IV Simposio de Espectrometría de Masas - Proteómica Celular y Molecular

8th-11th Noviembre, 2011, Puebla, México

2011 Organizing Committee

Rossana Arroyo CINVESTAV-IPN, México rarroyo@cinvestav.com

Bronwyn Barkla

Instituto de Biotecnología, UNAM, México bronwyn@ibt.unam.mx

Gerardo Corzo

Instituto de Biotecnología, UNAM, México corzo@ibt.unam.mx

Humberto Lanz Mendoza

Instituto Nacional de Salud Pública, México Humberto@insp.mx

Rosa Victoria Pando Robles

Instituto Nacional de Salud Publica Victoria.pando@insp.mx

Ernesto Pérez Rueda

Instituto de Biotecnología, UNAM, Méxio erueda@ibt.unam.mx

Rosario Vera-Estrella

Instituto de Biotecnología, UNAM, México

rosario@ibt.unam.mx

SPONSORS

This meeting was made possible by the generous financial support from the following organizations and companies.

Tuesday

November 8th Wednesday

November 9th Thursday

November 10th Friday

November 11th

07:00-08:45 Breakfast Breakfast Breakfast

09:00-09:50 Plenary lecture II Genaro Pimienta Yale University

Plenary lecture IV Mireya Gonzalez-Begné University of Rochester

Plenary lecture VI Sarah M. Assmann

Penn State University

09:50-10:40 Plenary lecture III

Jay Thelen University of Missouri

Plenary lecture V Alma Burlingame

University of California, SF

Plenary lecture VII Robert Winkler

Cinvestav Irapuato

10:40-11:00 Coffee break Coffee break Coffee break

11:00-13:30

Symposium 1 Bioinformatics & Systems Biology

Chair – Gerardo Corzo

Symposium 2 Biomedical Proteomics Chair - Rossana Arroyo

Symposium 3 Plant Biology

Chair - Bronwyn Barkla

11:00-11:30 Rosa María Gutierrez Rios Ma. Elizbeth Alvarez Sánchez Rosario Vera Estrella

11:30-12:00 Arturo Becerra Bracho Javier Ambrosio Romina Rodriguez Sanoja

12:00-12:30 Osbaldo Resendiz -Antonio Patricia Talamás Rohana Arturo Guevara

12:30-13:00 Luis Mendoza Sierra Lucero Ramón-Luing Ana Paulina Barba de la Rosa

13:00-13:30 Rosa Viner : Thermo Scientific, Falcon Rosa Viner : Thermo Scientific, Falcon Discussion: Mexican ProteomicsL

Where to go?

13:30-15:30

Lunch &

Poster Viewing

Lunch &

Poster Viewing

Lunch &

Poster Viewing

15:30-17:30 Oral Sessions Oral Sessions Oral Sessions

15:30-15:45 Augusto C. Poot Hernández David Salomon Dozal Domínguez Luis E. González de la Vara

15:45-16:00 Areli Cruz-Castañeda Cesar López-Camarillo Bronwyn J. Barkla

16:00-16:15 Fernando Vargas R. Nora Gutierrez Nájera Victoria Pando

16:15-16:30 Cesar Lugo-Caballero Lyssia Castellanos Tapia María Isabel Salazar

16:30-16:45 Rosa Elena Cárdena-Guerra Juan M. Guzmán Flores Angelica Torres Arroyo

16:45-17:00

REGISTRATION Hotel Lobby

Vladimir Paredes Cervantes Victoriano Pérez-Vázquez Juan M. Guzmán Flores

17;00-17:15 Carlos Ortega Jorge I. Sotelo Cano Francisco J. Rendón-Gandarilla

17:15-17:30 Homer A. Gamboa Romero Francisco Reta Mares Discussion

17:30-17:45 Official Opening Coffee break Coffee break Coffee break

17:45-19:00

Plenary Lecture I Richard J. Kuhn(C) Purdue University

Poster Session 1 even numbers

Poster Session 2 odd numbers

Business Meeting SMP and Closing

19:00-22:00

Cocktail Party Dinner GALA DINNER Dinner

IV Simposio de Espectrometría de Masas - Proteómica Celular y Molecular

IV Simposio de Espectrometría de Masas: Proteómica Celular y Molecular

PROGRAM

Day 1 (Tuesday November 8th, 2011) 3:00-6:00 pm Arrival and Registration – Hotel Lobby 6:00–7:00 pm Richard J. Kuhn

“DENGUE VIRUS INFECTION INDUCES CHANGES TO CELLULAR MEMBRANE ARCHITECTURE”

7:00–10:00 pm Opening Mixer (Canapés and Open Bar)

Day 2 (Wednesday November 9th, 2011) Bioinformatics and Systems Biology Morning Session - Auditorium 9:00 – 9:50 am Genaro Pimienta

“SYSTEM-WIDE mRNA TRANSCRIPT AND PROTEOME PROFILES OF B-CELLS EXPRESSING VIRAL NON-CODING RNAS”

9:50 – 10:40 am Jay Thelen “QUANTITATIVE PROTEOMICS OF OILSEEDS – DIFFERENTIAL ANALYSIS OF SEED MATURATION, DISCOVERY PHOSPHOPROTEOMICS, AND ABSOLUTE QUANTITATION OF ALLERGENS”

10:40 – 11:00 am MORNING COFFEE BREAK 11:00–11:30 am - Rosa María Gutierrez Rios

“ANÁLISIS COMPARATIVO DE LAS REDES REGULACION TRANSCRIPCIONAL DE ESCHERICHIA COLI Y BACILLUS SUBTILIS”

11:30–12:00 am - Arturo Becerra Bracho “THE GENE COMPLEMENT OF THE LAST COMMON ANCESTOR”

12:00 – 12:30 am - Osbaldo Resendis - Antonio

“WHY AND HOW SYSTEMS BIOLOGY CAN CONTRIBUTE TO GENOME SCALE EXPLANATION AND PREDICTION OF METABOLIC PHENOTYPE IN MICROORGANISMS.”

12:30-13:00 - Luis Mendoza Sierra

“MODELING OF THE GENETIC REGULATORY NETWORK OF T LYMPHOCYTES”

13:00-13:30 - Rosa Viner

“A HIGH-RESOLUTION/ACCURATE-MASS TARGETED APPROACH FOR KINASE INHIBITOR SCREENING USING THE Q EXACTIVE”

1:30 – 3:30 pm LUNCH AND POSTER VIEWING

Afternoon Session - AUDITORIUM 3:30 – 3:45 pm -Augusto C. Poot Hernández

“UNA ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ESTUDIO COMPARATIVO DEL METABOLISMO MEDIANTE ALINEAMIENTOS DE PASOS ENZIMÁTICOS”

3:45 – 4:00 pm - Areli Cruz-Castañeda

“HELICOBACTER PYLORI PROTEOMICS TO IDENTIFY HAEMOGLOBIN-BINDING PROTEINS”

4:00 – 4:15 pm - Cesar Lugo-Caballero “LYT1 FROM TRYPANOSOMA CRUZI OLIGOMERIZE AND SHOWS LYTIC ACTIVITY UNDER ACIDIC CONDITIONS”

4:15 – 4:30 pm - Fernando Vargas R.

“EFECTO DEL HOSPEDERO EN EL PERFIL DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DE MYCOBACTERIUM BORIS”

4:30 – 4:45 pm – Rosa Elena Cárdenas-Guerra

“LA REGIÓN PRE-PRO DE LA TVCP4 DE TRICHOMONAS VAGINALIS FUNCIONA COMO INHIBIDOR DE CISTEÍNA PROTEINASAS”

4:45 – 5:00 pm - Vladimir Paredes Cervantes

“PROTEOMA COMPARATIVO DE BRUCELLA ABORTUS 2308 Y SU MUTANTE EN EL SISTEMA DE SECRECION TIPO IV VIRB”

5:00 – 5:15 pm - Carlos Ortega

“PROTEOME OF CROTALUS BASILISCUS AND IDENTIFICATION OF IMMUNOGENS FOR ANTIVENOM MANUFACTURE”

5:00 – 5:15 pm - Homer A. Gamboa Romero

“ANÁLISIS COMPARATIVO DE LOS PERFILES PROTEÓMICOS UNIDIMENSIONALES Y EN DOBLE DIMENSIÓN DE LOS VENENOS DE SERPIENTES ADULTAS DE CROTALUS BASILISCUS, CROTALUS ATROX Y CROTALUS MOLOSSUS.

5:30 - 7:00 pm POSTER SESSION

Day 3 (Thursday 10th, 2011) Biomedical Proteómics Morning Session - AUDITORIUM 9:00 – 9:50 am Mireya Felhazy – Invited Speaker

"USE OF PROTEOMICS IN SALIVARY DIAGNOSIS" 9:50 – 10:40 am Alma Burlingame - Invited Speaker

“THE IMPACT OF ELECTRON TRANSFER MASS SPECTROMETRY ON SOLVING ISSUES IN PROTEIN BIOLOGY”

10:40 – 11:00 am MORNING COFFEE BREAK 11:00 – 11:30 am – Ma. Elizbeth Alvarez Sánchez

" EL PROTEOMA DE TRICHOMONAS VAGINALIS EN PRESENCIA DE Zn2+”.

11:30 – 12:00 am - Javier Ambrosio

“ANÁLISIS PROTEÓMICO E INMUNOPROTEÓMICO DEL CITOESQUELETO DE PARÁSITOS Y SU UTILIDAD EN LA EVALUACIÓN DE FÁRMACOS ANTIPARASITARIOS O DE SUSTANCIAS CON POTENCIAL PARASITARIO”

12:00 – 12:30 pm - Patricia Talamás Rohana

“ANÁLISIS PROTEÓMICO DEL LÍQUIDO ASCÍTICO DE PACIENTES CON CARCINOMA OVÁRICO EN ETAPAS AVANZADAS (III Y IV)”

12:30 – 1:00 pm - Lucero Ramón-Luing

“IDENTIFICATION OF A POTENTIAL PLASMINOGEN ACTIVATOR IN MYCOBACTERIAS”

1:00 – 1:30 pm - Rosa Viner “ADVANCES IN ORBITRAP TECHNOLOGY - A FULLY AUTOMATED WORKFLOW FOR GLYCOPEPTIDE ANALYSIS AND PROTEOMICS APPLICATIONS”

1:30 – 3:30 pm LUNCH AND POSTER VIEWING Afternoon Session 3:30-5:30 pm - AUDITORIUM 3:30 – 3:45 pm - David Salomon Dozal Dominguez

"DETERMINACIÓN DE VARIACIONES EN EL PROTEOMA SALIVAL EN PACIENTES PEDIÁTRICOS CON RABDOMIOSARCOMA MEDIANTE ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL"

3:45 – 4:00 pm - Cesar López-Camarillo

“IDENTIFICACIÓN PROTEÓMICA DE POTENCIALES MARCADORES TUMORALES EN CÁNCER DE MAMA INVASOR DE PACIENTES MEXICANAS”

4:00 – 4:15 pm - Nora Gutierrez Nájera

“UN ESTUDIO CON ENFOQUE PROTEÓMICO EN CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA PERMITE LA IDENTIFICACIÓN DE BIOMARCADORES DE TIPO METABÓLICO PARA ESTA ENFERMEDAD”.

4:15 - 4:30 pm - Lyssia Castellanos Tapia

“ANÁLISIS PROTEÓMICO EN TEJIDO ADIPOSO DEL EFECTO DE LOS ÁCIDOS GRASOS OMEGA 3 EN UN MODELO CON SÍNDROME METABÓLICO INDUCIDO POR LA DIETA”

4:30 -4:45 pm - Juan M. Guzmán Flores “ANÁLISIS PROTEÓMICO DIFERENCIAL EN PÁNCREAS DE RATONES OBESOS Y DIABÉTICOS DB/DB”

4:45 – 5:00 pm - Victoriano Pérez-Vázquez “CAMBIOS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN HÍGADO DE RATÓN DIABÉTICO”

5:00 – 5:15 pm - Jorge I, Sotelo Cano “IDENTIFICATION OF FEEDING-INDUCED CHANGES IN PROTEIN PROFILES FROM MEMBRANOUS FRACTIONS OF MECCUS PALLIDIPENNIS INTESTINES”

5:15 – 5:30 pm - Francisco Reta Mares “CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y ANTIGÉNICA DE VENENOS DE SERPIENTES C. BASILISCUS EN DIFERENTES ETAPAS DE DESARROLLO, UTILIZADOS EN LA PRODUCCIÓN DE ANTIVENENOS FABOTERÁPICOS)”.

5:30 - 7:00 pm POSTER SESSION

8:00PM- GALA DINNER

Day 4 (Friday November 11th, 2010) Plant Systems Biology Morning Session - AUDITORIUM 9:00 – 9:50 am Sarah Assmann – Invited Speaker

“SIGNAL INTEGRATION IN THE GUARD CELL PROTEOME” 9:50 – 10:40 am Robert Wrinkler – Invited Speaker

“PROTEOMIC SCREENING OF A MAIZE KERNEL COLLECTION FOR ACTIVE PEROXIDASES”

10:40 – 11:00 am MORNING COFFEE BREAK 11:00 – 11:30 am Rosario Vera-Estrella

"QUANTITATIVE PROTEOMICS TOWARD PLANT SALINITY TOLERANCE"

11:30 – 12:00 am Romina Ma de la Paz Rodríguez Sanoja

"DISEÑO DE UN MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AMILASAS EN UNA MASA DE POZOL"

12:00 – 12:30 pm Arturo Guevara

“IDENTIFICACIÓN DE GENES INVOLUCRADOS EN AL BIOGÉNESIS DEL CLOROPLASTO A TRAVÉS DE UN ANÁLISIS PROTEÓMICO COMPARATIVO DE MUTANTES DE ARABIDOPSIS THALIANA.”

12:30 – 1:00 pm Ana Paulina Barba de la Rosa

“PROTEOMICS TOWARD FOOD SCIENCES AND NUTRITION APPLICATIONS”

1:00 – 1:30 pm Discussion: Mexican ProteomicsL Where to go? 1:30 – 3:30 pm LUNCH Afternoon Session AUDITORIUM 3:30 – 3:45 pm -Luis Gonzalez de la Vara

“IDENTIFICACIÓN POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS DE PROTEÍNAS DE MEMBRANAS DE BETABEL SEPARADAS POR PARTICIÓN EN SERIE CON TRITON X-114”

3:45– 4:00 pm – Bronwyn J. Barkla

"PROTEIN PROFILING OF EPIDERMAL BLADDER CELLS FROM THE HALOPHYTE MESEMBRYANTHEMUM CRYSTALLINUM"

4:00 – 4:15 pm - Victoria Pando

“RESPIRATORY PATHOGENS DETECTION IN SAMPLES COLLECTED DURING PANDEMIC OUTBREAK OF RESPIRATORY ILLNESS ASSOCIATED TO INFLUENZA A (H1N1 PDM), BY RT-PCR AND MASS-TAG MULTIPLEX PCR”

4:45– 4:30 pm - María Isabel Salazar

“LA PROTEÍNA NS1 EN LA MODULACIÓN DEL MHC Y CITOCINAS RELEVANTES PARA LA RESPUESTA INMUNE CONTRA EL VIRUS DEL DENGUE EN UNA LÍNEA DE CÉLULAS MONOCÍTICAS HUMANAS”

4:30 – 4:45 pm - Angélica Torres Arroyo

“IDENTIFICACION POR INMUNOPROTEÓMICA DE LOS ANTÍGENOS RELACIONADOS EN LA HIPERSENSIBILIDAD A LA LECHE EN PACIENTES PEDIÁTRICOS”.

4:45 – 5:00 pm - Juan Manuel Guzmán Flores “ANÁLISIS PROTEÓMICO DIFERENCIAL DEL HÍGADO DE RATÓN DE 10 Y 20 SEMANAS DE EDAD”

5:00– 5:15 pm - Francisco J, Rendón-Gandarilla “ANÁLISIS DE LAS MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LA CISTEÍNA”

5:15– 5:30 pm DISCUSSION

5:30 – 7:00 pm MESA RODUNDA, CLOSING CEREMONY AND BUSINESS MEETING

DENGUE VIRUS INFECTION INDUCES CHANGES TO CELLULAR MEMBRANE ARCHITECTURE

Richard J. Kuhn1, 2

1Markey Center for Structural Biology, Dept. of Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, IN,

2Bindley Bioscience Center, Purdue University, West Lafayette, IN

Dengue virus is a positive strand RNA virus that induces substantial intracellular membrane rearrangements within host cells to facilitate replication. These membrane rearrangements coincide with increased lipid biosynthesis induced by the expression of viral gene products. We are using a multidisciplinary approach to investigate the molecular mechanisms that drive intracellular membrane rearrangements during dengue infection. We have developed a high-resolution mass spectrometry based approach to identify the lipid components and regulators important for the formation of these intracellular membranous structures. Results from these analyses have indicated a clear difference between the overall lipid composition of dengue-infected human hepatoma (Huh7) cells compared to uninfected cells. We are pursuing ultrastructural analyses of dengue-induced membrane structures using high pressure freezing and electron tomography in both Huh7 and C6/36 mosquito cells. These studies are focused on comparing the intracellular membrane structures of infected cells to uninfected cells and those expressing individual viral proteins. Using a combination of molecular genetics and biochemistry we are further defining the viral gene products responsible for these rearrangements and the combination of approaches will allow us to identify the signaling pathways and membrane trafficking pathways engaged by these viral proteins. Ultimately, the viral genome RNA is captured by capsid proteins and the complex buds into the ER acquiring a lipid bilayer and viral transmembrane glycoproteins. The use of structural techniques has allowed us to visualize the process of enveloped virus assembly, although we are now using mass spectrometry techniques to determine the precise molecular composition of virion particles. Dengue virus exploits the cell secretory pathway to facilitate major protein conformational changes required to activate infectivity. Furthermore, we have shown that although the viral membrane stabilizes and protects the interior of the particle, it functions to anchor transmembrane glycoproteins that exhibit substantial dynamic properties.

SYSTEM-WIDE mRNA TRANSCRIPT AND PROTEOME PROFILES OF B-CELLS EXPRESSING VIRAL NON-CODING RNAS.

1Genaro Pimienta, 1Victor Fok, 2Tukiet Lam, 2Kathy Stone and 1Joan Steitz

1Department of Molecular Biophysics and Biochemistry and Howard Hughes Medical Institutions, Yale University.

2W. M. Keck Proteomics Facility, Yale University New Haven, CT. USA. The Epstein-Barr virus (EBV) is a -Herpes virus that infects humans ubiquitously, with innocuous effects in most cases. Its targets are lymphocytes, primarily circulating Bcells.EBV infection has been casually correlated with tumorigenic outbursts in immunocompromised individuals. Upon infection, EBV coerces its cellular host through a viral gene expression program that induces a life-long state of latency. EBV-latency promotes cell growth, impairs immune-related signaling and assures viral maintenance. From the 94 open reading frames in the EBV genome, 10 proteins and 2 EBV encoded RNAs (EBER1 and EBER2) are produced during latency. While these viral proteins are expressed differentially in a host-specific manner, EBER1/2s are produced in high amounts at all times. EBER1/2s are non-coding, double-stranded RNAs transcribed by the host RNA Polymerase III. These highly structured RNAs establish stoichiometrical RNA/protein complexes and localize in the nucleus. The expression of EBER1/2s in Bcell line model systems is tumorigenic, activating protein synthesis and growth promoting cytokine-mediated signaling cascades. While it is clear that EBER1/2 expression has pleiotropic effects in B-cells, the evidence so far is observational and a mechanistic understanding is still missing. Here we investigate in a quantitative manner, the global effects of EBER1/2 expression in an in vitro B-cell line model system (BJAB cells). By using exon-based mRNA transcript arrays and SILAC-based proteomics, we have determined the transcriptome and proteome of BJAB cells expressing EBER1/2. With various bioinformatics tools, we have also performed a pathway network analysis of our data. Our results show how EBER1/2 expression in B-cells rewires global signaling cascades.

QUANTITATIVE PROTEOMICS OF OILSEEDS – DIFFERENTIAL ANALYSIS OF SEED MATURATION, DISCOVERY PHOSPHOPROTEOMICS, AND ABSOLUTE QUANTITATION OF

ALLERGENS

Jay J. Thelen

Department of Biochemistry, University of Missouri-Columbia Oilseeds are important renewable sources of protein and oil, which are produced primarily during the maturation or seed-filling phase of embryo development. To characterize this developmental process at the proteome level, my lab employs multiple proteomics approaches in parallel to quantitatively profile and identify hundreds to thousands of proteins expressed during seed filling in diverse crop and model oilseeds including soybean, canola, Arabidopsis, and castor. The principal objective is to quantitatively compare protein expression in developing seed that differ in oil:protein ratio and photosynthetic capacity. Interesting differences were found at the metabolic level and I will present the findings from these studies employing a combination of approaches (2-DE, MudPIT, and GeLC-MS) to study both development and seed tissues (www.oilseedproteomics.missouri.edu). We have also performed a comparative analysis of steady-state transcript and protein expression during seed filling in Arabidopsis, and using general linear modeling demonstrate that concordance is overall poor (~50%) and individually dependent upon protein function. Extending these protein expression studies we have begun analyzing important post-translational modifications and will present the results of recent discovery phosphoproteomic screens, using both experimental and bioinformatics approaches (www.p3db.org). Nearly all crop oilseeds are consumed by animals or humans, representing a significant and healthful source of fatty acids and protein. However, some seed proteins are anti-nutritional or allergenic. Modern regulatory practices now require monitoring of these proteins in new crop releases to insure food safety. Previous attempts to quantify these proteins from mature seed have employed low-resolution 2-DE, with equivocal results. In a large collaborative study with multiple government and corporate sponsors we have begun to determine both the genetic and environmental impact on ten prominent allergens in soybean using absolute quantitation (AQUA-MRM). The results reveal significant allergen-dependent variation within twenty commercial varieties of soy, covering most of the domestic food supply. With this targeted proteomic approach we were able to achieve technical reproducibility <10% CV, and are now extending this methodological approach in a discovery-to-targeted quantitation platform encompassing both basic and applied research.

ANÁLISIS COMPARATIVO DE LAS REDES REGULACION TRANSCRIPCIONAL DE ESCHERICHIA COLI Y BACILLUS SUBTILIS.

Vázquez Hernández Carlos Daniel, Freyre González Julio y Gutiérrez Ríos Rosa Ma.

Departamentos de Microbiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Apdo. Postal 510-3, Cuernavaca, Morelos, México

En los últimos años, la aplicación de la teoría de redes al estudio de los sistemas biológicos, ha demostrado que éstos comparten propiedades topológicas que han permitido empezar a conocer los mecanismos generales que han sido seleccionados a lo largo de la historia evolutiva. Una de estas propiedades es la modularidad, que nos permite descomponer a la red en entidades cohesivas y menos conectadas con el resto de la red. La importancia de esta propiedad y su asociación con posibles roles fisiológicos en los sistemas biológicos son de trascendencia para redefinir el concepto de función a partir de la relación módulo-función. De particular relevancia resulta la aplicación de este tipo de estudios a redes de regulación transcripcional, que son las responsables de controlar la expresión de genes frente a una condición particular y en el caso de organismos filogenéticamente, entender como las redes de regulación en organismos con nichos diferentes han evolucionado a través del tiempo para adaptarse a condiciones ambientales similares, lo cual es el objeto de esta plática.

