micon

afibre

cave

cut-offsuperficie

n.fibre

d,i.d.e.

(dalton)(c

m2)

(mm

)(m

m)

II

Imck

fiush

ng

uitra1

Htriio

ne

t

ricircolo

tipo

H1P3O

-4330.000

30055

1.12.1

HlP

3O20*

3OO

00600

2500.5

0.74H

iPi0

-20

10.000600

2500.5

0.74V

F2

P30*

30,0001000

10000.2

0.4

utilizzatinel

presentelavoro

im

odulia

hbrecave

utilizzatinel

pieseneelavoro

sonoprodotti

dallaA

miconG

racee

comnercbdizzati

principalmente

perultrafiltrazione

oper

perifusionedi

colturecellulari

(Weim

an,1983).

Nel

VF2

P30,il

modulo

cilindrie,

‘ungo23

cm,

conun

diametro

di2.3

cm&

compostr

ò1000

fibrecave

pohsolfonicheposte

alcentro

diun

rontcnitoredi

peip

txche

1acia

un“it

volume

hbcrointorno

all’insieme

dii

fibe

liIn

iI

d11

i‘t

rp

irt

allstrc

nit?a

unaha

3

2,flc

beja

4elqsc

appaac

hinluredi

‘i,iittpo

bioraftc

lattaskoien

’i1

pie’

itti

confauiad

io

rbaciflnslrng.

poichesia

dalaiori

sperinwntab

tl).E.K

ohwev

etal..

b8l)

he

du

datidel

presentelavoro

risultache

tale•-onhigL

iraziont.offre

k.m

iglioriprestazioni

idrolitichtdel

modulo

Imoduli

sono

dotatidi4

accessi:-

2process

pori,una

d’entiatae

l’altrad’uscita.

cheim

mettono

nellum

edelle

fibre(lum

enside)

2rerm

eatport

chealim

entanodirettam

enteil

volume

estcsnodelle

fibre(shellside)

-

Nella

figurae’

rappresentatoil

modulo

afibre

cavep

olk

olfo

nich

eV

itaFiberlI

P30che

mostra

caratteristichecom

uniad

altrim

oouliA

micon

ma

anchealcune

peculiarita’nella

particolaregeom

etriadello

shellside

chein

questom

oduloe’

localizzatoal

centrodi

unfascio

difibre

cavepolisolfoniche.

Questa

particolarita’com

portail

miglioram

entodella

fluidodinamica

ela

riduzionedelvolum

em

ortodel

modulo.

FL

re

P»in’eP

Ci’n

’L...

I’il

Mt

——

—.

J_:iJn‘1‘ru

wrT

hL

j-

—

—ti IS14

Sezionedel

modulo

VF2

P30

L’unita’

modulare

checostituisce

ilreattore

ceramico

tubolare(R

a)

e’costruita

montando

labarriera

ceramica,

come

e’m

ostratoin

figura,all’intento

diun

housingdi

perspexo

diacciaio

Perla

sperimenta7ione

preliminare

inlaboratorio

ilperspcx

e’stato

preferitoall’acciaio

p’rle

suecaratteristiuche

ditrasparenza,

leggerezzae

isolamento

teimico.

Ilprototipo

e’stato

utilizzatoper

lacaratterizzazione

dellepresta7ionl

dclniateriale

ceramico

inscala

dilaboratorio.

Ilvolum

em

ortoall’interno

diquesto

reattoree’

240cm

’.

Pcr’n

eat_pc

4Ki

-

i

r5

heil“

i

.4

Pn”

i’, orCfls...

-j

LiiI

li

i-

iE

i

{1

1040

011

0DI

1(1

111

402

-4

44

2vroH

((

II

2&

R

8oolioo

olooo

OR

4008

20

01(0

I0004

100

0(04010(00

40

93

2(01004

I0401

00

(04

10(1

0011(104(0

(0040(0

lo00

9P

lPU

01

4(0

004

(1(0

001010

40010(4(0

30

(0)1

,041(0

19

10(1(0

0104

)10

2P

VIl00

204910

ft1T

lÀ11

20(04(04

IT

OR

I(I)000(0

00

08

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POI

DIO

00

0/

(OlIO

Otl

010140

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(JlC

HIM

CA

Il[3jo)

JI)

(J)T

IUU

VU

I0lI

O

AncI

IOeust

tso

‘iir

ttOIe

r:

iso

itccttan

dPi

.n

figu

raiion

efluidodnaiv

cabackflushinp:

lairmen

taziom

permea

dal’estcr’

delPibarn

(she

sidejaIP

inrn

oi

men

sde1

nentraiib

aoduli

quio

aI

brepoi

solfonichee

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barnea

ceramica,

ilsu

bstrato

,costituitc

dauna

soluzionedi

Iattsto

intam

ponecitiatj

odal

sierodi

latte,perm

eadalU

esternodelle

fibre(shell

sideverso

Uinterno

‘lumen

sideLattraversando

Iospessore

dellam

embrana

interagiscecon

Fenzim

adepositato

esubisce

iidro

lisid

eldisaccarid

eD

allu

me

dellefibre

siraccoglie

unperm

eatocontenente

glucosiogalattosio

elattosio

nonidrolizzato,

iquali

avendoun

PMinferiore

alcu

toff

dellafibra

nonvengono

trattenutidalla

mem

brana.

Sezione

longitudinaledi

unafibra

cava,

Lo

studiodi

questobioprocesso

richiedeun

controlloaccurato

deiparam

etrio

perativ

iper

consentireal

biocatalizzatoredi

svolgerela

suaattivita”

specifica

nelleco

ndizio

ni

dim

assima

efficienza,T

emperatura

pressionepII

delm

ezzzo,oncentrazione

delsubstrato,

tempo

direazione,

sonoi

parametri

ontro

llatid

uran

tele

prosedi

idrplisiin

continuo

se

-A

eoo

oO

’o

SO

e0

,o’

ee

O0

[Lum

ensidej

QQ

QG

uco

swG

alattosioL

attosioL

attasi

[j

EiH07)

- U4

a a

O Li1

o’ CD

7)

7)

PS0”PS

7)P7)

o’Pi

6oo-)

PV

CO)

E(.7)

PS

Cn

PV

Ct

(.0

E

CO)PV

0*>

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E

0 O7) CI) 7) PV

2*c

r

PS 7) OVEo / bi,

L it /Ez

fh4rnnnnnvrnrrrnnnnnrZ7T-

I

L÷J 4)__J4

0‘0

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OCO

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PV

7)Ct 7)”O •‘

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.5

IL’

BZ

-MO

CO’

o’

‘7)

a;o

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IM

o

CI)

o’

Vo

2

p.C

o7)-A

O

Eo

‘ii

i-

(sI

I-

co

tneiu

rn1e

ne

eA

term

nn

izn

erave

ei-

istnb’i

tenninanelle

lpera

tiedei

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tattt

ptniia

ei

temperatura

delbioreattore

iene

rilevatain

jeita

daiod;ir

in-diana-iem

ocoppiaL

apressione

dirasm

embrana

esr—

tam

itoalia

r.

lep

onp

adi

alimentuziona

ontroibra

onm

ieromanori

tdigitale

e)flega

ocon

unregistratore

La

dete

rmianoi

edelta

coi

enti

i,

irli

ucos

)p

no’

ess

reesegu

ita

mediante

analisidisc

ontmue

ocontinue

Nel

primo

caso

ilflusso

dt

[‘erm

rreven

eraccolto

daun

collettoredi

frazioniprogram

mabile

(tempo,

numero

deglieventi

eoiu

me

dellefrazionbL

Tale

coilettorepuo’

conuoliare

lacontata

dellapom

pain

modo

dapro

gra

mm

are

opportu

nam

ente

lefasi

diavoro.

Ilpeim

eatocosi’

racolio

vieneanalizzato

conil

Glucose

Analyzei

li.N

elsecondo

asole

analisive

wen

enuitei

continuoda

unbiosensore

aiglucosio

sileppato

apposir- mente.

4Y

eaIita

Hii

mem

bran

a

La

pcrmeabilit&

dim

embrana

edefinita

dallar

lazime

Jl

AI

1dove

JC

ilflusso

attraversla

meinbfana

(cin/see),L

rla

permeabtlita’

divolum

e1di

mem

brana(sec

cm!g)

i’e

lapressio

ndi

trasmem

brana(d

yn

!cmi.

L’inverso

dellaperm

eabilitadi

meinhiane

ela

resistenzadi

mem

brana:

R=

l/LL

aresistenza

dim

embrana

pu

esserkem

aciataalla

viscosita’dalla

relazioneseguente:

R=

dovee’

laviscosita’

(gicm

sec)

deisolvente

edA

ilco

effic

ien

tedi

penneabilita’di

mem

brana,che

dipendedai

parametri

caratteristicidella

mem

brana,quali

laporosita’

ildiam

etrodei

pori,li

spessore,etc

Nelle

fibrecave

polisolfoniche,a

pressionidi

transmernbrana

supenoria

L8

bar.si

assistealla

deformazione

strutturaledella

fibrae

allaconseguente

perditadelle

propriet&intriffseche

delm

ateriale(perm

eabilita’,dim

ensionedei

pon)fino

allarottura.

Le

barriereceram

ichepossono

sopportarepression:

-diuansrnem

hranairoito

scpenoni(lO

2Obar)

erappiesentano,

per-

notom

ofvo

peraltrl

dicui

sidon’

ine

io

ilsu

pio

piune

nteci

>caleup

dpro

‘essoS

peri

italmente

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-)ih

draulA

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unm

io,-

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a.

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a.stIllatA

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jlfrd

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----

-dl1

‘e-la

.liC

ei’

‘\d

‘i

C1C

1i

teitJ

taJelii

diid

uli

mem

ban

aoF

Io‘\J

lIfiliP

lul

in

or

idio

mio

ceramico

aurnentodella

tcire

eri

tJ

osceviam

ente

laperm

eabilita’idrau’ica

perffetro

delladiriiuuziune

dl-scosita

delfluido

permeante

eper

ladilatazione

deipori

dedam

embran

i.D

alla4retta

rela

uv.

allaperm

eabilita’a

5°C

siicav

aun

a1ore

diR

55

1O

e/se

ccrn

2per

qV

FIIP3O,

Rm

=96

*lW

g/sec*

cmper

illI1

PI2

OeR11

=33iO

gsec*

crnper

quelloceram

ico.

70-

--

0L

u50

-1J

40b

iQ

(n/-in

)

30

20-

L

o

Oi

002

08

Ba

Nella

figurala

permeabilita’

inizialede

modulo

VFIIP3O

vieneconfrontata

conquella

ottenutadopo

rigenerazione(lavaggio

incontro

correntecon

NaO

HO

,1M).

La

permeabilit&

diun

modulo

VFH

P3Origenerato

conquesta

procedurae’

parial

34%di

quellainiziale

(1.7x1Og/sec

cm2).

Sebbene

laperdita

diperm

eabilita’sia

cospicuail

modulo

mostra

caratteristichetali

daconsentirne

ilriuso,

La

buonaperm

eabilita’del

VF2P3O

rispettoad

altrim

odulia

mem

branapolisolfonica

AM

ICO

N(H

1P1O-20)

hacreato

presuppostiinteressanti

perla

realizzazionedi

unbioreattore

lattasicoinscala

dilaboratorio

L’alta

resistenzadi

mem

branaesibita

dalm

aterialeceram

icoe’

onseguenzadello

spessoreelevato

(1-2m

m)

ma

nonrappresenta

unlim

iteoperativo

poiche’.com

esi

edetto,

conquesto

materiale

e’possibile

raggiungerepressioni

molto

elevatee

flussidi

permeato

consistenti,

_ig

LU

L9j

iluzineJ

rodijli

Lar

eecselci

s‘uttura

icd

ocrti

deinoouli

pol’solfonice

ceramic

rivestonopanicoiare

importanza

perIo

scaleup

diprocesso.

Accanto

adesse

devonopero’

essereconsiderati

altrifattori

cheinfluenzano

inm

ododeterm

inantel’econom

ieita’

delprocesso.

inun

qualsiasiprocesso

am

embrana

assumono

importan

zarilev

ante

leprocedure

dilavaggio

esterilizzazione

deim

oduliche

consentonoil

riusoper

lunghiperiodi

ditem

poI

aprocedura

dirigenerazione

dovrebberispondere

aiseguenti

requisiti:-sem

plicita’di

trattamento

-usolim

itatodi

reattivie

disolvente

(acqua)-tem

piridotti

ditrattam

ento-recupero

dellaperm

eabilita’iniziale

delm

oduloN

ellam

aggiorparte

deicasi

lasterilita’

delsupporto

e’un

requisitoim

portanteper

ilprocesso

eraram

entee’

possibilerigenerare

ilm

odulocon

trattamenti

chesiano

semplici,

rapidi,poco

inquinantie

nellostesso

tempo

efficaci,E’

richiestaallora

unafase

distudio

edi

ottimizzazione

delleoperazioni

dilavaggio.

Nei

moduli

polisolfonici,la

presenzadel

foulingdi

mem

brananon

consenteil

recuperototale

dellaperm

eabilita’iniziale,

Nella

rigenerazionedel

modulo

VH

IP3O

,condotta

conN

aOH

0.1M

,dopo

l’imm

obilizzazioneenzim

aticasi

hauna

riduzionedella

permeabilita’

inizialedel

60%.

Dopo

unsuccessivo

ciclodi

lavorazionesullo

stessom

odulosi

hauna

perditadi

permabilita’

del65%

rispettoa

quellainiziale

Cio’

evidenziache

larigenerazione

delm

odulonon

e’com

pletae

unsuo

limite

oggettivorisulta

dalfatto

chela

permeabilita’

diminuisce

neltem

po.L

aprocedura

dirigenerazione

sieffettua

influsso

nelladirezione

lumen

side-shellside

conreattivi

idrolitici(N

aOH

,N

aCIO

),e

inalcuni

casicon

enzimi

proteolitici.Il

trattamento

richiedealcuni

giornie

unanotevole

quantita’di

reattivo.L

eoperazioni

disterilizzazione

delm

odulopolisolfonico

richiedonol’uso

direattivi

chimici

battericidio

batteriostatici(form

aldeide,alcool

etilico,ossido

dietilene)

ol’im

piegodi

radiazioni(U

V)

poiche’la

sterilizzazioneterm

icadanneggia

inm

odoirreversibile

ilm

odulonelle

suecaratteristiche

peculiaridi

permeabilita’,

porosita’e

dimensioni

deipori.

Ilm

aterialeceram

ico,dotato

come

sie’

vistodi

minore

permeabilita’,

ma

dim

aggioreresistenza

allealte

pressioni,m

ostracaratteristiche

interessantiper

loscale

updi

processoanche

perquanto

riguardale

proceduredi

rigenerazionee

sterilizzazione,I

moduli

ceramici

possonoessere

rigeneratiterm

icamente

a900

°Cin

muffola.

Aquesta

temperatura

tuttoil

materiale

organicoviene

ossidatoed

cIm

natO

ttof

riva

diC

O2

Oe

SO

.n

un

terip

ore

atiam

ente

bre

ve

t7

ore’deternunandn

alloste

oter.p

ola

te,;i:iz’ìzior’cdei

noduw’

Ia

Ioerm

eabiti

diten

dran

aviene

tt

imnte

it.upe

atae

5p0

SO

nOIm

maginare,

si

lineadi

prnv’insiur

mi n

eo

infiniteW

ciclid

usoe

egenera

ione

2C

QC

1iJS

IOM

Im

odulipohsolfonici

onosi

nirercialm

entedisponibili

esi

sonoprestaò

nellafase

iniz

ia1e

diquesto

lavoroper

[acquisizionedi

elementi

preliminari

e,com

evedrem

cnei

prossimi

capitoli.hanno

consentitolo

diun

modelle

matem

aticodel

bioreattorelattasico

ela

messa

apunto

ditecniche

diim

mobilizzazione

enzimatica.

Im

oduliceram

icisi

sonorivelati

convenientiperche’

consentonodi

lavorarein

condiziontdi

pressionee

temperatura

chesono

mai

sopportatedai

moduli

polisoifonici.Inoltre

lapro

edura

dirigenerazione

esterilizzazione

neim

oduliceram

icisi

presentam

oltopiu’

semplice

erapida,

e,senza

consumo

direattivi

consenteanche

lasterilizzazione

delm

odulo.P

erquesti

motivi

moduli

ceramici

morran

ocaratteristiche

interessantinon

soloper

iprocessi

cataliticìm

aanche

perquelli

separativi.

2.7B

IBI

IOC

RA

FIA

Adam

A.

Fabiani

C,,

lkonardjM

.P

izzichiniM

.,L

o.D

nolland

Nakagaki;

Plenum

Può,241-253

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M; U

ltraflltrationhaudbook

Technom

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ublishingC

o,Inc.

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E.,

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chimica

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64,n

12775,

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Fabiani

C.,

Nannetti

19A

.,V

atteroniR

,,”A

lumina

tubularm

embranes

forgas

andliquid

separations”,F

irstinternational

Conference

onInorganic

mem

branes,July

3-6-1989M

ontpellier,F

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ltiit13

•‘l%fto’

;M

I)

pi

Ai

Iiii

‘f,I

flb

nid

.i’’ii

o

I•

la’Il

4.a

nirait

tilei

—

‘‘•

gi

a.•‘

L’r

.•i.

•itnt

i’Ei’tt•

•.

•—

;a.\i

drts_;1ao

Ii

•e.

•••4It.

4—t’

anchea

iati

,uccIeri

pn_sentiio

sou;to

ne

(lattosio.glucosio

gaiattosio)posson

ev

n_conn_

accettori,Irfatti

Iidro

oi

dellattosio

presentacom

eprodotta

stcondaiidegli

oligosa‘caridi,

inparticolare

trisaccaridi.L

apercentuale

dioligosaccaridi

dipendedalla

concentrazioneiniziale

dilattosio,

dalgrado

diidrolisi

edal

tipodi

f3-galattosniasi.L

aform

azionedi

tnsaccaridi.per

unaconcentrazione

inizialedi

lattosiodel

15%e

ungrado

diidrolisi

del758O

%.e

del9-10%

deglizuccheri

totaliper

laf3-galattosidasi

provenienteda

Kluyverom

icesfragtlis

edel

L4%

perquella

ottenutada

Aspergillus

oryzae(JE

Pren

osiI

etaL,

1987)

ftidelIL

a1atto

sid

asi

La

3-gaIattosidasie

stataisolata

daanim

ali,piante

em

icrorganismi,

questiultim

isono

generalmente

preferiticom

efonte

quandosi

vuoleottenere

unaelevata

quan

titadi

enzima,

Batteri,

funghie

lievitisono

tuttibuone

fontidi

3-galattosidasi,L

eproprieta’

dienzim

iprovenienti

dafonti

differentipossono

essereconsiderevolm

entediverse

(N.A

.Greenberg

etal.,

1981).L

atabella

mostra

alcuneproprieta’

delUenzim

aproveniente

davarie

fontim

icrobiche,

Proprieta

dellab-galattosidasi

ottenutada

diversefonti

nucroliche

p1I

Tem

p,(o

fattori

fonteopt

optimurn

necessariI’MSubunita’

Aspergillus

34

555-6

0nessuno

124.(.XK

)n.d.

nigerA

spergiUus

50

50-55nessuno

9(1.000n.d.

oryzae+

+K

luyveromices

6.637

Mn

,K201.000

2-10fragiiis

Kluyverom

ices6.9-7.3

35M

n’,N

a’

135.0001

IactisE

scherichia7.2

40N

atK

540.0004

(‘oliL

actohacillus6.2

55n,d.

