IZOELEKTRIČNO FOKUSIRANJE PROTEINA

LIKVORA

Željka Vogrinc i Ljiljana ZaninovićKlinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku,

KBC Zagreb

Elektroforetska metoda kod koje se razdvajanje proteina provodi u gelu s uspostavljenim stabilnim pH gradijentom

Proteini se razdvajaju na osnovu razlika u izoelektričnim točkama (pI)

pI je fizikalno-kemijska konstanta

za svaki protein specifičnost metode

IEF – visoka rezolucija i velika osjetljivost

Izoelektrično fokusiranje

pH gradijent

Anoda

+ -

Katoda

amfoterične molekule

smjesa kiselina i baza

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Amfoliti: Ampholine®, Pharmalyte® , Servalyte®, BioLyte®

NOSAČ mora stabilizirati pH gradijent i spriječiti difuziju

razdvojenih vrpci

Pod utjecajem električnog polja amfoliti se gibaju prema anodi ili katodi i

uspostavljaju pH gradijent - predfokusiranje

Nosači : poliakrilamidni gel, agaroza

Stvaranje pH gradijenta u gelu:pomoću smjese sintetskih spojeva - amfolita

AMFOLITI

Proteini se tijekom elektroforeze gibaju u gelu s gradijentom pH prema anodi ili katodi ovisno o naboju

Prolaskom proteina kroz pH područje koje odgovara njegovoj pI, prestaje se dalje gibati jer gubi naboj i sabija se u uskoj vrpciProces razdvajanja proteina

metodom IEF je završen: velik broj vrpci na gelu koje treba identificirati

+ -

Princip razdvajanja IEF

Za dobro razdvajanje potreban je visoki napon (oko 2000V): - tanki gelovi- hlađenje tijekom IEF

Primjena IEF u likvorskoj dijagnostici

U kroničnim upalama aktivira se lokalni imunološki odgovor koji može biti poliklonskog ili oligoklonskog tipa ◦ imunokompetentne stanice ulaze u SŽS kroz oštećenu (aktiviranu) barijeru◦ dugotrajna stimulacija humoralnog odgovora unutar SŽSa◦ transformacija B limfocita u plazma stanice koje lokalno sintetiziraju

antitijela (IgG, A, M klase)

Mali broj B stanica u SŽSu stimuliranih prisutnim Ag stvara ograničen broj tipova pojedine klase imunoglobulina (jedan klon B-stanica stvara samo jednu klasu imunoglobulina određenog tipa lakih lanaca) oligoklonski Ig (OIgG)

u likvoru se prikazuju kao uske vrpce (oligoklonske vrpce) u području gama globulinske frakcije

Nalaz OIg u likvoru je najosjetljiviji test za potvrdu intratekalne sinteze antitijela.

Važnost ektroforetskih analiza proteina likvora u dijagnostici različitih kroničnih upalnih bolesti

središnjeg živčanog sustava

Povijest:

“PRODUŽENA” ELEKTROFOREZA I IMUNOFIKSACIJA

NEKADA

◦ Zonska elektroforeza ◦ Imunoelektroforeza◦ Imunofiksacija

IMUNOELEKTROFOREZA

ZONSKA ELEKTROFOREZA

S

L

L

Pre

alb

um

in

Beta

2

Beta

1

Alb

um

in

Alf

a 1

Alf

a 2

Gam

a

Elektroforetske tehnike za dokazivanje oligoklonskih imunoglobulina u likvoru

Metoda izbora za dokazivanje intratekalne sinteze IgIZOELEKTRIČNO FOKUSIRANJE + IMUNOFIKSACIJA

DANAS

• IEF – elektroforetska metoda visoke

rezolucije i velike osjetljivosti jer se dobro

razdvajaju proteinske molekule čija se pI

razlikuje za manje od 0,001 pH jedinica

• IEF – elektroforetska metoda velike

specifičnosti jer se proteini odvajaju prema pl

koja je identifikacijska kartica pojedinog

proteina

Ručna – In house - metoda IEF

na ultratankom poliakrilamidnom gelu debljine ≤0,5 mm

podnosi visoke napone struje - za dobro razdvajanje proteinskih frakcija

nedostatak - neurotoksičnost

puno „ručnog“ rada, -

- priprema i izlijevanje gela

- priprema i nanošenje uzoraka

- postupak sa visokim naponom

- pažljivo nanošenja antiseruma

- fiksacija i ispiranje

- bojenja srebrom

Za analizu je potrebno 5-7 µL nativnog uzorka likvora

(razrijeđenog na 0,4 g/l proteina)

donja granica detekcije IgG je 0,010 g/L

granica detekcije monoklonske vrpce IgG 0,00031g/L

Priprema otopina:

