ISSN 0394 3291 Caleidoscopio - Medical Systems SpA · Maria Gabriella Mazzarello, Rinaldo Brunetti,...

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Principali Tecniche Analitiche in usonei Laboratori di Analisi Chimico

Cliniche e Microbiologiche

Direttore ResponsabileSergio Rassu

CaleidoscopioItal iano

... il futuro ha il cuore antico MEDICAL SYSTEMS SpA

Maria Gabriella Mazzarello, Rinaldo Brunetti,Mascja Perfumo, Angelo Michele Torriglia,

Giancarlo Montresor

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Principali Tecniche Analitiche in usonei Laboratori di Analisi Chimico

Cliniche e MicrobiologicheDirettore ResponsabileSergio Rassu

CaleidoscopioItal iano


Maria Gabriella Mazzarello, Rinaldo Brunetti,Mascja Perfumo, Angelo Michele Torriglia,

Giancarlo Montresor

Laboratorio Analisi Chimico Cliniche e Microbiologiche ASL 22, P.O. Ovada (AL)

ISTRUZIONI PER GLI AUTORI

INFORMAZIONI GENERALI. Caleidoscopio pubblica lavori di carattere monografico a scopo didattico su temi di Medicina.La rivista segue i requisiti consigliati dall’International Committee of Medical Journal Editors. Gli Autori vengono invi-tati dal Direttore Responsabile. La rivista pubblica anche monografie libere, proposte direttamente dagli Autori, redattesecondo le regole della Collana.

TESTO. La monografia deve essere articolata in paragrafi snelli, di rapida consultazione, completi e chiari. I contenutiriportati devono essere stati sufficientemente confermati. E’ opportuno evitare di riportare proprie opinioni dando unquadro limitato delle problematiche. La lunghezza del testo può variare dalle 60 alle 70 cartelle dattiloscritte ovvero 100-130.000 caratteri (spazi inclusi). Si invita a dattilografare su una sola facciata del foglio formato A4 con margini di alme-no 25 mm. Usare dovunque doppi spazi e numerare consecutivamente. Ogni sezione dovrebbe iniziare con una nuovapagina.

FRONTESPIZIO. Deve riportare il nome e cognome dell’Autore(i) -non più di cinque- il titolo del volume, conciso ma infor-mativo, la Clinica o Istituto cui dovrebbe essere attribuito il lavoro, l’indirizzo, il nome e l’indirizzo dell’Autore (com-preso telefono, fax ed indirizzo di E-mail) responsabile della corrispondenza.

BIBLIOGRAFIA. Deve essere scritta su fogli a parte secondo ordine alfabetico seguendo le abbreviazioni per le Rivistedell’Index Medicus e lo stile illustrato negli esempi:

1) Björklund B., Björklund V.: Proliferation marker concept with TPS as a model. A preliminary report. J. Nucl. Med.Allied. Sci 1990 Oct-Dec, VOL: 34 (4 Suppl), P: 203.

2 Jeffcoate S.L. e Hutchinson J.S.M. (Eds): The Endocrine Hypothalamus. London. Academic Press, 1978. Le citazioni bibliografiche vanno individuate nel testo, nelle tabelle e nelle legende con numeri arabi tra parentesi. TABELLE E FIGURE. Si consiglia una ricca documentazione iconografica (in bianco e nero eccetto casi particolare da con-

cordare). Figure e tabelle devono essere numerate consecutivamente (secondo l’ordine di citazione nel testo) e separata-mente; sul retro delle figure deve essere indicato l’orientamento, il nome dell’Autore ed il numero. Le figure realizzate pro-fessionalmente; è inaccettabile la riproduzione di caratteri scritti a mano libera. Lettere, numeri e simboli dovrebberoessere chiari ovunque e di dimensioni tali che, se ridotti, risultino ancora leggibili. Le fotografie devono essere stampe luci-de, di buona qualità. Gli Autori sono responsabili di quanto riportato nel lavoro e dell’autorizzazione alla pubblicazio-ne di figure o altro. Titoli e spiegazioni dettagliate appartengono alle legende, non alle figure stesse. Su fogli a parte devo-no essere riportate le legende per le figure e le tabelle.

UNITÀ DI MISURA. Per le unità di misura utilizzare il sistema metrico decimale o loro multipli e nei terminidell’International system of units (SI).