540,000n.d.

termophilus

Leuconostoc

6,56(1

nessunon.d

n.d.“itrovom

m

nd.

nondetrrm

inato

Le

differentipoptieta

della-g

alattosid

asidebbono

essereconsiderate

quandosi

scegliil

tipodi

enzima

daut

lizzr

‘Ip

oces

Infattife

wnra

ttem

tcda

urghì.che

pre’ema

condi

1loro

t.na’i

ap’-l

ac’doa

t”fflpertUn_

aaìt

ritapc

ere

ut‘a

.,u‘oo

d’!at

Iozi

ro

temt

daIievit

rrs

nti

nve

idizionio

ttimai

11neurro

hlo

rendonoaddtto

allidrolisidei

lattosionel

latte.inoltre

puoessere

usatosolo

atcniperature

moderate

encessata

dicofatto

ri

presentapero’

unrn

mo

rgrado

diinibizione

daiprodotti

direazione

La

3galatio

sidasi

ottenutada

EC

oli

chee’

dìsponibilesul

mercato

siam

forma

grezzache

purificata,e’

quellap

iuusata

perscopi

diricerca,

ma

nonlivello

industriale(idrolisi

dellatte

odel

siero),per

prohlernidi

tossicita’legati

allasua

provenienzache

nonla

rendonoadatta

perusi

ditipo

alimentare.

3.3

Lati4

eIlg

a1

atto

sid

asi

La

descrizionecom

pletadella

cineticadi

reazionedell’idrolisi

dellattosio

o’illustrata

nelseguente

schema

(Flaschel,

1982).

Reazio

ni

nti

nelLid

rolisi

rotE

LC

1rL

iattQ

faQ

Ei-

SgzH

ìE

S—

-->P

-

Ga(13)E

reazio

ne

ddro

ìisierizim

atira

reazio

ne

di

rnu

taro

azio

nc

Ga(

)E

E±

Ga()

reazion

ii

ìnih

izione

com

peitiv

aG

a()E

E±

Ga(c)

*re

azio

ne

diin

ibizio

ne

Gai)E

E+

Ga(ft)

S+G

a()E

zG

a(ct)E*S

Ga(

l)+G

a()E

z±

Oa()E

*G

a(

reazion

idi

form

azio

ne

com

posti

com

ple

ssiG

a()+

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*G

a()E

*G

a()

Do

ve:

Ga(a)

ea

C1

,it1o

sìoG

a(ll)ilfi

g;lit

tosio

Pil

glu

cosio

EE

eriiim

a.

Sil

su

))stra

lc

e!

PF

’’Pte

laii

(flOS

it

Ci

Otte

aO

Sctjt’flt1

IRote

°io

101

co

sih

st:

-

-1V0

1fl-)

oi.

pio

t;i

9/0

adi

ii

IlO

9)(

aìtto

so((a

‘i

ia

ti

ii

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flO

C’

rosm

iS

CL

O1V

aii

n-

ettt

ItL

ioo

nen

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ot’isa

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il

-noile

ta1987)

flCN

Sttn

m)lec

da(lei

pr)d

otti

(9e

(k

ieneila

soa

ii)t

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(nia

r

OsO

-OoIC

oriti

t71

4T

hì

oìci‘

I2-i-

O!

-i

i-

O

concetrazionedi

orodotto)

-liìh

iL

ione

ei eversthtle

edi

tipo

cokn

petitiv

o.

oe

siLi

aro(m

t;ore

eom

peto

oper

iosta

\0

sitod;

iegame:

La

roirrcazo

ni

con

sde

atesono:

KK

I+

SIS

-tjttG

c

EG

a:z

ie--G

aL

-=

K1/K3

Leq

uai

one9

fLrì,ia

irL

aabile

(latal

iie

azio

ni

a

(oh

Gl

(lvi

‘9[Si

5=

=dt

‘AtS

]±K

tI±1

[So]—5]

)/K

Ovaiore

diK

-)ottenbi1e

daulaielazo

ne

\=K

-9L

).

dne

m1presenta

ilnm

ersdi

sitiattivi

chepartecipano

allareazione.

Tale

custante,che

tappiserita

ilnum

eiodi

tuinover”di

tirienzim

a.p

essereifettiv

ali’

fltO

00

LtV

‘01:11

1w

epi ato

enzimatico

molto

puroe

Iai

itteriziatlO

Co

oti

‘i’io

siItiene

unaostante

cm‘tiea

appai ente,q

uaato

(E)

rappresentli

- rintit

odio

One

piesenti

I

i•

I•

‘tU

..4

•.

•:‘

‘—

I...

••

••:‘iId1t

C.S

tini.

-

1!.

Zt

L’u

alt

•tll-icrnce;it:a

,it:

-l

—t’P

4c,teJflJ(’

Liw

e!ocitWitt

Iin

ku

•aloiem

a

Q’n

li..

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iift

i‘G

‘cI

£‘c

‘LSis.

!2‘i;1irar

ltnga

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O’k

fli‘i, far

nazi

ilprod.:tto.

:,sl. ‘rtk

,‘.t

(S

etn

:ru:a

4.

k(K

11K1

iEK

C/cE

SI”,n

ta•,uale

allaco%

tdl,tthdscc.ciazioat

diL

S;.

Intal

casoK

Mraj;p

rcsrta

laiisuta

dellaetaH

ita’d

d.tp

L‘s

o•E

Stdt ,.c’tandc

IaffinjLat

chel’e.7i’na

mostra

nei confrontidel

substi‘to

klf it:uite

iniziahS=Sn.

per

:ui

la(li

diventa:

(-‘

5yn$.,

SoI(So-1CM

)C

onsideriamone

i’invasopci

ladt

4eim

mnio

ne

gmfire

dtt

parameW

:tqetjcj

Ve

T(rv

21lA

r5Jr

KinPv

[So)+

11Vli

qiesto

ndei

ricavanobpen

mcn

tatìnw

graficiiit1

cwcaver-B

ud

slati)sN.rjp

jncn

cA,C

liWttC

cozim

sjc’,

ih)

tud;

cielI’,costanti&

naiehea

l’atchvan

no

indisklui’ist

1eco

n.iao

ni

‘)peraineatta

wfl

ditenipeiatura

p11e

concdntrazioncdell’enzim

a.L

eI¼t.•

ce!

allsull’aulvita’

kl’nl’ticae

mostra

tonella

tigurrdella

ptg!naseguente

lleia

1co

mette

inevidenza

un

massim

ol

attivita’Ip

eeifi?

PC

unpII

int.’tt’ca

4,S(ad

un’ittinperaturadì

40T

‘4una

concentrazione1i;

lattoswdel5%

).L

’effcttodella

temperatura

sullare

aao

ne

- ‘idizzatadaIfri

Bgalatt.nsidasi

(lattosio5%

apH

45)

Cm

ostrato

nellaligura

dellapagina

rcguente.L

’andamento

ettenutom

ostraun

mas

mio

diatthita”

acirca

50

T!

increm

ento

dellatem

peraturaprovoca

peroanche

laai

ziaicdenaturazier’e

erin

ica

dell’enzima

(Peteron.

19891.N

ellaJeterrnirazione

dellattivua’sp

ec.ificae’

statiutilizzata

lam

inimi

c”ltittoi

enzima

chepeiin

ette

dicttenere

unseg

naleai

1ali&

cain

ente

rivelabile,L

’!‘oncentrazione

d’enzim

ae

percankgata

ailim

itedi

iilevabilita’della

tecnicaanilitica

utilizzata.

Uq

3

i

_

Attivit&

specificain

funzionedel

pII.

::U/rng

4

O13

2030

4050

60

Tem

pera

tura

Attivita

specificain

funzionedella

temperatura

Dei

cmi

iazionedelle

costantii

tici

studiodella

cineticadi

ieaiionee

rtaLer

1dtu

O9

I analizzatoredi

Juco

oG

lucoseA

nalyzerIl

dellaB

ecknìan,basato

sullareazione

dellaglucosio

ssidsi

accoppiatacon

unelettrodo

adossigeno.

Ilsistem

aenzim

aticoha

unlim

itedi

rivelabilitad.)

dicirca

0.1g/i

diglucosio

nercheutilizza

unsensore

adossigeno

(l.o.d.l0

M)

eperche’

ilsistem

aopera

ladiluizione

(1:50)dci

campione.

L’im

piegoditale

sistema

&possibile

conducendola

reazionedi

idrolisiper

nonm

enodi

20m

inuti.In

questom

odosi

riescead

ottenereuna

concentrazionedi

glucosioapprezzabile.

Le

provevengono

condottea

cinquediverse

temperature

(10°C,

20°C.

30°C.

40°C,

50°C).

tuttea

pH4.5

intam

ponecitrato.

La

quantita’dienzim

anel

batchstatico

direazione

e’di

Im

gin

unvolum

ecom

plessivodi

11m

l.Il

tempo

direazione

e’di

25m

inuti,l’interruzione

dellareilzione

avvieneper

shockterm

icoa

90°Cper

8m

inuti.V

ienem

isuratoil

glucosioprodotto

infunzione

dellaconcentrazione

inizialedi

substrato.Il

risultatoe’

ottenutodalla

media

aritmetica

diquattro

valori.C

onil

metodo

deim

inimi

quadratisi

ricavaun’equazione

linearedel

tipoY

=aX

+b,

icuiparam

etrihanno

ilseguente

significato:

Y=

1IV(m

M/m

in)

X=

1I(S)

(mM

)1

b=l/V

max

(mM

/min

)a=

Km

lVm

ax(l+(1)IK

i)(m

m)

La

tabellam

ostrai

valoridi

1/Vin

funzionedi

11(S)per

unacinetica

condottaa

30°Cin

assenzadi

inibitoreiniziale.

Tabella:

Idrolisiin

assenzadi

inibitorecondotta

a30°C

(S)11(V

)(P)

(g/i)(m

M/m

in)

1(g/i)

10.04.949

0.9120.0

3.1941.41

30.02.697

1.6740.0

2.4221.86

50.02,252

2.00

daouanflta

iziale

di2

icf

ii

ii

aonc

Art.

iquesto

a)

gri

uu

no

ettenuto

come

irdia

ii

cattio

vaI.L

taheHm

ostiaidati

de1acinetica

ndtta

a4

(con

i>=10gi]

labella:Idrolisiin

presenzadi

inibitore(10

/1)

condottaa

40C

(S)11(V

)(P)

‘g/l)(m

M/in

inY

1(gli)

101)1511

30.302

00

8.0430.56

30.05.82

40.784

00

476

30.97500

3.931114

60,03.29

11.29

Costanti

cinetichein

assenzadi

inihitoiecon

TV

max

Krn

iR

(°C)

mM

/min

)(m

M)

(mm

)

10,00.316

52,016,26

0,99820,0

0.4455

51

78.82

0,99830,0

0,63959.65

12,600,999

404.)0.835

67.ì4

16.550.997

50,01,156

73,5222,97

0,997

(ìti

‘netic

!c;n

rreenza

dinib

iore

a

R(gli’

mM

)

0.000835

0.000,997

5000,831

14,’50,996

1000,900

14,540,997

fl

1isuIti

ottenuti

Le

provecinetiche

finqui

espostesono

statecondotte

conun

tempo

direatiurie

di25

miiti

perovviare

all’elevatoL

o.d,del

sistema

adossigeno.

Inun

tempo

direazione

cosi’elevato,

igalattosio

prodottopuo

inibirein

modo

rilevantei enzim

ae

inciderenotevolm

entesulla

determinazione

dellavelocita’

inizialee

dile

altrec’o. tanti

cinetiche.L

ecostanti

cineticheottenute

inassenza

diinibitore

potrebberoessere

percioaffette

daun

erroree

risultarecostanti

cineticheapparenti.

Perovviare

aquesto

problema

e’necessario

ridurreil

tempo

delleprove

cinetichecon

l’ausiliodi

unsistem

aanalitico

piu’sensibile.

Utilizzando

un.sensore

alglucosio

basatosu

unelettrodo

adacqua

ossigenata(1

o4.

i0M

)sul

campione

nondiluito

siriesce

adabbassare

il1.o4.

aiun

fattore500.

Un

sensoredi

questogenere

permette

percio’laccquisiziO

fledei

natirelativi

allacinetica

enzimatica

diidrolisi

neiprim

im

inutidi

reazione.11

sensore,di

cuisi

dar&am

piadescrizione

inun

capitolosuccessi vo,

e’stato

assemblato

nelcircuito

aflusso

schematizzato

infigura

checonsente

diseguire

incontinuo

lareazione

diidrolisi.

Una

pompa

peristalticapreleva

dalbatch

direazione

(50m

l),im

merso

inun

termostato,

unapiccola

quantitadi

soluzioneche

vieneinviata

alsensore

perla

misura.

Prim

adì

arrivareal

sensore,il

campione

attraversadue

serpentinein

accaio(lunghezza

10cm

.id=1

mm

)che

consentonodi

operarelo

shockterm

ice(90’ C

)per

fermare

lareazione,

e.successivam

ente,il

raffredamento

delcam

pionea

30’(‘

Dal

mom

entodel

prelievoalla

misurai

operatain

continuosui

batchdi

reazione,passano

circa4

minuti

eciascuna

provacinetica

puo’essere

percio’com

pletatain

circa10

minuti.

Le

provevengono

condottea

T=

30’C,

pH=4.5

intam

ponécitrato,

conconcentrazioni

variabilidi

substrato(lattosio

05,

1,0,2.0,

Nell’analisi

differenzialedei

daticiiietici,

lacausa

principaledi

errorederiva

dallaaccuratezza

concui

sonodeterm

inatele

tangentialle

curveconcentrazione

tempo.

E’per

questoche

perogni

valoredi

[S0],

sonostate

effettuatetre

curveco

ncen

trazioneem

po

inm

odoche

(-rs)0

e’rappresentato

come

media

aritmetica

ditre

valoridi

tangenteall’istante

iniziale.I

datisperim

entalisono

statielaborati

colm

etododei

minim

iquadrati,

valutandol’incertezza

suiparam

etria,

bdella

rettadi

regressionee

determinando

come

questaincertezza

sipropaga

suivalori

numerici

deiparam

etricinetici

Vm

axe

Ilfascio

dicurve

dellaprim

afigura

(paginaseguente)

seguenel

primo

trattoun

andamento

esponenziale(cinetica

delprim

oordine),

nelsecondo

tratto(di

raccordo)la

cineticae’

diordine

variabile,infine

lareazione

raggiungelo

statostazionario

incui

laconcentrazione

diglucosio

aumenta

linearmente

neltem

po(cinetica

diordine

zero):

d[G

]=A

:d[G

]=A

dt

‘Registrato

eA

rnp

me}

NN

direazione

Quenceddaento

Pompa

peristaltica

Sistem

ain

flussoper

lostudio

dellacinetica

direazione

inbatch

**

[Gj=

At+

[Gj

At

=A

t+B

a

iiim

d

583Im

M

55.5rnM

21.Sm

M

13.9mM

I.

Il

i.t

(miri)

T3O

C

i1/(—

rs)o=

(106f6

.6)I/[S

014

(1546±

211)

ao

tXyZ

_094

•V

max_(6•5jO

•9)S

IO

4t1/4••It

K=

(6.B

tt.4)

Lt’2M

o’

te.

1’+1”

iC

j$fl

/iìMlrrin

1’1-R

Om

M

\30

0e

costantiV

max

eK

r.deteri

ne

r-luc

nt

radipr

ticamente

‘oirid

on

o.

Ie

(Stan

tidetarm

iat

rr

ma

librioL

ah

sr

conil

primo

metodo,

inpresenza

ein

ase

izadi

inbitore,non

sonoafC

ted

llerrore

ipo0zzato(im

bi

ione

delgalatiosio

‘ailiattiv

ita’enzim

atica)e

sarannoconfrontate

oi

quelledclU

’nzirnain

mobilizzato

sulreattore

1attasico

16

Effetto_dello

iote

Calcio

suiFidrolisì

enzimatica

WM

aiorn

ead

altri(1980),

inun

Iavro

ull’idrolisidel

lattosionel

sierodi

attecon

enzimi

imm

obihzzati,rrette

inv

iden

zal’inibizu

nedella

lb

a1attsd

asi(fonte

nonspecificata)

dap

deli

toii

caci

esentiflCL

sieroio

vieneevauenziato

dalconitonto

delg

addi

idrolisidel

sierotrattato

indiversi

modi

espressoin

percentualerp

eo

a1valoie

100relativo

all’idrolisidi

unaso

luzio

ne

dilattosio

con

lastessa

concentrazionedel

sieioi

aquesti

datirisulta

cheil

sierointero

presentail

49%di

idrolisi,il

sierodeproteinizzato

il5

3%

ilsiero

deionizzatoF8

8/c,

Sulla

btse

diqueste

rforn

azionisi

e’ritenuto

necessarioen

icare

siain

batchche

nelbioreattore

l’eveituale

inibizionedel

calcioN

elpresente

lavoro

ladete

rmin

azio

n‘

dellaconcentrazione

delcalcio

incam

pionireali

disiero

ultrafiltratom

essia

disposizIoneda

unaindustria

lattieroasearia

e’stata

effettuatacon

unm

etodopotenziom

etnicodiretto.

Tisistea

dim

isura

c(cstìtuit

daun

ekitrodettivo

allioie

(SV

iiLppat(

dall EN

EA

,in

collaboraìionecon

laditta

IDR

ON

AU

T(B

rugb

eriM

iimo

Iloste

nala

usodi

onaforo

disperso(E

TH

1001,F

LU

KA

21192)in

unam

embrana

dPV

(’,di

unelettrodo

diriferim

entodi

Ag/A

gCI

isolatodalla

soluzloie

campione

dauna

mem

branadi

acciaiodi

cellulosae

daun

poten7ometro.

E’da

ricordarec

v.ur

neodo

potenziemetiico

direttocon

ISEin

gradod

stabibrel’atdvlta’

diuno

zonein

da

iic‘e

mm

lasua

concentrazin‘

meno

ditra’tanìent’

(dIIc,71I

Vr7

urdel

pii

eicvaa

forzaionica

ecci

checonsentano

diren

dre

11cffi

ni

att

itau

nca

inE

gurae

rapp

tentat2

Eretta

dtaratura

utilizzatapcr

frm

isur(1

mV

)i

10I

ogLt

a++

co. imita

c11

SOI

rioni

Ci

aIcio(E

)oandard

inuna

soluzioneN

a(iO

‘M

/

-A1E

3E

-iE

2E1

ilsiero

acido:p

i14.6

)utilizzato,

haun

contenutodi

(a(H)

liberopari

a346

ppm.

Questo

valoree

piuttostobasso

rispettoa

quellinportati

Inletteratura

(500-1500ppn0

(Robinson,

1’76).N

eicam

pionidi

sieroil

calcioO

berodiffensce

daquello

totaleper

unaserie

dequilibri

diprecipitazione

c

com

piesa7

one

congli

ameni

inorganicie

leproteine

caricheneg

atiamen

te

/2L.

