Izolacija i identifikacija sekundarnih metabolita za organsku hemiju i...HEADSPACE TEHNIKA (HS)...
Transcript of Izolacija i identifikacija sekundarnih metabolita za organsku hemiju i...HEADSPACE TEHNIKA (HS)...
IZOLACIJA SEKUNDARNIH
METABOLITA
Odabir procedure za izolaciju sekundarnih metabolita zavisi od
Biljnog materijala
Spojeva koji se izoliraju
Prije odabira metode, potrebno je utvrditi cilj izolacije, koji može biti:
· nepoznata bioaktivna komponenta
· poznata komponenta
· grupa spojeva koji su strukturno slični
2
Fitohemijski screening uključuje;
Izbor odgovarjućeg biljnog materijala
Adekvatno prikupljanje biljnog materijala
Determinacija biljnog materijala
Sušenje
Pakovanje i skladištenje
Ekstrakcija
Separacija
Identifikacija
3
PRIKUPLJANJE BILJNOG MATERIJALA
Potrebno je kod prikupljanja biljnog materijala
voditi računa o;
Odgovarajuća fenološka faza (količina i vrsta
konstituenata zavisi od stepena razvoja biljke)
Prikupljena biljka treba biti zdrava (npr. da nije
inficirana nekim virusom, bakterijom ili gljivicom)
Determinaciju biljnog materijala treba izvršiti
stručno lice
Obavezno ostaviti voucher (reprezentativan uzorak)
4
PRIKUPLJANJE BILJNOG MATERIJALA
Divlje biljke Kultivirane biljke
Limitirano prirodno stanište (rijetke i endemične vrste), rašireni na velikom prostoru
Prisutni na limitiranom području
Teško dostupni Lako dostupni
Moguće da dođe do nedostatka materijala zbog konstatnog prikupljanja
Dostupni kontinuirano
Osoba koja vrši prikupljane mora biti iskusan botaničar
Osoba koja vrši prikupljanje ne mora biti botaničar
Daje pravu sliku hemijskog sastava na prirodnom staništu
Uticaj kontroliranih uslova života
Neistražen biljni materijal koji pruža mogućnost identifikacije novih aktivnih komponenata
5
Izolacijski proces za biljne materijale uključuje sljedeće
korake:
sušenje i usitnjavanje biljnog materijala (homogenizacija)
odabir i primjena prikladne metode izolacije npr: ekstrakcija,
destilacija ili presovanje
pročišćavanje ekstrakta
koncentriranje (npr. uparavanjem)
sušenje ekstrakata
6
Sušenje biljnog materijala
obično se obavlja u prostorijama koje nisu direktno izložene
sunčevoj svjetlosti
Pakuju se u papirne vrećice
Čuvaju se u sredini u kojoj su kontrolirani uslovi
7
Izolacija volatilnih sekundarnih metabolita vrši
se različitim metodama npr;
Headspace tehnikom
Destilacijom
Cijeđenjem
Anfleranž (enfleurage)
...
8
HEADSPACE TEHNIKA
Headspace tehnika se zasniva na određivanju volatilnih
komponenti prisutnih u zraku koji okružuje različite objekte.
Predstavljena je u novembru 1986 na 10. Internacionalnom
kongresu esencijalnih ulja u Washingtonu, gdje su prezentirani
rezultati na uzorku cvijeta jasmina.
Headspace predstavlja zrak iznad ili oko mirisnog uzorka koji
sadrži volatilne spojeve.
Ova metoda nije destruktivna
9
Headspace je važna ekstrakciona tehnika koja
omogućava direktnu analizu volatilnih spojeva koji su
prisutni u nevolatilnom matriksu.
Headspace omogućava da se dobiju podaci o aromi
koju imaju biljke na prirodnom staništu i daju nam
jasniju sliku o razlikama u sastavu volatilnih
konstituenata kod žive biljke i ekstrahovane faze
10
Primjenjene tehnike često se kalsificiraju prema različitim
principima uzorkovanja, na
statičku
dinamičku
11
HEADSPACE TEHNIKA (HS)
Statička HS metoda se sastoji u tome da se tečni ili čvrsti
uzorak stavi u vijalicu, koja se zagrijava do određene
temperature prije zatvaranja.