ABBREVIAZIONI. Utilizzare solo abbreviazioni standard. Il termine completo dovrebbe precedere nel testo la sua abbre-viazione, a meno che non sia un’unità di misura standard.

PRESENTAZIONE DELLAMONOGRAFIA. Riporre il dattiloscritto, le fotografie, una copia del testo in formato .doc oppure .rtf,ed copia di grafici e figure in formato Tiff con una risoluzione di almeno 240 dpi, archiviati su CD in buste separate.

Il dattiloscritto originale, le figure, le tabelle, il dischetto, posti in busta di carta pesante, devono essere spediti alDirettore Responsabile con lettera di accompagnamento. L’autore dovrebbe conservare una copia a proprio uso. Dopo lavalutazione espressa dal Direttore Responsabile, la decisione sulla eventuale accettazione del lavoro sarà tempestiva-mente comunicata all’Autore. Il Direttore responsabile deciderà sul tempo della pubblicazione e conserverà il dirittousuale di modificare lo stile del contributo; più importanti modifiche verranno eventualmente fatte in accordo conl’Autore. I manoscritti e le fotografie se non pubblicati non si restituiscono.

L’Autore riceverà le bozze di stampa per la correzione e sarà Sua cura restituirle al Direttore Responsabile entro cinquegiorni, dopo averne fatto fotocopia. Le spese di stampa, ristampa e distribuzione sono a totale carico della MedicalSystems che provvederà a spedire all’Autore cinquanta copie della monografia. Inoltre l’Autore avrà l’opportunità di pre-sentare la monografia nella propria città o in altra sede nel corso di una serata speciale.

L’Autore della monografia cede tutti i pieni ed esclusivi diritti sulla Sua opera, così come previsti dagli artt. 12 e segg.capo III sez. I L. 22/4/1941 N. 633, alla Rivista Caleidoscopio rinunciando agli stessi diritti d’autore (ed acconsentendo-ne il trasferimento ex art. 132 L. 633/41).

Tutta la corrispondenza deve essere indirizzata al seguente indirizzo:

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Introduzione

Il XX secolo testimonia la nascita e lo sviluppo della chimica clinica comemetodologia diagnostica e di prevenzione negli Ospedali (55). Nei secoli pre-cedenti i Clinici erano in genere indifferenti all'idea che la chimica potesseessere applicata allo studio funzionale in vivo, alla predizione delle malattie ocomunque al di fuori delle osservazioni post-mortem (16,17,18). Fisiologi eChimici come Fourcroy (1755-1809), Berzelius (1779-1848), Liebig (1803-1873), Prout (1785-1850), Rees (1813-1889) iniziarono a considerare i processifisiologici dell'organismo con le leggi note della chimica e della fisica arrivan-do a correlare gli stati patologici con anomalie nelle reazioni osservabili neicampioni biologici (36,42). Solo successivamente Folin (1867-1934) e VanSlyke (1883-1971) introdussero definitivamente l'analisi chimica diLaboratorio come servizio diagnostico indispensabile per la clinica ospedalie-ra (38). Ancora a cavallo tra il XIX e il XX secolo Robert Koch identificò il bat-terio responsabile del carbonchio nel 1877 e stilò alcuni postulati ancora oggiutilizzati nell'eziologia delle malattie infettive: nacque così la Microbiologiacome scienza. Con la scoperta degli anticorpi (Von Berhing-Kitasato,1890),dei virus (Beijerinck, 1889), della penicillina (Fleming, 1929), dei primi meto-di di coltura, delle colorazioni, anche le tecniche di diagnostica microbiologi-ca furono introdotte come supporto alla clinica ospedaliera (31,60).

Nel 1944 O. Avery identificò il DNA la cui struttura venne descritta per laprima volta da Watson e Crick nel 1953 (58). Con la messa a punto da partedi Mullins nel 1983 della Polimerase Chain Reaction (PCR) (32) la diagnosti-ca ospedaliera subì una svolta con l'introduzione delle tecniche di biologiamolecolare.

Attualmete le tecniche di Laboratorio si avvalgono delle più svariate pro-prietà chimiche, fisiche e sono state sviluppate a scopo diagnostico presen-tando caratteristiche di specificità e sensibilità. Esse vengono utilizzate nel-l'ambito della fisiologia, della patologia umana, animale e vegetale, nell'ana-lisi ambientale, delle acque e degli alimenti per citarne solo alcuni. In campoclinico tali metodiche vengono utilizzate sia a scopo qualitativo che quanti-tativo soprattutto per la determinazione di microrganismi patogeni o mole-cole come ormoni, proteine, oncoproteine, anticorpi, citochine e marcatori didanno d'organo (26).