-

o-

/

—______

__

____

2E

7

Cm

es

vedenetta

figurail

piideterm

inala

variazionedeilattivita’

delloiene

calcioche

raggiuneeun

mas’n

ioin

torn

oap

H=

2.0

-25.

Nel

sieroin

esame

ilcalce’

Obero

siaggira

intornoai

2lo

pp

m.

Ilcalcio

totale(670

ppm)

e’stato

determinato

acidificandoil

campione

apH

=2O

.A

pi-ipiu’

acidisi

notauna

diminuzione

dellaf.e

rn..Q

uestoandam

entoe’

giastato

osservatoin

letteraturacon

elettrodicalcio

spectfìcicostruiti

conil

rned

esirnionoforo.

Questo

effetiopotrebbe

esserespiegato

conuna

modficazen

estrutturale

pHdipendente

delloinnoforo

(basesO

Lew

odche

perdela

suaspecificita

per1i

one

ca1co(A

:amam

,1

97

).A

pHpie’

riir1

40<

pIfr5

.-6si

oda

ladim

inuzionedel

calciolib

eoe

apii’(

0Is

piccipitazionedell’ldro?em

loido

siicaIro’

(pK

213P

04)=

72

1)

Ftd

.ifc

ti.•

.:...:.

•:

p.•vc.r.!ic.ùc

ìdtiv

ltddella

j.eft,c

4j

datS

sieik

.s’w,s

C1’

irs

ti?ti

ieri1

(Sono

‘tear

aS

‘1’(lO

i!‘-h

ioO

))rn

div

t.s‘o

cnutodiC

attO‘0.

50.100

201,.3O

pprn’;n

11

*n

),une

citra

to25

mM

pH=4

5C

onil

biosen‘ore

aalu

osio

s‘i

lai;

vocita’

direazione

(moli

glucosolhtrom

in)dopo

racgunti

dci)w

rna(..aentiazic.ne

reibatcb=

0.lgli)

aciascuna

delle5

ioluziøpiU

naprova

analoaae’

stataf

Jtuatasul

sic,rodi

latte(lattosio

44glI,

determinato

conil

biosensorea

iattosi?i.T

dati,ottenuu

iar=

25T

sonoriportati

nellaseguente

tabella

Ca’lO

.M;m

in;

1003i0

2002

.2i0

3502.2

1(0

Sicro

tFR

io4

Da

questidati

risultache

la[3-galattosidasi

daA

spergillusoiyzae

nonsubisce

alcunainibizione

daparte

degliioni calcio.

3.7B

ibliografia

Am

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,BiL

IJA

;it)sE

EN

bA

1CÀ

Sf

FB

LPoLi

lzJUQ

A

41

Metod

diin

irnohiii,

ioueenziu

atc

a

na

Ai

ipaliappli

ui

dia

esi

am

nb

rarnelle

eli

iensitc

d’im

xb

ui

biotetah

zzaton

(enzimi

oI

ule)con

obetA

odi

ondr

pla

tic2

ate

latr

sformazione

chm

icadi

ursu

bsiato

,M

embrane

dim

icrofiltrazione.uitnlìhrazione.

iperfiitrazioneed

ancheosm

osin

’etsa

teneonorantaggiosam

ente‘m

piegateper

questo5C

Ci).L

oscopo

de1iimm

chii:zzazoneco

nsite

neifa.ncoraresaldam

enteil

mediatore

biologicoal

supportom

antenendola

suaattivita’

perlungo

tempo.P

erIim

irobilizzazione

enzin

1arica

srtapreposta

uia

vasta

gamm

adi

iaterialidi

supportoe

dlm

etodicheallo

scopodi

reahzzaieun

proceso

continuo(l.C

hibata,1976,

KM

osbach,1976

11A

Messing,

196’

W,M

arcon989)

Questi

metodi

possonoessere

cosPriassnntb

iLeg

ame

covalentefra

enzima

esupporto

polimerico

tramite

unareazione

congruppi

funzionalidell’enzim

anon

coinvoltinell’attivtK

catalitica.2

(‘rosslinkingcosalente

dell’enzima

conpolim

erinaturali

om

acromolecole

sinteticheper

reazionecon

rcagentibifunzionali

3A

dsorbimento

uuna

matrice

insolubiletram

itelegam

ieettro

staticiinterazioni

idi ofobichee

legame

idrogeno.3.intrappolam

entofisico

inm

atricipohm

eriche.m

icroeapsule.fibre

caveo

fibrespugnose.

4A

Jgrnesykn±

e

Questo

metodo

e’il

piu’com

unemente

usatoper

processidi

imm

obilizzazioneenzim

aticain

scaladi

laboratorio.Ji

legame

fortecon

ilsupporto

polimerico

conferiscestabilita’

all’enzima

neiconfronti

delletariazioni

ditem

peratura,pH

.foiza

ionica,concentrazione

delsubstrato.

etc.G

lisvantaggi

deIm

etododerivano

dallalaboriosa

ecostosa

oceduradi

imm

obilizzazionee

dalfatto

chem

oltospesso

siha

unag

uificatis’adisattivazione

dell’eniima

dovutaal

coinvolgimento

deisiti

attivinei

legairi di

ancoragg’o

r‘ta

equesto

ei

etodc

ealente

diiinm

obia)

lan

itura

deigruppi

fano

i11

proteineco

ino

ltinel

legame

Lovalente

on

ilsuppo

h,le

caratteristiLhe

fisichee

ehlmR

hedei

polirnerodi

supportoai[interno

delquale

vieneinserito

iigruppo

funzionaledell’enzim

a,M

oltedelle

piu’com

unireazioni

coinvolgonol’attacco

diun

grupponucieofdo

(aminico.

idro

siiicotiolico

ncarbossilico)

delleproteine

adun

gruppocarbonile

ocarbossile

(es.acile.

azide.anidride

acida).I

gruppifunzionali

enzimatici

disponibiliper

legami

covalentisono:

-gruppi

aminici

dellecatene

lateralidella

lisinae

argininae

gliN

-terminali

dellecatene

polipeptidichegruppi

carbossiliciin

alfadell’acido

asparticoe

glutamico

ei

C-term

inalidelle

catenepolipeptidiche

-anello

fenulicodella

tirosinagruppo

solfidricodella

cisteinagruppi

idrossilicidella

senna.treonina

etirosina

-gruppo

imidazolico

dell’istidinagruppo

indolodei

tnptofanoPer

attivarelegam

icovalenti

fraenzim

ae

polimero

insolubileen

gono

seguitedue

strategiegenerali.

La

prima

consistenell’attivare

ilgruppo

funzionaledel

materiale

disupporto

equindi

consentireuna

reazionecon

igruppi

dellaproteina

enzimatica,

laseconda

nell’usareun

reagentebifunzionale

perlegare

l’enzima

direttamente

alsupporto.

4d

Cro

ssLiflk

iDg

Ilreagente

piu’im

piegatoper

questotipo

dilegam

e&

laglutaraldeide.

Im

etodidi

imm

obilizzazionecon

questoreagente

possonoessere

didue

tipi:1)

reticolazioneinterm

olecolarefra

molecole

dellostesso

enzima

2)adsorbim

entodell’enzim

asu

unm

aterialedi

supporto(polim

eronaturale

oartificiale)

seguitoda

unareazione

chimica

checonsente

dilegare

stabilmente

l’enzima

adsorbito,Il

primo

metodo,

nonostantele

difficolta’incontrate

nelcontrollo

diun

grannum

erodi

parametri

(concentrazionedell’enzim

ae

delreagente,

pH.

forzaionica,

temperatura.

tempo

direazione,

etc.),ha

ilvantaggio

difornire

aggregativolum

inosiche

sonoattivi

einsolubili.

Inquesto

modo

sono

state

ottenoteim

porta

nti

ap

plic

azio

ni

industrialiglucosin

isonerasi

dellaN

ovotW

Carasik

etaL

1983)

iab

oIb

iii.uua

1w

uflii

iidi

ja4o

dge

iOcgw

111111

usatir

qucstate

iica

Iariia

Enzin

iin

imobih

,zatiper

acL,orbim

ent3

rosIin

kin

g

Materiale

Reagente

Enzim

adi

supportobifunzionale

Chitina

talutaraldeideL

attasinon

esterificataG

lucosioisom

erasìB

entoniteT

ricloro-triazinaInvertasi

Sepharosio

Tricloro-triazina

Chim

otripsinaP

oliacrilamide

Glutaraldeide

Fosfatasi

Glucosio

ossidasiT

ripsinaC

ellulosaG

lutaraldeideL

altasii

ripsinaA

ldolasiC

ollageneG

lutaraldeideP

apainaU

reasiG

lucosioossidasi

4d,3

Adso

rbim

ento

Gli

enzimi

possonoessere

adsorbitisu

materiali

insolubiliorganici

oinorganici.

Ipiu’

comuni

supportiusati

sonochitina,

sepharosio,cellulosa,

allumina,

collagene,etc,

Tabella:

Materiali

disupporto

perl’im

mobilizzazione

peradsorbim

ento

Organici

Inorganici

Polisaccaridi

Polim

eriP

roteinesintetici

Chitina

Polifenolo

Collagene

Bentonite

Carragenano

Polistirene

Vetro

Cellulosa

Allum

inaA

mido

Magnetite

Sepharosio

Agarosio

Alginato

tJuco

.‘

oi

h.

Ied

cC

oiìflfl1

C(

.1

ai

j7tfl

sevs’

XII’

Z1

CP

flWe

aato

da’legai

ia

alerfrU

no

sn

niag

fae

r‘tes

flUito

Ii

tittoche

pess)aria

ana

redi

PRtem

pera:u

r.o

foroa

oaU

ap

dJ

causaren

distaccodclle’aiim

adal

supportoari

qualee’

ax!sorhito,C

Ie

dovutoal

fattoche

leforze

dic

gne

oinvoltencil

adsorbnrentosono

ditipt

debolecom

ein

teriio

ni

elettrotatiche,

interazjonidiofobiche

oIeg

an1i

idrogeno.

4J4

_In

tra9

kie

nto

Questo

metodo

ebasato

sullinclusione

dell’enzima

nellam

atricedi

unp

olm

erodi

supporto.Il

polimero

consentela

diffusionedei

substrato.m

anon

lafuoriuscita

dell’enzima

quandole

dimensioni

molecolari

sonom

aggioridel

diametro

medio

deipori

deisupporto.

Poiche’non

c’e’la

formazrone

diun

legame

fraenzim

ae

matrice

nonsi

haperdita

diattivita

dovutaa

impedim

entisterici

oa

modifiche

deisito

attivo,com

enei

casofrequente

dellegam

ecovalente.

Gli

enzimi

possonoessere

intrappolatiali

Internodi

mrcro

apsuie.liposoini.

fibrecave

em

embrane

ingenerale

costituiteda

varisupporti

(organicie

inorganici).

Im

aggiorivantaggi

diquesta

tecmca

sono:-

semplicita’

operativae

bassocosto

diim

mobilizzazione,

elvvataresa

diintrappolam

entoenzim

atico,possibilita’

diim

mobilizzare

piu’di

unenzim

aa

varilivelli

dipurificazione.

facilerecupero

deiprodotti

direazione.

-possibilita’

diconfinam

entoe

recuperodi

cellule.

4.1.51

rnm

ob

ihz4

on

edella

-galatto

sidasi

E’stata

sperimentata

(Pizzichini

ealtri

1988)l’im

mobilizzazione

dellalattasi

sufibre

cavepolisolfoniche

principalmente

pervia

fisicaM

oduliA

micon

deltipo

HIP

1O-43,

H1P

IO-20.

HIP

3O-43

assicurano,in

configurazioneback-flushing,

lacom

pletaritenzione

dell’enzima,

ma

mostrano

deilim

itioperativi

interm

inidi

permeabilita’

idrau

iicaQ

uestim

oduliinfatti

aduna

densira’di

caricaintorno

a‘2

mg/cm

acui

coirispondeuna

resadei

47%con

lattosio5%

,presentano

unasensibile

riduzionedella

per

ieab’l’ta’id

aule

icht

ronfO

(essere

compensata

dau

neritc

dpzs

ion1JrIIlK

ad

imb

i’.

N-i

tentahvod

uperare

aesI

1irn

itsi

e’eic

at’

dscegiie

r

ua

nebrana

ae

tft

u’de

ao

cun

qued

tatoci

unam

aggkre

permeabilita

spcifia

Lom

eudla

esibitadai

mod’,di

VF

Questo

modulo

presentain

oltre

un

superfiic

dim

embrana

piu

elevata1000

cm2

risp

etto

a600

cm

deglialtri

aoduli,

eu

na

dimensione

dellefibre

notevolmente

ridottain

diametro

epessore

di

mem

brana,T

uttavial’im

mobilizzazione

diatta

dellaf3

gaiattosidasisaL

modulo

VF

2P

30non

equantitativam

entepossibile

poiche’frazioni

consistenti

dell enzima

permeano

attraversola

mam

brana.C

ioe’

spiegabilecon

li

significatostatisbco

delvalore

dicutoff,

cheevidentem

entenel\1F

2

presentauna

curvagaussiana

piu’allargata.

Per

cercaredi

conciliarela

buonaperm

eabilira’del

modulo

VF

2

conla

necessita’di

ritenerequantitativam

entela

[3—galattosidasi,

sie’

impiegata

unapolvere

inicrocristallinacom

elallurnina

inm

ododa

unire

ilfenom

enodi

adsorbimento

(enzirna-allumina)

all’imm

obilizzazione

fisicasulla

mem

brana.

41

SI

imicb

ihuzazi

neeir

aluin

ra

Pe

sdeti

lavoritiion

iinstr

it

ctienldteriali,

come

lay

dilumila,

adsorbonopruteire

adaz’on.

cnìirn

atica(N

.A.

Greenberg

etal

19l;

M.B

,Fa&

iata

1089).P

rinvidell

imm

obilizzazionesJ

reattoresono

statefatte

delleprove

inbatch

pertrovare

ilgiusto

rapportostechiornetrico

3galattosidasi-’y-allum

inaS

onostate

preparate5

sospensIonidi

allurnina(0.1

gin

100m

ldi

tampone

citratopH

4.5)alle

quaHsono

stateaggiunte

leseguenti

quantitadi

enzima:

0.05g.0.lO

g,O

20g,0.30g.

Le

sospensionivengono

agitateper

30m

inutie

poicentrifugate

per2

orea

3500rpm

,per

permettere

lasedim

entazionedellallum

inae

dell’eventualeenzim

aadsorbito.

11supernatante

vieneanalizzato

all’UV

(280nm

)e,

dopoaver

aggiuntolattosio

5%al

Glucose

Analyzer

li.L

em

isureall’U

Vvengono

confrontatecon

unaretta

ditaratura

fattacon

lostesso

enzima

aconcentrazioni

chevanno

da0.01

g/Ia

0.2g/I.

Entram

bele

proceduredi

controllohanno

dimostrato

chein

batchil

rapportostechiom

etricotra

allumina

egalatto

sidasi

e’rispettivam

ente21.

La

caricaenzim

aticaviene

preparatainviando

unasospensione

di500

mi

dtam

poneritrato

(25m

M,

pIi4,5)

contenente0.5

gdi

-

gaiattosidasie

Ig

diallum

ina.Q

uestasoluzione

vienetrasferita

nelreattore

atem

peraturacostante

J(30°C

)e

aduna

portatapiu’

elevatadi

quelladi

lavoro(5

mllm

in)per

permettere

unadistribuzione

piu’uniform

edel

complesso

enzim

aallum

inasulla

superficiedelle

fibre.Il

caricamento

e’avvenuto

inviandoi

500m

ldi

sospensioneenzim

aticae

ricircolandosuccessivam

enteil

permeato

peralm

eno4

ore,I

controllidell’im

mobilizzazione

hannom

ostratola

completa

ritenzionedell’enzim

aall’interno

delbioreattore.

Com

eosservato

inprecedenza

lintrappolamento

fisicoe

l’imm

obilizzazionechim

icahanno,

inlinea

diprincipio,

effetticontrastanti

sull’a.ttivita’e

sullastabilita’

dell’enzima.

L’esigenza

diottenere

ivantaggi

dell’unae

dell’altratecnica

d’imm

obilizzazioneha

suggeritodi

condurreuna

proceduradi

tipom

isto(fisico-chim

ico).P

erfar

questosi

esfruttata

lareazione

direticolazione

(cross

hnking)tra

l’enzima

ela

BS

Aad

operadi

unreagente

bifunzionalequale

laglutaraideide

La

giutaraldeidepoiecie

duege!o

piJ&

idice

possonoreagire

coneruppi

apr1jr

ijdelreizL

iae

deltaB

SA(fiuura

dpagina

seguentf)L

areticolazione

delledue

proteineurisei

tala

formazione

diaggregati

adho

pesoro

lecolare

c[

permettono

fintrappolamento

nelm

oduloa

fibiecave.

Lazien

ereticolante

dellaglutaialdeide

puoidetarm

inareun

irrigidimento

dellastruttura

terziariadella

piotema

equindi

unai iiro

rereativita’

agliagenti

chim

ici

eduna

maggiore

resistenzaagli

agentifisici.

Per

lostesso

motivo

sipu&

vei ificareuna

diminuzione

deH’attivita

specificadelU

enzima

imm

obilizzato.P

rima

diprocedere

allimm

obilizzazo

ne.

&stata

e.eguita

un’analisi

dell’attiv

itaenzirnatica

inbatch

indiverse

condizionidi

reazione.S

onostati

valutatii

seguentiparam

etri:

-C

oncentrazionedella

glutaraldeide:S

onostate

consideratediverse

concentrazionidi

agentereticotante

(0.110

%).

Dalle

proverìsulta

checoncentrazioni

diglutaraldeide

inferiorial

I%

nondeterm

inanola

denaturazionedell’enzim

a,

Tem

pidi

reazione:L

’effettodella

reticolazionesull’attivit&

enzimatica

e’stato

seguitonell’arco

delleventiquattro

ore.P

er

concentrazionidi

glutaraldeidepari

allo0.1

qcnon

sihanno

effettinegativi

nelleprim

esei

oredi

reazione.

-C

omposizione

dellesoluzioni

dilavaggio

perdeterm

inareil

quenchingdella

reticolazione:po

iche

lareazione

direticolazione,

seprolungata

neltem

po.puo’

avereeffetti

dannosisull’attivita’

enzimatica,

sie’

realizzatoun

sistema

dilavaggio

cheallontana

laglutaraldeide

econtem

poraneamente

reagìscecon

essabloccando

isuoi

gruppifunzionali.

Per

questosi

usauna

soluzionedi

lavaggioa

basedi

glicina(0.03

moii/L

in

tampone

citrato).I

gruppiam

minici

dellaglicina

reagisconocon

igruppi

carboniliciliberi

dellaglutaialdeide

fermando

lareazione

direticolazione.