Termin statička metoda se odnosi na zatvoreno okruženje
gdje se sakupljaju nastale volatilne komponente.
Nakon što uzorak dostigne ravnotežu sa
gasovitom fazom, alikvot se prebacuje
siringom za GC na hromatografsku analizu.
Osjetljivost statičke headspace tehnike je u
mikrogramskim količinama, a zavisi i od
prirode volatilnih komponenata.
12
HEADSPACE TEHNIKA (HS)
Dinamička HS analiza koristi purge and trap (čišćenje i zamka)
tehniku, provodi se povlačenjem volatilnih komponenata sa
materijala strujom prečišćenog zraka ili inertnog gasa kroz cjevčicu
napunjenu nekim čvrstim adsorbentom.
Nakon određenog vremena cjevčica se prebacuje u jedinicu za
toplotnu desorpciju gdje se zagrijava, a adsorbovane komponente
nošene inertnim gasom se sakupljaju u jedinici trap, u kojoj je
temperatura mnogo niža.
Kada su sve kompnente desorbovane purge, i sakupljene idu dalje
na GC/MS analizu.
Osjetljivost dinamičke headspace tehnike je reda veličine
nanograma.
13
14
DESTILACIJA
Vrste destilacija
destilacije vodenom parom,
vodene destilacije (hidrodestilacije),
vodeno-parne destilacije.
Sve tri metode se zasnivaju na istim
teorijskim principima destilacije, a razlika
je u primarnom kontaktu biljnog
materijala i vode, tj. vodene pare.
15
16
Ilustracija destilacije esencijalnog ulja
CIJEĐENJE
Cijeđenjem se dobija esencijalno ulje iz svježe kore npr. limuna i narandže, jer se nalazi ispod same epiderme. I ova ulja se mogu dobiti destilacijom vodenom parom, ali zbog njihove lake dostupnosti vrši se cijeđenje na običnoj temperaturi.
Spugna-proces se sastoji u cijeđenju ulja iz svježe kore agruma na spužvu. Na kori se napravi nekoliko rezova i cijedi. Kada se spužva napuni uljem, iscijedi se u sud u kome se kasnije, stajanjem, ulje postepeno odvaja od mutne vode i pliva na njoj. Na ovaj način se dobije najbolje ulje, ali je metoda spora, ima mnogo gubitaka, tako da je prinos mali. Odvojeno ulje se filtrira da se dobije bistar proizvod.
Cijeli plodovi se pritišću i taru u posebno izbušenim posudama od nerđajućeg lima koje na unutrašnjoj strani imaju sitne, vrlo oštre iglice. Ove iglice izbuše spoljni dio kore u kome se nalaze velike šupljine sa uljem.
17
ANFLERAŽ (ENFLEURAGE)
(enfleurage) je francuski način izdvajanja esencijalnih ulja. Metoda je spora i skupa. Primjenjuje se za slučajeve kada je količina esencijalnih ulja tako mala, da se drugi načini ne mogu primjeniti. Princip se zasniva na tome da se koristi osobina masti da vrlo lako upijaju mirisne materije bilja na običnoj temperaturi.
Metoda se zasniva na adsorpciji mirisnih sastojaka na prečišćenom bezmirisnom loju. Dobvena “mirisna mast” se obrađuje odgovarajućim otapalom.
18
Mast se rasporedi po staklenoj ploči postavljenoj u drveni ram.
Svježi cvjetovi se rasporede po površini, nakon što se
esencijalna ulja absorbuju u masnoći, cvjetovi se zamijene
novim.
Na ovaj način se dobiju najfinija i najskupocjenija esencijalna
ulja. Pošto se radi na običnoj temperaturi i s neutralnim
materijama za upijanje, praktično se dobija prirodno
esencijalno ulje, onakvo kakvo se nalazi u biljci, jer se pod tim
okolnostima ekstrakcije ne mijenjaju ni organoleptičke osobine,
niti fizičke i hemijske konstante.