Esistono diverse tipologie di analisi la cui scelta dipende dalle caratteri-stiche sia dell'oggetto della procedura analitica cioè il campione che dallecaratteristiche dell'analita, la molecola d'interesse nella determinazioneall'interno del campione che può essere naturale e presente in situazioni nor-

M.G. Mazzarello, R. Brunetti, M. Perfumo,A.M. Torriglia, G. Montresor

Principali Tecniche Analitiche in uso nei Laboratoridi Analisi Chimico Cliniche e Microbiologiche

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mali (es. TSH), in situazioni patologiche (es. HIV Ab), o costituito da sostan-ze artificiali quali ad esempio farmaci, droghe d'abuso ed ormoni.

Il limite di rivelabilità è la minima quantità di analita determinabile permezzo di una tecnica analitica.

La sensibilità è la variazione di quantità di analita apprezzabile in funzio-ne della tecnica impiegata.

Scelta delle tecnologie

La metodica che viene scelta in ambito ospedaliero per effettuare unadeterminata analisi si basa sulle caratteristiche analitiche del sistema, sugliaspetti organizzativi ed economici; il risultato è in genere un compromesso.

La scelta viene effettuata dopo un accurato esame dei seguenti parametri:- Linee guida-prestazioni analitiche: CLSI (The Clinical and Laboratory

Standards Institute): documenti EP5, EP6, EP7, EP9, EP10- Caratteristiche del sistema: es. Modello di Stockmann- Un protocollo di sperimentazione - La disponibilità di campioni adeguati (livelli di analita, interferenti)- Applicazione di metodi statistici per l'elaborazione dei dati- Capitolato adeguato.

Modello di Stockmann

Prende in considerazione tutti gli attributi funzionali ed organizzativi cheinfluenzano o caratterizzano l'uso di un sistema analitico. Si tratta di 200parametri, suddivisi in 14 gruppi, ripartiti in 4 capitoli:

o INSTALLAZIONE o ORGANIZZAZIONE DEL LAVOROo ASSICURAZIONE DI QUALITA' o MISCELLANEA (manutenzione, troubleshooting)



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Microscopia

Storia

Il microscopio semplice più antico era costituito soltanto da un tubo conuna piastra per l'oggetto da osservare ad un'estremità e, dall'altra, da unalente “obiettivo”. Esso veniva usato per l'osservazione di piccoli esseri viven-ti come ad esempio le pulci.

Circa nel 1590, gli olandesi Zaccharias e Hans Janssen, sperimentaronoche più lenti montate in un singolo tubo permettevano un maggior ingran-dimento e costruirono il precursore del microscopio composto. Nel 1609Galileo studiò i principi del funzionamento delle lenti e costruì uno stru-mento di maggior qualità dotato di un dispositivo di focalizzazione.

Padre vero e proprio della microscopia è considerato l'olandese AntonVan Leeuwenhoek (1632-1723) il quale inventò nuovi metodi per la molatu-ra e la lucidatura delle lenti che gli consentì la costruzione di microscopi coningrandimenti fino a 270 diametri. Fu il primo ad osservare e descrivere i bat-teri, i lieviti, gli elementi del sangue (5,21,47).

Nel XVIII secolo innovazioni tecniche basate sullo studio delle lentimigliorarono la visibilità e la risoluzione in microscopia. Vengono in seguitosviluppati nuovi tipi di microscopio: l'ultramicroscopio nel 1902 (67), ilmicroscopio a contrasto di fase per osservare materiali biologici incolori nel1942 (66), il microscopio elettronico nel 1931 (43) ed il microscopio a scansio-ne nel 1981 (4).

Funzionamento e tipologie dei microscopi

Il microscopio è uno strumento capace di fornire un'immagine ingrandi-ta di un piccolo oggetto osservato attraverso di esso. seconda della radiazio-ne utilizzata per illuminare il campione si distinguono due tipi principali dimicroscopio, quello ottico e quello elettronico: nel primo si impiega radia-zione visibile (luce), nel secondo un fascio di elettroni accelerati.