La

valutazionedi

questiparam

etrie’

stataeffettuata

impiegando

unbiosensore

perm

isurareil

glucosiopiodotto

nellediverse

condizionidopo

l’aggiuntadi

lattosio5/c

Nella

figuraseguente

e’riportato

loschem

adelle

reazionicoinvolte

nell’imm

obilizzazionecondotta

conla

piocedura135A

-gi utaraldeideG

liesperim

entipielim

inaricondotti

inbatch

hannoconsentito

la

ceno:ia

fl

)ttlrz-

f)T(

,Iii

na

tt.

.LiO

Ibeh

4ata

cei

izaiii

qIllo

ian

r.tdell

inphcu

sfruttandoiC

5wre

ag

unc°n

unsein

plict

Lin

rnohii:z

za;io

ne

estata

cndata

iaian

do

mn

solu

Loe

dìta

rpone

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tenen

teB

SA

e[3--galattoida

arap

porto

i2

ela

glu

taradeid

ea!io

01

Que’

aso

luzio

ne

estata

mnata

aricircofo

totalead

una

portatadi

45

I/nonL

eanalisi

&attivita’

su’

perm

eato

conil

bioseusorea

glucosioe

lem

isuredi

assorbanzaallo

spettrofotoinetio1V

a280

unì

hanno

perm

esso

diferm

arela

reazionedi

reticolazionesolo

quandola

f3-galattosidasiera

statatotalm

entctrattenuta

dalm

odulo.A

ilinizio

delricircolo

infattie”

possibileriscontrare

nelperm

eatoil

passaggiodi

[3-galattosidasie

diB

SA

chedecresce

neltem

pofino

adanullarsi

inui

tem

po

massim

odi

5ore.

Concluso

ilnei

colosi

puoprocedere

allavaggio

dellaglutaraldeide

liberacon

ghcina0.03’m

oli/Lin

tampone

citrato.

eI

-aiu

iem

ci‘r

insi

‘a’e

noe

diazor,e

nociv

’e

;‘iuen

atz

rs;ehe

e1.an

se,a1lo

uta

naL

cI

!avaagìo.

(I)

tiO4

+Q

HC

—(C

i{2)—

CH

&

CII

(CH

)C

HC

4

rIfti

[iI

rt)

+no4

(I’)

1i,fl;

11--

-

39

i)9C

?Th3

27h

La

figurasuccessiva

mostra

ilfunzionam

entoper

230001-e

inconim

uo

delbioreattore,

nellaprova

diim

mobilizzazione

perreticolazione;

nelgrafico

sonoriportati

ivalori

diresa

idroliticanelle

seguenticondizioni

operative:tem

peratura30°C

,portati

dialim

entazioneI

mi/m

io,

lattosio2.

Ilcontrollo

dellaresa

idroliticae’

statoeffe

ttuato

conun

sistema

appositamente

studiatoper

ilm

onitoraggioon

line.L

eanalisi

delglucosio

prodottosono

compiute

ogni3

rnin

utiin

questocaso,

none’

possibilevalutare

iltem

podi

decadimento

dell’attivita’enziinatica

ola

vitam

ediadel

bioreattoreperche’

ilsistem

ain

3m

esidi

funzionamento

nonha

mostrato

nessundecrem

entodelle

sueprestazioni.

100

90

80

n

inI

500

1000

15002000

Ore

Questo

risultatoe’

paiticolaim

enteinteressante

percheoltie

adevidenziare

lastabilita

reattivanei

tempo

avaloii

elevatidi

rendimento

oc

stt

etse

eo

es

ilJU

le&

iIsisL

ema

faciimenL

estensibilead

unasa

iatm

partk

ua

superioreli

aiore

divita

nredio

ern

uto

r1li

rndiiio

nl

suidettee

ain

ten

irito

visto

IeI

esa

diproduttivita

e’una

rettaparallela

all’assedelle

ascisse.Per

valutareil

tempo

divita

media

occorronosperim

entazionipiu’

lunghe(I

anno)

i,2,2E

ffettodei_caricam

entoenziniatico

Inquesta

provasi

e’studiato

l’effettodella

caricaenzim

aticasulla

resaidrolitica

aparita’

dialtri

parametri

operativi.Sono

stateadottate

leseguenti

condizioni:tem

peratura30

Cportata

im

i/min

-substrato,

lattosio2%

e5%

Sonostate

effettuatetre

caricheenzim

atichesuccessive

(0.5,0.25,

0.25g

dienzim

ain

questoordina)

Per

ognicarica

enzimatica

ilbioreattore

halavorato

72ore

incontinuo.

Infigura

laresa

idroliticaviene

espressain

funzionedel

ioadingenzim

atico,cioe’

delpeso

seccodell’enzim

arispetto

allasuperficie

dimem

brana,per

ledue

diverseconcentrazioni

dìsubstrato.

70

=-It

!j

60[T

3CC

0,40

E0,6

00

01,0

‘,t¶2’

3¶,A

¶,E,0

balt

4c1dc

La

figuram

ostrache

all’aumento

dellaquantita’

dienzim

aim

mobilizzato

corrispondeun

aumento

dellaresa

ditrasform

azione

rf

in

-

.3-20

Lti14

oc

SC

iti

tte

98hocno

7-4’:er

ott

«2

on

nnid

0:ta

ciric

a

nnff?

(aquatr

ohinit

eri

s5

1r

dr,itc

he

OtiO

inte

er

o’

ra,iiia

lmente

er

tffe

uv

cdifl

ot

Gapan

deisubsri

aro

e

m?’

3iffe

todi

nibizioneda

rodottu

Effetto

dellaconcentrazione

disu

bstrato

La

concentrazionedi

substratrnotto

inipe

1tante

neldeterm

inare

laresa

idrolrticadel

bioreattoreN

ellatlzìna

Jm

ostratala

resaa

differenticoncentrazioni

disubstrato

neilarova

diim

mobilizzazione

dellaf3-galattosidasi

perreticolazione

—-

——

rtc

o0

5%

soC

C

40»

TS

QC

Q1P

s

Zo4t

oo%

2000

‘°n

Aparita”

dialtri

para

rnelii

ut

ari

tem

pera

tura

porta

tae

aric

a

enzrmarica,

minore

e’la

eoneenriazonedi

lattosioe

mangiore

e’la

resa

idrolitica.C

ioconseguenza

sia

dellaqua

ititam

inoredi

substratoda

convcrtrresia

delfatto

chela

quantita”di

giucocioe

digalattosrti

prodotti

e’m

inore

equindi

ancheil

gradodi

rnioizondovuto

algalattosio

424

Effe

tj4jIa

orL

ata

sulla

conversio

ne

Pa

portataha

neeffe

’dete

rimna

1culla

h)n

veIS

Icfl

in

t.ìi

ilt

ali

1i

•i

Ili)T

it

)Od

tt

1at ella

Wespiess

ilcid’na..r”,

‘droiti

‘,lo,ita’

diproduzio

te(m

digìut.osit

prcdc

itial

imnuto

sC

LICportata

‘olu

mena

diaPrnentaziene.

adue

diverseconcentrazioni

d2su

baira

to.

éilatt’tperaw

ndi

eserciziodi

30

Tnella

pio

va

diim

mobilizzaàone

c’frnka

di 0.5g

dienzima.

1dori

riportatiscio

ottenutifacendo

Lam

ediaaritm

eticasui

rischatiottenuti

in2.4

oredi

lavoroin

contin

uo

nelle

diversecondizioni

operative

rana

Effetto

dellaportata

QS(lattosio)

Vp

(mllm

m)

(g/i)

(mgfm

in)(M

gluc/Msub)

0.520

0.4590%

1.020

81081%

2.020

i3.0065’*

1.050

15.7563%

2.050

23.5047

k

Mentre

lavelocita’

diproduzione

aumenta

conla

po

rtatala

percentualedi

conversionedim

inuiscecom

econseguenza

didivers;

effetti:

-differentetem

podicontatto

trasubstrato

edenzim

a, chespiega

raumento

di resaa

bassae1ocita’

dialimentazione;

-lavelocita’

direazione

vienead

essereinfluenzata

daim

eccanismi

ditrasporto

diffusivodeterm

inantia

basseelocita’

dialim

entazione,e

daim

eccanismi

ditrasporto

wnvettivo

adalte

velocita’ dialimentazione;

inibizioneda

piodotto.cG

ntenutaad

alteportate,

lequali

pero’influiscono

negativamente

sullaiesa

idrolitic.a.

Aivello

d’p

rocso

siposonoscegliere

lecondizioni operative’del

dìo

iut

unata

dei

1.e

ete

tIla

j)r

idi

r’jone

Queste

evr-n

etroe

drien

atcdalle

presio

ne

diesercizio

chen.

ripi

tacella

nt

rehim

icad

Ilefb

reil

ite

come

supporto

42.5

Effetto

termico

Com

etutti

glienzim

ianh

la3

gaItto

sidas

subiscecon

latem

peraturaun

aumento

dell’attivita’catalitica.

La

letteraturariporta

cheoltre

il37’C

taleincrem

entoviene

controbilanciatoda

unadisattivazione

termica

pin’o

meno

sensibilea

secondadel

tipodi

enzima

edella

suacondizione

fisicaoperativa

(enzima

liberoo

imrnobilizzatoì(R

SP

etersonce

ai.,1989)

L’enzim

ain

oggetto,in

batch,presenta

unabrusca

inversionedell’attivita’

enzimatica

oltrei50”C

.Sui

reattore,e

quindiin

condizionedi

enzima

imm

obilizzato,si

e’voluto

verificarequesto

effetto.I.e

provesono

stateeseguite

siasul

bioreattoreottenuto

peradsorbim

entodell’enzim

asu

allumina

chesu

quelloottenuto

perreticolazione

conglutaraideide.

La

figuram

ostrala

resaidrolitica

delreattore

(imm

obilizzazioneper

adsorbimento

suyalluniina)

atem

peraturefra

55O°C

.

Drtttodw

igaH

uiifla

7LT

t4

dT

C50

TC

zol

C’orver

onea

dive.sets

upelature.(im

mobilzzazi

me

conA

1203)

ie

pr’

sonon

nn

eie

c’L

icondzio

mnncentia

zoie

disubnr:o’

(;lltCs

itonpone

citiate)carie

nzlT

aica

ggai

po

rtatadi

alimen

tazione

ml!m

Le

singoleprove

sonostate

seawte

senìp

rda

unperiodo

ailavoro

aduna

temperatura

diriferim

entoO

C)

persaggiare

ina

eventualedisattivazione

dell’enzima,

-

Nella

stessaprova

diim

mobilizzazione

uncontrollo

allatem

peraturadi

riferimento

(30°C)

mostra

chedopo

100ore

dilavoro

abasse

temperature

(5

e15°C

)l’enzim

aha

conservatola

suaattivita

catalitica.m

entredopo

80ore

dilavoro

adalte

temperature

(45-50°C)

e’visibile

ladisattivazione

termica,

Infattim

entreil

tempo

divita

medio

aduna

temperatura

di30°C

e’di

1590ore,

talevalore

scendea

200ore

peruna

temperatura

diesercizio

di45°C

eviene

ulteriormente

dimezzato

a100

oread

untem

peraturadi

50°C.N

ellafigura

vienem

ostratala

resaidrolitica

alletem

peraturecom

presetra

15°Ce

50°Cnella

provadi

imm

obilizzazioneper

reticolazione.

[-—

--—

o70r20F

Nella

figurasuccessiva

siriassum

onoi

risultatiresa

vstem

peraturae

siconfrontano

conquelli

ottenutiprecedentem

,ntecon

unm

oduloH

IPIO

-20con

unadensita’

dicarica

di1.66

rng/cm

.L

afigura

indicache

l’imm

obilizzazionecon

illumina

diminuisce

lievemente

ladi

‘attivaziont.term

cad

°ilenzima

rispetto

OO

O40t-c

h’

rimoh

ozzaziori.pe

to:dente

cliintervallo

ditem

peiatuia(

Moiv,

favotevolee’

i’apd

er

deto

otto

ut-

en

ienzima

Questa

proceduraoltre

adn

en

t;ufra

il10

eil

20

lerese

tnoduttivedel

reatezrenon

semC

ru

ostr

are

effettidi

disattivazionererjìica,

Questo

andamento

richiedeulteriori

conferme

sperimentali

operandoa

temperature

superioria

50

C.

E??tIri!

—-—

—.—

——

—----

DflZIrTS

IvcIi

—

0,_—

‘tpot

HW

1Q

’

40

ZZ

Mdrbtto

3t

13B

2020

320

4040

0)20

ker,,e

ralu

raO

Fffetto

dellatem

peraturasull’attivita

dell’enzima

imm

obilizzatop

er

intrappolamento,

adsorbimento,

reticolazione,

ieo

del

sierodi

latte

Nelle

provereattoristiche

descrittefinora,

sie’

sempre

utilizzatauna

soluzioneartificiale

dilattosio;

nell’ottimizzazione

delfunzionam

entodel

bìoreattorelattasico

afibre

cavee’

molto

importante

verificareil

suocom

portamento

inpresenza

delsubstrato

realeda

utilizzarenei

procecssoindustriale,

ilsiero

dilatte,

ilconfronto

daidati

diconversione

ottenuticon

esenza

ilcalcio

hannom

ostratoche

l’enzima

inqueste

condizioninon

risentedella

inibizionedocum

entatain

letteraturadovuta

allolone

bivalente.Infatti

laresa

idroliticam

edia(6

3),

inqueste

condizionioperative.

rimaie

‘irj’i

‘‘iia

tadti

‘o

Su‘so

iaiu

ntee

iii1ti

51Li

diai

Ultt

Il’ii

Ite

lan

la)SiO

deI

Lt?

Cliv

alat

ivI.r’Jatti

Nel

pro

diim

mo

nhzzazio

ne

di

SOQ

ui

ce

iar’er

1enco

lazlon

e,il

hio

reartore

aimen

tiaocon

o‘‘n

d’latte

ha;av

orau

I(Xi

orein

continuoC

oltem

ostrala

Punta.

Lt

rca

ottenutasi

e’

mantenuta

stabiieintorno

avalori

delP

SL

,non

evidenziandeonindi

ahunnaperdita

diattivta’

enzinmtica

Questo

risultatoe’

molto

importante

percheforniste

lehasi

peruna

ealespenm

entazionedel

sistema

alivello

diim

piantopilota.

Cb

b*

—Ia

ttosW

nI

0<

2;tts

0s!tic

44%

)

Olm

i’rnln

IT

flC

-J

,L

C_

,i

010

3000

0060

6000

6060

00ep

oC

h)

Resa

idroliticanei

tempo

conii

substrato‘cute’

ilsiero

dilatte

ultrafiltrato.

43

Conclusioni

Ilbioreattore

lattasicoa

mem

branae’

uninteressante

sistema

per

idrolizzarein

continuoil

lattosiocontenuto

nelsiero

dilatte.

Lo

studioe

1-osviluppo

delbioreattore

halo

scopodi

ieahzzareun

nroeessodi

valonzzazionee

recuperodei

costituentinaturali

delsiero,

n’eramente

basatosull’im

piegodelle

tecnologiedi

mem

brana(processi

separativibioreattore,

biosensori)Il

bioreattoreottenuto

perim

mobilizzazione

dellagalattosidasi

sufib

recac.

eo

tituisc

eun

sistem

are

attiv

on

ote

volm

en

te15’u’

avanzato

rimetto

adalto

supportienzirnatici

izeoliu,etro

poroso.sefarosio,

ai(

mdelL

arte

iLhe

lcici

rtt

4uili

delip

poto

riolt

‘udef

iìitee

o.

tv

entvalutabili.

Le

men

ìhrii.

afih

ecave,

come

qeeHe

poliso

lfnieh

impieg’ite,

vengonoom

mcu

aIizzaten

unrrasta

gamm

adi

poio

ita’,cut-off,

spessore.estensione

suprificialedm

enso

ne

deicapillari,

etcQ

uestim

odulioffrono

pertantonote

voli

vantaggipratici

aifini

dellaim

mobilizzazione

enzmatica.

rispettoad

altrisupporti

organicie

inorganici.F

raquesti

ucurdiamo

facile

proceduradi

imm

obilizzazionedì

enzim

io

cellulerealizzata

persem

plicefiltrazione;

possibilepurificazione

dell’enzima

durantela

fasedi

intrappolamento,

perperm

eazionedalle

eventualiim

purezzeattraverso

iporidella

mem

brana:debole

disattivazioneenzim

atlcada

paitedel

polirnerodi

supporto;soddisfacenti

flussidi

permeato

abasse

pressionidi

esercizio(

5m

I/min

a0,01

bar);distribuzione

relativamente

omogenea

sullasuperficie

dellefibre;

possibilita’di

recuperarel’enzim

aim

mobilizzato

persem

pliceinversione

diflusso

all’internodel

modulo;

possibilita’pratica

disceglm

ere,anche

infase

operativa,la

piu’conveniente

configurazioneidraulica

delm

odulo(ricircolo,

backfiushing,ultrafiltrazione).

Lo

studioin

oggettoha

consentitodi

correlarele

prestazioniidrolitiche

delreattore

allaspecifica

tecnicadi

imm

obilizzazioneim

piegata.I

risultatim

iglioriin

term

ini

divita

media

edi

resaidrolitica

delreattore,

sonostati

ottenutireticolando

conglutaraldeide

la-gaiattosidasi

ela

BSA

.Q

uestoaggregato

vienetrattenuto

dallam

embrana

polisolfonicain

virtu’delle

piu’elevate

dimensioni

molecolari.

Inqueste

condizioni,con

unsingolo

passaggiodel

substratoattraverso

lefibre

inbackflushing

siottengono

a30°C

reseidrolitiche

del97%

conlattosio

0.5%e

del70%

conlattosio

5%.

Lattivita’

enzimatica

delbioreattore

esprimibile

interm

inidi

reseidrolitiche

e/odi

produttivita’rim

aneparticolarm

entestabile

neltem

poper

2300ore

continuativedi

idrolisi,Inoltre

questebuone

prestazionidel

bioreattoresono

stateottenute

incondizioni

diesercizio

delsistem

aparticolarm

enteblande

pertem

peratura(30°C

)e

pressione(0

20

6bar).

Cio’

dimostra

cheil

sistema

operativodel

reattorepuo’

essereulteriorm

entestressato

perottenere

prestazioniarcora

SU

Ci

otisofr?ttutto

interm

inidi

ioduttv

ita’

‘an

n;

iicìoIc)saL

candIpro

dctt

nebtiiu

dtm

)

Anche

ele

migliori

giestazInTce!

reattoresi

r:ngt-r;

fl

acccl’

oe

de”attas

galci

rodi

sdiati,

ciqu

hope’

ar

iirentcon

allurnirapresentano

aicisvolti

ict

‘Sa

t.ega

i

soprattuttoalla

posit dita

diim

mobil

zzare

Iei

ima

susuppoiti

er9miei

nalternativa

aquelli

polimerici.

Da

unpunto

divista

economico

ilprocesso

studiatopresenta

alcun’

puntidi

forza

-ilcosto

dell’enzima

impiegato

erelativam

entebasso

circa2000

Litlg)

-l’enzima

e’in

gradodi

operaread

elevaterese

(709k‘

an

che

con

un

substratoda

sierodi

latte(lattosio

4.4%)

pecedentem

ente

ultrafiltrato;-la

quantit&di

monosaccaridi

ottenibileper

idrolisicn

r0.5

gdi

enzima

none’

valutabilea

pienoper

ilunghi

tempi

divita

medi

del

reattore,m

ae’

comunque

superioreai

100K

g;-il

sistema

e’particolarm

enteflessibile

persoddisfare

lediverse

esigenzedi

lavoroesso

puo’fornire

elevaterese

idroliticheo

alternativamente

elevatevelocita’

diproduzione

dim

onosaccaridi.