In recent years, the application of network theory to the study of biological systems has shown that their networks share topological properties that permit to elucidate general mechanisms that have been selected over evolutionary history. One such property is modularity, which allows us to decompose the network into cohesive entities, less connected to the rest of the network. The importance of this property and its association with physiological roles are transcendent to redefine the concept of function from module-function relationship. Of particular relevance is the application of this type of study to transcriptional regulatory networks, which are responsible for controlling the expression of genes in a particular condition. And in the case of distant phylogenetically organisms, as Escherichia coli and Bacillus subtilis, understand how the regulatory networks of these bacteria have differed and evolved over time, to adapt in similar environmental conditions, which is the subject of this talk

THE GENE COMPLEMENT OF THE LAST COMMON ANCESTOR

Arturo Becerra Bracho

Facultad de Ciencias, UNAM

Estimates of the gene complement of the last common ancestor may be hindered by ancient horizontal gene transfer events and polyphyletic gene losses, as well as by biases in genome databases and methodological artifacts. Nevertheless, most reports agree that the last common ancestor resembled extant prokaryotes. A significant number of the highly conserved genes are sequences involved in the synthesis, degradation, and binding of RNA, including transcription and translation. The resulting complement is dominated by different putative ATPases, and by molecules involved in gene expression and RNA metabolism. DEAD-type RNA helicase and enolase genes, which are known to be part of the RNA degradosome, are as conserved as many transcription and translation genes. This suggests the early evolution of a control mechanism for gene expression at the RNA level, providing additional support to the hypothesis that during early cellular evolution RNA molecules played a more prominent role. Conserved sequences related to biosynthetic pathways include those encoding putative phosphoribosyl pyrophosphate synthase and thioredoxin, which participate in nucleotide metabolism. Although the gene complement of the cenancestor includes sequences that may have originated in different epochs, the extraordinary conservation of RNA-related sequences supports the hypothesis that the last common ancestor was an evolutionary outcome of the so-called RNA/protein world.

WHY AND HOW SYSTEMS BIOLOGY CAN CONTRIBUTE TO GENOME SCALE EXPLANATION AND PREDICTION OF METABOLIC PHENOTYPE IN MICROORGANISMS.

Osbaldo Resendis Antonio. Center for Genomics Sciences-UNAM. Universidad Nacional Autónoma de México.

Cuernavaca, México. Email:resendis@ccg.unam.mx.

Abstract.

With the advent of high-throughput technology an increased need to develop theoretical frameworks proper to analyze data in a coherent and systematic fashion is a mayor priority in systems biology for understanding how cell organize its metabolic response under environmental perturbations or internal mutations. This enterprise faces with statistical and methodological challenges whose solutions require of computational tools for unwinding and understanding the relation between genotype and phenotype in microorganism. Among the variety of issues to solve, the quantification of metabolic phenotype in genome scale modeling claims for an interdisciplinary view for analyzing how biological networks interact among them to specify the macroscopic phenotype in living organisms. In this talk, I will present a paradigm in systems biology and how through a combined analysis of top-down and bottom-up schemes one can survey the feasible phenotype capacities in microorganisms. This approach leads us to construct a computational model that serves as a guide for 1) integrating high-throughput data, 2) describing and predicting metabolic activity, and 3) designing experiments to explore the genotype-phenotype relationship in microorganisms. To exemplify the integrative description of these schemes, we briefly discuss some specific examples to show how metabolic networks confer phenotype properties in organisms. References Modular analysis of the transcriptional regulatory network of E. coli. Resendis-Antonio O, Freyre-González JA, Menchaca-Méndez R, Gutiérrez-Ríos RM, Martínez-Antonio A, Avila-Sánchez C, Collado-Vides J. Trends Genet. 2005 Jan;21(1):16-20. Systems biology of bacterial nitrogen fixation: High-throughput technology and its integrative description with constraint-based modeling. Resendis-Antonio O, Hernández M, Salazar E, Contreras S, Batallar GM, Mora Y, Encarnación S. BMC Syst Biol. 2011 Jul 29;5:120. Metabolic reconstruction and modeling of nitrogen fixation in Rhizobium etli.Resendis-Antonio O, Reed JL, Encarnación S, Collado-Vides J, Palsson BØ. PLoS Comput Biol. 2007 Oct;3(10):1887-95. Epub 2007 Aug 17. Filling kinetic gaps: dynamic modeling of metabolism where detailed kinetic information is lacking. Resendis-Antonio O. PLoS One. 2009;4(3):e4967

MODELING OF THE GENETIC REGULATORY NETWORK OF T LYMPHOCYTES

Luis Mendoza

Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México Ciudad Universitaria, D.F. CP04510, México.

There is a vast amount of molecular information regarding the differentiation of T lymphocytes, in particular regarding in vitro experimental treatments that modify their differentiation process. This publicly available information was used to infer the regulatory network that controls the differentiation process of T lymphocytes into CD4+ and CD8+ cells. The network consists of 50 nodes and 95 regulatory interactions, representing the main signaling circuits established between molecules and molecular complexes regulating the differentiation of T cells. The network was converted into a continuous dynamical system in the form of a set of coupled ordinary differential equations ad its dynamical behavior was studied. With the aid of numerical methods, nine fixed point attractors were found for the dynamical system. These attractors correspond to the activation states observed experimentally for the following cell types: CD4CD8, CD4+CD8+, CD4+ naive, Th1, Th2, Th17, Treg, CD8+ naive, and CTL. The dynamical behavior of this network model will be presented, showing that it represents qualitatively the known behavior of differentiation of T lymphocytes under different in vitro settings.

UNA ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ESTUDIO COMPARATIVO DEL METABOLISMO MEDIANTE ALINEAMIENTOS DE PASOS ENZIMÁTICOS.

Augusto César Poot Hernández, Patricia Guadalupe Ortegón Cano, Katya Rodríguez

Vázquez y Ernesto Pérez Rueda.

Instituto de Biotecnología, UNAM. Instituto de Investigaciones en Matemáticas Aplicadas y en Sistemas, UNAM.

(dragopoot@gmail.com, katya@uxdea4.iimas.unam.mx, erueda@ibt.unam.mx)

El metabolismo se define como el conjunto de las reacciones bioquímicas que suceden en un ser vivo y que le permiten intercambiar energía y materia con el ambiente. Aunque se ha estudiado el metabolismo y su evolución desde diversas perspectivas, son pocos los estudios donde se le compare globalmente en diferentes organismos desde una perspectiva funcional, que nos permita identificar sus similitudes y diferencias. En este sentido, los Números Enzimáticos (NE) son un sistema de clasificación que describe la actividad catalítica de las enzimas, por lo que pueden ser usados para comparar el metabolismo desde una perspectiva funcional. En este trabajo proponemos la implementación de una estrategia general para el alineamiento de cadenas lineales de pasos enzimáticos representados por sus NE. Esta estrategia implica la generación de cadenas de pasos enzimáticos a partir de los mapas metabólicos contenidos en la base de datos KEGG. Posteriormente estas cadenas se alinean usando un algoritmo genético. De este modo podremos analizar las similitudes y diferencias funcionales entre los metabolismos de distintos organismos de forma global y sistematizada. Usando esta estrategia hemos analizado el metabolismo de la bacteria Escherichia coli K12. Se analizaron 47 mapas metabólicos que originaron 452 cadenas de pasos enzimáticos. Estas cadenas se compararon por pares todas versus todas con lo cual se generó una matriz de similitud que posteriormente fue analizada con métodos de agrupamiento. De este análisis se obtuvieron 34 grupos de cadenas de pasos enzimáticos similares. Así, se pueden identificar grupos de pasos enzimáticos funcionalmente similares pertenecientes a rutas metabólicas diferentes. Uno de estos grupos incluye cadenas de pasos enzimáticos provenientes de mapas que describen el metabolismo de diversos carbohidratos. Algunas de estas cadenas incluyen reacciones que son catalizadas por enzimas homólogas lo cual sugiere reclutamientos de pasos enzimáticos tipo Patch work. Actualmente estamos trabajando en refinar esta estrategia para hacer un análisis comparativo del metabolismo de distintas especies de Gama Proteobacterias, con el fin de poder identificar las similitudes y diferencias en sus metabolismos.

HELICOBACTER PYLORI PROTEOMICS TO IDENTIFY HAEMOGLOBIN-BINDING PROTEINS

Areli Cruz-Castañeda and José de Jesús Olivares-Trejo.

Posgrado en Ciencias Genómicas, Universidad Autónoma de la Cuidad de México, San Lorenzo, 290, México, D. F.

Corresponding address: jouacm@gmail.com Grant number PIFUTP09-269 and SALUD-2010-C01-139945

H. pylori is a human bacterial pathogen, generally is founded causing peptic ulcer and has been suggested that this bacterium needs high concentrations of iron to survive in the human. Since free iron concentrations are minimal in the host, H. pylori has developed the capacity to obtain iron from sources available like lactoferrin (Lt) haemoglobin (Hb) or haem. In fact, this bacterium can grow under laboratory conditions using Hb or haem as sole iron supply. Only three proteins with unfortunately unknown identities have been related to haem utilization and one protein termed FrpB2 with capacity of Hb-binding has been identified recently. Now, we are using a strategy different, which allow us to identify Hb-binding proteins, in order to explore the complete mechanism of iron acquisition, developed by H. pylori to obtain iron from Hb. The results showed us that H. pylori expresses at least seven Hb-binding membrane proteins. These proteins were separated from membranes of H. pylori grew in absence of iron, then, their Hb-binding capacity was tested using an overlay assay. Overall findings, suggest that the mechanisms developed by H. pylori to utilize Hb as iron source, involves more proteins that those previously reported and maybe the mechanism is more sophisticated, but necessary to support the extreme conditions present in the host stomach.

LYT1 FROM TRYPANOSOMA CRUZI OLIGOMERIZE AND SHOWS LYTIC ACTIVITY UNDER ACIDIC CONDITIONS

César Lugo-Caballero, Arturo Rojo Domínguez, Rebeca Manning Cela

Departamento de Biomedicina Molecular, CINVESTAV Zacatenco.

Av. Instituto Politécnico Nacional 2509, San Pedro Zacatenco CP 07360 México DF Email: cesarlugoc@gmail.com

Few molecules have been identified that participate in the infection process of T. cruzi but only LYT1 has been demonstrated by genetic analysis. Two LYT1 products are obtained by alternative trans-splicing in which the full-length LYT1 protein contains an amino-terminal signal sequence and an internal sequence for directs nuclear localization, whereas the truncated protein lacks the secretion sequence. Therefore, one form of the LYT1 protein is secreted and participates in hemolysis, infectivity and the parasitophorous vacuole escape whereas the other form is located in the nucleus and kinetoflagellar zone and is involved in the parasite developmental process. This dual/single-gene expression, and the consequent differential localization and functional switching of LYT1 protein products expose these molecules to different microenvironments that could impact on protein folding and the LYT1 interaction with itself and with other proteins that could result in their possible participation in the LYT1 phenotypes. Therefore, in this work we obtained the LYT1 interactome and evaluated the LYT1-LYT1 interaction using in vitro and in vivo approaches. The result shows that LYT1 interacts with itself and with at least other 14 proteins from 8 to 255 kDa. The MS-MS analysis allows us to identify proteins that are related with the infection or stage-transition process including the endogenous LYT1. NATIVE-PAGE experiments showed that LYT1 associates with itself only under acidic conditions, apparently by the presence of a coiled coil region included between the 163 to 198 residues of its amino acid sequence determined by in silico analysis. Hemolytic assays showed that while the full-length LYT1 has lytic activity, its coiled-coil-deleted mutant not thus demonstrating that LYT1 lytic activity is dependent of its protein multimerization. Furthermore, the different domains of LYT1 or combination of them lacked hemolytic activity suggesting that the folding of the protein is important to carry out the lytic activity. Finally, the electron microscopy analysis of biological membranes, that were negative stained after their interaction with the full-length LYT1 recombinant protein and the corresponding coiled-coil-deleted mutant, demonstrated that the hemolysis was the result of LYT1 pore forming activity dependant of the LYT1-LYT1 interaction through its coiled coil structure.

EFECTO DEL HOSPEDERO EN EL PERFIL DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DE MYCOBACTERIUM BORIS

M. en C. Fernando Vargas R*1, Dr. Francisco Suarez G2, Dr. José Ángel Gutiérrez P2, Dr.

Mauricio Castañón-Arreola.1

1Posgrado en Ciencias Genómicas, UACM, 2Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM.

*vfernandor@hotmail.com La tuberculosis es una enfermedad causada por especies estrechamente relacionadas que afectan tanto al humano como a los animales. Las dos especies de mayor importancia para el humano son M. tuberculosis y M. bovis. Si bien se reconoce a M. tuberculosis como el principal agente etiológico de la tuberculosis humana, esta también puede ser debida a la infección por M. bovis, aunque en menor grado (La OMS estima que causa el 3% de los casos nuevos de tuberculosis cada año). Aunque estas dos especies comparten más del 99.5% de homología en su secuencia, muestran diferencias significativas en el espectro de hospederos que pueden infectar; mientras que M. tuberculosis se ha reportado casi exclusivamente en humanos, M. bovis presenta un ciclo más complejo, pudiendo colonizar al hombre, animales domésticos y fauna silvestre, lo que hace más difícil su control y eventual erradicación. A pesar de que no están bien definidos los factores involucrados en la virulencia de M. bovis, se sabe que está relacionada a la capacidad de invasión de la bacteria y la expresión de genes específicos relacionados con la evasión de la respuesta inmune, metabolismo y crecimiento. Estas diferencias en virulencia al parecer son el resultado de la expresión deficiente de las proteínas involucradas en la evasión de la respuesta inmune, debido a que los bovinos son más susceptibles a la infección. Para identificar proteínas que son expresadas diferencialmente por M. bovis en diferentes hospederos, se analizaron 30 aislamientos de campo para identificar una con el mismo espoligotipo que la cepa 04-302 que fue aislada de jabalí y cuyo genotipo esta asociado a casos de infección en humanos. Mediante la comparación del secretoma de ambas cepas se observó la expresión diferencial de más de 60 proteínas. Al evaluar la capacidad de infección de las bacterias en ensayos de fagocitosis con la línea celular de Macrófagos J774 se observó que esta era significativamente mayor en el aislado de Jabalí, a la vez que se presentaba una menor producción de óxido nítrico. La identificación de las proteínas expresadas diferencialmente estos aislados y la vacuna M. bovis BCG, permitirá determinar el papel que juegan en la invasión y la evasión de la respuesta inmune. Este proyecto se realiza con financiamiento de Instituto de Ciencia y Tecnología del Distrito Federal (proyectos: PIFUTP08-101 y PIFUTP09-269).

LA REGIÓN PRE-PRO DE LA TVCP4 DE TRICHOMONAS VAGINALIS FUNCIONA COMO INHIBIDOR DE CISTEÍNA PROTEINASAS.

Rosa Elena Cárdenas-Guerra1, Rossana Arroyo2 y Jaime Ortega-López1.

1Departamento de Biotecnología y Bioingeniería, CINVESTAV-IPN; 2Departamento de

Infectómica y Patogénesis Molecular, CINVESTAV-IPN. Av. IPN No. 2508. Col. San Pedro Zacatenco, CP 07360. México, D.F. rarroyo@cinvestav.com; jortega@cinvestav.com

La tricomonosis causada por Trichomonas vaginalis, es una de las infecciones de transmisión sexual más común en el mundo y con un fuerte impacto en la salud humana. Trichomonas vaginalis, es un protozoario parásito que tiene múltiples proteinasas, principalmente del tipo cisteína (CPs). Las CPs se sintetizan como precursores inactivos que poseen una región pre-pro (un péptido señal y un prodominio) y un dominio catalítico (enzima madura). La región pre-pro se requiere para el plegamiento apropiado del precursor y también funciona como inhibidor específico que por cambios de pH o condiciones de óxido-reducción se remueve para dar lugar a la enzima madura. La TvCP4 es una CP de T. vaginalis con homología a catepsinas L, cuya expresión se regula positivamente por hierro y es una de las CPs más inmunogénicas reconocida por sueros de pacientes con tricomonosis. La TvCP4 se sintetiza como un precursor de 305 aminoácidos, contiene la región pre-pro y la triada catalítica (C25, H159, N175), típica de las CPs de tipo papaína. El objetivo de este trabajo fue determinar si la región pre-pro de la TvCP4 funciona como un inhibidor específico para CPs. Para ello, se clonó, expresó y purificó la región del pre-pro en bacterias. Para probar el efecto inhibitorio de la región pre-pro recombinante se realizaron zimogramas en 1- y 2-D de los extractos de proteasas después de la incubación de la región pre-pro recombinante con parásitos metabólicamente activos y con extractos proteicos ricos en proteasas. Los resultados muestran inhibición de la actividad proteolítica de las regiones de 97.5, 50, 39 y 30 kDa. Estos datos sugieren que la región pre-pro recombinante puede utilizarse como un inhibidor sintético de la actividad catalítica de tipo cisteína en T. vaginalis y posiblemente en otros protozoarios.

PROTEOMA COMPARATIVO DE BRUCELLA ABORTUS 2308 Y SU MUTANTE EN EL SISTEMA DE SECRECION TIPO IV VIRB

Vladimir Paredes Cervantes1,2,3, Humberto Lanz Mendoza2, Martha Cecilia. Moreno Lafont

1, Ángel Tello Tolentino2, Jane Castillo Vera3,4, Victoria Pando Robles2, Gerardo Hurtado Sil2, Octavio Rodríguez Cortes1, Edith González González1, Raúl Flores Mejía1, María Teresa

Vega Ramírez1, Adriana Gutiérrez Hoya1, Rubén López Santiago1*.

1Departamento de Inmunología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, México, D.F. 2Centro de Investigación sobre Enfermedades

Infecciosas, Instituto Nacional de Salud Publica, Cuernavaca, Morelos, México. 3Instituto Mexicano del Seguro Social CMN “La Raza”. 4Departamento de Microbiología, Escuela

Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, México, D.F.Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional. Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n. Colonia Santo Tomás. 11340, México D. F. Tel: (+5255)57296300 ext.

62368. Fax (+5255)57296300 ext. 62489. e-mail: rlslennon@gmail.com Brucella pertenece al grupo de las alpha-2-proteobacterias, cuenta con un sistema de secreción tipo IV (SST4) llamado virB que ha mostrado ser esencial para la virulencia de la bacteria al permitirle formar una vacuola replicativa en asociación con el retículo endoplásmico de la célula huésped. En el presente trabajo comparamos los proteomas obtenidos mediante electroforesis bidimensional de la cepa mutada en el SST4 virB de Brucella abortus 2308 con los de la cepa silvestre, crecidas en condiciones de estrés ácido. Enfocamos nuestra atención en identificar las proteínas que mostraron un aumento en su nivel de expresión en la cepa mutante en virB crecida en pH ácido, con la finalidad de identificar posibles sustratos del SST4 o de reconocer proteínas relacionadas con la expresión del SST4 sobre las que este sistema de secreción tenga algún tipo de regulación. Se identificaron mediante MALDI TOF/TOF MS/MS y Swiss Prot 47 manchas que se sobreexpresaron y 22 que disminuyeron su nivel de expresión (Ludesi REDFIN). Algunas de las proteínas que identificamos han sido reportadas previamente en otras especies de Brucella en condiciones similares de cultivo y algunas se ha sugerido que pueden ser proteínas de secreción. El análisis bioinformático realizado mostro que un número importante de las proteínas identificadas pertenecen a la membrana externa y al espacio periplásmico (P-SORTb) y que teóricamente están relacionadas con el SST4 (STRING 8.2).

PROTEOME OF CROTALUS BASILISCUS AND IDENTIFICATION OF IMMUNOGENS FOR

ANTIVENOM MANUFACTURE

C. Ortega1,4, V. Pando2, H. Lanz2, S.M.T. Serrano3, A. Zelanis3, E. Kitano3, ME Jiménez4, F. Reta4, BE García1, J. Luna1.

1) Departamento de Inmunología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional. Mexico City, Mexico. 2) Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud Pública. Cuernavaca, México. 3) Laboratorio Especial de Toxinología Aplicada-CAT/CEPID, Instituto Butantán, Sao Paulo, Brasil. 4) Laboratorios de Biológicos y Reactivos de México, S.A. de C.V., Mexico City, Mexico. Envenoming by snake bite is a neglected public health problem in many tropical and subtropical countries, principally in Africa, Asia and Latin America. Around 5 million people are bitten each year, resulting in 400,000 amputations and at least 100,000 deaths. In Mexico, during 2006 a total of 3955 cases of snakebite poisoning were reported with a total of 2912 deaths. Antivenom, is the only antidote to snake envenomation, an antiviperin sera (polyvalent immune Fab) is used for the treatment. It is a polyclonal product that neutralizes venoms from snakes belonging to Crotalus and Bothrops genera, species that cause the major accidents in Mexico. The goal of this study is to characterize the proteome of Crotalus basiliscus venom, by two dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry and identify the components that are recognized by the antiviperin serum most common used in Mexico (produced by Birmex Company). A total of 16 proteins were identified from around 75 proteins visualized in the 2-D gel. Among all proteins characterized we found three protein families: serine proteinases, metalloproteinases and phospholipases in the venom and some of them show immunogenic activity, mostly those of low (6-16 kDa), and high (45- 68 kDa) molecular weight. The identification of immunogenic components of the proteome of C. basiliscus snake venom helps antiviperin third generation sera production; this is the use of recombinant DNA technology. The heterologous production of these proteins leads to the production of an antivenom biologically safe and skip the use of snakes. This work had support by Conacyt “Apoyo al fortalecimiento de Posgrado” y por el proyecto 86494SEP-CONACYT 2007 Caracterización molecular y funcional de los venenos de serpientes mexicanas, B. asper y C.basiliscus en diferentes etapas de maduración.

ANÁLISIS COMPARATIVO DE LOS PERFILES PROTEÓMICOS UNIDIMENSIONALES Y EN DOBLE DIMENSIÓN DE LOS VENENOS DE SERPIENTES ADULTAS DE CROTALUS

BASILISCUS, CROTALUS ATROX Y CROTALUS MOLOSSUS.

Homer Alfredo Gamboa Romero1, Humberto Lanz-Mendoza2, Francisco Reta Mares1, Alfredo Uscanga Reynell1 Nelson Álvarez Anell1, Ma Eugenia Jiménez Corona1, Ángel Tello

López2, Samuel Ponce de León1.

1Laboratorios de Biológicos y Reactivos de México. BIRMEX, SA de CV, México, DF. 2Instituto Nacional de Salud Pública, Cuernavaca Morelos. fretam@birmex.gob.mx*.