I principali parametri che caratterizzano un microscopio sono il potere diingrandimento ed il potere di risoluzione. Il primo è definito come il rappor-to tra la dimensione dell'immagine ingrandita e quella dell'oggetto osserva-to. Il secondo è il reciproco della distanza minima tra due punti del campio-



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ne che lo strumento è in grado di far apparire come distinti. Tale distanza,secondo la formula empirica di Ernst Abbe, è data dal prodotto di unacostante opportuna per la lunghezza d'onda della radiazione utilizzata.Quindi, per avere una risoluzione migliore è necessario impiegare radiazio-ne con lunghezza d'onda piccola; in realtà, esiste un limite intrinseco al pote-re di risoluzione di un microscopio. Tale limite è posto dal fenomeno delladiffrazione che rende impossibile percepire distintamente un oggetto didimensioni paragonabili a quelle della lunghezza d'onda della radiazioneimpiegata.

Si ricorda che anche per il microscopio elettronico si può parlare di lun-ghezza d'onda, in quanto, in accordo con i principi della meccanica ondula-toria, un fascio di particelle può essere visto come radiazione corpuscolare dilunghezza d'onda pari al rapporto tra la costante di Planck h e la quantità dimoto p della particella (γ = h/p). È proprio per migliorare il potere di risolu-zione che è stato ideato il principio della microscopia elettronica e, più tardi,il metodo della scansione, applicato sia alla microscopia elettronica che aquella ottica.

Microscopio ottico

Il nome completo del microscopio ottico è “microscopio ottico composto”(MOC), denominazione che permette di distinguerlo dal cosiddetto microsco-pio semplice, lo strumento ottico meglio noto come lente di ingrandimento.

Nella sua forma più essenziale, il microscopio composto è costituito dauna combinazione di due lenti convergenti, l'obiettivo e l'oculare, montate adistanza fissa alle estremità di un tubo chiuso. L'obiettivo raccoglie la luceproveniente dal campione e ne fornisce un'immagine reale, capovolta eingrandita; l'oculare riceve questa immagine nel proprio fuoco e la trasformanell'immagine finale, che è virtuale, capovolta e ingrandita rispetto all'im-magine reale. L'attrezzatura accessoria di un microscopio comprende inoltreil piano portacampioni e alcuni dispositivi di regolazione della distanza del-l'obiettivo dall'oggetto, per la messa a fuoco. In genere il campione da osser-vare viene posto fra due vetrini sottili e fissato al portacampioni. La luce chelo illumina può provenire da una sorgente diretta o da uno specchio che laindirizza sul campione. I modelli più sofisticati sono provvisti inoltre di unsistema di viti micrometriche per la regolazione fine della posizione del cam-pione e di tre o più obiettivi montati su una testa girevole, che consentono divariare rapidamente il potere di ingrandimento dello strumento.

Esistono diversi sistemi di illuminazione del campione, a seconda dellesue caratteristiche di trasparenza o opacità. I sistemi più utilizzati sono quel-lo a trasmissione o a campo chiaro e a diffusione o a campo scuro. Nel primo

caso, la luce proveniente da una lampada a incandescenza attraversa com-pletamente il campione. Nel caso del sistema a campo scuro la luce colpisceil campione e ne viene diffusa, più precisamente, il fascio incide sul prepara-to lungo una direzione quasi perpendicolare all'asse dello strumento, per cuil'obiettivo raccoglie solo la luce diffratta dal campione. Il risultato è che leparti libere del campione appaiono come un fondo scuro su cui risaltano iparticolari in esame. La tecnica è particolarmente utile per l'osservazione dicampioni biologici limpidi e trasparenti, e per oggetti talmente piccoli darisultare invisibili con il sistema di illuminazione normale (7).

Il potere di ingrandimento di un microscopio ottico è dato dal prodotto diquello dell'obiettivo per quello dell'oculare. I modelli più sofisticati sono ingrado di ingrandire l'immagine del campione fino a circa 1000 volte (1000x).Il potere di risoluzione, invece, è limitato dal fenomeno della diffrazione edipende dalla lunghezza d'onda della radiazione impiegata; per la luce bian-ca, la minima distanza percettibile è di 0,2 micron (0,2 millesimi di millime-tro), che equivale a un potere risolutivo 1000 volte migliore di quello dell'oc-chio umano.