Questo

studioha

consentitouna

realeottim

izzazionedel

reattoreenzim

aticoa

fibrecave

precedentemente

studiatopnsso

l’EN

EA

interm

inidi

messa

apunto

delleprocedure

diim

mobilizzazione

edi

..ontrolloin

lineatram

itebiosensori,

Questi

dueaspetti

significativihanno

consentitorispettivam

entedi

stabilizzarela

produttivita’ad

elevaterese

idrolitichee

autornatizzareil

processocom

plessivodi

idrolisidel

lattosiocom

esi

richiedead

un

impianto

pilota.

4,4B

IBL

IOG

RA

FIA

Carasik

W.,

Carrohi

J.O.,

Developm

entof

imm

obilizedenzym

esfor

productionof

highfructose

cornsyrup.

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I..im

mobhized

enzymes.

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ileyand

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ewY

ork,N

Y,

(1976)

-‘

la\4

flt’jC

[iuafiìtrazio

licdi

enzimin

rnembr

rjanc

‘E.”

Wi;’P

B/87!3t

(i97)

iJd

aM

d..iessi

M.R

Rinaldi

A..

Satta

G..

Sandy

allumina

assubstrate

fnom

icand

highìyefficient

imm

ebilizationof

glucosidase,B

iotechen

g,

voI33.

777-779,(1989

Greenberg

NA

.and

Mahoney

R.R

.;Im

mobilisation

oflactase

(-galactosidafor

asen

Jairyorocessing:

AR

eview,

Process

Biochem

istry,F

ebJM

arc1981

IUP

AC

Com

pendiumcf

analyticalnom

enclature,D

efinitiveR

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iP

ergamon

Pres.

Preparato

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ica,E

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Lacey

R.E

‘Basis

ofE

lectromem

braneP

rocesses

cap1,

3-20,da

“1ndusUi

Pocessing

with

Mem

branes”E

d.R

.E.L

aceye

S.L

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(1972)i

Levenspaei

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Ingegneriadelle

reazionichim

iche,E

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Milano,

2ndi

ed1972

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arconiW

.,”lmm

obilizedenzym

es:their

catalyticbehaviour

andtheir

industrialand

analyticalapp!ications”.

Reactive

Polym

ers,11

(1989’)11

9

Messing

R.A

.A

dvancesin

Biochem

icaiE

ngeneering.V

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Mosbach

K,

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inE

nzimology,

Academ

icP

ressN

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ork,N

Y(1976)

Peterson

R.S

.,H

illC

.G..

Am

udsonC

i-I.;E

ffectof

temperature

onthe

hydrolysiSof

lactosehy

irnmobilized

-galactosidasein

acapillary

bedreactor,

Biotechfli

andB

ioeng..V

ol.34,429

437,(1989)

iP

izzichin

iM

..P

illotonR

..Z

edditaG

;S

tudiodi

unreattore

enzimatico

am

embrana

perU

idrolisidel

lattosionel

sierodi

latte,A

cquaA

ria.V

oi,10,

126311271.

(1988)

Inquesto

apitd

oci

occuperemo

deLm

odellom

atematico

deibioreattore

polisoifonicocercando

diottenere

unarelazione

semplice

trie

caratteristiche

geometriche

deim

odulo,le

variabilioperative

ela

resaid

rolitìc

delboreattore

Questo

studioe’

utileper

loscale

updel

piocessoperche

consentedi

stabilirele

dimensioni

diun

impianto

pilotauna

voltafissate

lerese

ele

portateche

sidevono

realizzare,L

oscopo

cuisi

tendenell’estrapolazione

dellecondizioni

operativedel

modello

all’impianto

e’quello

diottenere

lastessa

resae

lastessa

selettivita’

raggiuntenel

modello.

La

resadi

unareazione

chimica

inun

reattorecontinuo

e’controllata

dalle

stessevariabili

checontrollano

lavelocita’

direazione,

daltem

podi

permanenza

e

dalladistribuzione

dellavelocit&

deglielem

entidi

fluidoL

avelocita’

direazione

e’controllata

asua

voltadalla

concentrazionedei

reagenti,dalla

temperatura

e,nel

casodelle

reazionieterogenee,

daifenom

enidiffusivi.

Quindi

laconoscenza

della

distribuzionedei

tempi

diperm

anenzadegli

elementi

difluido

nelreattore

e’

fondamentale

siaper

lasua

caratterizzazionefluidodinam

icache

perun

eventuale

scale-upad

impianto

pilotaed

industriale.

ernan

enza

deli

elementi

difluido

Per

determinare

taledistribuzione

cipossiam

oservire

dialcune

tecniche

sperimentali

chepossono

essereclassificate

come

tecnichestim

olorisposta.

Lo

stimolo

e’costituito

dall’iniezionedi

unasostanza

tracciantenel

fluidoche

entra

nelreattore

(supponiamo

diaver

giasuperato

lafase

dim

essaa

regime

edi

trovarciin

statostazionario),

mentre

larisposta

e’costituita

dauna

registrazione

neltem

podella

quantita’di

traccianteche

escedal

reattore.C

ome

tracciantesi

puo’usare

qualsiasisostanza

chenon

perturbilo

statofluidodinam

icodel

sistema

inesam

ee

chepossa

esserefacilm

enterivelata.

Im

etodidi

stjmolo

sidifferenziano

peril

modo

incui

vieneinviato

il

tracciante.N

elnostro

casoe’

statoutilizzato

ilm

etododel

segnalea

gradino.A

l

tempo

t=0

vieneeffettuata

unaim

missione

agradino

diun

tracciantea

concentrazionenota

(C)

nelflusso

dialim

entazione;la

registrazionein

funzionedel

tempo

dellaconcentrazione

ditracciante

inuscita,

misurata

come

(C/C

)prende

ilnom

edi

CU

RV

AF.

1ltracciante

utilizzatonel

nostrocaso

e’il

glucosio50

mM

,e,

tramite

un

sistema

dim

onitoraggioin

continuo(biosensore

aglucosio),

sie’

seguitanel

poia

ai;Iooe

coicentraion

delglicos

nelpeim

eatoin

uscitaL

ecos

ottL

IauL

4eiie

ionnalizzatiinsp

itoalla

cuiien

traiuric

deltra

ccia

nte

inm

odoche

ilvalore

diplateau

risultiunitario

Sipu

odim

ostrareche

lacurv

aF

godedella

seguentepropriet&

:

(1)J[IF

(t)jdt=

t

tncui

te

iltem

pom

ediodi

permanenza

delreattore.

La

(1significa

chei’area

compresa

trala

rettaF=1

ela

curvaF

(t)rappresenta

iltem

podi

permanenza

delreattore,

La

forma

dellacurva

Ffornisce

info

rmazio

ni

sulcom

porta

mento

fluidodinamico

delreattore,

Per

idue

sistemi

idealidi

flussole

curveF

hannola

forma:

a)flusso

apistone

(2)F(t)=O

perO

<t<

t

F(t)l

pert>

th)

mescolainento

perfetto

(3)F(fl=

iet)

Nelle

figuresono

mostrate

duecurve

Fdel

VF2P3O

adue

differentiportate

dialim

entazione,

D-

oC

o

/,

O

:70.5

YF23O

0.4

0.3k

02

/

VF2

PO

;‘

/

06

06

2026

30

La

curvaa

Q=

12.7mllm

inha

laform

adi

mescolam

entoperfetto,

mentre

quellaa

Q=

2.13m

llmin

presentauna

“coda”.S

perimentalm

entee’

statonotato

chequesta

“coda”scom

parea

portate

Q>

5.6m

llmin.

La

presenzadella

codae’

dovutaalla

diffusioneassiale

del

traccianteche

diventapiu’

importante

erivelabile

abasse

portate.D

aqueste

considerazionisi

deduceche

ilcom

portamento

fluidodinarnicodel

VF2P3O

e’,con

buonaapprossim

azione,quello

diun

reattorea

mescolam

entototale

(Cheryan,

1986).In

seguitosi

vedra’che

questorisultato

e’stato

raggiuntoanche

pervia

teorica.Sono

stateeseguite

diversecurve

Fa

differentiportate

Qriportate

in

tabellacon

icorrispondenti

valoridel

tempo

diperm

anenza.T

alivalori

sonostati

misurati

integrandole

aree.

Tabella:

Tem

podi

residenzain

funzionedella

portata

Q(m

i/min)

t(min

)

1.118.23

2.910.92

5.69.86

7.36.41

10.76.02

12.75.85

13.75.24

17.03.87

irad

/i

tuJ.

!ci

inr

tta

difc

iodi

natal

UI

dia

aI

i.a

diaaL

iin

r‘r

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cheapp

ionadei

a:ì

LiJ

nìc

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ar

zionr

dellam

asca.P

eram

eIa

aam

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in!anca

iate,

bso

ena

innanzituttodefjqjr

ii

eoat

tadt

sistra

inasa

le

Infig

ur

e’r;;p

nsentata

laseza

me

lntudinale

dc-unafibia

cava.

___._L

__J

La

sim

metria

delsistem

ae’

iiindiica.N

ellatigura.

lefrecce

indicanola

direzionedel

camm

inode!

fluido(configurazione

hacktlushing).L

azona

I(esterno

dellafibra)

vienealinientata

con

lasoluzione

dipartenza:

nellazona

2(interno

dellafibra)

avvienela

ieazionechim

ica;nella

zona3

(lume

dellafibra)

sira

ccoglie

ilperm

eatocon

iprodotti

dellaicazione.

ae’

iraggio

inteinodella

fibra,b,

ilraggio

esteino.(h

a)

e’lo

spessoredella

fibia.r

e’la

coordinataradiale

conl’oiigine

posta

sull’assedella

fibracava:

Le’

lalunghezza

dellafibra.

Per

effettuareil

bilanciodi

materia.

ci

riteria

ino

all’elemento

jnfinitesirnodi

volume

dellafibra

cava,dV

,di

spessoredr

edi

lunghezzaL

.S

tabiita

lageom

etriadel

sistema

scegliamo

ilcom

ponenteris

petto

a)quale

nferiie

ilbilancio

dim

ateria:considcnanm

ilsubstrato

(S).

Allo

statostazionario

ilbilancio

dim

ateriarifeiito

all’elemento

dioItim

edV

iIspettoal

substratoe’:

EZ

ZZ

hL.

Le

dimension>

deitenni

iiidella

i isono

i>oli/tcm

p0)L

plieitiam

oara

iterm

inidella

il>.

li‘.uhsrato

entranell’elem

entodi

volume

condue

ima

Lan

imi

Jtr4ap

>nd>

inateiin

,

!U0!

%t1

1W1P

:iai

a1If

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UO

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safl

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epa:

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—’Il

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11:

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d:1

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3.

—(

‘

-‘a

’i.

‘a:t

.‘t’

ana

‘‘.

•1u

Li

Cf

11011IIL

Ooak

alfl0

t10tL

jledi

1rc

soro

Ii0II

diubsti

iiii

;ci

une

dii

lozionein

[tch

)(tem

po)\

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nd

iiferir

i:oeìei

dìa,

r:ttchalla

unita’di

massa

dei

ae(enzim

aar.a’

heai

voiuna.d

zio

nO

sZ

i0iflO

scri’ere:

iflOIl

SL

OO

VC

F1

ItCtenìptr’

\tu

Ine

Vciiu

meb

,rtl

ino

i8

con

eriitetcm

poi

j=t moli/m

ionigE

)

Seora

definiamo

ladensita’

didistribuzione

dell’enzima

infibra

come:

[6di__

__

-—

F(m

g)quantila

dienzim

ain

fihra

VF

(dio=

volume

dellefibre

cave

sisuppone

unadisti

ihu

zote

deilen

zima

infibra

uniforme

cioe’indipendente

dar

spuo

scrivere:

(‘max

)=fl

‘‘rtmx

\(dm

)/EhtC

l(ang)j [

E1;(

mg)/V

(drn

3)]=

__

__

__

__

__

_

=(m

oii

Sconvertte!m

andm3fihr

__

___

__

-1Q

uin

dtra

(V,.j:4

)hespresso

ìflm

oliì,nuì

4ingE

nz?e

Vrnax

(velocitadi

reazionein

fhra)

esre

ssoin

moli

rnin

1(dm

afih

ra)esiste

unfattore

diconversione

chee’

semp

Icemen

tela

densitadi

distribuzionedell’enzim

ain

fibra.D

obbiamo

considerare,inoltre,

chel’enzim

a,durante

ilprocedim

entodi

imm

obilizzazione,pecialrn

ente

sedi

tipochim

ico,subisce

unaperdita

diattivita’

dovutaalla

denaturazioneirreversibile

diuna

partedelle

molecole

enzimatiche

Di

questofenom

enosa

tieneconto

mim

eicamen

teintroducendo

nella(7)

un

coefficienteadim

ensionaleO

<1)<I

dettorendim

entodi

imm

obilizzazione.D

alla

(7)n

risultaunivocain

nte

definitocoinr

(Marconi,

1989):

po

‘iie

0\‘F

!\

ma

ìha’c

\‘batehiE

E/L

batc’ì=

Li

9c-

Iciì

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Y1

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I]+

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di;dc/di;

r(djd

r),i

Sviluppando

gliin

cie

iien’i

InhiniteinHe

ricordandoche

v(’)=

Q/27tL

Nr

locitaradiale

diflu

ss)si

ha!eq

uazio

wdifle

renzia

le:

‘9)/2

Thi1

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dc/rd

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Per

guneralizzareI’e

juìio

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traslorniian/

la(9

)iiloim

aadim

dnsio

nale

u1

ii

andole

seguenti

sostituziom:

R=

r/bdi

bdR

C=

c/c

0dc=

c1dC

KM

kO_d.9K

i43

(I O)d2C

/dR

24(i+

Q/2

7tL

DN

)dC

/RdR

=[h

V*

2°

)j

tira

ppolto

intrinsecocioe

inL

UI

compalono

grandezzeappartenenti

tuttetk

stesSo

sistem

a)

(Q/2T

hLD

N)

eun

num

ero

adin

iensio

ntlu

.d

esso

vienedato

“om

edi

Num

erodi

Peclet

(Pe)

eia

ppre

senta

ili ;m

ppoitutra

ilm

eccanism

odi

TL

porto

diInatiiin

moto

dila

siem

ee

anello

ditra

sporto

dim

ateriaper

fN

0fli

anIm

ale.

ii’111

:e•cia

LO

flÌ1iiC

ucfla9

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,il

(Il.s

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dii.

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Il;’t’:‘‘ccc

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ai.

lai0

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ct;r;-Iv

ddi

114

-

!-$d

Rt4(

1:iuCIR

dR$“Q

1W.:9P!

tit443)O1

-

Ie

condJ7inILai n,ntonic:

sone:

(-Ip

cR=

l(12)

dC’AIR=O

itiR

=aìb=

r1

1a

UI)

e’un°quazione

differen7iaicdel

si’condoordine

acoefficienti

vanabili.L

integraledella

(li).con

lecondi7ioni

(12),e’

unafunzione

diR

,(=

f(R)

cheiappresenta

ilprofilo

diconcentiazione

dclsubstrato

all’internodella

fibra

La

secondacondizione

della(lu

ideriva

dallaconsiderazione

cheper

R=

r1

siannulla

ilflusso

dim

ateiaper

diflu’ioneradiale,

cio’com

portache

ilprofilo

diconcentrazione

intale

p’inloha

unatangente

oiinontale.dC0

perR

=n(

lafrazione

disubstrato

nonconvertita

cheesce

dallafibra,

quindiI-C

JC

’0=

Xtappresenta

laconversione.

La

conversionee’

lagiandezza

chesi

determina

diiettamente

mediante

lam

isuradel

glucosionel

permeato.

Detto

questoil

passosuccessivo

e’quello

delconfronto

deidatidiconversione

calcolaticonla

(11)e

la(12)

conquelli

misurati

sperimentalm

enteA

taleproposito

sonostati

detenninatisperim

entalmente

ivaloridicon’eisione

infunzione

dellaportata

nelleseguenti condizioni operative:

-quantita’di

f3-galattosidasiim

mohili,zata

infibra

1500mg

-T=

30°C-p

H=

4.5

0in

tampone

citrato25

inMconcentraiione

inizialedi

substrato=0139

M

Dalla

(ll)sisede

che.

Xrf(O

43.sP2.

Pe)

O.[

3.’1rso

no

suot :ak.1:ati

LiiiIirIan’Iui

valorinum

t’rci•‘e’

ewan

’err.della

I

)

•JltG

%.d

4’t

:1.icm.n

afl‘M

C•k

iItai!iltide

nbat

1’.1

1 =3(f’(’“

pH=4.5U

I°p

ym

inel reattntt

I‘‘u

4ak’%

f4.r,pIp

a1:,c’

aseiaila

dire

azio

ne

e

d(

IIt

-Al(

$lliain

(Ril

capitol’3)

Ci:”

s:gnificaclic’

i attivitatotale

imm

nbilin,ilauIle

fiNe

secondoE

datidei

sitch(denom

inatoredella

(8)e’:

lOM

/imn

0.050I

ISCi., mgIO

.3m

g—

7.5iolilnan

quesw

puntogli

unicipara

metri

dellacurva

C=f(R

)re

stano

ilnum

erodi

I’.clet(dcc’

inultim

aanalisi

lap

orta

tadi

alimentazione),

edil

rendimento

di

imm

obilizzazioneT).

-

La

(II)

e’sta

taintegrata

numericam

entecon

l’ausiliodi

uncalcolatore

MS

1)05286

edun

pro

gra

mm

ain

basicclic

utilizzail

metodo

delledifferenze

finite.ale

elaborazioneci

fornisceil

valoredella

concentrazionedi

substratoin

7punti

sII’f

bra.Il

problema

principalee’

quellodella

determinazione

diT). Q

uestosi

risolve

asse

gn

an

do

valoridiversi

adfl

econfrontando

ilvalore

diconversione

calcolato

aduna

portatadi

alimentazione

conquello

ottenutosperim

entalmente

allastessa

portataA

llaportata

Q=

lml/m

in,X

sper=

(38

±O

.5)%

con1)=O

.8si

ottiene

Xcalc

•=4S

YO

con1=

O.6X

jc=

4O5%Q

uestosignifica

cheil

rendimento

di

imm

obilizzazione,che

tieneconto

deim

olteplicieffetti

sulrattivita’enzim

aticadovuta

allareticolazione

conglutaraldeide.

alleinterazioni

conil

supportoecc.

puo’essere

calcolatoin

modo

indiretto.Si

e’assunto

come

rendimento

di

imm

obilizzazioneT)=60%

.In

figurasono

riportatii

profilidi

concentrazionedel

substratocalcolati

infibra

allevarie

portatedi lavoro

e

__

__

__

__

__

__

__

__

__

__

____

____________

T$

‘C

FIBRAs,•u

i

UI

‘a.

..-

—.

‘a

ai.