Introducción Las mordeduras provocadas por serpientes mexicanas del genero Crotalus y Bothrops, constituyen un importante problema de salud pública en México. En el año 2009 la Dirección General de Epidemiología reportó 1,493 accidentes por mordedura de serpiente. El tratamiento indicado para este tipo de mordeduras son los antisueros específicos, llamados faboterápicos). Desde hace más de 30 años Birmex produce un faboterápico equino antiviperino, a partir de una mezcla de venenos de serpientes Crotalus basiliscus y Bothrops asper, el cual ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de mordeduras de serpientes de estos géneros. Sin embargo se desconoce el espectro específico del reconocimiento antigénico del faboterápico contra los venenos de las diferentes especies de serpientes de dichos géneros causantes de la mayoría de las mordeduras en México; por lo que es importante determinar el perfil proteico del veneno de serpiente y evaluar la variabilidad del mismo entre diferentes especies, aspecto que aborda el presente trabajo para varias especies mexicanas del género Crotalus. Objetivo general: Comparar los perfiles electroforéticos de los venenos de tres serpientes mexicanas adultas del género Crotalus sp (basiliscus, atrox y molossus) en geles de poliacrilamida unidimensionales y en dos dimensiones. Material y Métodos: Se realizó el estudio del veneno de tres serpientes adultas Crotalus (basiliscus, atrox y molossus). El corrimiento electroforético unidimensional se realizó en condiciones reductoras y desnaturalizantes por la técnica de Laemmli. Los venenos de cada especie también fueron resueltos mediante Isoelectroenfoque en tirillas comerciales con gradiente de pH de 3-10 y luego fueron resueltos según el método de Laemmli ya mencionado. Las proteínas fueron visualizadas con azul brillante de Coomassie. Los geles se elaboraron por triplicado con la misma cantidad de proteína a fin de determinar la variabilidad de los ensayos. Con los tres geles de cada especie se integró un gel maestro por especie que contiene las proteínas que estuvieron presentes en 2 de los tres ensayos. Se compararon los geles maestros de las tres especies a fin de determinar las proteínas comunes, y las que presentan cambios en abundancia entre especies. Resultados: Mediante la caracterización electroforética unidimensional y bidimensional se observaron importantes variaciones entre los venenos de serpientes de diferentes especies en relación a sus componentes proteicos sobre todo entre componentes menores a los 10 kD. De igual manera se observaron componentes proteicos comunes a las tres especies estudiadas. Conclusión: La caracterización electroforética de los venenos de serpiente de las tres especies estudiadas permiten concluir que existen componentes proteicos que se comparten entre las tres especies de Crotalus y que adicionalmente hay algunas diferencias en proteínas de peso molecular por abajo de los 10 kDa. Será de vital importancias determinar cuales de los componentes encontrados en los proteomas de cada una de estas especies son reconocidos mediante reacción cruzada por el suero antiviperino producido en BIRMEX así como identificar por espectrometría de masas la identidad de estos componentes.

Use of Proteomics in Salivary Diagnosis

M. Gonzalez-Begne., DDS, PhD Center for Oral Biology; University of Rochester School of Medicine and Dentistry, Rochester,

NY., 14642

Human saliva contains a large array of proteins such as enzymes, growth factors, cytokines, immunoglobulins and mucins. Recent advances in oral biology have associated changes in oral fluids with local and systemic diseases. The determination of salivary biomarkers as a means of monitoring general health and for the early diagnosis of disease is of increasing interest in clinical research. However, there are no generally accepted saliva-based tests of oral disease susceptibility. In part this stems from the gap in our knowledge about the normal levels of salivary proteins in healthy subjects as well as the lack of adequate tools for monitoring and detection of various systemic diseases. The aim of this research was the identification of salivary proteins in health vs. oral diseases using proteomics. Salivary proteins were separated using different fractionation methods, digested with proteolytic enzymes, and then analyzed by MudPIT LC-ESI-MS/MS. The results showed that combination of different analytical approaches were crucial for reducing the complexity of the salivary proteome, thus enriching medium and low-abundant salivary proteins which could be used as important biomarkers for health and disease processes. In conclusion, these data have provided new information on the salivary proteome composition highlighting the potential use of saliva for disease diagnosis and prognostic monitoring. This research project was supported by UO1 DE16267-02, OCMB-NIH Training Grant DE07202 and 5KL2RR024136-04.

THE IMPACT OF ELECTRON TRANSFER MASS SPECTROMETRY ON SOLVING ISSUES IN PROTEIN BIOLOGY

A.L. Burlingame

UCSF, San Francisco, CA 94158-2517

The electrospray process forms multiply protonated protein and peptide species with ambient internal energy content. Thus mass selection of charge states from such clusters of pseudomolecular ions must be subjected to internal energy deposition of some kind in order to induce unimolecular dissociation reactions. The formation and analysis of the suites of product ions observed are essential in order to establish both sequence scaffolds and to elicit more detailed structural information present in complex spectra. Collisional precursor ion activation has been common place for some three decades, but has some major limitations. The advent of ETD energy deposition has provided an orthogonal technology to probe challenging problems in protein biology. These range from investigation of labile protein posttranslational modifications, through studies of larger peptides and proteins as intact species to new strategies for identification of chemical “rulers” as constraints on the architecture of protein machines This presentation will focus on examples from current research in my laboratory.

Financial support was provided by the NIH NCRR 0614 and HHMI.

EL PROTEOMA DE TRICHOMONAS VAGINALIS EN PRESENCIA DE Zn2+.

Dra. María Elizbeth Alvarez Sánchez

Posgrado en Ciencias Genómicas, Universidad Autónoma de la Ciudad de México. Proyecto ICyT PIFUTP08-150, Conacyt 83808

El Zinc es un componente importante de los fluidos prostáticos en el hombre, se

encuentra presente en altas concentraciones (4.5-7 mM) y juega un papel crítico durante la espermatogénesis. Este catión tiene gran importancia en la defensa de la próstata por su capacidad para prevenir el establecimiento de patógenos en el tracto reproductor masculino. El Zn2+ es un elemento esencial para la sobrevivencia de Trichomonas vaginalis, parásito de transmisión sexual agente causal de la tricomonosis. Se estima que existen alrededor de 250 millones de casos de tricomonosis anualmente a nivel mundial. En México, durante el año 2009, se reportaron 116,622 casos de tricomonosis urogenital, de los cuáles el 97% corresponde a mujeres y solo el 3% a hombres. En la mayoría de los hombres la tricomonosis es asintomática, sin embargo en ocasiones se puede presentar uretritis, epididimitis, prostatitis crónica asociados a esta infección. El Zn2+ tiene un efecto tricomonicida en altas concentraciones (1.6 mM), a concentraciones más bajas el parásito puede persistir por largos periodos de tiempo en el tracto genitourinario masculino. Este trabajo se enfocó al estudio del proteoma, morfología, adhesión y citotoxicidad de T. vaginalis durante la interacción con las células prostáticas DU145 y la identificación de las proteínas expresadas diferencialmente en presencia de Zn2+. RESULTADOS: Los datos obtenidos muestran una expresión diferencial de 56 proteínas en presencia de Zn2+ y su identificación se llevó a cabo por espectrometría de masas. Este catión regula también el crecimiento del parásito así como la adhesión y citotoxicidad y a las moléculas que participan en estas funciones (adhesinas y proteinasas). Los niveles transcripcionales de TvCP65 y TVCP39 también se encuentran regulados por la presencia de Zn2+. CONCLUSIONES: El Zn2+ juega un papel importante en la modulación de algunas propiedades de virulencia de este parásito así como en la expresión diferencial de proteínas dentro de su proteoma. La interacción de T. vaginalis con las células prostáticas mostró cambios moleculares y morfológicos que podrían contribuir al entendimiento de cómo el parásito puede causar un daño en el hombre.

ANÁLISIS PROTEÓMICO E INMUNOPROTEÓMICO DEL CITOESQUELETO DE PARÁSITOS Y SU UTILIDAD EN LA EVALUACIÓN DE FÁRMACOS ANTIPARASITARIOS O DE SUSTANCIAS

CON POTENCIAL PARASITARIO.

Dr. Javier Ambrosio.

Depto. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México. México, DF.

El análisis proteómico permite, en un momento determinado y bajo circunstancias de análisis definidos, el evaluar la expresión de varias proteínas en un solo instante. El análisis inmunoproteómico, gracias a la utilidad de la identificación de las proteínas mediante anticuerpos específicos, permite confirmar y definir cuantas variantes de una sola proteína pueden estar siendo expresadas en un momento dado o bien, el definir la identificación de una proteína dada. Luego, si ambos procesos experimentales se combinan, el producto resultante permite determinar con precisión la calidad de la expresión de las proteínas identificadas, así como la variabilidad de sus isoformas. Si estas dos estrategias se combinan, es factible el establecer como impacta en la expresión diferencial de proteínas particulares el desarrollo evolutivo de los parásitos o bien el tratamiento con fármacos antiparasitarios o con sustancias con potencial farmacológico. En este último caso, la variabilidad de la expresión de las proteínas seleccionadas podría ser útil para establecer el mecanismo de acción de tales sustancias, o bien, si se le combina con la química medicinal, ello podría ser base del desarrollo de nuevos fármacos. En el caso del citoesqueleto (dado que es una entidad compleja en la que radica la forma, el tamaño, la dinámica y la migración de los organismos y que dentro de su complejidad agrupa a ubicuas o constitutivas y muy estudiadas), la identificación y expresión de sus proteínas y de sus variantes durante tratamientos de los parásitos con sustancias químicas es una forma muy directa de aproximarse certeramente al blanco farmacológico, incluso a nivel molecular. Nuestro grupo de investigación ha logrado, hasta el momento, mediante el análisis de subproteomas del citoesqueleto de diferentes parásitos, el determinar la variabilidad en la expresión de isoformas de algunas proteínas del citoesqueleto en diferentes estadios de desarrollo de diferentes parásitos protozoarios o helmintos, así como determinar la variabilidad en la expresión de algunas proteínas durante el tratamiento in vitro con fármacos convencionales o experimentales de los que se conoce que actúan a estos niveles. Consideramos que esta estrategia de estudio es útil para definir los blancos farmacológicos o para efectuar estudios relacionados con el diseño racional de fármacos y con ello la posibilidad de desarrollar otros nuevos agentes antiparasitarios, incluso estadio específicos, en las que las proteínas del citoesqueleto serían considerados como blancos farmacológicos.

ANÁLISIS PROTEÓMICO DEL LÍQUIDO ASCÍTICO DE PACIENTES CON CARCINOMA OVÁRICO EN ETAPAS AVANZADAS (III Y IV).

Olga Lilia Garibay Cerdenares1, Dolores Gallardo Rincón2 y Patricia Talamás Rohana1

1Departamento de Infectómica y Patogénesis Molecular, CINVESTAV-IPN; 2Departamento de Oncología Médica, INCan

En las mujeres, el cáncer de ovario es el sexto más frecuente con aproximadamente 205 mil nuevos casos al año; sin embargo, representa el 47% de las defunciones, por lo que se convierte en la primera causa de mortalidad entre los cánceres de origen ginecológico a nivel mundial. A pesar de los avances, no existe ningún método eficaz que facilite el diagnóstico temprano del carcinoma ovárico, por lo que más del 90 % de los casos se presentan en fases avanzadas cuando éste ha invadido el abdomen. La identificación de biomarcadores específicos para la detección del cáncer de ovario es una prioridad importante de salud debido a la naturaleza asintomática y a la baja supervivencia de la enfermedad. En nuestro laboratorio se utiliza la electroforesis en geles bidimensionales (2DE) para identificar proteínas expresadas diferencialmente en líquido ascítico de pacientes con cáncer de ovario que pueden resultar útiles como biomarcadores de la enfermedad. Del análisis de 33 muestras de fluido ascítico de pacientes mediante electroforesis bidimensional se ha detectado la expresión diferencial de 10 proteínas, las cuales al identificarse por MALDI-TOF, resultaron ser 7 isoformas de Haptoglobina y 2 isoformas de Transtiretina. Proteínas de fase aguda como Haptoglobina y Transtiretina se elevan en muchas enfermedades, como cirrosis hepática, hepatitis-C y diversas formas de cáncer,. Recientemente, se ha demostrado que proteínas como la Haptoglobina se sobreexpresan en tejidos tumorales, por lo que nos interesa evaluar la posible participación de la haptoglobina en los procesos de metástasis y migración celular en el microambiente ascítico de las pacientes con carcinoma ovárico. Este trabajo ha sido apoyado a través del Proyecto 115617 de los Fondos Sectoriales de Salud-CONACyT.

IDENTIFICATION OF A POTENTIAL PLASMINOGEN ACTIVATOR IN MYCOBACTERIAS

L.A. Ramón-Luing1, E. Rodriguez1, G. Mendoza-Hernández2 and C. Espitia1

1Departamento de inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas; and

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UNAM, Mexico City, Mexico. E-mail: ramonluing@yahoo.com.mx. Grants: 81214 and 10110-184-09 (CONACYT).

Several bacterial pathogens, including the human pathogen Mycobacterium tuberculosis, binds a variety of host cell proteins including those of fibrinolytic system. Plasminogen (Plg) bound to proteins on bacteria surface could be activated by host activators/or by bacteria own activator (s) to generate the proteolytic enzyme Plasmin (Plm), turning bacteria into proteolytic organisms which can augment their invasive potential. In this work we first demonstrate that Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium smegmatis were able to activate Plg bound to its surface in vitro in absence of tissue plasminogen activator (t-PA), suggesting this observation that bacteria could have a Plg activator, tPA-like, that is secreted as has been described for Yersinia pestis. In addition, we also found in soluble extracts (SE) from M. smegmatis a Plm-like activity and the tPA-like activity that were not found in SE from BCG and M. tuberculosis. Furthermore, a potential Plg activator was identified in M. tuberculosis using a proteomic approach. This molecule was observed in the cytoplasmic compartment, cell wall, and culture filtrate of Mycobacterium tuberculosis by one (1-D) and two-dimensional (2-D) gel electrophoresis. The protein was recognized by a polyclonal antibody anti t-PA by 1-D and 2-D Western blot assays. Together these observations support the results obtained with live mycobacteria and suggest the presence of a plasminogen activator in the mycobacteria and a possible contribution of the fibrinolytic system to invasion in tuberculosis.

DETERMINACIÓN DE VARIACIONES EN EL PROTEOMA SALIVAL EN PACIENTES PEDIÁTRICOS CON RABDOMIOSARCOMA MEDIANTE ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

David Salomòn Dozal Domínguez; Dr. Alejandro Zentella Dehesa; Dr. Alberto Olaya

Vargas; Dra. Rocio Cárdenas Cardos; Dr. Horacio Reyes

Instituto Nacional de Nutrición Salvador Zubirán (INNSZ) Unidad de Bioquímica; Vasco de Quiroga 15, Colonia Sección XVI, Tlalpan C.P.14000, México D.F., Teléfono: 54870900 ext. 2607, 55730487. david_dozal@hotmail.com

Introducción: Las proteínas son bio-moléculas que actúan como reguladores de la salud respondiendo a señales intracelulares; por lo cual su desregulación conduce a la aparición de enfermedad.

El cáncer es resultado de un desequilibrio que conlleva a la modificación de su producto génico, las proteínas ; las cuales al ser liberadas al torrente sanguíneo pueden ser observadas en otros fluidos. Por lo cual las variaciones existentes en los proteomas salivales de niños con cáncer pueden conducirnos a la identificación de marcadores de diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad El objetivo de este estudio se determinar mediante electroforesis bidimensional (2D PAGE) los cambios cuantitativos y / o patrones cualitativos proteicos presentes en la saliva de los niños enfermos con Rabdomiosarcoma (RMS) en comparación con la saliva de los niños sanos . Materiales y métodos: Se obtuvieron muestras de saliva de 15 pacientes de 1ª infancia con RMS, los proteomas obtenidos de cada uno se compararon contra sus controles para identificar cambios en los patrones proteicos de saliva que pudieran guiar al establecimiento de proteínas de asociación de la enfermedad Resultados: posterior a la estandarización del muestreo y manipulación proteica logramos generar mapas de proteínas reproducibles en donde identificamos 33 spots de coincidencia entre los 2 grupos y a su vez una variación de 53 spots entre ellos. Datos significativamente estadísticos t = 3.75 p = 0.007. Posteriormente se generó in sílico el proteoma salival de nuestros casos y controles tomando en cuenta los vectores de deformación de cada mapa 2D generado, en donde identificamos la presencia de 3 spots exclusivos de los casos de RMS los cuales están presentes en 10 de los 15 casos de RMS. Conclusiones: La saliva es un recurso biológico de gran importancia para el estudio de la dinámica salud-enfermedad, los proteomas representan la distribución proteica de un individuo en un momento determinado, permitiendo la evaluación de episodios de enfermedad e identificar proteínas asociadas con un cambio sistémico o en su caso transformación tumoral. Nuestros resultados muestran la existencia de cambios en los arreglos proteicos de pacientes con RMS; La identificación de esta variabilidad podría permitir la generación de biomarcadores de diagnóstico de cáncer infantil.

IDENTIFICACIÓN PROTEÓMICA DE POTENCIALES MARCADORES TUMORALES EN CÁNCER DE MAMA INVASOR DE PACIENTES MEXICANAS.

Miguel A. Fonseca1, Sergio Rodríguez-Cuevas2, Guillermo Mendoza3, Laurence A.

Marchat4, Alfredo Hidalgo-Miranda5, Valeria Quintanar5, Cesar López- Camarillo1*

1Universidad Autónoma de la Ciudad de México, Posgrado en Ciencias Genómicas, México. 2Instituto de Enfermedades de la Mama, FUCAM, México. 3UNAM, Facultad de

Medicina, México. 4ENMyH-IPN, México. 5INMEGEN. *Autor corresponsal: genomicas@yahoo.com.mx

Introducción. El cáncer de mama es la neoplasia con mayor incidencia y mortalidad en las mujeres alrededor del mundo. Un problema en el tratamiento del cáncer de mama es la baja respuesta a la quimioterapia inicial y el alto porcentaje de recurrencia. En consecuencia, la reducción de la mortalidad requiere el desarrollo de estrategias moleculares que permitan identificar predictores de progresión, recurrencia y respuesta patológica completa lo que puede contribuir en la mejoría de la respuesta al tratamiento de las pacientes. Además, las proteínas que se expresan de manera diferencial en los tumores mamarios representan candidatos idóneos como blancos terapéuticos. Objetivo. En este trabajo nos enfocamos en la búsqueda de proteínas expresadas de manera diferencial en biopsias de carcinomas mamarios invasores en comparación con el tejido mamario normal de pacientes mexicanas. Metodología. Las biopsias tumorales fueron donadas por el Instituto de Enfermedades de la mama FUCAM, previo consentimiento de las pacientes y bajo las condiciones éticas del Instituto. Se realizó un análisis comparativo de la expresión de proteínas obtenidas de las biopsias tumorales y de tejido sano de mama mediante electroforésis en 2 dimensiones (2DE). Las proteínas detectadas fueron identificadas mediante espectrometría de masas LC-MS/MS. La expresión de una de las proteínas identificadas se validó mediante inmunohistoquímica con anticuerpos específicos en microarreglos de tejidos constituidos por alrededor de 80 tumores mamarios heterogéneos. Los datos se analizaron estadísticamente y se estableció la correlación con los parámetros clínicos de las pacientes. Resultados. Seleccionamos 24 proteínas que presentaron expresión diferencial en las biopsias tumorales de los carcinomas mamarios e identificamos 17 de ellas mediante espectrometría de masas LC-MS/MS. Algunas proteínas identificadas relevantes en el desarrollo y progresión de los tumores mamarios incluyen: la peroxiredoxina 6, glioxalasa I, heat shock protein 27, Nm23, heat shock protein 70, DJ1 y la anexina A1, entre otras. Entre estas destaca la glioxalasa I (GLOI), que participa en la desintoxicación del metilglioxal, un subproducto tóxico de la glucólisis que causa daño al DNA y activa la apoptosis, por lo que la célula tumoral podría sobreexpresarla como un mecanismo de destoxificación. La GLOI incrementó su expresión en un número considerable de tumores de mama analizados en los microarreglos de tejidos. Interesantemente, el análisis estadístico indica que existe una correlación entre el grado nuclear (3) avanzando y la alta expresión de GLIOI por lo que podría representar un nuevo marcador tumoral de progresión en cáncer de mama invasor.

UN ESTUDIO CON ENFOQUE PROTEÓMICO EN CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA PERMITE LA IDENTIFICACIÓN DE BIOMARCADORES DE TIPO METABÓLICO PARA ESTA

ENFERMEDAD.

Nora Andrea Gutiérrez-Nájera, Diana Ruiz-Lira, Aida Fernanda Carrillo-Piña, José Luis Cruz-Colín, Carlos Alejandro Díaz-Tufinio, Iván David Anguiano- Yescas, Valeria Quintanar-

Jurado.

Instituto Nacional de Medicina Genómica, Av. Periférico Sur No. 4124, Col. Ex rancho de Anzaldo, CP 1900, Del. Álvaro Obregón. Tel. 53-50-19-64, ngutierrez@inmegen.gob.mx

Los estudios en proteómica han hecho posible el descubrimiento de diversas proteínas del metabolismo que se encuentran implicadas en el fenotipo canceroso. De acuerdo a la hipótesis de Warburg la función mitocondrial estaría disminuida en cáncer por lo que los niveles de las proteínas mitocondriales serían disminuidos en estas células ya que las células de cáncer obtendrían su energía principalmente de la glucólisis aerobia más bien que de la fosforilación oxidativa de la mitocondria. Ya se había observado en un estudio de proteómica en nuestro laboratorio en microsomas de células de cáncer de mama comparadas con la línea de tejido normal de mama, que algunas de las proteínas que se incrementan en dicha fracción en cáncer eran la piruvato cinasa isoformas M1/M2 (PK) y la alfa-enolasa, enzimas de la glucólisis. Por lo que los objetivos de este estudio son a) estudiar las diferencias en los niveles de las proteínas involucradas en el metabolismo de la mitocondria que distinga a los diferentes tipos de cáncer de mama del fenotipo normal y b) estudiar por métodos bioquímicos la función enzimática de proteínas del metabolismo de la glucólisis como la piruvato cinasa y la enolasa en líneas de cáncer de mama. Se utilizaron líneas celulares provenientes de ATCC (American Type Culture Collection); Hs578Bst (normal), Hs578T (cáncer de mama), MCF7 (cáncer de mama), MDA-MB231 (cáncer de mama), PC3 (cáncer de próstata). De aquí se obtuvieron extractos de proteína soluble y mitocondria por centrifugación diferencial. En extractos de proteínas que se obtuvieron de estas células, se midió la actividad de la PK y la enolasa con ensayos acoplados midiendo la desaparición de NADH a 340 nm. Se realizó el análisis del proteóma mitocondrial con geles 2D, analizando las imágenes con el software ImageMaster 2D Platinum 6.0. De los resultados de los geles de la mitocondria en células de cáncer se pueden observar diferencias cuando se compara el patrón de proteínas. Dichas proteínas diferenciales aún falta identificarlas por espectrometría de masas. Las líneas celulares de cáncer de mama presentaron actividad de PK similar entre sí, mientras que la actividad de la línea celular de próstata fue menor. Cuando se agrega un activador de la PK, la fructosa-1,6-bifosfato se observa un efecto diferente en la actividad de PK de las líneas celulares de cáncer activando o incluso inhibiendo la actividad como en el caso de MDA-MB231 y PC3 respectivamente. En cuanto a la actividad de enolasa la actividad mayor la presentó la línea de cáncer de próstata y una de las líneas celulares de cáncer de mama, Hs578T. Los resultados de la actividad de piruvato cinasa y enolasa sugieren que dichas enzimas cuentan con isoformas que se presentan en cáncer de mama y no en otros como el caso de próstata. Así como las diferencias que se presentan entre las proteínas de la mitocondria de los diferentes tipos celulares de cáncer de mama y de próstata permiten proponer que cada línea celular presentará una huella metabólica.