19
ANFLERAŽ (ENFLEURAGE)
EKSTRAKCIJA
proces razdvajanja komponenata iz biljnog materijala,
na osnovu različite topljivosti u otapalu kojim se vrši
ekstrakcija. Ekstrakcija uključuje nekoliko
istovremenih procesa:
difuzija otapala u stanice biljnog materijala
otapanje metabolita u otapalu
difuzija otapala s otopljenim tvarima izvan stanica
ispiranje
20
EKSTRAKCIJA
Faktori koji utiču na ekstrakciju su temperatura,
veličina čestica,
kretanje otapala i
pH-vrijednost.
Poželjna svojstva otapala za ekstrakciju: selektivnost za spojeve koje se žele ekstrahirati,
veliki ekstrakcijski kapacitet,
nereaktivnost s biljnim komponentama,
neškodljivost za ljude i opremu,
potpuna hlapljivost i
niska cijena.
21
EKSTRAKCIJA
Često se metode esktrakcije s otapalima dijele na kontinuirane i nekontinuirane postupke.
Maceracija
Ultrazvučna ekstrakcija
Perkolacija
Ekstrakcija po Soxhletu
Ekstrakcija s otaplaom pod pritiskom
Ekstrakcija pod refluksom
Ekstrakcija superkritičnim fluidima
22
MACERACIJA
usitnjeni biljni materijal u pogodnom otapalu u zatvorenoj
posudi se ekstrahira na sobnoj temperaturi. Povremeno ili
konstantno miješanje može povećati brzinu ekstrakcije
(maceracija uz miješanje ili vrtložna maceracija).
23
ULTRAZVUČNA EKSTRAKCIJA
ovo je modificirana maceracija, gdje je ekstrakcija
olakšana upotrebom ultrazvuka (visoko-frekventni
pulsevi, 20 kHz)
Ultrazvuk se koristi za mehanički stres na stanice
stvarajući kavitacije u uzorku. Raspadanje stanica
povećava topljivost metabolita u otapalu i poboljšava
ekstrakciju.
24
PERKOLACIJA
usitnjeni biljni materijal se postavlja u
perkolator (cilindrični kontejner s
slavinom na dnu) i natapa u otapalu.
Dodatno otapalo se zatim dodaje na vrh
biljnog materijala i pušta da «perkolira»
polako (kapajući) sa dna perkolatora.
25
EKSTRAKCIJA U SOXHLET-u
Biljni materijal se postavlja u cilindar u
ekstrakcijskoj komori koja se postavlja iznad
posude za sakupljanje, a ispod refluksirajućeg
hladila.
Glavna prednost ove vrste ekstrakcije je
kontinuirana ekstrakcija. Svježe otapalo se
kondenzira i ekstrahira biljni materijal
kontinuirano. Otapalo s ekstrahiranim tvarima
prelazi u balon gdje se koncentrira.
Nedostatak je u tome što se ekstrakt kontinuirano
zagrijava na temperaturu vrenja otapala, što može
dovesti termičkih razlaganja.
26
EKSTRAKCIJA POD REFLUKSOM
biljni materijal se uranja u otapalo u tikvici
koja je spojena na hladilo. Otapalo se
zagrijava do ključanja. Kako otapalo
otparava ulazi u hladilo gdje se
kondenzira i vraća se u tikvicu.
27
EKSTRAKCIJA SUPERKRITIČNIM FLUIDIMA
(engl. supercritical fluid extraction, SFE) – superkritični fluidi (SCFs) zamjenjuju organska otapala. Kritična tačka čiste tvari se definiše kao najviša temperatura i pritisak na kojima tvar može postojati u parno-tekućoj ravnoteži.
Na temperaturama i pritiscima iznad ove tačke nastaje jedan homogen fluid, poznat kao superkritični fluid.
SCF je težak kao tekućina, ali ima svojstvo prodiranja
kao gas. SCF nastaju zagrijavanjem gasova iznad
kritične temperature ili komprimiranjem tekućina iznad
kritičnog pritiska. Npr: Promjenom pritiska i
temperature mijenja se sposobnost otapanja
superkritičnog CO2 (visokokomprimirani CO2 (t > tk i p >
pk), bez mijenjanja sastava otapala. Ekstrakcija se
obično vrši na 40-50 oC i pritisku 200-300 bara.
28