.-

—‘G

iulia

•l’a

---a

H(L

:-

sai:iaila

1oace

dJ

a3a7t:

c’’azt

-ra

rn:i

e-autom

a‘

t;øt

di

9che

ind

uen

iasolo

ildIu

-:‘-o

nv

.dw

ac;llo

di.Nin

azi

ied

Su

dii

iibrae

rarlcuanentepia

na.

bi

altr

auaer

dipantaL

diu%

mcntaziane

esplorato.Q

uestodeiiva

dailassu

azio

ne

iriiziaie:o

nd

ala

qualeil

reattoreenz1m

atcoa

fibreco

tS

ico

mp

orta

co1re

an

-aJto

em

esco

lam

en

toperfetto.

Questa

assunzionee

peraltroconierniata

a1

veilo‘periinentale

dalprofilo

dellecurve

F.L

bpotesidi

unadistribuzione

radalc

uniforme

delien

zima

nonrisulta

unapprossim

azionegrossolana

prpi

cpcrcfìe

ilb

ioeatto

resi

comporta

come

uneattore

am

escolamento

perfetto(la

onla,

19901re

llafigura

segin

oe

n-dltabella

sonocontrontati

ivalori

conversione

ottenutisperim

entalmente

adiverse

portatecon

quellicalcolati

ponendofl=

0.6.

Q(m

i/miri)

Xm

iX1

0.9(7

6.0

±l.6

)dt

76.0%1.8

(61.4±0,5%

64.3%3.4

(5362

.2)%

52.8%4.8

(47,0±0.41%

47.0%6.0

(414±1.21%

43.0%0(3

8+

0.5j%

4ft5%

X.=

l.O2’X

a.lg

i=

0.9

94

mts

calcr=

0.989

se—

——

—-

\o

Xcco

blo

7C

\T

ao

5

aL

.

5$

5O

l&lfl)

Conversione

infrazione

dellaportata:

t’onfrcntotra

idai’spc

ncntalie

quellicalcolati

53

Determ

inazionedello

stadioco

ntro

llante

Stabilito

ilcornportam

entdcl

itattore

ele

equazkrn

cheIo

descrivono.vediam

odi

analizzare11

processodi

idrolisienzim

aticaper

stabilirequale

stadiorontrolla

lavelocita’

deiprocesso

globale.L

avia

seguitaper

questoscopo

e’quella

empirica

(Dente,C

appelli)che

consistenell’esam

inaresperim

entalmente

‘effettodi

certevariabili

sulfenom

enosenza

conoscerele

equazionifondam

entaliche

loregolano.

Questo

metodo

eparticolarm

enteadatto

quandosono

ingioco

resistenzechim

ichee

diffusive,Si

eagito

inparticolaie

sullatem

peraturapoiche’

ingenerale

adun

aumento

ditem

peraturasegue

unaum

entodelle

velocita’dei

processichim

icie

fisici.In

particolarela

velocitadi

unareazidne

chimica

e’piu’

sensibilead

unavariazione

diI

abassa

temperatura

chenon

adalta

ejO’

derivadal

fattoche

illogaritm

odella

costantecinetica

diuna

reazionechim

icae’

funzionelineare

dii/I.

Siintroduce

percio’un

coefficientedi

temperatura

definitocom

eil

rapportora

duevelocita

direazione

misurate

aI

e1+

10°C(in

cuiprefenbilm

ente=

15°C).

R(T

=l5

C)

Un

coefficientedi

temperatura

maggiore

di2

caratterizzaun

regime

chimico;

uncoefficiente

minore

dii

5caratterizza

unregim

edinam

ico(nel

nostroaso

diffusivo).N

eicasi

intermedi

puoesistere

unregim

em

istoch

imico

dinamico.

Infigura

e’riportata

laproduttivita’

infunzione

dellaI

nellecondizioni

operativeindicate.

H-

OC

3fr•

o. cz105

2026

3002

.015

50tW

r$tU

C

Ilcoefficiente

diT

e’:

1.2<1.5

questorisultato

ciperm

ettedi

affermare

cheper

Q=1

mi/m

iriil

regime

e’

diffusivo,cioe’

lostadio

checontrolla

lavelocita’

delprocesso

equello

della

diffusionem

olecolare.Inoltre,

l’analisidel

numero

diP

ecletm

ostrache

il

trasportodi

materia

perdiffusione

molecolare

e’significativo

intutto

ilrange

di

portatadi

alimentazione

swdiato,

Tabella

8:N

umeri

diP

ecleta

diverseportate

dialim

entazione

Portata

(mllm

in)N

umero

diP

eclet

0.90.02

1.80.04

3.40.08

4.80.11

6.00.14

7.00.16

4)i(

iuS

iu1

iin

questocapitolo

sonostate

correlatele

caattcristiche

geometriche

de

modulo

daultrafiltrazione,

lecondizioni

‘perativealla

resaidrolitica

delht

reattore.L

erese

idrolitichepreviste,

calcolatese

condo

ilm

odellopresentato,

fappresntanom

oltobene

idati

sperimentali

ottenutiL

asoluzione

dell’equazionedifferenziale

ottenutanum

ericamente

conlau

siliodi

unpersonal

computer,

nrm

ette‘a

simulazione

delbioreattore

conla

conseguenteopportum

ta’di

stabilirele

dimensioni

diun

impianto

pilota.Si

e’potuto

inoltrecalcolare

ilrendim

entodelhi

imm

obilizzazionechim

icaettenuta

conalutaraldeide

e13SA

descrittanella

precedentesezione.

E’(la

notareche

leparticolari

condizionioperative

incui

sisvolge

imm

obilizzazionechim

icainfluenzano

relativamente

pocol’attivita’

dell’enzima

circail

6O

-di

quelloottenuto

conl’enzim

alibero,

inbatch.).

Questo

risultatoe’

diparticolare

importanza

poiche’conseiìtedi

realizzareii

processocon

l’enzima

imm

obilizzatochim

icamente,

ottenendointeressanti

risultatiper

quantoriguarda

iltem

podi

duratadi

unsim

ilesistem

a.

SS

BIB

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hydrIv

sIsnf

icoe

hm

mnm

hilizrd.3

gilatu

dae

ina

rapillamy

bedT

eaLtu’.

Rjm

rei.

•L)

ir

iquest)

crpitoloF

irnmobiIiizazion.

deU

iocatalizzatoreper

UidroIii

dellattosio

vienecom

piutasu

diun

nuovosupporto

pervalutarne

leprestazioni

ela

realizzabilita’in

scalapilo

ta11

supporto,di

materiale

ceramico,

costituisceun

materiale

diparticolare

interesseper

lesue

caratteristchestrutturali

chelo

rendonopiu’

resistentealle

piessionielevate

ealla

temperatura

eper

laprocedura

disterilizzazione

erigenerazione

chedovrebbe

consentireÌi

totalerecupero

dellaperm

eabilit&per

unelevato

numero

dicicli

operativi.L

oscopo

diquesto

lavoroe

diverificare

lafattibilita’

delprocesso

diidrolisi

enzimatica

el

lattosiocon

questonuovo

tipodi

supportoe

diporre

lebasi

perlo

sviluppoin

scalapilota

ditale

sistema.

Si&

procedutoalla

imm

obilizzazionefisica

della3-galattosidasi

utilizzandouna

procedurache

consentela

totaleritenzione

dell’enzima.

Questo

sistema

&stato

confrontatocon

unbioreattore

sviluppatoda

Pizzichini

etal

(1989)su

fibrepolisolfoniche

conim

mobilizzazione

fisicadel

catalizzatore.C

ome

sivedr&

nellesuccessive

sezionidel

lavoroi

miglioram

entiottenuti

utilizzandoquesto

tipodi

supportoincoraggiano

laricerca

neicam

podella

fabbricazionedi

nuovebarriere

congeom

etriepiu

adattee

dellaim

mobilizzazione

enzirnaticacovalente

sutali

supporti

obilizzazioneeiiziniatica

6.L1

Pro

cedu

radi

caricamen

todell’enzim

a

La

barrieraceram

ica,costituita

dauno

stratom

icroporososu

cuiè

depositatolo

stratoesterno

dict-allum

ina,presenta

uncut-off

molecolare

(MW

CO

)che

nonperm

ettel’im

mobilizzazione

della3-galattosidasi

perintrappolam

entofisico

(pesom

olecolarem

edio90.000

Dalton),

Infattiun

confrontodell’

assorbanza(290

nm)

(Mc

Bean

etaL,

1978)effettuato

trail

flussodi

permeato

ela

soluzioneenzim

aticadi

alimentazione.

ham

ostratola

totaleperm

eazionedell’

enzima,

Per

realizzare1’

imm

obilizza7ionefisica

dell’enzima,

èstata

messa

apunto

unatecnica

dicaricam

entoche

permette

latotale

ritenzionedel

catalizzatoresul

supporto.L

acarica

enzimatica

vieneeffettuata

inviandoI’enziirw

dissoltoin

una

sospenkne

diT

alluni

a(100

tnj

nm

poneitrato

(2m

pH45),

in

unvulum

einiz’ale

lì300

ml

aricir

oioto

t1e

‘iCIIeatf

lTe

eJ

altaportata

(50rnllm

in)N

eiprim

i15

minuti

-ogni5

minuti-

siaggiungono

all alimentazione

aliquotedi

100m

ldi

tampone

citrato25

mM

cadauna).in

modo

daottenere

ingradiente

diconcentrazione

dell’enzim

ae

dellay-aliurnina.

Sperim

entalmente

èstato

notatoche

ilgradiente

diconcentrazione

migliora

ladistribuzione

dellay-allum

inae

dellt

enzima

sullasuperficie

del

supporto.E

sauritaquesta

fase,la

portatadel!’

alimentazione

vienzdim

inuitaad

unvalore

dicirca

5m

llmin

perperm

ettereun

efficaceadsorbim

entodella

y

allumina

edell’

enzima;

l’interaprocedura

dicaricam

entodura

circadue

ore.

Isuccessivi

caricamenti

de1’enzim

apossono

esseredirettam

ente

eseguitisugli

stessim

odulisenza

ulterioreaggiunta

di7-alium

ina,previa

combustione

deiresidui

organiciin

muffoia

a750

Cper

almeno

setteore.

Tale

tecnicaha

permesso

l’imm

obilizzazionedei

100%dell’

enzm

a

6J2

Controllo

dell’im

mobilizzazione

11controllo

dell’m

rnobilìzzazioneviene

effettuatoad

ogni

caricamento,

attraversola

verificadell’

attivitàidrolitica

sufrazioni

di

permeato,

dopodue

oredi

ricircolototale,

mediante

unconfronto

conuna

ugualequantità

disoluzione

dell’enzim

aprelevato

prima

dcii’

imm

obilizzazione.T

uttele

provehanno

dimostrato

1’assenza

diattività

lattasicanel

permeato

dopodue

oredi

ricircolototale.

Dopo

essersiassicurati

dellastabilita’

dell’imm

obilizzazioneenzim

atica,

sie’

alimentato

ilreattore

conil

sierodi

latteprecedentem

enteultrafiltrato.

Gia’

dall’analisidelle

prime

frazionidi

permeato

sie’

notatauna

elevata

attivita’lattasica

cheindica

evidentemente

lapresenza

di-g

alattosid

asinella

correntedi

permeato,

Questo

comportam

entosi

puo’spiegare

assumendo

chela

[3-

galattosidasisi

imm

obilizzasul

supportoceram

icoper

adsorbimento

fjsico,

infattile

sieroproteineancora

presentinel

sierodi

latteultrafiltrato

spostano

perazione

dim

assale

molecole

dienzim

adal

supportosostituendosi

adesse.

Da

questaanalisi

risultache

latecnica

diim

mobilizzazione

sopra

descrittanon

e’adatta

all’applicazionesul

sieroche

sivuole

effettuare,U

na

viada

seguirenello

studiofuturo

delletecniche

diim

mobilizzazione

e’

quellache

prevedel’attivazione

delsupporto

ceramico

perconsentire

mo

o’a,

himic

de’n,

‘dian

tt

rmaiio

ne

dun

lecanie

en

atene

Ao

rLp

sutod

srgnalaie

illa

oiodi

Nakajim

at

liii

i1989)i’

‘i.i

‘ii

‘ìutorioropon’onu

diatti

vaie

i Isuppoulo

ceramico

mediante

silanizzainne

Icate

Icui ‘ma

conun

lcgune

covalentecon

la

glutarall

iJo

Inn’sto

lavoro,i

risultatiotW

nuicon

Iiniu

nohilizazio

ne

fisic

’ìhanno

tuL,V

Ta

Uh

I)!\a!idita

je1cIleC

onsCnknO

lavalutazione

delsupporto

CT

Ui flkO

Iai

speru

nenta

zio

ne

t’utwa

iguird

eni’

lesti

apolazio

ne

deirisultati

Otte

nuti

suim

odulo

poliselfonicoV

iiiP

30( P

arte11.

imm

obilizzazione

os

aLente

dclhuc’catalizzatorc)

alsu

pporto

cetamico,

inm

ododa

unirei

vanta

iel

dilIue,T

’uluiunQa

iiCil

(ICIiUiiuunobilizzazione

enzimatica

cnvaler,w

fu!$

Influ

enza_

delr

imm

obilizzazio

ne

suIla

meabih

tìì

Iapre

senza

dellenzim

ae

dellay

allu

min

asul

suppoatoceram

ico

intlu

as’o

no

suìa

permeabiliP

ì,che

com

unque

subisceuna

diminuzione

non

sotanziale,

Infitu

ia

veio

no

inostiate

O.pern

ieahil

itìia

0°

(di

una

bainera

ceramica

nuova,

dopo

l’aggiu

nta

dj

ailum

ina

edopo

lai igene!

azione.

le+6

‘ie3

3ea

t)

i:

(uyn/crn

i)

tF

tcI

(d

[ii

ova

tii

eIi

ici

niu

inn

obiiizat

liq

csa

conla

medesin

ìja

ntta

diC

nfima,

1op

da!L

amenro

[Iflì

C

•N

iovoO

Aflo

nin

a÷

Lrizim

a•

fit,cnrra!

atJ\1

iIHlr1

a.

E-:n,[fl1)

(0e0

2e0

4ei

1e÷

Sipuo

notarela

rigenera

zio

ne

nonaltera

lapovosita

deisu

ppo

rtodopo

l’aggiuntadi

allumina.

6.2T

EM

PO

DI

RE

S1D

EN

z1

E\IO

DE

LL

O[L

IJID

OD

INÀ

MIC

O

11confronto

(aparità

diportata)

trale

cuiv

eF

deicasi

idealie

dein

ostro

sistema

cip

cim

ette

diconsiderare

(conbuona

aLprossilnazione)

ire

atto

recera

mic

o(R

.CL

)com

eun

reattorecontin

uo

idealea

mescolarnento

totale(vedi

figw

a).

/rno

—

2e4

--

P(‘n

;’m2)

io

LL

0,6

O4

oA

4rk

ro

Piuq

fow

02

13m

lI

I-

30C

‘)4(

9w

uiì

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’4r)i

saI

4(1

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1lI

DM

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I[).

\L1U

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-

09 001

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LoO

O3J

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r)09i0

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1505

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10. L

IIU

I

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13

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05:0

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IJO

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HP

50301

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3>1

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kL

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6.

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)IIt.C

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cita

(hui

it

epre

taz’ìm

aJ

LxeattT

een

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csse

neC

Ren

tuale

dcl

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’ii7,e

com

ee

iirazx

iiede

tLis

ileosin

1 ro

dì7in

!o

no

se1eii:i

disO

i,

nedel

iiiH

UL

lìguantita

dil

ucosiopi()dotta

iun

inim

ito(in

g/win)

e1

lem

am

alieo

ndzio

ni

opeiaiise

delieattoie.

iltiend

della

produzionedel

glumaio

neltem

poassiune

ilinofilo

cara

tteris

tico

dei

hio’istemi

inìn

ìub

lizZ

au

sudl\

CIS

Cm

anic

i<

(usak

ov

cial.

9S

7S

cott.1985>

.T

ue

curvapresenta

un

massim

nn

elle

prim

eore

ditunziunam

ento,e

ag

iunae

unotat

tazio

nai

run

elle

ne

su

ecesiv

e.

infigura

25son

o

iii)st1

atii

prodIdella

selocH

adi

produzionedel

glucosion

el

tem

po

per

varie

tempeta

uieopeia

tIea

con

centiazio

ne

disubstrato

costante(50

g/I)

En

zima

=20

0rng

3(1

Periidui

reI

teiineila/u

nix

allintei

no

delle

atto

2si

eim

pie

gato

un

batteiios

atiro

(suiL

atodi

potassio(4

[cli

ettO

dellaci

escita

batte

rica

si

manitesta

iiiItl

eo

ine

tino

spui

ain

eiì o

dI

supoi

Ocon

eo

flseg

tien

te

aumento

dellaseN

isteil/adi

inein

Luni

•10’c

°2(rC30°C

]40°C

ti2

4o

xiO

21416182022242628

Ore

dilavoro

oo

ii

i1

ota

eiìin

ad

i!suljser

110cn

)1tP

tC

vai

uoi

sa

1Ì-’flIia

CIit

/11iR

Idl’lu

siiprodo(t

iufunzione

dellIfl

\t

51’de

tlportata

(i

tCii’

piO

iIIIa

cefl

cui

i:iz

ttteP

substr

ato

costatc)si

ita

ciie

ladipendenza

mostiala

tit’igura

7

1’30”C

Erìzrn

a200

mg

Effetto

dellate

nera

tura

sullaresa

1/Om

in/ri

La

resaidiolitica

arimenta

alcrescere

dellatem

peratma

direazione,

chee’

responsabile.d’altra

parte.della

denattiaazione

dell’enzim

a.E’

espre

ssio

ne

matem

aticache

rappresentala

velocitìidi

disattivazioneper

sistemi

adenzim

aim

mobilizzato

èdi

solitoun’

equazionedifferen

zialedel

primo

ordine<

Shan

iianY

angcu

al.i8

9:

Peterson

etal..

1 989>:

dA/dt=

KjA

lacui

soluzionee:

AL

A()

c’xp[K

dtj

dove.A1

èla

costanteK

dIlo

steptircveH

lbiledcli’

idrolisitinin

),m

entieK

de

lai

stantedi

dc

ai

me

ntlì

iii

e

16’E

12’

lo0.00,i

0,20,3

(340,

0,607

0,

(3,91

0

Oe

s‘a

viene‘1dI\

idi

‘aie

ntc

‘ei

enzuna

iz

pc0’i

iti

et

OO

mzia1

PLc

dctcrminazione

citef’p

ooi

diiczzd

muto

jIreatto

n

ern

triz

iìc

(anOp

aun

tenipodi

1iiicn

100ore

eiIa

ra

verwuno

rio

str

atii

iandain

ritidell

alo

iiidi

pre

lui

ia

e‘i

di

erse

upera

ture

opera

tive

Fnztrn

9200

rnq)t.)

—

28i

.,•.

..,.•....

.••

..•.“.

ng/n

JOT

26i......

oI

cig

/min

‘.

C2422•

20“

18l614i2

-*4»

.