ANÁLISIS PROTEÓMICO EN TEJIDO ADIPOSO DEL EFECTO DE LOS ÁCIDOS GRASOS OMEGA 3 EN UN MODELO CON SÍNDROME METABÓLICO INDUCIDO POR LA DIETA

Lyssia Castellanos Tapia1, Rosa María Oliart Ros, María Elizabeth Barrera Tejero, Mauricio

Rodríguez Dorantes.

Instituto Nacional de Medicina Genómica, periférico sur 4124 col. Exrancho de anzaldo delegación Alvaro Obregón, C.P 01900. México, Distrito Federal. Correo electrónico

lcastellanos@inmegen.gob.mx Uno de los nutrimentos que se ha visto tiene efectos benéfico en diversas procesos metabólicos y enfermedades son los ácidos grasos omega 3. En especial, se ha visto que los ácidos grasos poliinsaturados omega 3 regulan una variedad de genes en tejido adiposo y tienen un efecto benéfico ampliamente demostrado sobre el metabolismo de los lípidos. El objetivo de este trabajo fue: analizar el efecto de los ácidos grasos poliinsaturados omega 3 en la expresión de proteínas en tejido adiposo en un modelo con síndrome metabólico inducido por la dieta.

Se alimentaron ratas Wistar macho durante 21 semanas con una dieta control dieta y la inducción del síndrome metabólico con sacarosa al 30%, la dieta con aceite de pescado (7,5%) se llevo durante 6 semanas a los inducidos con síndrome metabólico. Se extrajo proteínas de tejido adiposo del epidídimo de cada uno de los tres tratamientos: ratas alimentadas con dieta control, ratas alimentadas con glucosa en agua 4% y ratas alimentadas con aceite de pescado. Se hizo un pool de cada tratamiento y se hicieron tres réplicas para cada tratamiento. La primera dimensión se hizo en tiras de 13cm con un pH de 3-10 NL con 350 g de proteínas totales y la segunda dimensión se hizo en cámaras de electroforesis a 50-110 volts. Los geles fueron teñidos con sypro ruby y coomassie. Las imágenes se analizaron con el programa Image Master 2D Platinum 6.0 software. Los spots diferenciales se tomaron a partir del gel maestro que se obtuvo con el match de las imágenes con grupos de geles del mismo tratamiento comparando con el control. Los spots de interés se digerieron con tripsina (25ng/L) durante 12hrs a 37°C. Se purificaron los péptidos con puntas C18 Zip-TipsTM. El análisis de los péptidos se hizo con MS/MS con el MALDI TOF/TOF. La identificación de las proteínas se hizo con el programa 4800 plus Proteinpilot con un 95% de probabilidad. La validación de las proteínas encontradas fue a través de western blot por quimioluminiscencia. Se obtuvieron 7 proteínas subexpresadas en el tejido adiposo de ratas con síndrome

metabólico comparado con 2 que pertenecen al metabolismo b-oxidación, 3 que

pertenecen al metabolismo de la glucólisis y 2 al transporte de ácidos grasos. Las

proteínas que fueron subexpresadas por los ácidos grasos omega 3 fueron: anhidrasa

carbónica, lipasa de monoglicéridos, proteínas de heat shock, glutamine sintetasa y la

glutation S transferasa.

Al parecer los ácidos grasos omega 3 están regulando proteínas que están involucradas en

el metabolismo de la -oxidación y en el estrés oxidativo de la célula en el tejido adiposo.

ANÁLISIS PROTEÓMICO DIFERENCIAL EN PÁNCREAS DE RATONES OBESOS Y DIABÉTICOS DB/DB

Juan M. Guzmán Flores1, Daniela P. Mares Álvarez1, Elsa C. Flores Pérez1, Sergio

Encarnación Guevara2, Magdalena Hernández Ortiz2, Gabriel Martínez Batallar2, Joel Ramírez Emiliano1, Maciste H. Macías Cervantes1, Sergio López Briones1, Victoriano Pérez

Vázquez1

1Departamento de Ciencias Médicas, División de Ciencias de la Salud, Universidad de Guanajuato, Campus León. 20 de Enero 929. Col. Obregón. CP 37320. Tel. 01(477)

7143812. vicpe@yahoo.com 2Centro de Ciencias Genómicas, UNAM. Cuernavaca, Morelos.

Introducción. La diabetes Mellitus tipo 2 es una enfermedad multifactorial caracterizada por aumento en la concentración de glucosa sanguínea, que aparece cuando las células β son incapaces de compensar la resistencia a la insulina con secreción apropiada de esta hormona. El vínculo entre la resistencia a la insulina y la falla de las células β no se ha esclarecido. Objetivo. Estudiar esta asociación mediante el análisis del perfil de expresión de proteínas en páncreas de ratón obeso y diabético db/db. Metodología. Se emplearon 2 grupos de ratones machos de la cepa C57BL/6J de 10 semanas de edad, un grupo control (n=3) y un grupo de ratones diabéticos db/db (n=3). Las proteínas fueron separadas en 2D-PAGE al 12% de 18 cm. Los geles fueron teñidos con azul de Coomassie coloidal, digitalizados y analizados en el software Image Master 2D Platinum. La identificación de proteínas se realizó mediante espectrometría de masas por tiempo de vuelo. Resultados. Se detectaron 617 spots en los mapas bidimensionales de los ratones control y 620 spots en los de los diabéticos db/db. Se encontraron 31 cambios de expresión de proteínas en el páncreas de los ratones diabéticos, de los cuales 23 aumentaron su expresión y 8 la disminuyeron. Dentro de las proteínas con cambios de expresión se encontraron algunas relacionadas con el transporte de electrones, el procesamiento y secreción de proteínas, el metabolismo de carbohidratos, la regulación redox y la traducción. Conclusión. Los resultados de las proteínas expresadas diferencialmente en el páncreas de los ratones diabéticos reflejan la severa resistencia a la insulina o las complicaciones de la hiperglucemia. Agradecimientos. Trabajo subsidiado por PROMEP (UGTO-PTC-120). JMGF es Investigador posdoctoral CONACYT.

CAMBIOS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN HÍGADO DE RATÓN DIABÉTICO

Victoriano Pérez-Vázquez*, Elsa C. Flores-Pérez, Joel Ramírez-Emiliano, Sergio López-Briones, Magdalena Hernández, Gabriel Martínez-Batallar, Sergio Encarnación-Guevara.

*Departamento de Ciencias Médicas, División de Ciencias de la Salud, Universidad de

Guanajuato. Campus León. 20 de Enero 929. Col. Obregón. CP 37320. Tel 01(477)7143812. e-mail: vicpe@yahoo.com

Introducción. La diabetes mellitus tipo 2 es una de las enfermedades endócrinas más comunes en los países desarrollados. La prolongada elevación en los niveles de glucosa sanguínea lleva a complicaciones diabéticas como la enfermedad cardiovascular, el infarto, la neuropatía diabética, la retinopatía y la susceptibilidad a infecciones. El hígado es considerado un órgano clave en la regulación, la homeostasis y el metabolismo de la glucosa. Estudios previos han demostrado que muchas enzimas y proteína están bajo control transcripcional por insulina y alteran el contenido de éstas, con la reducción de la insulina en la diabetes. A pesar del control de la glucosa en sangre y las terapias con los fármacos existentes, las complicaciones de la diabetes siguen siendo un problema de salud en todo el mundo. Objetivo. Estudiar el perfil de expresión de proteínas en hígado de ratones diabéticos de 20 semanas de edad para buscar biomarcadores de la enfermedad o sus complicaciones. Metodología. Se utilizaron 2 grupos de ratones macho (C57BL/6J), diabéticos db/db y sanos (db/+ y +/+) de 20 semanas de edad. Las proteínas del hígado de ambos grupos de ratones (n=4), fueron separadas en geles bidimensionales de 18 cm. mediante el sistema O´Farrell, los cuales se tiñeron con azul de coomassie coloidal. El perfil de expresión de proteínas fue analizado con el software Image Master 2D Platinum y las proteínas con cambios de expresión diferencial se identificaron por MALDI-TOF. Resultados. Encontramos 30 cambios de expresión diferencial de las proteínas (de al menos 2 veces), de las cuales 7 disminuyeron su expresión, 11 la incrementaron, 5 desaparecieron y 7 aparecieron de novo en los ratones diabéticos. La mayoría de las proteínas con cambios de expresión son citosólicas y mitocondriales relacionadas con el metabolismo de carbohidratos y aminoácidos y los sistemas antioxidantes. Conclusión. El análisis proteómico comparativo reveló cambios de expresión de proteínas importantes en las complicaciones de la diabetes. Muchas de estas proteínas están dentro de los mecanismos propuestos para explicar las complicaciones, como la acumulación de sorbitol y el estrés oxidativo. Agradecimientos. Trabajo subsidiado por CONCYTEG (09-16-k662-079 NUM 2) y PROMEP (UGTO-PTC-120). Elsa Flores es becarias de CONACYT para estudios de Maestría.

IDENTIFICATION OF FEEDING-INDUCED CHANGES IN PROTEIN PROFILES FROM MEMBRANOUS FRACTIONS OF MECCUS PALLIDIPENNIS INTESTINES.

MC Jorge Isidoro Sotelo Cano1, Dr. José Lino Zumaquero Ríos2, Dra. Alicia Chagolla

López3, Dr. Donaciano Flores Robles1, Dr. Eduardo Castañeda Saucedo1, Dr. Alejandro Millán Vega1, Dr. Pável Sierra Martínez1*

1Universidad Autónoma de Guerrero.2Benemérita Universidad Autónoma de Puebla 3CINVESTAV-IPN (Unidad Irapuato). pavelsierra6@hotmail.com: Unidad de Investigación

Especializada en Microbiología. Calle sin Nombre No. 13, Col. Las Colinas, C.P. 39105, Petaquillas, Guerrero. Tel: 7471224631

ABSTRACT Meccus pallidipennis are insects from the Hemiptera order, and are vectors for the Chagas disease. They are haematophagous and their digestive system is divided into three regions: foregut, midgut and hindgut. To date, no proteins involved in blood digestion have been identified in the stomach (foregut) of these organisms. In this work, using a proteomic approach, we identified a group of proteins that showed differential expression pattern in Meccus pallidipennis stomach, at increasing times after blood feeding, suggesting the presence of a biochemical machinery required during haematophagy. Stomachs from M. pallidipennis males were dissected at 4 different times after bloodfeeding (7, 15, 50 and 70 days). Total proteins were separated by SDS-PAGE on 10 % gels. We found a total of 15 differentially expressed bands in the different times. Two major bands (one of ~180 and other one of ~100 kDa) were selected from day 15 after-fed lane and analyzed by MALDI-TOF. Peptides identified from the band of ~180 kDa did not match to any known protein. For the ~100 kDa band, we identified paramyosin, a protein with motor activity involved in muscle contraction and relaxation, at this time can only be suggested on basis of its homology whit molecules identified in Sarcoptes scabiei, Dermatophagoides farinae and Boophilus microplus, organisms that have contact with the blood during its feeding.

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y ANTIGÉNICA DE VENENOS DE SERPIENTES C. BASILISCUS EN DIFERENTES ETAPAS DE DESARROLLO, UTILIZADOS EN LA PRODUCCIÓN

DE ANTIVENENOS (FABOTERÁPICOS).

Francisco Reta Mares1, Jorge Gomez-Herrera1, Ma Eugenia Jimenez Corona1, Oscar Andrade, Correa1, Claudia Jaime Aguilar1, Humberto Lanz-Mendoza2, Victoria Pando

Robles2, Ángel Tello2, Gerardo Hurtado Sil2, Samuel Ponce de León1.

1Laboratorios de Biológicos y Reactivos de México. BIRMEX, SA de CV, México, DF. 2Instituto Nacional de Salud Pública, Cuernavaca Morelos. fretam@birmex.gob.mx*.

Introducción La intoxicación y las muertes provocadas por mordedura de serpiente, constituyen un importante problema de salud pública en África, Asía, latino-América y Nueva Guinea. En México, en el 2009 la Dirección General de Epidemiología reportó 1,493 accidentes por mordedura de serpiente. El uso del suero antiviperino (SAV), es el único tratamiento específico, contra la mordedura de serpiente. Se han reportado diferencias en las actividades biológicas, así como en los componentes tóxicos, entre serpientes jóvenes y adultas de una misma especie. Debido a estas variaciones, una de las tareas más críticas, es el diseño de la mezcla antigénica que va a ser utilizada en la producción del antisuero. Entre las serpientes venenosas de mayor importancia nuestro país, desde el punto de vista de salud pública son Bothrops asper y más de una especie de Crotalus (C. basiliscus). BIRMEX, utiliza los venenos de estas serpientes para la producción del suero antiviperino (SAV) polivalente de origen equino. Objetivo general: Caracterizar molecular y antigénicamente los venenos de serpientes jóvenes y adultas de C. basiliscus utilizadas en la producción del SAV en BIRMEX. Material y Métodos: Se realizó el estudio del veneno 6 serpientes adultas y 9 juveniles de C. basiliscus. El corrimiento electroforético en una dimensión se realizó en condiciones reductoras por la técnica de Leammli . La identificación de las proteínas comunes y diferenciales se realizó por espectrometría de masas, (AB 4800 masas7masas).En la identificación de las proteínas se realizó utilizando los programas Protein Pilot y Mascot. La Transferencia se realizó mediante el sistema descrito por Towbin y col. Para la inmunodetección, como primer anticuerpo se utilizó SAV-BIRMEX; como segundo anticuerpo se utilizó anti-IgG de caballo, conjugado a peroxidasa, utilizando un sistema de detección rápida (SNAP i.d., Millipore). Para el revelado se utilizó 4-cloro, 1-naftol. Resultados y conclusiones: Mediante la caracterización electroforética se observaron variaciones entre venenos de serpientes de diferentes edades en relación a sus componentes tóxicos. Los venenos de las serpientes juveniles de C. basiliscus presentan componentes que están ausentes en serpientes adultas y viceversa. El SAV producido en BIRMEX presenta anticuerpos que reconocen a la mayoría de los componentes caracterizados por electroforesis en gel de poliacrilamida del veneno de C. basiliscus. Uno de los componentes identificados por espectrometría de masas que pudieran aumentar en el veneno con la edad de la serpiente parece ser una metaloproteinasa hemorrágica, o bien una Zinc metaloproteinasa con un Peso moléculas de aproximadamente 27-28 kD.

Conclusiones: 1. La caracterización electroforética de los venenos de serpiente, constituye una poderosa herramienta para el control de calidad de los venenos que van a ser tilizados en la producción del suero antiviperino. 2. Es necesario establecer en BIRMEX, una mezcla de venenos estándar, así como su patrón electroforético, que reúna las características electroforéticas del veneno de serpientes jóvenes y adultas (y de diferentes regiones geográficas), contra el cual comparar todos los antígenos que van a ser utilizados tanto en la producción como en el control de calidad del SAV. 3. El SAV producido en BIRMEX presenta anticuerpos que reconocen a la mayoría de los componentes caracterizados por electroforesis en gel de poliacrilamida del veneno de serpientes de C. basiliscus

SIGNAL INTEGRATION IN THE GUARD CELL PROTEOME

Sarah M. Assmann,

Penn State University, 208 Mueller Laboratory, University Park, PA, 16802, USA. sma3@psu.edu

Guard cells, located in the leaf epidermis, regulate the apertures of microscopic stomatal pores through which both carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water vapor loss occur. Guard cells respond to numerous environmental and endogenous signals including light, carbon dioxide, humidity, and phytohormones, and have become a premier single cell system for unraveling complex cellular signaling networks. In response to drought stress, plants synthesize the hormone abscisic acid (ABA), which triggers guard cell responses leading to stomatal closure, thereby minimizing water loss. One-gene-at-a-time approaches have identified dozens of signaling and effector proteins involved in the guard cell response to ABA. Omics approaches provide an alternative way to identify candidate signaling molecules. We are applying transcriptomic1, proteomic2, metabolomic, and large-scale protein-protein interaction approaches toward identification of the components and assembly of the network3 of guard cell ABA signaling.

1. Wang R, Pandey S, Li S, Gookin TE, Zhao Z, Albert R and Assmann, SM 2011. Common and unique elements of the ABA-regulated transcriptome of Arabidopsis guard cells. BMC Genomics, May 9;12(1):216.

2. Zhao Z, Zhang W, Stanley BA, Assmann SM. 2008. Functional proteomics of Arabidopsis thaliana guard cells uncovers new stomatal signaling pathways. Plant Cell. 20: 3210-32226.

3. Assmann, SM 2010. Hope for Humpty Dumpty: Systems biology of cellular signaling. Plant Physiol. 152: 470-479.

NOVEL USES OF MASS SPECTROMETRY IN PLANT RESEARCH

Robert Winkler

Department of Biotechnology and Biochemistry, CINVESTAV Unidad Irapuato, Km. 9.6 Libramiento Norte Carr. Irapuato-León, 36821 Irapuato Gto., México,

robert.winkler@ira.cinvestav.mx

Mass spectrometry has become one of the most important technologies in modern biological and medical sciences. Especially the popular un-targeted metabolomics and proteomics approaches generate vast amount of data, which only can be interpreted after significant computational processing and additional evaluation by experts.

On the other hand, practical problems are prevalent in plant research and agricultural development, which can be addressed by mass spectrometry based strategies at significantly reduced effort. This can be exemplified by two real life projects from our lab.

In the first example, we investigate the possible correlation between peroxidases in maize grains and their susceptibility against post-harvest pests. Here, we have developed a peroxidase activity based proteomic strategy, which helps us to focus on relevant fractions, and therefore permits the screening of whole maize collections.

In the second example, several hundred families of coffee trees with several thousand individuals need to be classified according to their metabolic phenotype. By normalizing the data and performing an un-targeted clustering, we can efficiently classify the trees based on the mass spectra of their leaf extracts. The overall strategy has shown to be highly scalable and relatively economic.

Certainly, the consequent development would be the application of mass spectrometry directly in the field and on living plants. This would require portable devices and suitable ambient ionization techniques, which allow for non-destructive analyses. Therefore we are pursuing to construct a low temperature plasma ionization source. Preliminary results demonstrate that this device can be applied to plants without causing visible damages.

Summarizing, this seminar focuses on novel strategies of using and developing mass spectrometry techniques for studying complex biological systems, with a special focus on plant research.

QUANTITATIVE PROTEOMICS TOWARD PLANT SALINITY

Rosario Vera-Estrella, Bronwyn J. Barkla, and Omar Pantoja

Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, A.P. 510-3, Colonia Miraval, Cuernavaca, Morelos, México, 62250. e-mail: rosario@ibt.unam.mx

ABSTRACT

Salinity is considered one of the major limiting factors for plant growth and agricultural productivity. Thellungiella halophila is a salt tolerant plant that possesses many of the advantages that have made Arabidopsis thaliana such a popular model plant system. These include a small genome of approximately twice the size of A. thaliana, a short life cycle, self-pollination and abundant seed production following vernalization, thus allowing for fast and efficient genetic analysis. We have previously reported that T. halophila is able to tolerate high salinity levels for short periods of time, however, when this plant is stressed for longer durations at high salt concentrations, growth is inhibited and plants show signs of death. It appears that T. halophila accumulates Na+ primarily in older leaves and to a lesser extent in a tuber-like structure, while excluding Na+ from the young leaves and roots. Activities and/or protein expression of transporters shown to be important in Na+ transport were also investigated, including tonoplast (TP) V-ATPase and plasma membrane (PM) P-ATPase, the TP V-PPase, Na+/K+ co-transporters, and Na+/H+ exchangers. To increase our understanding of the role of the cell membranes in plant salt tolerance and with the aim to identify proteins involved in the complex network of transporter regulation to enhance vacuolar Na+ sequestration, we exploited a targeted quantitative proteomics approach. Two dimensional Differential In Gel Electrophoresis (2D-DIGE) analysis of microsomal membranes from control and salt-treated Arabidopsis thaliana y Thellungiella halophila plants was used to identify and compare proteins involved in salinity tolerance in these two plant species.

This work is supported by DGAPA grant IN203711 to RV-E and IN212410 to BJB.

DISEÑO DE UN MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AMILASAS EN UNA MASA DE POZOL

María Catalina Cárdenas Ascención1; Jocelin Marari Rizo Villagrana1; Carmen Wacher Rodarte2; Romina Rodríguez Sanoja1.

1IIB, UNAM. 2FQ, UNAM. Apartado Postal 70228, Ciudad Universitaria 04510, México, D.F. 56-22-91-91, 56-22-91-88 romina@biomedicas.unam.mx

El pozol es una bebida de origen prehispánico elaborada a base de masa fermentada de maíz nixtamalizado. En el proceso de fermentación participa una microbiota abundante y diversa (más de 40 diferentes especies identificadas, con una abundancias del orden de 1010 UFC/g de pozol). Los estudios realizados a la fecha no logran explicar la dinámica de la fermentación, en especial en lo referente a la utilización de la fuente de carbono presente (99% almidón). Se decidió entonces aproximarse a esta fermentación a través del estudio de las enzimas que intervienen es la utilización del almidón, para lo cual, uno de los objetivos del proyecto fue diseñar un método para la obtención del metaprotema del pozol y la posterior identificación de las amilasas presentes mediante zimogramas. El método diseñado incluye tanto pasos mecánicos, como químicos. Se disminuyó el tamaño de partícula para favorecer la interacción del buffer de extracción con los gránulos insolubles de almidón. Por otro lado, las proteínas de alta abundancia, como las zeinas, fueron prácticamente eliminadas de la muestra aprovechando sus características de solubilidad en etanol. Se utilizaron agentes caotrópicos y detergentes que mejoraron la calidad de la muestra pero alteraron la estructura tridimensional de las proteínas, inactivando las enzimas de la muestra. Para validar que el método permitía la recuperación de la actividad se utilizó como control interno la α-amilasa de Lactobacillus amylovorus. El sobrenadante de una fermentación del lactobacilo (que contenía la enzima) fue añadido a la masa de pozol, la enzima, que se sabe tiene un dominio de adsorción al almidón, se dejo interaccionar con la masa 30 minutos y posteriormente se realizó la extracción de las proteínas de la masa con el método diseñado. El extracto obtenido se corrió en geles SDS-PAGE y 2D. Para la renaturalización de la α-amilasa utilizada como control positivo, los geles de 1 y 2D se lavaron e incubaron toda la noche en buffer citrato-fosfato 10mM pH 5 a 4°C, seguido de un lavado con tritón X-100 y múltiples lavados con el mismo buffer citrato-fosfato. Finalmente el gel se incubó con almidón al 1% y se reveló con yodo-yoduro. La actividad se logró identificar tanto en el gel SDS-PAGE como en el de dos dimensiones. El mismo estudió permitió identificar la actividad mínima necesaria para su detección en un zimograma. Se obtuvo un protocolo de extracción reproducible, y un método que permite la renaturalización de amilasas para su detección in situ,

IDENTIFICACIÓN DE GENES INVOLUCRADOS EN LA BIOGÉNESIS DEL CLOROPLASTO A TRAVÉS DE UN ANÁLISIS PROTEÓMICO COMPARATIVO DE MUTANTES DE ARABIDOPSIS THALIANA.