1. Otopina bis-akrilamida

2. Štok otopina riboflavin-5-fosfata (w = 0,1%),

3. Otopina amonij-persulfata (w = 40%)

4. Otopina glicerola (w=80%)

5. Anodni pufer: razrijeđena otopina orto-fosfatne

kiseline (f = 1%)

6. Katodni pufer: razrijeđena otopina etilen-diamina (f

= 2%)

7. Otopina AgNO3 (w=0,2 %)

8. Otopina octene kiseline za stopiranje boje (w=1%)

Priprema uzoraka :

Izmjeriti koncentraciju IgG u likvoru i serumu

Koncentraciju IgG u serumu i likvoru prilagoditi na

istu koncentraciju (oko 15 mg/L). Sva razrjeđenja se

rade s destiliranom vodom.

Analitička faza :

1. Postavljanje gela

2. Nanošenje uzoraka

3. Postavljanje sustava

4. Prefokusiranje i upijanje uzoraka (30 min)

5. Izoelektrično fokusiranje (75 min)

6. Imunofiksacija

7. Ispiranje

8. Bojanje srebrom

Sebia - automatizirana metode IEF

• na agaroznim gotovim gelovima

• manje su toksični

• smanjena osjetljivost metode

dosta „ručnog“ rada,

- priprema i nanošenje uzoraka

- pripreme analizatora

- pažljivog nanošenja antiseruma pomoću aplikatora

- bojenja i konačnog tumačenja rezultata

Za analizu je potrebno 20 µL nativnog uzorka likvora

donja granica detekcije IgG koju deklarira proizvođač je 0,020 g/L

granica detekcije monoklonske vrpce IgG 0,00031g/L

Međunarodni dogovor o klasifikaciji nalaza oligoklonskih IgG vrpci primjenom metode IEF: preporuča se 5 tipova rezultata paralelne analize likvora i seruma

IEF/PAGE + bojanje srebromRazličit izgled vrpci u likvoru i serumu ukazuje na lokalnu sintezu IgG

Tip 1(normalan)

Tip 2

Tip 3

Tip 4

Tip 5

CSF S

CSF S

(CSF S )

CSF S

CSF S

CSF S

CSF S

Tip 1 : Normalan nalaz ( difuzni “poliklonski” tip)Tip 2 : Oligoklonski IgG samo u likvoruTip 3: Oligoklonski IgG u likvoru, a manji broj (ili slabije izražene) i u serumuTip 4: Identične IgG vrpce u likvoru i serumuTip 5: Monoklonske IgG vrpce u likvoru i serumu

•••••

Učestalost nalaza oligoklonskih IgG u likvoru:

Bolest Učestalost OIg (%)

Subakutni sklerozirajući panencefalitis-SSPE 100

(uzrok: perzistirajuća infekcija virusom morbila)Multipla skleroza 95 Ostale kronične zarazne bolesti SŽS-a(neurosifilis, neuroborelioza i dr.) 50-80 Druge upalne bolesti SŽS-a 50

Važnost diferencijalne dijagnostike!

Likvoreja • stanje kod kojeg likvor nekontrolirano istječe iz SŽSa.

• Najčešće mjesto istjecanja je nosna šupljina, ali može biti i oko, uho...

• Stanje može biti vrlo opasno

Biološki uzorak koji se šalje u laboratorij kod sumnje na likvoreju najčešće nije čisti likvor već smjesa sekreta, krvi i likvora što otežava dijagnostiku.

Pouzdani biljega likvoreje je asijalotransferin (oblik transferina bez sijalinskih kiselina koji se stvara u SŽSu, a koji predstavlja oko 30%intratekalno stvorenog transferina)

U krvi - 82% transferina vezano sa 4-6 sijalinskih kiselina

- vrlo malo asijalo i monosijalo transferina

- u osoba s kroničnim alkoholizmom i u rijetkim slučajevima nasljednih metaboličkih bolesti – mogu se naći oblici transferina s manje sijalinskih kiselina (monosijalo- i disijalotransferin)

IEF na poliakrilamidnom gelu uz direktnu imunofiksaciju s antiserumom na humani transferin te bojenjem precipitata srebrom

pI asijalotransferina je u području pH 4-6

5-7 µL uzorka - razrijediti na koncentraciju ukupnih proteina od oko 0,4 g/L

pozitivna kontrola - slučajni uzorak likvora

negativna kontrola - uzorak seruma pacijenta

pozitivna kontrola

pozitivan nalaz

pozitivan nalaz

negativan nalaz

pozitivan nalaz

negativna konrola