10-—

i—

t—

1020

.300

7080

90100

Ore

eìavoro

Dal

graficodi

figura,si

èpotuto

verificareche

1’enzim

aim

piega5,5

io1ni

(a53

C)

perpeidere

lam

età

dellasua

attiv

ità,

mentr

eil

tempo

di

dimezzainento

a30

(‘è

giàdi

71

gioini.

Inbase

aquesle

informazioni

siè

potu

totrascurare

Ieffetto

della

lrsauivazioneterm

icadel!’

enzima

nelcalcolo

dellecostanti

cinetiche.

4jtm

titàoi

Un

obie

ttivo

diquesta

cantici

iìiazio

nc

quellodi

individuarela

uan

titàdi

enzim

anecessario

adid

rolizare

ilI 0(Y

fdel

lattosiodell

Ili

ne

ola

zio

ne

Man

tenen

do

leco

ndii

ionioper

alve

coian

(r(H

()(.

latto

sio

56

cd

ma

poita

ladi

1,6rn

Unin

)si

iraL

(’ti(atrin

icm

va

dellaresa

nF

unio

ne

delia

—

—1

‘‘—

CT

))

*4z—

It—

—--t

-

—4-—

—-—

-—

---—

——

-—

—

1)a’dati

cineticie

dalIen

iialie

Wdim

ensionamento

delreattoie

siprevede

una

coicr

sionedel

I0(Y%con

unaquantità

dienzim

apari

a500

me

Sperim

entalmente

pertale

quantitàdi

enzim

isi

èriscontrata

unaconversione

parial

97,4

(/,che

dimostra

chein

questecondizioni

nonsi

èancoia

giuntial

valoredi

saturaiioncdel

supporto.E’

statoriscontrato

chee’

possibileim

mobili

zareI.à

dienzim

asu!

supportodi

allum

ina

64

ift)I)EL

l()U

lNE

ii(()

64,i

Cin

eticain

hatch

dellai3

G.

lattosid

asi

sellaparte

idi

quro

lt’oi

‘gia

affrontatala

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-calattosidasi,in

queNio

entcs(o

Lsi

liinta

ariportare

ilifo

rma

grafca

iris

ulta

tisperim

enl

‘1ottn

ui.

i,(‘

(

(

(i

20io(3 V

±E

z±zE

z*Hz

J__

——

—-

——

i0

100

200

300

400

500

(00

700

800

900

000

mg

Enzim

a

013

002

0,010,00

0,010,0

20,0

30,0

4

i/S

Linew

eaver-Burk

pjL

div

erse

tenip

era

turc

inaSscn7a

diinibitore

18161412IO8O4Lo2

(E)-

0,lg

/lY

401.

0,0

30,0

20,01

0,000,0

10.0

20.0

30,0

4

•1/V

1/V

I-IO

L

iine’veaver—R

nuknlot

i 1(1(

innresenìii

diinibitore

Dai

erahcidelle

t’uue

sottcn

ono

valorideile

variecostanti,

(i

:“

-•-

I/

unti

nelletabelle

successive:

ì

:‘‘b

»kllP

t3C

.:2

J.fljjQ

t4

i.-in

izh

k.

(i

im

iii’

031652,0

e2f

0.9982(0

(‘45

S5

11

8820,998

30.0S9.nS

12.600.999

4000,S

367.34

16,550.997

sooj

2..j1

0,997

Tahella

Costanticinetiche

inpresenza

di inibitore

£11V

max

(g/i)(m

Mlrni’i)

(m.M

’

0.006.835

0.000,997

5,000,811

14,150,9%

10.00.900

14,540.997

Le

valutaz‘m

itern’od’nam

ichevengono

effettuateutilizzando r

ipotesi

attribuitaad

Eyring:

ireagenti

fonnaneun

complesso

attivatoper

poi

decaderenei

prodotti.tale

compleso

atti attoè

assuntoin

equilibriocon

i

reagenti chelo

formano,e

quindi lecostanti

di equilibiioassum

onola

forma:

K2=kt (kT

lh)K#

dove:kt

èil

coefficientedi

trasmissione.

Tla

temperatya

assoluta.k

edh

sonorispettivam

entele

costanticli Boltzm

anne

Planke

Kè

lacostante

diformazione

delcomplesso

etiivato.N

ormalm

entenelle

reazionienzim

atichein

isteiiiiom

ogeneisi

considerakt=

l<W

alter.I 965>.

Seora

trattiamo

Kcom

euna

qualunque

costarneterm

odinamica, possiam

oscrivere

che.

K2=kt (kT

/h)expL-A

G/R

T]

doveSE)

èr

energialibera

molare

standarddi

formazione

del

complesso

attivato.Dalle

espressioni termodinam

iche:

AG

*-rSll*.-TAS*

4

(L

6t(

—N

’‘

O?U

ì’j

ff

T-

‘‘

‘i,

(_>{

()

i

00

——

——

—O

O

zzzz

zz

—7

——1—

.or

i-

—j_

-—

-i—

—-

r—

hz.

—‘

—1

-ii_

_—

-

OO

I

arnj

!HP

1IJ

flp

)jO

tO

L

.1]!

((N

l11

IS

iti

OIjP

hU

I()

ttIU

IItt

IS

-‘1

PI

It?

\1I

IttI

)

NIi

+{i)-

2

‘Ii

.1

1

:1Itim

nis

‘am

entwilcot.U

icientc.aic’laie

dellasteonda

è(A

ll+

RT

)/R=

291o.iK(R2=

0.9

98

)co

nR

=1S

9cal/(m

ol4K)

Ada

tempeiatura

di30

(quindivirv

SS=

1321

cdl/(n,cltK)

All

5,26kcl/m

ol

livalore

dell’enew

alibw

rair7ja

re

diform

azionedel

complesso

attivatorisulta

essere.A

GA

ll-1

iS=

0.6’kcal/m

ol

Ilvalore

delA

G*

molare

difonnazione

delcom

plessoattivato

ricavatodalla

reazionecondotta

inbatch

statico.sen

iràda

confrontocon

quellotrovato

peril

reattorecciam

ico.allo

scopodi

stimare

iltipo

diinfluen7a

esercitatadalla

temperatura

sullareazione

ei’

even

tuale

disattiv

azione

subita

dalrenzim

ain

seguitoall’

iminobilizza,ione

Ilm

odellocinetico

adottatoper

I’idiolisi

incontinuo

dellattosio

èsim

ilea

quelloproposto

perla

trattazionein

batcli.Si

èfatta

I’ipotesi

cheI’

enzima

edil

substratosi

combinino

ineisibilmente

perform

aieun

intennediot.

chegli

umri

piodottid

lhreaiionc.

diidrolisi

fosseioil

glucosiocd

l;a’attosio

?oichéi

eu

iaun

cro

eproprio

allontanameieto

deiprodotti.

aniaggioi

I4gionee

lecitosuppone

chtsolo

una(razione

trascurabiledei

piodottiven»

i riassocianpci

iiform

aieil

substiato.

•1)3.3

3.43.5

3.6

t00

0/T

iL)

ieto

1una

OpL

I-ie

nsiJerafl

quellicon

meccanism

oip

etitisoap

zand

clicip

Ico

l-Ci

)ion

siastabiL

nossas

md

isi

ipreser

zdcl

substratoQ

iidi

qrrzjc

nc.di

dime

mionarnento

delreattore

erainico

risulta

!n

i’’ii

M±

OiH

li

max

Per

individuarela

costantecinetica

dellostep

irreversibileoccorre

farealcune

considerazionisull’

enzima

imm

obilizzatonel

reattore,K

2viene

ricavatadalla

relazioneV

rnax

K2*(E

)e

quindisi

hailproblem

adi

esprimere

laquantità

dienzim

a(E

)in

mM

,Si

puòragionevolm

entesupporre

chele

molecole

dienzim

adopo

uncerto

tempo

diassestam

entosiano

tutte(o

quasi)adsorbite

sulm

oduloceram

icoe,

tenendopresente

ledim

ensionidei

pori,si

puòanche

imm

aginareche

questeabbiano

unadistribuzione

pi

om

enouniform

enell’

interospessore

delsupporto.

Queste

ipotesiperm

ettonodi

individuareil

volume

direazione

edidentificano

conil

volume

delsupporto

poroso.quindi

E)

saràespressa

come

laquantità

totaledi

proteineiinm

obilizzatediviso

ilvolum

edel

supporto,diviso

unpeso

molecolare

convenzionale(P

Mdel

glucosio).I

puntiper

realizzareil

plotdi

Linew

eaver-Burk

sonostati

ottenutim

isurandola

concentrazionedel

glucosioprodotto

avarie

concentrazionisi

substiato,

Anche

lecostanti

ottenutelavorando

incontinuo

devonoritenersi

apparenti,infatti,

oltrealla

semplificazione

delm

odellocinetico,

èstata

trascuratal’inibizione

prodottadal

galattosioform

atosidal

substratoiniziale,

La

determinazione

dellacostante

diinibizione

èstata

realizzataconducendo

dueserie

siscansioni

diconcentrazione

disubstrato

a3O

Cim

mettendo

inciascuna

unaquantità

inizialedi

galattosiopari

a5

e10

g/I.

Nelle

seguentitabelle

sonoriassunti

irisultati

ottenuti:

200

300

350

400

o(3164(3,222

128.48i

‘‘*

Et,

I597

I203,86

.798

5,7956,2749,310

0,9980,9990,9970,997

0,005.0010,00

al-9

tI

LIO

ils’

fla

di1rE

biWf

K(

IiI’i

‘innN

1nL

in

Tabella

Ym

axii

(gli)

(mM

!rnin)(m

M)

Attiav

eroil

valoredella

costantedello

stepirreversibile

(K2,

figureseguenti),

sonostati

calcolatii

valoridell’

entalpiadell’

entropiae

dell’energia

liberadi

formazione

delcom

plessoattivato

a30

‘C’(vedi

tabella).N

ellefigure

successivesono

riportatii

graficiottenuti

mentre

idati

termodinam

icicom

paiononella

tabella:

7,33kcal/m

ol(R2=

O997)

=16

42cal/(m

ol*K)

(R2=

0,9

96)

=2.35

kcal/nìol 0,8350.1150,222

0.0036,9812,69

0,9990,9980,995

H

_

+.4

4,2

(onfro

nto

delleco

Lai

rct

rm1h

OT

lk.S

tI’ìi

\lltj

ira

Kcal!n,ei

falem

aremento

s)

ibL

alnterpi ‘tarc

come

unapa

zialed

isattivazo

ne

eserceaiadall

albi

ua

1I

supportosuB

’en

zima

c’nconseguente

aum

nto

dellabarjera

encietiaa

dasuperare

<W

aiiar.i 9(5,>.

Per

qu

an

torignaida

ilS

1aum

enti’ri’.contrato

neln’attore

edi

circ

a

2.75u.e..

i’aum

entopotrebbe

essereattrlh

uto

adun

miglioram

entodel

meccanism

odi

“aggancic-seancio”.del

suhstratoe

deiprodotto

daparte

dcli’enzim

a<

Walter.

19o5’>.aum

entandodi

conseguenzai

gradidi

libertiidei

sistemaL’

merem

entod

il’energia

liberi:di

foimazione

delcom

plessoattivato,

perla

reazionecon

1’en

zina

supportatou

il’allurnina,

risultaessere

dell’ordine

di1,6

Kcal/m

ol(a

30°C).

6.5C

on

fron

totra

isu

ppo

rtipolis

olfo

nic

ie

ceramici

Ilconfronto

delleprestazioni

delreattore

ceramico

con

quellopolisolionico

e’operato

suirisultati

diun

precedentelavoro

(Pizzichini

etala

1989)che

utilizzail

modulo

IIIP1O

20della

AM

ICO

Ncon

l’enzima

ntrappola1ofisicam

ente,li

confrontocon

Ilm

oduloV

FIIP

3On

on

e’stato

tratta

topoiche

inquesto

casol’e

nzim

ae’

statoim

mobilizzato

chimicam

ente

6.5

,lPern

ìeabilità

dim

embran

a

Le

fibrecave

polisolfonichem

ostranouna

resistenzadi

mem

branafortem

entedipendente

dallatem

peraturadi

esercizio.N

elreattore

polisoll’onicola

resistenzadi

mem

branaè

legataalla

teinpematura

assolutasecondo

1’equazione:

Rm

=6,8

5l0

2,0

0*

107

F=

0.996

Al

contrarioi

moduli

ceramici

hairn

om

ostratouna

bassasensibilità

dellaperm

eabilitàalle

variazionidi

tem

pei’a

tura

.com

erisulta

dall’equazio

ne:

Rrn

=7,2

9*10

8l.3

3*l0

6TR2

=0,9

97

intabella

sonoriassunti

ivalori

delleresistenze

dim

embrana

deidue

supporti

LL

ciu

Cfl

io8

1087*j

)8,2

6lO

8

LIm

piegod

efleitli

ca

epoi1’l!cII1cue

come

stippoi teim

itobi1izzazione,risolta

esseriiiem

saritaggiosoa

causadella

superioredipendenza

dallatem

peratura.nonché

dallafacile

deformabihtà

dellefibre

adelevati

flussi

dipeinieazione.

6S

2P

arametri

dip

rcesso

Ia

fluidodinamk

adei

dueleattori

funi

onantiam

beduein

configurazionebackflushing,

etisu

ltata.inentram

bii

casi.assim

ilabilead

uereattore

continuoideale

am

esroiamento

totale.

Ilrange

dipre

ioni

dieerc

zio

delletibie

caseè

molto

limitato

essepossono

resisteresolo

finoal

atmosfeie

senzasubite

dannistu

tturali

Al

Ontiario

isupporti

celamici

possiedonom

mc

limite

superiorela

piessioncrn

assma

tollerabiledalla

stiutturatC

izia

riadell’

enzima.

La

temperatuia

massim

aco

iìentita

daiuppntI

polisolfonici55

Cnon

sembra

essereun

paiam

etrodeterm

inante:è

icuian

ente

superiorealla

temperatura

ottimale

dilavoro

dell’enzim

a5

’(‘i,

he

èquella

corrispondentealla

massim

aresa

con

lam

inima

denaturazione.I

moduli

polisolfonicia

fibrecave,

grazieal

loioalio

svilu

ppo

superficiale.possono

imm

obilizzaieirna

giandequafltlta

dienzim

a.I

moduli

ceramici,

aielativam

entebasso

svilupposuperficiale.

5000

statial

mom

entosperim

emati

solocon

modeste

quantitàdi

enzima

(I5

g).In

entrambi

ireattoii

lete

cnic

he

diim

mobilizzazione

adottatehanno

consentitosem

predi

imm

obilizzateil

l00

dellenzim

ainviato.

Tuttavia

laprocedura

diim

mobilizzazione

èdeteim

inante,per

leprestazioni

delreattore,

nquanto

ildeposito

en

zlin

atic

odev

eesc.ere

ilpiù

omogeneo

possib

ile.

Idati

termodinam

iciriguardanti

ilreatture

afibre

cavem

nostraouna

eneigialibera

molare

difo

riiazion

edel

complesso

attivato(G

=3

39

Kcal/m

ola

30C

)praticam

enteinvaiiante,

intutto

ilrange

dellatem

peraturaoperativa

perm

essa

dall’enzima,

acausa

diun

inodcsto

contributoeiìtropico.

Al

contrario,a

reazionecatalitica,

Sv

OitJ

conl

enzima

imm

obilizzatosu

isupporto

cerarnic,

motIa

unaenerta

!thea

‘n!a

ei G

=2.3

skcalhm

)i

Lli

flO.

la’

z’i

‘d

‘i

Iri

rueàtb

topti

i.

lioci

ilne

tatti

ecir

6iin

‘L

adt

aw

vai

ne‘

ri

ili

ci

iimupp‘t

ci

ducslstern

drIo

stessooroine

Igran&

iraI

arigenerazione

totaled’i

modul

ceraidci

alcontrarie

diquelli

polisolfonici(per

ognirigenerazione

siottn..ne

unrecupero

massim

odella

permeabilita

dei7(Y

7c)è

sicura

inente

il‘antusì

mprincipale

litali

supporti

66

CO

NC

LU

SIO

NI

Le

prestazionidel

bioreattoreceram

icoad

attivitàlattasica

vannoanalizzate

inun

contestogenerale

divalo

rizzazore

diun

prodottodi

rifiutocom

ei

siero,che

costituisceuna

categoriarappresentaliva

disottoprodotti

dell’industria

agro

alimen

tareL

einform

azioniottenute

inutiesto

lavoro(caratterizzazione

fluidodinarnicadei

reattoreceram

icoe

valutazionedella

dipendenzadella

reazionedi

idrolisicon

enzima

imm

obilizzatodalla

temperatura

edalla

naturadel

supporto),hanno

permesso

tiaaggillngirnento

dialcuni

obiettiviutili

alpassaggio

discala

deisistem

aIn

forma

schematica,

lasperim

entazionecondotta

hainfatti

permesso.

La

caratterizzazionefluidodinam

icadel

ieattore;L

acaratterizzazione

cineticadella

ieazionecondotta

incontinuo.

Rispetto

alreattore

polisolfonicoa

fibrecave

ilieattoie

ceramico

presentai

seguentivantaggi

esvantaggi:

tai.

Rigenerabilità

completa

deim

oduli;R

imozione

totaledei

depositiorganici,

mediante

combustione;

-Indeform

abilitàdei

moduli

allealte

pressioni:P

ossibilitàdi

impiego

incondizioni

dilavoro

piuspinte;

-Riduzione

dellaperm

eabilitàm

enodrastica

inseguito

allaim

mobilizzazione;

Piùdefinita

geometria

deasistem

a(sopratutto

adalti

flussi’);M

iglioredistribuzione

dellenzim

asul

supporto,-

Maggiore

influenzadella

temperatura

sullaresa;

Piùelevato

costod’im

pianto.nia

piùrapido

amm

oitamento;

Ird

)e

mcii

dctc

ia

inultim

aanaF

sile

bairiere‘eram

iche6

presentanoccn’e

ottn

tIternative

allefibre

polimeriche

invirtù

deirequisiti

appeiaccennati

Pern

pasa

pioad

rspennientazione

sus

alapilota

01/a

Tc

pero’W

UltC

flOe

sfarzoCi

nate

aper

real!zzarem

odulidi

dmensiont

piùadatte

spessorendotto

edim

ensto

nC

cipori

piùpiccole)

eper

sviiupparwm

ezodd’im

mobilizzazione

enziinaticaidonei

altipo

disupporto

inorganico(silanizzazione)

6.7.BIB

LIO

GR

AF

IA

Cappelli,

Dente

Teoria

esviluppo

deiprocessi

climici

Clup,

Milano

Cesari,

La

regolazioneautom

arteadegli

impianti

indu

sriaL,

Ed

Franco

Ar

geli,N

apoli

AN

.G

usakov,A

.P.

Sinìsryin

etA

L.

Biotechnol,

Bioeng.

29.Pp.8989O

O. I987

O.

Levenspiel,

Ingegeriadelle

reazionichim

icheE

d,A

inorosiana,1978

R.D

.M

acbean,N

.S.W

illman.

mt,D

airy(ìongress,

p.947,

1978

W,

Marconi

F.B

aroli,

D.

Zaccaidelli,

lmm

obilizedE

nzyrnes,E

d.M

.S

alinonaet

Al..