Luis de Luna Valdez1, Sergio Encarnación Guevara2, Gabriel Martínes Batallar2, Magdalena

Hernández Ortiz, Patricia León1 & Ángel A. Guevara-García1*. * aguevara@ibt.unam.mx

1Instituto de Biotecnología-UNAM. Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca,

Morelos, México, 62170. 2Centro de Ciencias Genómicas-UNAM. Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca,

Morelos, México, 62170.

La vida en la biosfera depende de la habilidad de los cloroplastos para integrar átomos de carbono inorgánico (CO2) en moléculas orgánicas (carbohidratos), usando como fuente de energía la luz. Desde su aparición, estos organelos han sufrido cambios morfológicos y moleculares que les permitieron integrarse y hacerse indispensables en el ciclo de vida de los eucariontes fotosintéticos. Los cloroplastos tienen un genoma propio que codifica para apenas un centenar de proteínas, ésto implica que gran parte de la maquinaria enzimática necesaria para su desarrollo y función, que depende de la participación de alrededor de 3000 proteínas, está codificada en el genoma nuclear. Con la idea de esclarecer los mecanismos moleculares que regulan la biogénesis del cloroplasto, en el laboratorio se compiló una colección de mutantes deficientes en la pigmentación, denominada clb (Chloroplast Biogenesis), a través de cuya caracterización molecular y funcional, se ha logrado la identificación de genes implicados en este interesante proceso de diferenciación. Para profundizar en este estudio, se abordó una estrategia proteómica enfocada al análisis comparativo de los perfiles de expresión de proteínas de plantas tipo silvestre y cuatro mutantes de la colección clb (cla1, clb2, clb5 y clb19). Especificamente, extractos proteícos de tres réplicas biológicamente independientes de plántulas mutantes y tipo silvestre, de 16 y 8 dias de desarrollo, respectivamente, se resolvieron en geles de 2-D. Al momento, usando el software de análisis de imágenes PD-Quest (Biorad, Hercules CA), se ha determinado la presencia de aproximadamente 1000 péptidos en cada uno de los muestras, de los cuales 144 mostraron una clara expresión diferencial, de al menos dos veces (26 inducidos y 118 reprimidos), con un nivel de confianza estadístico (t-Student) del 98%. Un análisis por espectrometría de masas con el sistema MALDI-TOF de 115 de los péptidos expresados diferencialmente ha permitido, con la ayuda del motor de búsqueda Mascot (http://www.matrixscience.com), la identificación de 82 proteínas distintas. Los avances en el proceso de caracterización de los genes correspondientes, con la intención de vincularlos al proceso de biogénesis del cloroplasto, se discutirá en el simposio.

PROTEOMICS TOWARD FOOD SCIENCES AND NUTRITION APPLICATIONS

Ana Paulina Barba, Jorge L. Mazorra-Carrillo, Antonio De León-Rodríguez

IPICyT, Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C.

Camino a la Presa San José No. 2055, Lomas 4ª. Sección, 78215 San Luis Potosí, S.L.P., Mexico. E-mail: apbarba@ipciyt.edu.mx

There is an increasing interest in the application of proteomics in all areas of the life sciences, especially in the area of biomedical research, where proteomics is providing essential insights into critical disease pathways, biomarkers for early disease detection, novel targets for therapeutics and disease response to therapy.1 With the adoption of omics technologies by nutritional and food science field, the term “Nutrigenomics” was coined to describe how nutritional factors affect gene and protein functions with a translational output to human health.2 Cancer is a leading cause of death worldwide, but about 30% of cancer deaths can be prevented by eating balanced diets.3 Many of common foods contain cancer-fighting properties; some examples are the active peptides such as lunasin4 and phytochemicals such as the flavonol rutin that besides its powerful antioxidant properties is claimed as cancer-preventive compound.5,6 The aim of the present work was to use the proteomics tools to investigate the changes in protein profiles in NHI3T3 cells induced by chemical mutagenic 3-methylcholanthreno (3-MCA) when the cells are in presence or absence of lunasin and rutin. Our results showed that lunasin and rutin were able to inhibit the foci cell formation, confirming its claimed cancer preventive-properties. Analysis of 2-DE proteins profiles showed differentially proteins that were identified by MS. The proteins were grouped according its subcellular localization. Lunasin had more effect on nuclear proteins (Histone H1.2, prelamin A/C isoform and several ribonucleoproteins). By other hand, rutin´s treatment had more effect on citoplasmatic proteins such as Rho GDP-dissociation inhibitor-2, T-complex protein-1, cytokeratin 10, and protein p21. Several mitochondrial enzymes were found differentially expressed among treatments. The techniques such as two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry analysis allowed us to obtain more information about the protein targets of bioactive food compounds that result in health benefits. We thank Waters-Mexico. References: 1. Plymoth A, Hainaut P. Curr Opin Oncol 2010, 23:77-82. 2.Wittwer J, Rubio-Aliaga I, Hoeft B, Bendik I, Weber P, Daniel H. Mol Nutr Food Res 2011,55:341-358. 3. WHO. 2011. http://www.who.int/cancer/en/. 4. Galvez AF, de Lumen BO. Nat Biotechnol 1999,17:495–500. 5. Afanas’eva IB, Ostrakhovitch EA, Mikhal’chik EV, Ibragimova GA, Korkina LG. Biochem Pharmacol

2011,61:677–684. 6. Kwon KH, Murakami A, Tanaka T, Ohigashi H. Biochem Pharmacol 2005,69:395-406.

IDENTIFICACIÓN POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS DE PROTEÍNAS DE MEMBRANAS DE BETABEL SEPARADAS POR PARTICIÓN EN SERIE CON TRITON X-114

Luis E. González de la Vara, Alicia Chagolla López, Flor C. Alcántar Aguirre y M. Bárbara Lino Alfaro

Departamento de Biotecnología y Bioquímica, Unidad Irapuato, Cinvestav-IPN. Km 9.6 Libramiento Norte, 36821 Irapuato, Gto. Tel: (462)6239639. lgonzale@ira.cinvestav.mx

Las proteínas de membrana presentan dificultades especiales para su separación previa a su identificación por espectrometría de masas. Se han desarrollado métodos, como la electroforesis nativa-azul bidimensional (Wittig et al. 2006 Nature Protocols 1:418), para separar y analizar complejos de proteínas de membrana. En el laboratorio, hemos desarrollado una técnica para extraer y separar a las proteínas de membrana de acuerdo a sus hidropatías, consistente en una serie de particiones de fase con el detergente Triton X-114 (González de la Vara y Lino Alfaro 2009 Anal Biochem 387:280). Para su identificación por MS, las proteínas en las diversas fracciones obtenidas con esta técnica se concentraron por precipitación y se separaron por SDS-PAGE. Las bandas de proteínas de interés se digirieron con tripsina y los péptidos resultantes se analizaron en un espectrómetro de trampa iónica lineal acoplado a un cromatógrafo de líquidos de flujo ultra-lento. En una corrida típica, este espectrómetro produce cientos de espectros de fragmentación. Los espectros seleccionados por su calidad se analizaron primeramente con Mascot MS/MS Ion Search y después, a partir de ellos, se obtuvieron manualmente muchas secuencias que se compararon con las existentes en las bases de datos con MSBlast (Shevchenko et al. 2001 Anal Chem 73:1917). En este trabajo se presentan los resultados obtenidos con membranas plasmáticas y con membranas externas mitocondriales, ambas de raíces de betabel. En las membranas plasmáticas, se identificaron cinasas de proteínas dependientes de calcio (CDPKs) en fracciones con proteínas de muy diversa hidropatía; así como cinasas de la familia STRUBBELIG en fracciones con proteínas poco hidrofóbicas. En las membranas externas mitocondriales se encontró tanto a la porina mitocondrial (VDAC, una proteína intrínseca de membrana) como a la hexocinasa (una proteína soluble) en fracciones hidrofóbicas. Esto podría indicar que existe una asociación entre estas dos proteínas, como ocurre en mitocondrias de células tumorales humanas (Pedersen 2007 J Bioenerg Biomemb 39: 211).

PROTEIN PROFILING OF EPIDERMAL BLADDER CELLS FROM THE HALOPHYTE MESEMBRYANTHEMUM CRYSTALLINUM.

Bronwyn J. Barkla, Rosario Vera-Estrella, Omar Pantoja

Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, A.P. 510-3, Colonia

Miraval, Cuernavaca, Morelos, México 62250. ABSTRACT Plant epidermal trichomes are as varied in morphology as they are in function. In the halophyte Mesembryanthemum crystallinum specialized non-glandular trichomes called epidermal bladder cells (EBC) line the surface of the leaves and stems, and increase dramatically in size and volume upon plant salt-treatment. These cells have been proposed to have roles in plant defence and UV protection, but primarily in sodium sequestration and as water reservoirs. In order to gain further understanding into the roles of EBC a targeted proteomics approach was taken. Cell sap sampling from individual EBC and tissue sampling of leaf abaxial epidermal peels was combined with shotgun peptide sequencing (LC-MS/MS). Identified proteins in the samples showed diverse biological functions and cellular location, with a high representation of proteins involved in H+-transport, carbohydrate metabolism, glycolysis and photosynthesis. In contrast there were relatively few proteins involved in plant defence and stress responses. Comparison of proteins identified in cell sap vs. epidermal peels revealed only 36 common proteins, with 45 unique to cell sap and 43 unique to epidermal peels. The proteome of EBC confirms the role of these cells in ion and water homeostasis and raises the possibility that they are photosynthetically active and functioning in CAM. Funding for this work was provided by DGAPA 212410 to BJB.

RESPIRATORY PATHOGENS DETECTION IN SAMPLES COLLECTED DURING PANDEMIC OUTBREAK OF RESPIRATORY ILLNESS ASSOCIATED TO INFLUENZA A (H1N1 PDM), BY RT-

PCR AND MASS-TAG MULTIPLEX PCR. Victoria Pando-Robles1, Ian W. Lipkin2, Rafal Tokarz2, Pablo Cruz1, Victor Bermudez1, Rosa

E. Gomez1, Cesar Fuentes1, Rosa M. Medina3, Lourdes García-García1.

1Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud Pública.2Center for Infection and Immunity, Mailman School of Public Health, Columbia

University, NY-USA. 3Laboratorio Estatal. Morelos. México. Background: Acute respiratory infections are a leading cause of morbidity and mortality worldwide. However, in approximately 50% of cases the etiologic agent is not identified. We investigated during the outbreak of pandemic influenza A (H1N1) 2009, others respiratory pathogens associated to the influenza-like illnesses (ILIs) clinical diagnostic. Methods: From May to December 2009, respiratory samples from patients with ILIs were submitted to the Public Health Laboratory of Morelos State-Mexico. 1042 samples were evaluated for the presence of H1N1pdm by Real Time PCR and then 562 positives and negative samples were selected using random stratified test to analyze 23 respiratory pathogens including virus and bacterial by MassTag Multiplex PCR. Results: We detected 513 (49%) samples positives to influenza H1N1 pdm, 476 (46%) positives to Influenza A and 53 (5%) negatives to influenza by RT-PCR. In the 562 selected samples, the most frequently detected pathogens were: Enterovirus 16.2%; Haemophilus influenza 15.5%, Streptococcus pneumonia 13.5%, and Pneumocystis jiroveci 5.87%. Co-infections were detected in 19.6% of samples. In 56.9% of the 562 samples only viruses were identified and in 0.4% only bacteria. In 9.3% (24/257) samples negative for H1N1 pdm were identified bacterial organisms susceptible to antibiotic treatment. Conclusion: The rapid detection of multiple pathogens by Mass tag Multiplex PCR allows to improve the epidemiology of infectious diseases, affect patient managements decisions and lead to improved patient outcomes, more appropriate use of antivirals and antibiotics, and/or more cost-effective delivery of care.

LA PROTEÍNA NS1 EN LA MODULACIÓN DEL MHC Y CITOCINAS RELEVANTES PARA LA RESPUESTA INMUNE CONTRA EL VIRUS DEL DENGUE EN UNA LÍNEA

DE CÉLULAS MONOCÍTICAS HUMANAS

Salazar MI*, López-Ortega O, Castro-Mussot ME.

Laboratorio de Inmunología Celular e Inmunopatogénesis. Departamento de Inmunología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional.

Tel. 5729-6000, ext. 62487. México, DF. *E-mail: isalazarsan@yahoo.com

La proteína NS1 del virus del dengue es una glicoproteína de peso molecular entre 46 y 50 kDa presente en los cuatro serotipos del virus del dengue. Esta proteína presenta tres isoformas: la forma asociada a la membrana (mNS1), la secretada (sNS1) y la

intracelular (NS1). Se han encontrado niveles de hasta 50 µg/ml de sNS1 en suero de individuos infectados y los altos niveles parecen condicionar fiebre hemorrágica por dengue. La respuesta inmune contra la infección viral involucra la activación de linfocitos B, T, NKs y macrófagos así como la producción de citocinas tales como: IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, IFNs, TNF-α, de varias de ellas sus concentraciones correlacionan con la severidad de la enfermedad.

El objetivo de este trabajo fue establecer el papel que la proteína NS1 tiene en la modulación de la respuesta inmune a la infección con el virus del dengue en cultivos de células humanas de origen monocítico (THP-1). En estos ensayos se utilizó proteína NS1 recombinante (rNS1) con la que se efectúo un pretratamiento o tratamiento de las células THP-1 y se comparó su respuesta con células infectadas con el virus a diferentes tiempos. Para cada grupo experimental se estableció su efecto sobre la expresión de MHC clase I y sobre la producción de citocinas relevantes (IFN-α, TNF- α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10).

Mientras la infección viral induce un aumento significativo en la expresión tanto de MHC clase I como de IL-1β, IL-2 e IL-4 en las células THP-1, el tratamiento o pretratamiento de las células con la proteína NS1 del virus dengue produce una importante disminución en la expresión de estas mismas moléculas. Así, nuestros resultados sugieren que la proteína NS1 participa en la modulación de la respuesta que las células monocíticas THP-1 dan a la infección por el virus del dengue.

IDENTIFICACION POR INMUNOPROTEÓMICA DE LOS ANTÍGENOS RELACIONADOS EN LA HIPERSENSIBILIDAD A LA LECHE EN PACIENTES PEDIÁTRICOS.

Torres Arroyo Angélica, Espinosa R Francisco, Gutiérrez C Pedro,Luna P Héctor, Oria H

Jesús, López V Gabriel, Reyes V Horacio.

Laboratorio de Bioquímica Genética, Instituto Nacional de Pediatría. SS. Investigador Responsable:Dr. Horacio Reyes Vivas. e-mail: hreyesvivas@yahoo.com.mx. Tel: 10 84 09

00 Ext 1442 INTRODUCCIÓN: Los antígenos de las proteínas de la leche son los primeros antígenos a los que son expuestos los niños, un porcentaje de la población infantil llega a desarrollar un cuadro de hipersensibilidad a las proteínas de la leche (HPL); estas reacciones pueden ser mediadas por inmunoglobulinas IgE (Hipersensibilidad tipo I o inmediata) o por la formación de complejos inmunes solubles (Hipersensibilidad tipo III o tardía). El diagnóstico se basa en la historia clínica y en las dietas de eliminación de alimentos y el tratamiento en la exclusión de la leche en la dieta o el uso de fórmulas proteolizadas extensivamente. OBJETIVO:Búsqueda de estrategias para apoyar el diagnóstico certero de HPL en pacientes pediátricos de nuestra población, además de la identificación del tipo de anticuerpo que interviene en la repuesta inmune y de las proteínas que provocan la HPL. MATERIAL Y MÉTODOS: Uso de métodos bioquímicos, inmunológicos y proteómicos para caracterizar la reacción inmunológica de un paciente con diagnostico clínico de alergia alimentaria. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:Los ensayos de ELISA se estandarizaron y demostraron que el anticuerpo que intervino en la respuesta inmune del paciente fue del tipo IgG. Se ensayaron técnicas de inmunoprecipitación para el aislamiento de las proteínas antigénicas de la leche; logrando identificar por MS-MALDI-ToF, a la lactoferrina y lactoperoxidasa como potenciales proteínas responsables de la HPL. Se realizó un fraccionamiento de las proteínas de leche. El análisis de ELISA mostró que todas las fracciones reaccionan con distinta intensidad al suero del paciente. El análisis por Western-blot nos reveló la reacción de las IgG con varias proteínas en cuatro fracciones. CONCLUSIONES: Las metodologías desarrolladas pueden ser viables para apoyar el diagnóstico certero de la HPLV y para la identificación de las proteínas alergénicas que producen la sintomatología de esta patología.

ANÁLISIS PROTEÓMICO DIFERENCIAL DEL HÍGADO DE RATÓN DE 10 Y 20 SEMANAS DE EDAD

Juan M. Guzmán Flores1, Elsa C. Flores Pérez1, Sergio Encarnación Guevara2, Magdalena

Hernández Ortiz2, Gabriel Martínez Batallar2, Joel Ramírez Emiliano1, Sergio López Briones1, Victoriano Pérez Vázquez1

1Departamento de Ciencias Médicas, División de Ciencias de la Salud, Universidad de Guanajuato, Campus León. 20 de Enero 929. Col. Obregón. CP 37320. Tel. 01(477)

7143812. vicpe@yahoo.com 2Centro de Ciencias Genómicas, UNAM. Cuernavaca, Morelos.

Introducción: El hígado sufre numerosos cambios estructurales y funcionales relacionados con la edad. Estos cambios inducen la disminución de la función hepática y la respuesta al estrés, así como la pérdida de la capacidad regenerativa. Sin embargo, los mecanismos implicados en los cambios funcionales relacionados con la edad no se han esclarecidos por completo. Objetivo: Analizar los perfiles de expresión de proteínas en hígado de ratones de 10 y 20 semanas de edad. Metodología. Se emplearon 2 grupos de ratones machos de la cepa C57BL/6J de 10 y 20 semanas de edad (n=3), Las proteínas fueron separadas en 2D-PAGE al 12% de 18 cm. Los geles fueron teñidos con azul de Coomassie coloidal, digitalizados y analizados en el software Image Master 2D Platinum. La identificación de proteínas se realizó mediante espectrometría de masas por tiempo de vuelo y comparación con la base de datos UNIPROT mediante el motor de búsqueda Mascot. Resultados: Se encontró diferencia significativa (de al menos 2 veces) en la expresión de 11 proteínas de hígado, de las cuales 2 aumentaron su expresión y 9 la disminuyeron en los ratones de 20 semanas de edad, con respecto a los de 10 semanas. Algunas de las proteínas identificadas con cambios de expresión sugieren una reducida actividad del ciclo de la urea, del ciclo de Krebs y del metabolismo de aminoácidos y carbohidratos. Conclusión: Nuestro estudio proporciona evidencia molecular, a nivel de la expresión de proteínas, de la alteración de los parámetros funcionales que contribuyen al deterioro de la actividad del hígado de ratones, relacionado con la edad. Agradecimientos. Trabajo subsidiado por PROMEP (UGTO-PTC-120). JMGF es Investigador posdoctoral CONACYT.

ANÁLISIS DE LAS MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LA CISTEÍNA PROTEINASA DE TIPO LEGUMAÍNA 1, TVLEGU-1.

Francisco Javier Rendón-Gandarilla y Rossana Arroyo.

Departamento de Infectómica y Patogénesis Molecular. CINVESTAV-IPN. Av. IPN No 2508. Col. San Pedro Zacatenco, CP 07360. Deleg. Gustavo A. Madero. México, D. F. Tel.: (5255) 5747-3800 ext 5667; Fax: ext. 5625. Donativos: 58611 y 68949 (CONACYT) y

ICyTDF-299. rarroyo@cinvestav.com

La tricomonosis es una de las infecciones de transmisión sexual de mayor frecuencia en el mundo y es causada por el protozoario parásito Trichomonas vaginalis, el cual posee múltiples cisteín proteinasas (CPs). El gen tvlegu-1 es uno de los 10 genes de CPs de tipo legumaína pertenecientes al clan CD identificados en el genoma de T. vaginalis. El gen tvlegu-1 codifica para una proteína precursora de ~42.8 kDa que se procesa a una proteína madura de 30 kDa. Por Western blot en 2D e identificación por espectrometría de masas se encontró que 3 manchas proteicas de 30 kDa con distintos pI corresponden a la TvLEGU-1, lo que sugiere posibles modificaciones post-traduccionales. Por lo que el objetivo de este trabajo fue identificar las posibles modificaciones post-traduccionales que presenta la TvLEGU-1. Para identificar posibles glicosilaciones en la TVLEGU-1 se utilizaron lectinas biotinadas: Concanavalina A (que reconoce α–D-Man, α-D-Glc) y SNA (que reconoce Neu5Ac α-2,6-Gal/GalNAc) en membranas de nitrocelulosa conteniendo extractos ricos en proteasas de T. vaginalis. La concavalina A reaccionó con dos de las tres manchas y la SNA con una de las tres manchas correspondientes a la TvLEGU-1. Para identificar posibles fosforilaciones de la TvLEGU-1, se realizaron ensayos de Western blot en 2D con los anticuerpos anti-fosfo-serina, anti-fosfo-treonina y anti-fosfo-tirosina en extractos ricos en proteasas de T. vaginalis. Los anticuerpos anti-fosfo-treonina y anti-fosfo-tirosina reconocieron una y dos de las tres manchas de la TvLEGU-1, respectivamente; mientras que el anticuerpo anti-fosfo-serina no reconoció a ninguna de las tres. En conclusión, este trabajo muestra que las isoformas de la TvLEGU-1 corresponden a diferentes tipos de modificaciones post-traduccionales, como glicosilacionesy fosforilaciones.

POSTER SECTION

1. CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DEL MRNA DE LA ISOFORMA PROTÉICA 5-HT5A DEL RECEPTOR DE SEROTONINA, EN HIPOCAMPOS DE RATAS

TRATADAS CON SEROTONINA.

Violeta García Santoyo, Laura Cristina Berumen, María Guadalupe García-Alcocer, Jesica Escobar, Angelina Rodríguez Torres.

Universidad Autónoma de Querétaro, Facultad de Química. C.P. 76177, 4421549569, leitovagriaca@hotmail.com

La serotonina es un neurotransmisor que regula varios procesos biológicos mediante la interacción con sus receptores. Uno de estos receptores es la isoforma 5-HT5A, la cual se ha identificado en varias regiones del sistema nervioso central, con un alto nivel de expresión en el hipocampo; sin embargo, aún no se sabe con exactitud qué funciones controla. El objetivo de este trabajo es conocer si existen modificaciones en la expresión del receptor 5-HT5A en el hipocampo de ratas tratadas con serotonina. Se utilizaron cuatro grupos de ratas (3 ratas en cada grupo). Tres grupos recibieron 3 adiministraciones continuas vía intraperitoneal a intervalalos de 48 hrs entre cada uno de ellas, los tratamientos fueron: 1) solución fisiológica, 2) 50 µg/kg de serotonina y 3) 25 µg/kg de serotonina. El cuarto grupo de ratas en estudio, recibieron una dosis única 50 µg/kg de serotonina. Transcurrida una hora de la última/única dosificación, se sacrificaron los animales y se disectó el hipocampo, se extrajo RNAm y se realizó RT-PCR en tiempo real, para evaluar los niveles relativos de expresión de mRNA del receptor de serotonina 5-HT5A en hipocampo de rata. Los datos muestran una disminución estadísticamente significativa en los niveles relativos de expresión de mRNA del receptor de serotonina con el tratamiento de una dosis única de 50 µg/kg de serotonina y un aumento en la transcripción del receptor 5HT5A en los hipocampos sometidos a tres dosis continuas tanto para 25 como para 50 µg/kg de serotonina. Estos resultados sugieren la existencia de una regulación en la expresión del mRNA del receptor 5-HT5A en respuesta a la serotonina sistémica circulante. Este neurotransmisor podría estar regulando la expresion de su receptor en hipocampo por una via indirecta, considerando que la serotonina no atraviesa la barrera hematoencefálica.

2. ESTUDIO CUANTITATIVO PARA IDENTIFICAR CAMBIOS EN EL PROTEOMA DE ESCHERICHIA COLI PRODUCTORA DE CITOCINAS.

Alma Gabriela Reyes González, Mariana Rubín de Celis Martínez, Sergio Rosales Mendoza,

Ruth Soria Guerra, José Luis Martínez Salgado, Luz María Teresita Paz Maldonado*.

Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Laboratorio de Biorreactores. Av. Dr. Manuel Nava 6 Zona Universitaria, San Luis Potosí, S.L.P., C.P. 78210 Tel. (444)8262440 Ext. 6430.

teresita.paz@uaslp.mx

Escherichia coli, es de los sistemas más utilizados para producción de proteínas recombinantes, debido a las múltiples ventajas que ofrece, sin embargo existen ciertas desventajas como la generación de cuerpos de inclusión o agregados proteínicos que causan inactividad biológica y un elaborado proceso de purificación, mismo que eleva el costo del producto final. El presente trabajo muestra las diferencias a nivel de proteínas de manera cuantitativa, en el sistema de Escherichia coli BL21 productora de tres citocinas, interferón beta (Inf-β), interferón gamma (Inf-γ) e interleucina 10 (IL-10), las cuales se han expresado en E. coli, sin embargo no todas de forma soluble, es por ello relevante identificar las diferencias dentro del proteoma de cada una, de manera que se establezca un modelo mediante ingeniería metabólica que permita crear una cepa de E. coli productora de citocinas de forma soluble.

Se realizaron 3 construcciones en pET38b(+) con los genes sintéticos de las citocinas humanas (Inf-β, Inf-γ e IL-10), optimizados para E. coli y se les adicionó un péptido señal . Los ensayos de expresión se realizaron en medio mínimo a 25°C, utilizando como inductor IPTG 0.1mM, una OD600 de 0.6, y se adicionó10mM de alcohol bencílico. Los extractos proteicos de la fracción total, soluble, insoluble y de periplasma fueron analizados por SDS-PAGE al 15%. Las bandas correspondientes a las citocinas se identificaron por espectrometría de masas. Las muestras solubles e insolubles de las citocinas serán marcadas con reactivos iTRAQ para el análisis a nivel de proteínas de forma cuantitativa utilizando un equipo MALDI-TOF/TOF 4800 (Applied Biosystems). La identificación de los péptidos y proteínas se realizará utilizando el software Protein Pilot v2. Este estudio permitirá elucidar posibles candidatos que favorezcan la producción de proteínas solubles en E. coli que podrán ser utilizados para el desarrollo de cepas metabólicamente modificadas productoras de proteínas solubles de alto valor agregado.

3. ANÁLISIS DEL COMPORTAMIENTO DE ESCHERICHIA COLI PRODUCTORA DEL ANTÍGENO APA DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS POR LA INDUCCIÓN QUÍMICA EN

CULTIVO CONTINUO.

María Fernanda Nava Ocampo, María de los Angeles Cancino Rodezno, Norma Adriana Valdez-Cruz, Mauricio Alberto Trujillo Roldan,

Instituto de Investigaciones Biomédicas. Unidad de Bioprocesos. México D.F. CP 04360.

Av. Copilco #76 edificio A6 Departamento # 204, Col. Copilco el bajo, tel. 0445530060617, mfernanda.nava@gmail.com

Introducción: Proteínas antigénicas de micobacterias patógenas como el Alanine-Proline rich Antigen (APA), pueden ser empleadas como parte de una vacuna y/o diagnostico contra la tuberculosis [1,2]. Cultivar M. tuberculosis para obtener estas proteínas es peligroso, lento y no aporta altas productividades, en cambio en E. coli se reducen los riesgos, su crecimiento es rápido y existen modelos de producción recombinante. Inductores químicos que trabajan a nivel del promotor lac como el IPTG son ampliamente utilizados a nivel laboratorio. Además, los cultivos continuos son usados en el estudio de adaptación de cepas a diferentes presiones de selección tras varias generaciones [3]. Objetivos. Analizar el comportamiento de una cepa recombinante de E. coli productora del antígeno APA de M. tuberculosis por la inducción química en cultivo continuo. Metodología. Utilizando E. coli Rosetta (DE3) productora de APA, se llevó a cabo un cultivo continuo en biorreactor de 1.0 L, suministrando medio de cultivo Luria Bertani el cual contiene 0.2383 g/mL de IPTG, 0.25 g/mL de Ampicilina y 0.034 g/mL de Cloranfenicol. Se estudian los efectos de adaptación tras una inducción química, durante 60 generaciones a una velocidad de dilución de 0.03 h-1, mediante análisis proteómico en geles 2-D. Resultados. En el cultivo continuo se mantuvo una D de 0.03h-1 y densidad óptica promedio de 3.75, durante 48 generaciones (1,129 h). La tensión de oxígeno disuelto se mantuvo en 30% controlándose por cascada de agitación. No se controló el pH, mientras que el control de temperatura mantuvo el cultivo a 30°C. Mediante Western Blotting empleando anticuerpo anti-6xHis se comprobó la producción de APA en el cultivo continuo de las últimas horas para confirmar la producción de APA. Además, la producción específica se mantuvo constante. En los análisis preliminares de proteómica se observan cambios sustanciales en las regiones correspondientes a proteínas de bajo peso molecular, mientras la APA se mantiene constante. Conclusiones. Un ensayo de adaptación sobre la cepa productora de APA bajo condiciones de inducción continua con IPTG durante 1129 horas no afecta negativamente la producción y es capaz de mantenerla constante. 1.-Espitia C. et al. Infect.Immun. 1995. 63 (2): 580-584. 2.-Romain F., et al. Infect.Immun. 1999 67 (11): 5567-5572. 3.- Kwon Y., et al. J Biosci Bioeng 2011. 111 (1): 26 – 30.

4. CHARACTERIZATION OF A TAENIA SOLIUM IMMUNOGENIC PROTEIN COMPLEX WITH CATHEPSIN L-LIKE ACTIVITY USING PROTEOMICS

Victoria Pando3, Daniel Rueda1, Ruby Piña1, Robert H. Gilman2, Andrés Gutierrez1, Myra Flores1, Cecilia Sifuentes1, Patricia Sheen1, Daniela Kirwan4, Silvia Rodriguez5, Héctor H.

García5, Mirko Zimic1, for the Cysticercosis Working Group of Perú.

1 Unidad de Bioinformática y Biología Molecular, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Peru; 2 Department of International Health, Bloomberg School of Public Health, The Johns Hopkins University, USA; 3 Centro de Investigación Sobre Enfermedades Infecciosas,

Instituto Nacional de Salud Pública, Mexico. 4 Department of Infectious Diseases and Immunity, Imperial College London, London. W6 0DT

Background: Cathepsin L-like proteases are secreted by several parasites including Taenia solium, and constitute important antigens for immunodiagnostics. Previously, a 53/25 kDa cathepsin L-like fraction was purified from Taenia solium cysticercus fluid. This antigen was highly sensitive and specific in the immunodiagnosis of human neurocysticercosis in a Western immunoblot and ELISA. In this study, the composition and immunodiagnostic properties of the 53/25 kDa fraction and its subunits were analyzed. Methods: The protein composition of the 53/25 kDa cathepsin L-like fraction was assessed using mass spectrometry. Treatment with type-O and type-N glycosidases and lectin blots were used to analyze the carbohydrate content. A total of 165 serum samples from patients with neurocysticercosis (53 with a single cyst, 57 with multiple cysts, and 55 with extraparenchymal cysts) were evaluated to ascertain the sensitivity of the subunits for diagnosis, and 103 serum samples from negative controls were evaluated to estimate the specificity. 99Ninety nine sera from patients with other helminth infections were included to determine cross-reactions. Results: The 53/25 kDa fraction was shown to be a protein complex comprising four subunits with type-N glycosylation, and to include several lectin-type carbohydrates. The proteomic analysis revealed that the four subunits comigrated with and showed motifs similar to the 8 kDa lectin-lentil glycoproteins used in the EITB from the USA Centers of Disease Control (CDC). The sensitivity of each of the subunits individually as well as of the combinations was lower than that of the native complex. Conclusion: The highly antigenic 53kDa53 kDa band, associated with cathepsin L-like activity, is a protein complex that comprises four subunits with type-N glycosylation that show motifs of the 8kDa8 kDa family antigens. None of the single subunits attained the high sensitivity of the native complex, suggesting that quaternary structural epitopes might be recognized.

5. CHARACTERIZATION OF PROTEINS FROM SKIN SECRETIONS OF LITHOBATES PUSTULOSUS AND LITHOBATES SPECTABILIS FROGS: EXPLORING THE COMPLEX

PROCESSING AND REGULATION MECHANISMS OF ANTIMICROBIAL PEPTIDE MATURATION AND THE MOLECULAR KEYS OF FROG SKIN HOMEOSTASIS

Lorena Hernández1, Erika Meneses1, Victoria Pando2 and Cesar V. Batista1

1Laboratorio Universitario de Proteómica, IBT-UNAM Av. Universidad, 2001, Col. Chamilpa, CP 62210, Cuernavaca, Mor., Mexico. 2Centro de Investigación Sobre

Enfermedades Infecciosas – INSP. Av. Universidad No. 655, Cerrada Los Pinos y Caminera, C.P. 62100, Cuernavaca, Mor., Mexico.

Antimicrobial peptides (AMPs), insulin releaser peptides, protease inhibitors, bradykinin-like peptides and a number of unknown proteins mainly compose frog skin secretions. AMPs are translated as prepropeptides, which are enzymatically processed to produce mature peptides. However, there is no information available in the current literature regarding the identification of the enzymes involved in the maturation process or its regulation. Only two articles have previously reported that AMPs in crude skin secretions are completely degraded when exposed to room temperature for two hours. This information indicates the presence of very active protease (s) in the frog skin secretions that may be released from the exocrine glands during the electro stimulation extraction or a natural process may release them. Many interesting questions arise from the AMPs maturation process: (i) how is the enzymatic process controlled? (ii) Are protease inhibitors the only molecular components involved in the process? (iii) Do small AMP fragments also manifest antimicrobial activity? (iv) Are frog proteases site specific in the maturation process of prepropeptides? Besides the role played by proteases in the maturation process, other types of proteins can expect to be found in the frog skin secretions. Considering that frog skin is a humid organ containing protein and peptides in soluble form and that the skin is exposed to UV light during the day, it is possible that free radicals will be produced, with consequent molecular damage. In order to correctly address these and other questions in the context of the complex mixture of protein contents, we used a proteomic approach to partially answer these questions. Page gel spots were digested with trypsin and a dozen proteins were identified; including prohormone convertase, peroxiredoxin, GLI pathogenesis-related 2, zymogen granule membrane protein, ring finger protein 38, ABC transport proteins, tripeptidyl-peptidase 2 and triose phosphate isomerase, among others. Additionally, more than sixty AMP fragments were de novo sequenced from collected skin secretions, with no protease inhibitors added and then incubated at 10ºC for two hours. Interesting, proteases did not hydrolyze the C-terminal loops of AMPs, which showed protease inhibition activity.

6. FROG SKIN PEPTIDES: AN EXCELLENT MODEL FOR STUDYING THE CHEMICAL BEHAVIOR OF UNCOMMON POSTTRANSLATIONAL MODIFICATIONS, IN GAS PHASE.

Erika Meneses1, Lorena Hernández1, Victoria Pando2 and Cesar V. Batista1

1Laboratorio Universitario de Proteómica, IBT-UNAM Av. Universidad, 2001, Col. Chamilpa, CP 62210, Cuernavaca, Mor., Mexico. 2Centro de Investigación Sobre

Enfermedades Infecciosas – INSP. Av. Universidad No. 655. Cerrada Los Pinos y Caminera, C.P. 62100, Cuernavaca, Mor., Mexico.

Posttranslational modifications (PTMs) are chemical groups attached to peptides and proteins after translation, which drive many biochemical processes at cellular level. During the last two decades, high-resolution mass spectrometry has become the most important analytical tool for characterizing PTMs, due to its applicability in large-scale experiments and its high accuracy and sensitivity. However, some proteins and peptides containing PTMs, such as sulfate, pyridoxal phosphate and hydroxyproline are not commonly found in mammalian cells, apart from hydroxyproline, which is a major component of the protein collagen. Due to the low occurrence of these specific PTMs, the fragmentation processes in gas phase have not been thoroughly studied or characterized. On the other hand, frog skin secretions represent a rich source of antimicrobial peptides (AMPs), protease inhibitors and bradykinin-like peptides, which contain all the PTMs described previously. Although peptides containing sulfate can either be synthesized or purchased from some companies, the real proportion of natural PTM components found in a complex mixture of peptides is sometimes difficult to reproduce. Here we present a detailed study of peptides containing sulfate, pyridoxal phosphate and hydroxyproline from frog skin secretions, when submitted to fragmentation in gas phase by collision induced dissociation (CID) and high-energy collision dissociation (HCD), in an Orbitrap-Velos mass spectrometer. Enrichment methods, such as TiO2 and IMAC applied to phosphate peptides, were found to be equally successful for enriching sulfate and pyridoxal phosphate peptides. Loss of sulfated peptides in HPLC metal lines and frits was detected, quantified and compared. Well-calibrated Orbitrap mass spectrometer was adequate for distinguishing sulfate and phosphate PTMs, which differ only by 0.009 Da. HCD and CID dissociation methods were compared in terms of neutral loss of sulfate. Finally, a multi-pyridoxal phosphate PTM from a protease inhibitor was characterized by top-down MS analysis.

7. IN SILICO DOCKING CALCULATIONS BETWEEN DISCREPIN, A SCORPION TOXIN, AND SHAB KV AND KV4.2 VOLTAGE GATED POTASSIUM CHANNELS

Omar Piña1, Froylan Gómez-Lagunas, Lourival D. Possani1, Gerardo Corzo1

1Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnología,

Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca Mor., 62250, México. 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, Coyoacan, D.F., 04510,

México. Voltage gated potassium channels (Kv) are a large and diverse family of proteins that are implicated in the regulation of many cellular functions. Incorrect functionality of these ion channels, among others, is related to several diseases; therefore, specific Kv ligands are important for the study of these cell receptors. The purpose of this work is to correlate the in vitro experimental data with the in silico docking calculations of the interaction of a scorpion toxin with its Kv receptor. Discrepin is a scorpion toxin described by D´Suze et al. (Arch. Biochem. Biophys. 430:256-263, 2004). It was isolated from the venom of the scorpion Tityus discrepans that blocks preferently the A-type Kv currents in cerebellar granular cells. Although the sub-types of Kv present in cerebellar granular cells are not known, we performed electrophysiological assays in three heterologously expressed Kv subtypes (Shaker, Shab, and Kv1.4) in the presence of Discrepin, which was able to block only the Shab Kv channel from Drosophila melanogaster. Therefore, we proceed to the computational study to generate protein models of Shab using the crystal structure of the already reported Kv1.2-2.1 chimera (PDB CODE) as an ion channel template, and the software program Modeller9v8. Since potassium ion channel toxins from the venom of scorpions block basically the pore of the channel, at this time only the Shab pore domain (S5-PS6) was used for in silico docking calculations. One hundred models of Shab were generated and five models with the best energy function were subjected to a process refinement and optimization. These optimized models were evaluated with PROCHECK and two of them were chosen for further Docking experiments with the toxin. The ZDOCK program was used to perform the docking experiments. Each docking produced 54,000 models that were filtrated with ZRANK program and subsequently inspected and analyzed.

Acknowledgements. This research has been accomplished by financial support of DGAPA-UNAM number IN220809 to GC and IN204110 to LDP, and a student grant to OP from CONACyT.

8. A SPIDER TOXIN ELUCIDATE INSECTICIDAL RECEPTORS IN DIATREA MAGNIFACTELLA AND GALLERIA MELLONELLA

Espinoza N.1, Cordero M.P.1, Lina L.1, Hernandez V.1, Corzo G.2 and Villegas E.1

Email: elbav@uaem.mx

1Centro de Investigación en Biotecnología - UAEM, Av. Universidad 1001, Cuernavaca,

Morelos, 62209, México. 2Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnología - UNAM,

Av. Universidad 1001, Cuernavaca, Morelos, 62210, México.

Spider venoms contain polyamines and peptide toxins that target cell receptors that allow them to paralyze and kill their insect preys. Polyamines and peptide toxins from the venom of spiders have been studied extensively, and they are interesting natural molecules for agricultural and clinical applications. Now days, the worldwide abuse of chemical insecticides has contributed to the insect pest resistance to a variety of pesticides of chemical and biological origin. Since spider insecticidal peptide toxins are specific for insects, they represent biochemical tools to study uncovered insect cell receptors. The insect specific peptides from the spider Paracoelotes luctuosus, named Palutoxins, have been found to be lethal to Galleria mellonella and Diatraea magnifactella, which are important crop pests in México. Therefore, Palutoxins from the venom of the spider Paracoelotes luctuosus (Araneae: Amaurobiidae) has been used as probes to elucidate insect cell receptors in Diatraea magnifactella and Galleria mellonella. The synthetic analogue of the native PaluIT1 and its fluorescent probe PaluIT1-FITC were used to determined the LD50 values of D. magnifactella and G. mellonella. Both the analogue of the native PaluIT1 and the PaluIT1-FITC peptide were neurotoxiv to larvae after half of an hour post-injection. Neurotic symptons such paralysis, tissue necrosis and death were observed in both G. mellonela and D. magnifactella larvae after 24 h. The PaluIT1-FITC LD50s for G. mellonela and D. magnifactella were 12.1 and 16.6 g/g larvae, respectively. After PaluIT1-FITC detection in larvae tissues, two putative receptors were found in the central nervous system of Diatraea magnifactella and Galleria mellonella. Spider toxins could be important biochemical tools to elucidate important cell receptors in crop pests for agricultural applications, further results will be discussed during presentation. Financial support: Conacyt CB2010-153606 y CB-2008-106949 a GC y EV, respectivamente. Keywords: Insect receptors, spider toxins, flourescent probe.

9. ANÁLISIS DE BIOMOLÉCULAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS EMPLEANDO PLASMA FRÍO COMO NUEVO MÉTODO DE IONIZACIÓN

Sandra Martínez Jarquín, Robert Winkler

CINVESTAV Unidad Irapuato; departamento de Biotecnología y Bioquímica, 36821

Irapuato Gto., México, robert.winkler@ira.cinvestav.mx. La Biología y Biotecnología tienen como objetos de estudio seres vivos y las biomoléculas que los componen. Una técnica analítica importante para el análisis de las biomoléculas es la espectrometría de masas, mediante esta se determina el peso molecular de los compuestos a analizar. Como condición para el análisis de moléculas por espectrometría de masas es necesario convertir las moléculas de un estado neutro a moléculas cargadas. En un espectrómetro de masas este proceso ocurre en la fuente de ionización. Debido a las condiciones fisicoquímicas extremas a las que someten a la muestra las técnicas convencionales para el estudio de biomoléculas (MALDI y ESI) no permiten realizar análisis de biomoléculas en condiciones in vivo. Recientemente se ha desarrollado una técnica basada en la utilización de plasma de baja temperatura (LTP) como fuente de ionización, que funciona en condiciones ambientales y por lo tanto representa una alternativa viable para el estudio de biomoléculas en condiciones in vivo. Solamente existen dos prototipos a nivel mundial, y debido a que no hay proveedores comerciales hemos construido un prototipo de sonda LTP en el laboratorio de Análisis Bioquímico e Instrumental, que opera con un bajo consumo de energía (3 W), a presión ambiental y baja temperatura (37°C). Hemos evaluado los efectos fisiológicos locales y sistémicos de diferentes organismos, así como la inhibición del crecimiento microbiano causado por plasma. El siguiente paso será acoplar la sonda LTP con un analizador de masas cuadrupolar lo que nos permitirá el análisis de moléculas in vivo utilizando plasma de baja temperatura como fuente de ionización respetando los límites específicos que demande cada organismo para su análisis.

Fig. LTP aplicado a hoja de Capsicum

annuum (chile serrano)

(chili)

10. COMPARASIÓN DE METODOS DE PRECIPITACIÓN DE PROTEINAS EN SALIVA PARA LA SEPARACIÓN DE MUESTRAS PREVIO AL ANÁLISIS PROTEÓMICO BIDIMENSIONAL (2-DE)

David Salomòn Dozal Domínguez; Dr. Alejandro Zentella Dehesa; Dr. Jose Luís

Ventura Gallegos. Unidad de Bioquímica, Instituto Nacional de Nutrición Salvador Zubirán (INNSZ).

Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM Unidad de Bioquímica; Vasco de Quiroga 15, Colonia Sección XVI, Tlalpan C.P.14000, México D.F., Teléfono: 54870900 ext. 2607, 55730487. david_dozal@hotmail.com

INTRODUCCION: La saliva humana tiene un gran potencial para el diagnostico de diversas enfermedades tanto locales como de tipo sistémico. Es la relación proteica existente de saliva con los niveles plasmáticos así como la técnica de obtención no invasiva, segura manipulación y bajo costo lo que hace que resulte una herramienta de diagnóstico atractiva. La preparación de la muestra es uno de los pasos cruciales para que la separación de proteínas tenga una alta calidad de resolución y un gran número de spots en mapas 2-DE (electroforesis bidimensional) permitiendo con ello resolver cientos de proteínas en un solo procedimiento de separación. Las muestras requieren estar libres de sales y otros agentes como detergentes iónicos, ácidos nucleicos, lípidos y compuestos fenólicos además de tener concentraciones proteínicas apropiadas. Al ser el agua el disolvente por excelencia, las proteínas se encuentran normalmente en disolución acuosa de la que pueden precipitar selectivamente por cambios en la polaridad del disolvente, fuerza iónica, pH o temperatura. Esta polaridad del disolvente disminuye cuando se le añade sustancias menos polares como el etanol o el acetona, con ello disminuye el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la molécula proteica, provocando la agregación y precipitación. Los disolventes orgánicos como el ácido tricloroacético (TCA) interaccionan con el interior hidrófobo de las proteínas desorganizando la estructura terciaria, provocando su desnaturalización y precipitación. De igual forma un aumento en la fuerza iónica del medio provoca una disminución en el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de las proteínas ya que estos solutos compiten con el agua y rompen los puentes de hidrógeno o las interacciones electrostáticas de forma que las proteínas se agregan y precipitan. Además de ser precipitadas y para su análisis en 2-DE éstas proteínas salivales necesitan ser solubilizadas, disgregadas, desnaturalizadas y reducidas. Para este fin agentes caotropos (urea y tiurea) son empleados para romper puentes de hidrógeno permitiendo el desplegamiento y desnaturalización, detergentes ziuteriónicos como 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylamonio] -1propano-sulfonato (CHAPS) y triton-X actúan sinérgicamente con caotropos previniendo la interacción y agregación de proteínas. Agentes reductores como ditiotreitol (DTT) tributilfosfonina (TBP) son usados para romper puentes disulfuro. OBJETIVOS: Comparar y seleccionar el factor precipitante de proteínas y métodos de precipitación que dará la mayor recuperación proteica de muestras de saliva human. Así mismo se evaluará la eficiencia de método de precipitación seleccionado por la resolución de sus proteínas (spots) separadas en 2-DE

MATERIALES Y METODOS: Químicos: acrilamida, bis-acrilamida, Dodecyl Sulfato Sódico (SDS), Tetrametilendiamina (TEMED), persulfato de amonio, tiourea, diotiotreitol (DTT), tiras 7 cm lineales (IPG), Gradiente inmovilizado de pH 3-10 GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA), urea, CHAPS, TCA, acetona, Iodoacetamida, coctel inhibidor de proteasas Roche(Manheim, Alemania)2-D Clean up kit (GE-Healthcare), Deep purple (GE-Healthcare), carbonato de sodio. Colección de saliva no estimulada de 3 voluntarios (previa estandarización), las muestras fueron mantenidas en hielo durante el procedimiento de colección, se adicionó al volumen obtenido coctel inhibidor de proteasas (Roche) para prevenir degradación proteica durante la preparación de las muestras. Tres precipitantes y seis métodos de precipitación fueron empleados: método A(Acetona 24 hrs), método B(Acetona inmediata), método C(TCA/acetona/DTT 24hrs), método D(TCA/acetona/DTT inmediata), método E(2-DClean up kit). RESULTADOS: Los 5 métodos de precipitación generaron un patrón de bandeo mejor que el correspondiente a la saliva sola reflejándose como un incremento en el repertorio proteico debido a la precipitación de la muestra previa electroforesis, de los cuales los métodos C y D son los que generan una mejor definición de bandas de proteínas. El análisis de densidades por carril fue de 11081 pixeles para el método A, 12067 método B, 12368 método C, 12299 método D, 12690 método E y 10311 saliva sin precipitación. El porcentaje de recuperación proteica se determino mediante cuantificación por Bradfford comparándose con el estimado proteico presente en la saliva sin precipitar. 44.98% de recuperación por el método A, 67.96% método B, 49.51% método C, 65.59% método D y 42.07% método E respectivamente. Debido a que nuestra finalidad de recuperación de muestra de saliva es generar patrones 2.DE se compararon las técnicas C y E debido a los resultados generados e repertorio proteico y porcentaje de recuperación. CONCLUSIONES: La recuperación de proteínas en saliva depende del tipo de precipitante y método empleado, además del contenido de sales que generan alteraciones en el isoelectroenfoque de las proteínas para 2-DE; La presencia de bacterias así como el grado de acidez en boca generan modificaciones en los patrones proteicos. En nuestros resultados, los métodos de precipitación que generaron los patrones proteicos mas definidos fueron 2D-clean up kit y TCA/acetona/DTT 24hrs , sin embargo el poder de recuperación más alto se vio atribuido al método de acetona inmediato. Debido a que nuestro interés se centra en definir una técnica que conjunte gran poder de resolución y alto porcentaje de recuperación, las técnicas de TCA/acetona/DTT 24 hrs. y 2D-clean up kit cumplen con las funciones deseadas siendo el tiempo que tarda la precipitación y los costos de estos los aspectos a tomar en cuenta para su uso en proteómica de fluidos humanos.

11. QUANTITATIVE PHOSPHOPROTEOMICS OF MONOCYTE CELL LINE INFECTED WITH DENGUE VIRUS

Victoria Pando1, Juan Oses2, Antonio Angel1, Myriam Rodríguez3, Isabel Salazar4, Rosa

María del Angel5, Cesar Batista3, Alma Burlingame2.

1Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud Pública. México. 2 University of California, San Francisco. USA. 3 Instituto de Biotecnología-

UNAM. Mexico. 4 Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, México. 5Centro de Investigación y de Estudios Avanzados. Mexico.

Dengue is a widespread mosquito-borne viral disease of humans, affecting 50 million people annually in tropical and subtropical countries, causing severe disease that requires hospitalization in approximately 500,000 of infected individuals and the mortality rate is about 5%. The causative illness agent is dengue virus (DENV), which exists as four serotypes. To date, there is no licensed prophylactic vaccine and no specific antiviral drug available. Dengue virus encodes only ten proteins, and with them must exploit/modulate host cell machinery and function, in order to complete their infectious cycle and to obtain viral progeny. Protein phosphorylation is a reversible post-translational modification that constitutes a key mechanism to control protein function via their activation/inactivation and regulated a myriad of physiological processes. Overall changes in the host cellular proteome upon virus infection result in a cascade of signalling events and pathway activation, where the identification of protein phosphorylation sites is a prerequisite for better understand the infection. In the present work, we used proteomic technology for analysis of phosphorylate protein expression of THP1 cells (Human acute monocytic leukemia cell line) after DENV-2 infection. Our methodology combines the use of strong cation exchange (SCX) and titanium dioxide (TiO2) for phosphopeptide enrichment, high-resolution MS for peptide and protein identification, and isobaric tag for relative and absolute quantization (ITRAQ). Our preliminary results showed 51 differentially-expressed phosphopeptides, with 4 up-regulated peptides and 47 down-regulated peptides. The implication for mammalian cellular responses to dengue virus infection was analyzed and we discuss the possible functions of the identified proteins.

12. QUANTIFICATION BY ISOTOPIC LABELING AND LC-MS/MS OF THE DIFFERENTIAL EXPRESSION OF PROTEINS IN HUVEC CELLS, INDUCED WITH PHYLLOKININS

Emmanuel Ríos-Castro1, María Martha Pedraza-Escalona2, Cesar V. Batista1

1Laboratorio Universitario de Proteómica, IBT-UNAM Av. Universidad, 2001, Col. Chamilpa

CP 62210, Cuernavaca, Mor., Mexico. 2Dep. Med. y Bioproc. IBT-UNAM Av. Universidad, 2001, Col. Chamilpa CP 62210, Cuernavaca, Mor., Mexico.

Kinins are peptides with low molecular weight involved in multiple pathophysiological functions, comprising a subset of a large number of mediators that contribute to inflammatory response and vasodilation. Bradykinin (RPPGFSPFR) is the most commonly characterized peptide within the kinin group and it can promote cell proliferation, mitogenic effects and cell mobilization. It also plays an important role in the formation of new blood vessels through the induction of the B2 receptor, constitutively expressed in most normal tissue cells. Amphibian skin secretions are a rich source of bioactive molecules and they include peptides, which stimulate the kallikrein-kinin system, and they are also chemical analogues of endogenous kinins. They are known as Bradykinin-Related Peptides (BRP's) and they can cause changes in the expression of protein levels involved in biological functions and mediated by the B2 receptor, when compared with the canonical bradykinin. Changes in protein expression can be relatively quantified using the LC-MS/MS and iTRAQ method. Here we used human vein endothelium cells (HUVEC) as a model, as these have an elevated level of expression of the B2 receptor, enabling the verification of the complexity of HUVEC cell proteome, prior to induction by BRPs. Firstly, BRPs were isolated from the soluble skin secretions of the Pachymedusa dacnicolor frog by applying HPLC, using an RP C18 column with a linear gradient of 0% buffer A (0.1% TFA / water) to 60% buffer B (0.1% TFA / ACN) for 60 minutes, and monitoring the eluted peaks using UV detection at 230 nm. Secondly, the fractions obtained were injected into the Orbitrap-XL mass spectrometer, revealing the presence of two BRP's: [Hyp]3 [Thr]6-Phyllokinin sulphated (RPPOHGFTPFRIYHSO3), and [Thr]6-Phyllokinin sulphated (RPPGFTPFRIYHSO3). The identification of each BRP was achieved by collision-induced dissociation (CID) and high-energy collision dissociation (HCD), which generated enough fragment ions for the manual assignment of their primary structures. Finally the HUVEC cells were expanded using medium-VEGF EndoGRO in polystyrene plates and grown in the incubator until confluence occurred (5-7 days) in a humid atmosphere with 95% air and 5% CO2. Preliminary results using total proteins extracted from the HUVEC cells, after 30 min induction with bradykinin and two different BRPs were carried out with an Orbitrap-Velos mass spectrometer, which indicated significant changes in protein expression.

13. UNA ESTRATEGIA PROTEÓMICA PARA EL ESTUDIO DE LA BIOGÉNESIS DEL CLOROPLASTO DE ARABIDOPSIS THALIANA.

Luis de Luna Valdez1, Sergio Encarnación Guevara2, Gabriel Martínes Batallar2, Magdalena

Hernández Ortiz, Patricia León1 & Ángel A. Guevara-García1*. * aguevara@ibt.unam.mx

1Instituto de Biotecnología-UNAM. Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos, México, 62170.

2Centro de Ciencias Genómicas-UNAM. Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos, México, 62170.

Los organismos fotoautótrofos son los responsables de sostener la vida en la biosfera, esto gracias a su capacidad para integrar átomos de carbono inorgánico (CO2) en carbohidratos usando como fuente de energía la luz, este proceso se conoce como fotosíntesis. La fotosíntesis fue adoptada por los organismos eucariontes por medio de un proceso endosimbiótico, por el cual algunas bacterias fotoautótrofas se integraron a la maquinaria genética, bioquímica y celular de sus hospedadores, convirtiéndose en uno más de sus organelos (cloroplastos). Los cloroplastos tienen un proteoma muy diverso cuya composición está estimada en alrededor de 3000 proteínas; de manera contrastante el genoma cloroplástico codifica para apenas 100 proteínas, este hecho pone de manifiesto que gran parte de la maquinaria proteica necesaria para el desarrollo y función de los cloroplastos esta codificada en el genoma nuclear de los organismos que los portan. Con la intención de dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la biogénesis de los cloroplastos, en el laboratorio se compiló una colección de mutantes llamada clb (Chloroplast Biogenesis), a través de cuya caracterización se han identificado algunos genes involucrados en este proceso. Con la idea de profundizar en el conocimiento de los mecanismos de biogénesis del cloroplasto, en este trabajo se abordó una estrategia proteómica comparativa bajo la que se analizaron los perfiles de expresión de proteínas de plantas tipo silvestre y cuatro mutantes de la colección clb (cla1, clb2, clb5 y clb19). Específicamente, extractos proteicos de tres réplicas biológicamente independientes de plántulas mutantes y tipo silvestre, de 16 y 8 días de desarrollo, respectivamente, se resolvieron en geles de 2-D. Además, usando el software de análisis de imágenes PD-Quest (Biorad, Hercules CA), se determinó la presencia de aproximadamente 1000 péptidos en cada una de las muestras, de los cuales 144 mostraron cambios de abundancia de al menos dos veces (26 inducidos y 118 reprimidos), con un nivel de confianza estadística (t-Student) del 98%. Un análisis por espectrometría de masas con el sistema MALDI-TOF de 115 de los péptidos que cambian su abundancia ha permitido, con la ayuda de los motores de búsqueda Mascot (http://www.matrixscience.com) y Profound (http://prowl.rockefeller.edu/), la identificación de 82 proteínas distintas. Actualmente se están llevando a cabo los análisis fenotípicos y moleculares de plantas mutantes afectadas en la expresión de las proteínas identificadas con funciones o localizaciones subcelulares que sugieren su participación en la biogénesis de los cloroplastos.

14. PROTEOMICS OF POZOL

Cardenas, C1., Mendoza, G2. Wacher3, C. Barkla, B4. and Rodríguez-Sanoja, R1.

1 IIB-UNAM, 2 Facultad de Medicina, UNAM, 3 Facultad de Química, UNAM, 4IBt-UNAM. Pozol is a traditional fermented maize dough prepared in southeastern Mexico. A wide variety of microorganisms have already been isolated from this spontaneous fermentation; these microorganisms include fungi, yeasts, lactic acid bacteria, and non-lactic acid bacteria. Pozol presents physicochemical features different from that of other food fermentation, such as a high content of starch in addition to low protein content. The aim of this study was to obtain a proteomic view of the different groups of proteins within the pozol using proteomic tools to create a fermentation reference map. A methodology was therefore developed to reduce the complexity of pozol matrix prior to 2D-PAGE analysis. The protocol involves various lysis or extraction buffers, homogenization and precipitation procedures. Critical steps for the extraction were: cell recovery by differential centrifugation; insoluble starch granules interaction with the extraction buffer and depletion of high abundance proteins (zeins). In a first effort to obtain the proteome of 360h fermented maize dough, proteins were separated and subsequently characterized by mass spectrometry and analyzed by sequence homology database search. 2D gel electrophoresis analyses revealed 280 protein spots expressed at this stage. After depletion of zeins, two main groups of proteins were identified, the first one from Maize involved in starch synthesis and storage proteins such as globulins, and the second group related to central carbon metabolism and cell growth/division in bacteria, specially from Streptococcus and Lactobacillus genus.

15. ANÁLISIS PROTEÓMICO DE PEROXIDASAS PRESENTES EN GRANOS DE MAÍZ (ZEA MAYS L.) Y SU POSIBLE RELACIÓN EN LA RESISTENCIA A INSECTOS POSCOSECHA

Janet Ana Isabel López Arciniega1, Silverio García-Lara2, Robert Winkler1.

1CINVESTAV Unidad Guanajuato. Km 9.6 Libramiento Norte Carr. Irapuato-León, 36821 Irapuato, Gto., México. Tel.: +52 462 6239 635. 2Departamento de Agrobiotecnología,

Escuela de Biotecnología y Alimentos, Tecnológico de Monterrey, Campus Monterrey, *E-mail: robert.winkler@ira.cinvestav.mx

El maíz (Zea mays L.) es considerado como la base de la alimentación de los países en desarrollo y junto con el trigo y el arroz, es uno de los cereales de mayor importancia a nivel mundial. Aparte de su papel clave en la nutrición, la demanda de maíz está incrementando por su uso en la producción de bioetanol. El maíz es el cultivo que ocupa la mayor superficie sembrada y su producción mundial supera actualmente las 800 millones de toneladas anuales. Las pérdidas poscosecha de cereales se presentan como pérdidas de peso, decremento en el valor alimenticio, reducción de la viabilidad de la semilla, pérdidas económicas, entre otras. Las plagas poscosecha son responsables de pérdidas de hasta el 40% en regiones tropicales y subtropicales, y en maíz susceptible se han reportado pérdidas de hasta el 60%, por lo que es necesario desarrollar estrategias para la eficiente y rápida

identificación de variedades de maíz resistente. El grano de maíz ha sido motivo de numerosos estudios debido a que representa la última barrera de defensa contra plagas y organismos patógenos (Fig. 1). Estudios actuales sugieren que las peroxidasas vegetales (PODs) están involucradas en diversos procesos fisiológicos, incluyendo la defensa contra patógenos e insectos. Sin embargo, no hay suficiente información sobre la identidad de estas proteínas en variedades de maíz resistente y susceptible a plagas. Nuestro objetivo consiste en determinar y evaluar los perfiles de peroxidasa activa en una colección de granos de maíz del CIMMYT resistente y susceptible a plagas de almacén, empleando un método de identificación eficiente basado en herramientas de proteómica, que permite reducir el enfoque a las proteínas relevantes activas.

Fig. 1 Composición estructural del grano de maíz maduro.

16. EVALUACIÓN DE FENOTIPOS METABÓLICOS DE CAFÉ (COFFEA SPP.), BASADOS EN PERFILES QUÍMICOS DE EXTRACTOS DE HOJAS

Josaphat Miguel Montero Vargas1, Eligio Galvez Ponce2, Christophe Montagnon2 y Robert

Winkler1*.

1CINVESTAV Unidad Guanajuato. Km. 9.6 Libramiento Norte Carr. Irapuato-León, 36821 Irapuato, Gto., México. Tel.: +52 462 6239 635. 2CIRAD-Bios / AMSA, UMR RPB Bosque de

Alisos 45A, Colonia Bosques de las Lomas, México DF, México. *E-mail: robert.winkler@ira.cinvestav.mx.

El cultivo de café es uno de los más importantes y apreciados a nivel mundial,

siendo México uno de los principales productores. Coffea arabica y Coffea canephora son las especies más importantes, con una producción del 70 y 30% respectivamente. El desarrollo de la planta de café tarda aproximadamente 3 años desde la germinación de la semilla hasta la producción del fruto, donde se obtienen los granos para la preparación de la bebida. La calidad del café es un parámetro complejo, asociado a diversos factores, entre ellos el perfil químico (cafeína, trigonelina, aminoácidos, entre otros). Estos compuestos están ampliamente estudiados en grano.

La espectrometría de masas nos permite obtener perfiles de compuestos presentes en extractos metanólicos obtenidos a partir de hojas de café. Así podemos determinar la variabilidad en cuanto a su composición química y realizar una clasificación por variedades después de una normalización y un “hierarchical clustering” de los datos. Dicha información nos permite además, la identificación de metabolitos relevantes. Aplicado a ensayos de descendencias diseñados para estudios genéticos, se podría estudiar la heredabilidad del contenido de estos metabolitos y sus correlaciones genéticas con compuestos del grano. Por lo tanto esta metodología puede acelerar drásticamente la selección de plantas en el mejoramiento de variedades de café gracias a una selección más precoz sobre caracteres de hojas desde la fase vivero.

Fig. 1 Clasificación de muestras de hojas de café, té rojo y té de mate de coca, basados en perfiles metabólicos obtenidos por espectrometría de masas.

17. PROTEOMIC ANALYSIS OF AMARANTH ROOTS UNDER NACL STRESS José Ángel Huerta Ocampo1, Hugo Sergio Aguilar Hernández1, Christian Salvador Mendoza

Hernández1, Eduardo Espitia Rangel2, Antonio De León Rodríguez1, Guillermo Mendoza Hernández3, Alberto Barrera Pacheco1,

Ana Paulina Barba de la Rosa1*.

1IPICYT, División de Biología Molecular, San Luis Potosí, México. 2INIFAP, Celaya, Guanajuato, 3Facultad de Medicina, UNAM, México, D.F., Mexico.

*Camino a la Presa San José #2055 Lomas 4ta, C.P. 78216. San Luis Potosí, S.L.P. México. (+52) 444 8342082. E-mail: apbarba@ipicyt.edu.mx

Introduction: Amaranth is a pseudocereal considered as drought and salt tolerant. It is also a highly nutritious and non-allergenic crop with remarkable nutraceutical properties (1). Salinity is one of the most severe abiotic stress factors that affects more than 800 million Ha of land worldwide (2). The aim of this work was to identify differentially expressed proteins in amaranth roots subjected to salt stress by a proteomic approach. Methods: Root soluble proteins (1.5 mg) were loaded on 24 cm Immobilized pH Gradient strips (pH4-7, linear). 2-DE gels were performed on amaranth root samples harvested from control plants and those subjected to 150 mM NaCl for 1 h, 1and 7d under hydroponic conditions. Gels were stained with Syrpo®Ruby and documented with Pharos FX Plus. Image analysis was performed with PDQuest v8.0. Mass spectrometry (LC/ESI-MS/MS) was carried out on differentially spots in a SYNAPT HDMS quadrupole/time-of-flight. Data interpretation and protein identification were performed using the MASCOT search algorithm. Identification was considered successful when a significant MASCOT score was obtained (p<0.01). Results: From more than 500 spots reproducibly detected among 2-DE gels, 101 were differentially expressed. So far 81spots have been analyzed and 60% of them have been successfully identified (P<0.01, FDR<10%) by searching against nrNCBI and Plants EST databases. Among the differential spots, 3 showing differential expression patterns were identified as cyclophilin. This protein is induced by salt stress among other abiotic stresses, and its absence turns plants hypersensitive to oxidative damage (3); but when over-expressed confers salt tolerance in rice (4). Proteins related to carbohydrate metabolism such as triosaphosphate isomerase and fructokinase were down regulated under salt stress. Conclusions: Potential candidate proteins for salt tolerance such as cyclophillins have been identified in amaranth. However further characterization is needed. Changes of the identified proteins as well as their implications will be discussed. References: [1] Huerta-Ocampo & Barba de la Rosa. 2011. Current Nutrition & Food Science. 7, 1-9. [2] Munns R. 2005. New Phytologist 167, 645-663. [3] Dominguez-Solis et al. 2008. PNAS 105, 16386-16391. [4] Ruan et al. 2011. BMC Plant Biology, 11:34.

18. IDENTIFICACIÓN DE BIOMARCADORES DE ADENOCARCINOMA PULMONAR EN EL PROTEOMA DE SALIVA (ESTUDIO PRELIMINAR)

José Guillermo Villagómez Olea, Dra. Gabriela E Mercado Celis

El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en la población

mundial. Cada año se diagnostican más de un millón de casos y cerca de 900,000 pacientes morirán durante el mismo periodo. El tabaquismo es el principal factor de riesgo y está asociado con el 90% de los casos. La sobrevida a cinco años es menor del 10% dependiendo del estadio de la enfermedad. Así, la sobrevida incrementa hasta un 70% en pacientes diagnosticados en etapas tempranas. El diagnostico temprano en este padecimiento se dificulta por la falta de sintomatología específica que indique el desarrollo de la patología y por falta de herramientas eficaces para su evaluación. Es en este contexto que se torna imprescindible contar con biomarcadores que permitan la detección temprana del adenocarcinoma pulmonar, lo cual con seguridad ayudará a disminuir la morbi-mortalidad y los gastos médicos relacionados con este padecimiento.