Raven

Press,

Pp.211-216,1974

M.N

akajima.

N.Jim

bo,F

lNabetani,

kW

atanabeLTse

ofceranuc

mem

branefor

enz’me

reactorsit

InternationalC

onferenceon

inorganicm

embranes.

Juiy3-6.

1989M

ontpellier.F

rance

E‘llC

J’Q

i(

‘1i!

PR

OC

ES

SO

\icni

ILpi

.dcnu

eatii(

nt

itli

pces

diIG

Olis

littosio

LO

nsldcra

ndo

SUPLX

)Ttidi

imm

oblIiz

7azio

’ìenia

anic

polisoitooeJ

noiganiei(a

ìrnm

ale

tecnice

diim

mobiliz

ziz

ione

covale

nte

eper

adso

rbrn

ento

del

cata

lizzato

re,

lecaiatteristilie

chim

icofid

ìche

(permeabilit&

,M

WC

O,

porosita’)dei

moduli

comm

ercialie

dìquelli

progettatiper

lebarriere

ceramiche

esi

eanche

sviluppatoe

verificatoun

modello

matem

aticoper

la‘im

ulazionedel

processoIn

tuttequeste

fasisperim

entalie

diverifica

lesviluppo

dun

sistema

dianalisi

econtrollo

inlinea

dellerese

idrolitichee’

risultatodi

enorme

importanza.

Inquesto

capitolosi

descrivein

dettaglioil

tunzionainentodi

unsistem

adi

biosensoriin

gradodi

controllareil

processo,sviluppato

interamente

inam

bitoE

NE

A.

Ilsistem

ain

oggettoutilizza

sensoria

mem

branam

odificaticon

enzimi,

Sie’

percio’sviluppato

unsistem

achiam

atodagli

espertinel

settorecon

ilnom

edi

biosensore.supersensore,

osuperprobe.

Ilsistem

asi

basasu

sensoridi

tipoelettrochim

ico,quelli

chea

ttitt’oggisono

consideratii

pin’adatti

secondoi

criteridi

economicita,

riproducibilita’precisione

edaccuratezza.

7.111

sistema

biosensore

Un

biosensoreelettrochim

icopuo’

esseredefinito

come

l’accoppiamento

diun

sistema

biologicamente

attiv

oim

mobilizzato,

conun

trasduttoredi

segnaleche

converteil

segnalebiochim

icoin

unoelettrico

analiticamente

quantificabile(F

rew.

1989).Q

uestibiosensori

sonogeneralm

enteelettrodi

am

embrana

accoppiaticon

mediatori

biochimici

qualienzim

iim

mobilizzati

erecentem

enteanche

anticorpi,batteri

etessuti

viventialtam

entespecializzati;

laselettivita’

deglielettrodi

ela

specificita’dei

mediatori

convertonospesso

unadeterm

inazionechim

icaaltrim

entiproblem

aticanella

semplice

operazionedi

unam

isuraelettrica.

Ibjosensorj

hannoavuto

recentemente

notevoleim

portanzasia

neicam

pobiornedico

chein

quello.biotecnologìco

(Palleschi,

1989),N

ellatabella

sonoelencati

unaserie

disubstrati

diinteresse

biologico,chim

icoe

farmaceutico

chenegli

annihanno

costituitooggetto

diricerca

perla

realizzizionc

d‘biosensori

specifici”(M

ascini,

Substrato

Catalizzatore

Specie

Sensore

Urea

Ureasi

NH

gas

Glucosio

Glucosio

Ox

°2C

lark

2°7

anodoplatino

Galattosio

Galattosio

Ox

H0E

anodoplatino

Colesterolo

Colesterolo

Ox

Clark

Lattato

Lattato

Ox

OC

lark

Alcool

Alcool-D

HN

DH

catodo

Penicillina

Penicillasi

11

vetro

Ossalato

Ossalato

oC

O2

gas

Glutam

inaM

itocondriN

Hgas

deltess,renale

Cisteina

Cellule

H2Sgas

batteriche

7,2B

iosensoria

glucosioe

1atto

i!

Ibiosensori

aglucosio

elattosio,

sviluppatiper

ilcontrollo

inlinea

delbioreattore

lattasico,si

basanosu

elettrodiam

perornetricispecifici

per

l’acquaossigenata

accoppiaticon

l’adattoenzim

ao

coppiadi

enzimi

peri

substratoin

esame.

La

specierivelata

dalsensore

elettrochimico

e’l’acqua

ossigenataprodotta

dallareazione

enzimatica

quidi

seguitoriportata:

GO

Dj3-D

Glucosio

+02

---->

Acido

Gluconico

÷H202

L’enzim

aglucosio

ossidasi(G

OD

)e

unaossidasi

flavinica

(Lehninger,

1979)che

possiedecom

egruppo

prosteticoil

Flavin

adenin

dinucleotide(F

AD

)che

determina

ilcolore

giallodi

tuttipreparati

enzimatici

abase

diossidasi,

Mentre

ilglucosio

vieneossidato

adacido

gluconicoil

FA

Dviene

inizialmente

ridottoa

FA

DH

,e

successivamente

riossidarodaH

ossigeno

dscaoitoin

soluzionecon

formazione

diacqua

oi.si.genata:

Ii

ee

‘ic

ano

s‘te

iiii

nla

essionep’

ial

do

s’n

c(

Ioliiz

ioia

(t

cosL

t!!IsCper

oL

otirn

ee

egp

pP

azoe

OrI

sopoittu

ttoper

Cam

pio

ni

delevata

cenceH

rrv

*di

clucoRio

U6

gi)

come

sived

tain

seguito

.cr’

d&serisore

peril

lattosio

lereazio

ni

enzim

atiche

son

od

ue

;ucia

tho

lisidel

lattosioa

glucosioe

galattosio,e

quellasuccessiva

dis

In

dclglucosio

adacido

gluconico.

gaIattosid

asi

Lto

rioG

lucosio±

Galattosio

GO

DltD

Glucosio

4A

cidoG

luconico+

H,02

7&

Sistern

ielettrochim

icodi

misu

ra

Lì

schem

ad

un

senso

ream

pero

men

-icoe’

np

oi

tatoin

figura.

——

—ari,riitri

nunlucrcin

ccnain

__jsilantnin

quarzijI’ttrilita

Rzferurcutn

Aq/PqCI

Orinq

--

—---4

0—

Lan

od

od

platin

oe

postoe

PeO

mv

Vs

un

rilerimen

todi

Ag/A

g(I.

La

coppiaelr

tirodicaim

mersa

inuna

soluzioneelettrolitica

diK

C1

01

MT

irao

1a

‘anr

otti(

flil

3cia

30aia)

dadiali’i

InL

talA

ita’

dno

cd

nO

oo

pr

flfl

Lm

teq

zl(:li

cIr!;e

1io

r.ponranil’

Via

r%pO

5l3

La

CO

iTentem

Lurata

ep

rop

orzio

raeaN

aco

nectrazu

ve

di11202

reicam

pione.I

impiego

diuna

ossidasiperm

ettedi

rreiarela

corrente

elettrodicaalla

concentrazionedi

substratonel

caip

ion

7AIn

terferenze

chimiche

Uim

piegodi

unelettrodo

adacqua

ossigenatapua’

comportare

degliinconvenienti

dovutialla

presenzadi

specieinterferenti

Questo

problema

sipresenta

ogniqual

voltaci

troviamo

difronte

aduna

matrice

reale

complessa.

Siusa

allorauna

mem

branadi

acetatodi

cellulosaim

permeabile

alle

sostanzeinterferenti

elettroattivecon

unprobabile

meccanism

odi

esclusionem

olecolare.Q

uestom

eccanismo

none’

ilsolo

operante:sem

braanzi

chela

seiettivita’di

talim

embrane

siadovuta

afiuna

interazionefra

lecariche

negativepresenti

sullam

embrana

ele

caricheche

lasostanza

interferente

possiedein

certecondizioni

dipII

eforza

ionica.N

ellapratica

pero’si

e’visto

chela

sodioazide,

utilizzatacom

ebatteriostatico

nelfeed

che

alimentava

i!bioreattore,

creavadei

problemi

diinterfeienza.

Le

misure

deicam

pionieffettuate

albiosensore

risultavanodi

un5%

piu

’basse

quandoera

presentela

sodioazide.

ilproblem

ae’

statorisolto

utilizzandouno

standardcontenente

lastessa

concenti azionedi

sodioazide

(0. l%w

/v),U

naltro

problema

dim

isurapuo’

derivaredal

sierodi

latte,anche

ukrafiltrato,per

lapresenza

diproteine

abasso

pesom

olecolare.Q

uestepossono

causaredei

problemi

diintasam

entodella

mem

brana

enzimatica

rallentandola

diffusionedelle

speciechim

ichee

diminuendone

ladurata

neltem

poche

rimane

comunque.

dicirca

30giorni.

lutto

cio

comporta

frequenticalibraziorn

deisensori

(inpratica

ogni2

oredi

funzionamento).

7,5_Procedim

entodi

imm

obilizzazioneenzim

atica

ib’i:a

ioae

en;

taa

sul;

sarfiie

‘rietetodicaven

e

Iii

foifin

izo

laara

cde

n

irnb

ariad

licarbo‘ato

(diamcls

dciori

)O

um)

sistratifaca

ursottile

film20

ul)da

unasoluzione

composta

daeniim

a(IO

mg/m

i).B

SA

IOm

glin’e

glutaraldeide5r/v

)in

tampone

fosfato(pH

7.0,0.1

M).

11reagente

bifunzionale.la

glutaraldeide,&

responsabiledei

legami

dicrosslinking

tral’enzim

ae

laB

SA

checostituisce

ilm

aterialedi

supportodell’im

mobilizzazione,

La

mem

branacosi’

preparatae’

lasciatariposare

perun’ora,

successivamente

vienelavata

contam

ponefosfato

(pH7.0

0. IM,

NaC

lIM

),ricoperta

conuna

mem

branadi

acetatodi

cellulosa(M

WC

O100

dalton)ed

infineassem

biatasul

sensorem

edianteun

O-ring.

La

mem

branadi

acetatodi

cellulosa,selettiva

all’acquaossigenata.

e’posta

sullasuperficie

elettrodica,m

entrequella

dipolicarbonato

e’a

contattocon

ilcam

pione.Q

uest’ultima

proteggel’enzim

adall’attacco

battericoche

comprom

etterebbela

duratadel

sensorein

modo

rilevante.Il

sensorecosi’ottenuto

e’inserito

inuna

cellaa

flussocon

unvolum

edi

circa40

ul.

nrrj

i[ucsio

Ilprocedim

entoappena

descrittoe’

comune

aidue

biosensori;per

quelloa

lattosiosi

deveprocedere

all’imm

obilizzazionedei

dueenzim

i(glucosio-ossidasi

e3-gaIattosidasi).

Alcune

provesperim

entalihanno

stabilitoche

inquesto

casoconviene

imm

obilizzareseparatam

entegli

enzimi

sudue

mem

brane(im

mobilizzazione

asimm

etrica)anziche’

procedereall’im

mobilizzazione

contemporanea

deidue

enzimi

suuna

singolam

embrana

(imm

obilizzazionerandorn),

Inpratica

ilprocedim

entoviene

condottoseparatam

enteper

laG

OD

.sulla

mem

branadi

acetatodi

cellulosa,e

perla

f3-galattosidasisu

quelladi

policarbonato.L

em

embrane

sno

infinesL

rnblate

sull’elettrodocdm

ee

sl

ematizzato

irifigura

—ccit:dcr

76F

wln

ectoinysijfj

enof

teni

ncdia

nirnm

obiiizzazione.

iti

sueletrio

dad

acquaossigenata

sonolineari

nelrange

tral0

tMIO

rnM.

Per

ilsensore

alattosio

siriportano

infigura

lerette

dicalibrazione

perU

H202.

ilglucosio

eil

lattosio.

Illim

itesuperiore

diquesti

metodi

e’fonte

diproblem

iquando

sieffettuano

misure

inlinea,

sullem

atricireali,

adelevate

concentrazionidegli

analitida

determinare.

Per

rientrarenel

rangedi

linearitadella

misura,

sie’

impiegata

unatecnica

diFIow

lnjectionA

nalysis(F

IA),

cheperm

ettela

diluizioneriproducibile

delcam

pioneda

analizzare.Il

sensoree’

alimentato

incontinuo

contam

ponefosfato

(PII

7.0,0.1M

)ad

unaportata

costantedi

4m1/m

in.Il

prelievodel

campione

e’effettuato

conuna

microsonda

(id=0.2m

m,

od=0.5m

m)

eduna

pompa

peristaltica.con

portatavariabile

(0.3

4,0

mi/m

in),che

inviail

campione

inuna

valvolacon

unloop

dilO

pi.L

arestante

partedel

campione

e’reim

messa

nelflusso

delprocesso.

Ogni

90secondi

unim

pulsoelettrico

determina

l’imm

issionedel

campione

neltam

poneveicolante

(fosfato0.lM

pII7.0).

Quindi

ilcam

pione.attraverso

untubo

aspirale

concaratteristiche

geometriche

definite(lunghezza

Im,

id=0.2rnm

,od=

0.5mm

).diffonde

neim

ezzoveicolante

consentendo,in

modo

riproducibile.la

necessariadiluizione

primraggiurgere

ilsens

ie(fwura

ag

ni

senuentc)

Tsritu

rd

rtor

ttsio

mm

oIUL

.

Nelle

seguentifigure

sonoriportate

lacurva

dicilibrazione

peril

glucosiocon

il4sterna

FIAe

l’outputdel

registratoreper

differenti

soluzionistandard.

‘I

i(nA

)

40o

_

-

o100

200

[Oo]

‘M)

=—

-

.iji

—

O40

00

Nella

seguentefigura

eriportato

l’outputsu

registmore

conla

scaladei

tempi

espansa.del

segnaledovuto

aduna

soluzionestandafd

diglucosio.

4c%)i

LD

I

2C

oD

’

OO

O00

4050

OC

’.O20

ì40

50tpa

di

lJandamento

codatodei

piccopuo

ese

ie‘;piegatn

considerandoi

profilidi

concentrazionedel

glucosicalF

inerfac’ia

soluzione/mem

branae

airinternodella

rnìh

ran

aenzim

atica

ssN

ellfigura

seguentesono

rpo

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duen

or

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nelenaie

quandoil

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Con

latecnica

FIA

e’possibile

effettuarem

isurenel

range0.1-150

mM

econtem

poranamente

ridurread

unvalore

trascurabile(400

jillora)il

volume

dicam

pioneper

leanalisi

inlinea.

Questa

tecnicainoltre

consentedi

minim

izzarequalunque

effetto

dellam

atricesiero

sullam

isura(intasam

entodella

mem

brana,

denaturazioneenzim

atica,variazioni

delpii

edella

temperatura,

variazioni

dicom

posizione.ecc.).P

oiche’dopo

ognim

isurala

correntetorna

alvalore

dizero

del

tampone

veicolantee

larisposta

e’lineare

nelrange

diconcentrazioni

realizzatenel

processo,si

puo’ricorrere

adun

sistema

dicalibrazione

ad

unpunto,

conovvie

semplifi-cazioni

delsistem

aanalitico.

L*accuratezza

dellam

isurae’

statastim

atain

±1%

.L

arisposta

delsensore

e’stata

controllatasu

frazioniraccolte,

conil

Beckm

anG

lucoseA

nalyzerlI.

Pcril

mom

eoraggiodel

glucosioe’

statom

essoa

puntoun

sistema

di

tigenerazionedel

tampone

veicolante,che

neconsente

Vuso

incondizioni

icie

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men

toe

osib

ilerìcic!are

i!tainpuiie

veico

inte

percirca

3000

analisiIl

recipientee

tenutosotto

costanteò

itazionenì

dianteun

ancorettam

agneticaIn

questom

odle

speciehim

ìche

glucosioe

acquaossigenata

chepossono

influiresulla

rispostadel

sensorevengono

trasfomate

inacido

gluconico,ossigeno

eacqua

daglienzim

icontenuti

nel

tuboda

dialisi,

7.8A

utomazione

delsensore

Ibiosensori

alattosio

eglucòsio

descritti,sono

statisviluppati

perun

sistema

automatico

dicontrollo

inlinea

dellattosio

all’entratae

delglucosio

all’uscitadel

bioreattorelattasico

am

embrana.

La

tecnicadi

Flow

InjectionA

nalysis(F

IA)

ela

rigenerazionedel

tampone,

descrittisopra,

hannoperm

essol’autom

azionedel

biosensore.Infatti

oltrea

permettere

l’analisidi

campioni

inun

rangedi

0.115O

mM

,si

e’anche

ridottoad

unvalore

trascurabile,circa

400ul/orail

volume

dicam

pionesottratto

peril

controlloin

lineaSi

possonoeffettuare

misure

ogni90

secondi(30

secondiper

ottenereil

100%della

risposta,40-50

secondiper

ilritorno

alvalore

zero).U

navalvola

deviatriceed

untirner

consentonola

completa

automazione

delsistem

acon

ciclidi

misura

dicinque

ore,intervallati

datrenta

minuti

dicalibrazione.

Nella

figuradi

paginaseguente

eriportato

untracciato

esemplificativo

relativoal

monitoraggio

incontinuo

delbioreattore

lattasico,

Lo

sviluppodi

unapposito

programm

ain

linguaggiobasic

Applesoft

consentel’acquisizione,

lam

emorizzazione

el’elaborazione

deidati

diconcentrazione

inm

onosacaccaride,produttivita’

eresa

percentuale.Il

programm

a(listato

eflow

sheetnelle

figuresuccessive),

sviluppatosu

unm

inicomputer

Apple\\c

interfacciatocon

potenziometro

Orion

conuscita

serialeR

S-232c,

consente,l’autom

azionecom

pletadel

processonella

fasepilota

permettendo

lam

odificadei

parametri

diprocesso

(temperatura,

portata,loading

enzimatico)

perrealizzare

unprodotto

definitoe

costantenel

tempo.

+

i :

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aglucosio

peril

controlloon

line

dell’idrolisienzim

aticadel

lattosioha

consentitolo

sviluppodi

unsistem

a

completo,

efficienteed

automatico

chebene

sipresta

alm

onitoraggiodel

processodescritto

neicapitoli

precedenti.sia

nellafase

diacquisizione

dati

edi

studiosi

nellafase

discale

updel

processoad

impianto

pilota.S

onostate

verificatele

caratteristichedel

biosensorea

glucosio

riguardoalla

specificita’,alla

prontezza,alla

precisioneed

accuratezza

dellem

isurecon

unsistem

adi

riferimento

(Glucose

Analyzer

lI.B

eckman)

ottenendoottim

irisultati.

Iltem

podi

vitadell’enzim

aglucosio

ossidasjim

mobilizzato

sull’elettrodoe’

dell’ordinedi

56

mesi

mentre,

con

ilsistem

adi

rigenerazionedelle

soluzionitam

pone.il

sistema

e’in

grado

diprocedere

automaticam

enteper

circaun

mese

consentendola

misura

di

circa30.000

campioni.

La

partricolaretecnica

HA

checonsente

ladiluizione

delcam

pione.riduce

sensibilmente

iprob’erni

difouiing

dm

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daparte

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