El biofluido por excelencia para la búsqueda de biomarcadores es el plasma, sin

embargo, se han evaluado otras alternativas, una de las más atractivas es la saliva. La saliva ofrece varias ventajas como biofluido, la recolección es no invasiva, segura, sencilla y los costos son menores. En un estudio preliminar (Figuras 1 y 2) en el que analizamos las proteínas totales contenidas en muestras de saliva de 6 pacientes fumadores con diagnóstico de adenocarcinoma pulmonar (FCC) y 6 fumadores sanos (FSC) (Edad 64.5 vs. 58.16 p=0.26, paquetes año 24.34 vs. 25.7 p=0.90), identificamos 20 áreas que contenían proteínas que solamente estuvieron presentes en los pacientes del grupo FCC. Después de hecho su análisis se identificaron 67 proteínas, 14 de las cuales no fueron redundantes. De estas últimas, una de ellas, caracterizada como la anexina A1, pudiese representar un buen ejemplo de biomarcador del adencarcinoma de pulmón. Esta conclusión es apoyada por dos estudios recientes. En el primero de ellos se realizó un análisis del suero de individuos sanos, con carcinoma de células no pequeñas de pulmón y con diferentes tipos de cáncer, con el objeto de identificar autoanticuerpos. El estudio reporto que el 60% de los pacientes con adenocarcinoma pulmonar y 33% con carcinoma epidermoide tenían autoanticuerpos para las formas glicosiladas de las Anexinas I y II (Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Aug 14; 98(17):9824-9). En el segundo estudio, también se buscaron autoanticuerpos en suero, pero en este caso la búsqueda se realizó por lo menos un año antes del diagnóstico de cáncer de pulmón, y nuevamente se encontraron anticuerpos dirigidos contra Anexina A1 (J Clin Oncol. 2008 Nov 1;26(31):5060-6).

Figura 1. Perfiles de Expresión diferencial entre fumadores (FSC) y fumadores con adenocarcinoma (FCC) de pulmón. Se identificaron 20 spots diferenciales.

Figura 2 Espectrometría de masas. El perfil de péptidos se obtuvo utilizando un MALDI 4800 plus (ABI). Los péptidos fueron utilizados para la búsqueda en bases de datos: 67 proteínas fueron identificadas 14 no redundantes.

19. CUANTIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DIFERENCIALES PRESENTES EN OVOCITOS EN METAFASE II DE MUJERES MENORES Y MAYORES A 35 AÑOS

Grisel Estrada-Manrique1, Eva Ramón-Gallegos1*, Israel Maldonado-Rosas2, Edgar

González-Tovar3, Abel Avilés4, Gabriela González-Agüero1, Nikola Batina5,Guillermo Mendoza-Hernández6

Lab. citopatología Ambiental, ENCB-IPN1, Lab. de FIV Inmater2, Lab. de FIV CEFAM3, Lab. de FIV IVI México4, Lab. de nanotecnología e ingeniería molecular-UAM iztapalapa5, Fac.

de Medicina, UNAM6. *Autor correspondiente: eramong@ipn.mx Hoy en día a nivel mundial recurrir a técnicas de reproducción asistida es cada vez más común, debido a que existen diversos factores sociales, fisio-patológicos o medio-ambientales que pueden afectar la fertilidad de las personas en edad reproductiva, añadiendo que las mujeres a partir de los 35 años sufren un declive en la calidad de sus óvulos limitándolas a lograr un embarazo exitoso. Una de las técnicas de inseminación in vitro de ovocitos más utilizadas en la reproducción asistida es la microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) ya que asegura la introducción mecánica del espermatozoide en el citoplasma del ovocito, pero en la práctica diaria en los laboratorios de reproducción aunque el espermatozoide haya sido puesto en contacto con el citoplasma ovocitario, el 20% de los ovocitos no llevan a cabo la activación de su citoplasma como parte del proceso de fertilización. Sin embargo, a pesar de haberse llevado algunos estudios proteómicos aún se desconocen los mecanismos por cuales algunos ovocitos humanos que se someten a un proceso de inseminación por ICSI no son activados y permanecen en metafase II (MII) disminuyendo así el número de ovocitos fertilizados. Por tales motivos en este trabajo se buscarán proteínas involucradas en el bloqueo del ovocito en MII que no permiten que se lleve a cabo la fertilización. Los ovocitos con fallo de ICSI fueron obtenidos de 3 clínicas de reproducción asistida bajo consentimiento informado de las pacientes. Dichos ovocitos detenidos en metafase II sin signos de fertilización (sin emisión del segundo cuerpo polar ni presencia de pronúcleos) fueron integrados en 3 grupos de estudio, dos fueron formados por ovocitos con fallo de ICSI provenientes de pacientes menores a 35 años y mayores a 35 años respectivamente, mientras que el grupo control fue formado por ovocitos sin inseminar provenientes de donadoras jóvenes menores a 30 años. Se extrajeron las proteínas de membrana y citoplasmáticas de los ovocitos MII por un método de lisis por agentes detergentes como lo menciona el manual de electroforesis 2D de GEhealthcare mas el inhibidor de proteasas ProteoBlock™. Se midió la concentración de proteínas por el método de Bradford. Estas proteínas se pasarán por el Kit 2D Clean-Up para concentrarlas y eliminar el exceso de sales y otros componentes del buffer de lisis. Se correrá una electroforesis bidimensional utilizando 15 µg de proteínas. La primera dimensión se correrá en tiras IPG de 13 cm con gradiente de pH de 3.0-10.0. La electroforesis por peso molecular se realizará en geles de poliacrilamida al 10%. El análisis de los geles 2D se realizará con el sistema ImageQuant LAS 4000 y posteriormente se realizará la identificación de proteínas diferenciales por el método de LC/MS. Este proyecto está aprobado por la comisión de Bioética de la ENCB,

IPN. Hasta el momento se han obtenido 94 ovocitos MII. Se probaron diferentes formas de conservación y cuidados de los ovocitos durante el transporte para conservar las proteínas. Hasta el momento se tiene que la concentración de proteínas en ovocitos de mujeres menores a 35 años es de 0.777 µg/µL mientras que para los de mujeres mayores a 35 años es de 0.753 µg/µL y para ovocitos control es de 0.714 µg/µL. Debido a la baja concentración de proteínas se utilizará el colorante fluorescente Deep-purple en lugar de la tinción con azul de Coomassie ya que es un método más sensible.

20. UNA INUSUAL MODIFICACIÓN EN TVEIF-5A MEDIANTE LA ACTIVIDAD DE UNA DEOXIHIPUSINA SINTASA DE TRICHOMONAS VAGINALIS

Laura Itzel Quintas-Granados1, Bertha Isabel Carvajal Gamez1; Rossana Arroyo2, Jaime

Ortega López3; M. Elizbeth Álvarez-Sánchez*1.

1Posgrado en Ciencias Genómicas, Universidad Autónoma de la Ciudad de México, México; 2Departamento de Infectómica y Patogénesis Molecular, y 3Departamento de

Biotecnología y Bioingeniería, CINVESTAV-IPN, México. *Autor corresponsal

San Lorenzo #290, Col. Del Valle, CP 03100. México D.F., México. Teléfono: +52 36912000 x 15306. Fax: +52 55755805

email: elizbethalvarezsanchez@yahoo.com.mx Proyectos ICyTDF (PIFUTP08-150) y CONACyT (83808)

El parásito T. vaginalis expresa un factor de inicio de la traducción 5A (TveIF-5A) el cual requiere de una modificación postraduccional específica denominada hipusinación, que consiste en el cambio de un residuo de lisina por uno de hipusina. La enzima que cataliza esta inusual modificación es la deoxihipusina sintasa. El objetivo de este trabajo fue purificar a la deoxihipusina sintasa de T. vaginalis (TvDHS) y determinar su actividad enzimática sobre TveIF-5A precursora. Metodología. La purificación de TvDHS se realizó mediante cromatografía de afinidad seguida de una exclusión molecular. La actividad de TvDHS se determinó mediante un ensayo enzimático utilizando a TveIF-5A precursora, en presencia de NAD y espermidina. Posteriormente, las isoformas hipusinada y no hipusinada de TveIF-5A se separaron por cromatografía de intercambio iónico. Mediante mapeo peptídico y ESI/MS/MS identificamos el cambio del residuo de lisina por el de hipusina en TveIF-5A. Adicionalmente, la actividad de TveIF-5A hipusinada se determinó mediante ensayos de interacción al elemento de respuesta a eIF-5A (ERE) del 3’UTR del RNAm de cox-2. Resultados. La hipusinación in vitro de TveIF-5A mediante TvDHS generó dos isoformas (una hipusinada y otra no hipusinada) con diferentes puntos isoeléctricos (5.26 y 5.46), las cuales fueron separadas mediante cromatografía de intercambio iónico. Estas isoformas presentaron un patrón peptídico diferente, debido al cambio del residuo de lisina por el de hipusina. Estos resultados fueron corroborados mediante ESI/MS/MS identificando al residuo de hipusina. Solamente la TveIF-5A hipusinada fue capaz de unirse a la estructura ERE del 3’UTR de cox-2. Conclusión. T. vaginalis posee una enzima deoxihipusina sintasa capaz de hipusinar a TveIF-5A que entonces es capaz de unirse a estructuras ERE. Este proyecto fue financiado por el CONACyT (83808) y por el ICyTDF (PIFUTP08-150).

21. ANÁLISIS PROTEÓMICO DE TROFOZOÍTOS DE ENTAMOEBA HISTOLYTICA QUE SOBRE-EXPRESAN A LA PROTEÍNA EHMYB10.

Elisa Azuaraa, Carlos Alberto Galiciaa, Laura Vázqueza, Helios Cárdenas, Guillermina Garcíac, Abigail Betanzosc, Esther Orozcob,c y Elizbeth Alvareza.

aPosgrado en Ciencias Genómicas, Universidad Autónoma de la Ciudad de México; bRectoría, Universidad Autónoma de la Ciudad de México; cDepartamento de Infectómica y Patogénesis Molecular, Cinvestav-IPN. E. histolytica es el protozoario intestinal causante de la amibiasis. La capacidad de este organismo para invadir el colon y persistir, a pesar de la respuesta inmune del hospedero, depende de la expresión diferencial de sus factores de virulencia. En este contexto, uno de los puntos de control más importantes es la síntesis diferencial de mensajeros, por lo que el estudio de los factores de transcripción involucrados en esta compleja red de regulación, nos ayudará a entender los mecanismos moleculares responsables de la virulencia de este parásito. EhMyb10 es un factor transcripcional, el cual se sobre-expresa durante la invasión y colonización intestinal. Esta proteína reconoce una secuencia de DNA canónica C/TAACG/TG. Con la finalidad de encontrar los posibles genes blanco de EhMyb10 nos planteamos la idea de sobre-expresarla en trofozoítos de E. histolytica y realizar un estudio proteómico para comparar los perfiles de las células transfectantes respecto a la condición control. De las proteínas identificadas con expresión diferencial analizaremos los promotores de los genes que las codifican con la idea de encontrar las secuencias de reconocimiento. Previo al análisis proteómico se realizaron ensayos funcionales por qRT-PCR para corroborar la sobreexpresión del gen ehmyb10. Así mismo, por medio de ensayos EMSA también observamos que los complejos DNA-proteína se enriquecieron en las células transfectantes. Finalmente, estas células produjeron un mayor efecto citopático así como un aumento en los abscesos hepáticos en un modelo de hámster. Este estudio mostró diferencias entre los perfiles proteómicos de las células que sobreexpresan a EhMyb10 con respecto a las células transfectadas con el vector vacío. De las proteínas expresadas diferencialmente elegimos dos grupos de proteínas uno cuyo peso molecular varía de 100 a 150 kDa, y otro cuyo peso molecular varía de 20 a 25 kDa. La identidad de estas proteínas está siendo investigada mediante espectrometría de masas (LC/MS/MS). Proyecto apoyado por CONACYT (CB-2007-01-79293), UACM PI2010-17 y PIFUTP09-269.

22. THE IBT-UNAM´S PROTEOMICS CORE FACILITY: SEVEN YEARS WORKING FOR THE MEXICAN SCIENTIFIC COMMUNITY

Cesar V. Batista

1Laboratorio Universitario de Proteómica, IBT-UNAM Av. Universidad, 2001, Col. Chamilpa, CP

62210, Cuernavaca, Mor., Mexico.

The main goal of the proteomics laboratory of IBT-UNAM is to provide state of the art mass spectrometry-based proteomic services for the entire Mexican scientific community. Here we show statistical data referring to the main user institutions, the amount of analysis carried out during the last seven years, the different types of analyses performed, how critical the quality of the sample is for successful analysis, crucial technical factors responsible for bad results, the analytical capabilities and limitations of our analytical platform and a comparison between our services and services provided by reference laboratories at an international level. Mass spectrometry-based proteomic services in the biomedical and chemistry fields are basically dependent on the analytical platform, quality of the sample and which analytical protocol is chosen and implemented. Types of services can be classified as high, intermediary or low risk, depending on the analytical question that needs to be answered. Services most requested by the users include: determination of the molecular mass of proteins and peptides; identification of known proteins by LC-MS/MS; identification of complex mixtures of proteins; de novo sequencing of peptides; partial de novo sequencing of one gel spot protein; identification of complex mixtures from unknown proteins by de novo sequencing; general determination of posttranslational modifications; relative quantification of the differential expression of known proteins; phosphoproteome analysis and relative quantification of phosphoproteome from unknown proteins. Taking into account that the majority of the sample processing protocols are finely optimized, unsuccessful analysis corresponds to only 10% of all services provided each year. However, it is important to point out that more than 90% of unsuccessful analyses are due to poor quality samples and these include samples that are in non-homogenous form, high contamination with human keratin and/or albumin; reduced sample quantities and frequent use of erroneous protocols for purification/enrichment of proteins, as well as a lack of scientific criteria for handling samples. Errors also occur during sample processing and mass spectrometric analysis, as the addition of excessive amounts of endoproteases caused by undefined quantities of sample, which commonly produce MS ion suppression. Other problems include C18 desalting tips which have manufacturing defects, disconnection of cables by maintenance and cleaning personnel, the clogging of capillary columns and poor optimization of the nano-electrospray ionization source. The services most requested in our facility are protein identification and the de novo sequencing of peptides and proteins. The proteomics laboratory of IBT-UNAM has a prestigious national reputation due to the accuracy and precision of the de novo analysis, obtained by the high-resolution instruments available and the highly qualified personnel. The Proteomics laboratory of IBT-UNAM is an accessible facility, designed to help the entire Mexican scientific community.

PARTICIPANTS MAILING LIST Ma. Elizbeth Alvarez Sánchez

CG, UACM, México. elizbethalvarezsanchez@yahoo.com.mx

Javier Ambrosio

Facultad de Medicina, UNAM, México jrah@unam.mx

Antonio Humberto Angel Ambrocio

INSP, Cuernavaca, Mor., México angeluu@gmail.com

Rossana Arroyo

CINVESTAV-IPN, México rarroyo@cinvestav.com

Sarah M. Assmann

Penn State University. USA sma3@psu.edu

Eliza Azuara Liceaga

UACM, México azuara@uacm.edu.mx

Ana Paulina Barba de la Rosa

IPICyT, San Luis Potosí, S.L.P., Mexico. apbarba@ipicyt.edu.mx

Bronwyn Barkla

IBT-UNAM, Cuernavaca, Mor, México. bronwyn@ibt.unam.mx

Cesar V. Batista IBT-UNAM, Cuernavaca, Mor, México

Arturo Becerra Bracho

Facultad de Ciencias, UNAM, México abb@ciencias.unam.mx

Maria Ofelia Benítez Boijseauneau

INSP, Cuernavaca, Mor., México obenitez@insp.mx

Andrea Bedoya López IIB-UNAM, México

Alma Burlingame

UCSF, San Francisco, CA, USA alb@cgl.ucsf.edu

Ma. De los Angeles Cansino Rodezno

IIB-UNAM, México angelescancino@gmail.com

Maria Catalina Cárdenas Ascensión

IIB-UNAM, México catycardenas@hotmail.com

Rosa Elena Cárdenas Guerra CINVESTAV-IPN,México DF

janeiro2606@yahoo.com.mx

Febe Elena Cazares Raga CINVESTAV-Zacatenco, IPN, México

fcazares@cinvestav.mx

Gerardo Corzo IBT, UNAM, Cuernavaca Mor., México.

corzo@ibt.unam.mx

Areli Cruz Castañeda CG, UACM, México,

arichiquilla@gmail.com

Luis Alberto de Luna Valdez IBT, UNAM, Cuernavaca Mor., México.

ldeluna@ibt.unam.mx

David Salomòn Dozal Domínguez INNSZ, UNAM, México

david_dozal@hotmail.com

Grisel Estrada Manrique CINVESTAV-Zacatenco, IPN, México

grypez30@yahoo.com.mx

Miguel Angel Fonseca Sanchez UACM, México

mfonseca_79@hotmail.com

Norma Angelica Galicia Canales PCB-UNAM, México, DF

normagalicia@gmail.com

Homer Alfredo Gamboa Romero BIRMEX, SA de CV, México, DF. h_alf_gamboa@yahoo.com.mx

Violeta García

UAQ, Queretaro, México leitovagriaca@hotmail.com

Maria Fernanda Gomez Mendez

IBT-UNAM, Cuernavaca, Mor., México mfegoz@gmail.com

Mireya Gonzalez-Begné

University of Rochester, NY, USA Mireya_Gonzalez@urmc.rochester.edu

Luis E. Gonzalez de la Vara

CINVESTAV-Irapuato IPN, Irapuato, Gto. lgonzale@ira.cinvestav.mx

Angel Arturo Guevara-García

IBT-UNAM, Cuernavaca, Mor, México aguevara@ibt.unam.mx

Rosa Maria Gutiérrez

IBT-UNAM, Cuernavaca, Mor, México rmariab001@gmail.com

Juan Manuel Guzmán Flores

U de G, León. Guanajuato, México manuguz@yahoo.com.mx

Lorena Hernández

IBT-UNAM, Cuernavaca Mor., México.

Victor Manuel Higareda Alvear UAEM, Cuernavaca, Mor., México.

mercurio287@hotmail.com

Richard Kuhn(C) Purdue University, IL, USA

kuhn@purdue.edu

Humberto Lanz Mendoza INSP, Cuernavaca, Mor., México

humberto@insp.mx

Gloria León Avila ENCB, IPN, México

leonavila60@yahoo.com.mx

Janet Ana Isabel López Arcienega ENCB-IPN, México, DF.

jalopez@ira.cinvestav.mx

Mario Cesar López Camarillo CG, UACM, México.

genomicas@yahoo.com.mx

Zarina López Villavicencio Cryopharma, Guadalajara, Jal., México

investigacion-biotecnologia@grupoifaco.com

Sandra Martínez Jarquín

CINVESTAV-Irapuato, Gto., México smartinez@ira.cinvestav.mx

Luis Mendoza

IIB, UNAM, México lmendoza@biomedicas.unam.mx

Erika Meneses

IBT-UNAM, Cuernavaca, Mor, México

María Cristina Miranda Vergara UPAP, Puebla, México

Marychrism@gmail.com

Josephat Miguel Montero Vargas CINVESTAV-Guanajuato., México

jmontero@ira.cinvestav.mx

Delia Angelica Narvaez Barragán IBT-UNAM, Cuernavaca Mor., México.

liadecita@gmail.com

María Fernanda Nava Ocampo UNAM, México, DF

mfernanda.nava@gmail.com

Carlos Ortega ENCB- IPN, México, DF

cr_ortega_s@yahoo.com

María del Carmen Palacios Reyes IMSS-IPN, México, DF. cyapalacios@gmail.com

Rosa Victoria Pando Robles

INSP, Cuernavaca, Mor., México victoria.pando@insp.mx

Vladimir Paredes Cervantes

IPN, INSP, IMSS CMN, México D vlapace@hotmail.com

Victoriano Pérez Vázquez

U de G, León, Guanajuato, México vicpe@yahoo.com

Francisco Javier Pérez Flores

IQ-UNAM, México, DF. jape@unam.mx

Genaro Pimienta Rosales

Yale University, New Haven, CT, USA rosales@yale.edu

Augusto César Poot Hernandez IBT, UNAM., Cuernavaca, México

dragopoot@gmail.com

Laura Itzel Quintas Granados UACM, México, DF.

litquingra@yahoo.com

Lucero de los Angeles Ramon Luing PCG-UNAM, México DF.

ramonluing@yahoo.com.mx

Osbaldo Resendis-Antonio CCG, UNAM, Cuernavaca, Mor., México

resendis@ccg.unam.mx.

J. Francisco Reta Mares LABORATORIOS y REACTIVOS de México

fretam@birmex.gob.mx

Myriam G. Rodriguez Gandarilla IBT-UNAM, Cuernavaca, Mor. México

myrirod@hotmail.com

Romina Rodríguez Sanoja IIB, UNAM. FQ, UNAM, México, D.F.

romina@biomedicas.unam.mx

Alma Gabriela Reyes González UASLP, San Luis Potosí, S.L.P, México

gaby_reyes@live.com.mx

Emmanuel Ríos Castro IBT-UNAM, Cuernavaca, Mor., Mexico.

eriosc@ibt.unam.mx

Ma. Isabel Salazar Sánchez ENCB-Zacatenco, IPN, México

isalazarsan@yahoo.com

Jorge Isidoro Sotelo Cano UAG, Petaquillas, Guerreo, México jorge_sotelocqb@yahoo.com.mx

Jay Thelen

University of Missouri-Columbia, USA thelenj@missouri.edu

Patricia Talamás Rohana CINVESTAV-Zacatenco, IPN, México

ptr@cinvestav.mx

Ángel Tello INSP, Cuernavaca, Mor., México

attello@insp.mx

Angelica Torres Arroyo INP, México

angelli_sky@hotmail.com

Adriana Valdez IIB-UNAM, México

adrivaldez1@gmail.com

Fernando Vargas Romero CG, UACM, México

vfernandor@hotmail.com

Laura Vazquez UACM, México, DF

laurav1231@yahoo.com.mx

Luis Velasco Ibarra IQ-UNAM, México, DF.

luisveliba@hotmail.com

Rosario Vera Estrella IBT-UNAM, Cuernavaca, Mor., México

rosario@ibt.unam.mx

José Guillermo Villagómez Olea INMEGEN, México, DF.

Rosa Viner

Falcon-Thermo Scientific

Robert Winkler CINVESTAV- Irapuato, Gto., México

robert.winkler@ira.cinvestav.mx