La più alta risoluzione per un microscopio ottico è stata raggiunta da ungruppo di ricercatori statunitensi che hanno perfezionato una tecnica notacome “microscopia Raman a campo vicino”. La tecnica, applicata a campio-ni di nanotubi di carbonio, ha reso possibile l'osservazione di strutture delledimensioni di 30 nanometri. La tecnologia Raman consiste essenzialmentenell'inviare sul campione luce laser e nell'osservare come questo la defletta,misurando i modi vibrazionali delle molecole analizzate; per focalizzare ilfascio laser, in questo caso la luce è stata inviata sulla punta di un cavo d'ar-gento di 10 nanometri, quindi utilizzata per esplorare il vetrino a 1 nanome-tro di distanza dalla sua superficie.

Il microscopio stereoscopico è costituito da due microscopi a basso pote-re di ingrandimento, affiancati e puntati sullo stesso campione. Con questoimpianto, sebbene l'ingrandimento non superi le 100 volte, è possibile otte-nere immagini tridimensionali.

Il microscopio a ultravioletti utilizza radiazione con lunghezza d'ondaminore della luce visibile, cioè luce ultravioletta. L'accorgimento produce unaumento del potere di risoluzione, ma impone alcune modifiche: poiché ilvetro non è trasparente agli ultravioletti, gli elementi ottici devono essere rea-lizzati con altri materiali, quali quarzo, fluorite o specchi alluminizzati.Essendo gli ultravioletti invisibili all'occhio umano, inoltre, per essere visualiz-zata, l'immagine deve essere resa per fosforescenza o per scansione elettronica.

Il microscopio polarizzatore emette un fascio di luce che attraversa ilcorpo del preparato in modo da far visualizzare l'immagine in luce polariz-zata. La microscopia in luce polarizzata è formata da onde ciascuna delle



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quali oscilla in un piano, detto piano di vibrazione o piano di polarizzazioneche è perpendicolare alla direzione di propagazione dell'onda stessa.

Il microscopio a raggi X è basato sull'emissione di radiazioni a raggi X.Viene utilizzato per studiare le strutture di particolari molecole o ioni pre-senti all'interno della cellula. Quando i raggi emessi attraversano le strutturecellulari subiscono delle diffrazioni che verranno impressionate su una lastrafotografica, apparendo come delle sfocate bande concentriche. Dalla diffe-rente disposizione di tali bande si potrà determinare la distribuzione atomi-ca delle molecole all'interno dei tessuti analizzati.

Il microscopio a contrasto di fase è un tipo particolare di microscopio cheanalogamente al microscopio luce emana radiazioni luminose. La maggiorparte di componenti cellulari è trasparente alla luce visibile, anche a causadell'elevata presenza di acqua, tuttavia vediamo che le radiazioni luminoseuna volta oltrepassata una componente o un organello cellulare, subisconodei cambiamenti di fase che dipendono sia dallo spessore, sia dal diversoindice di rifrazione della struttura oltrepassata. Mediante il microscopio acontrasto di fase è possibile andare a determinare tali cambiamenti e conver-tirli in differenze di densità così da ottenere dei dati, cioè delle informazioniutili circa la composizione di cellule e tessuti analizzati. Questa tecnica dimicroscopia è molto utilizzata per osservare le cellule mantenute in vita inapposite colture in vitro: infatti tramite la microscopia a contrasto di fase sievita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli altera-zioni strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che è l'orga-nizzazione cellulare (66).

Microscopio elettronico

Lo schema di un microscopio elettronico è analogo a quello di un micro-scopio ottico: una sorgente produce la radiazione che incide sul campione e,passando attraverso specifici sistemi che fungono da lenti, va a comporrel'immagine ingrandita. La radiazione, tuttavia, non è di natura elettroma-gnetica, ma corpuscolare: si tratta infatti di un fascio di elettroni accelerati nelvuoto. Le lenti convergenti non sono di tipo ottico ma di tipo elettromagne-tico, costituite da campi elettrici e magnetici che, come è noto, sono in gradodi modificare la traiettoria delle particelle cariche. Il tutto è protetto da uncontenitore, all'interno del quale è praticato il vuoto. L'immagine viene com-posta su uno schermo fluorescente o, in alternativa, mediante sistemi foto-grafici o televisivi (33).

L'uso di elettroni in luogo di luce visibile porta notevoli vantaggi ai finidelle prestazioni dello strumento. La lunghezza d'onda minima della lucevisibile, infatti, è di circa 400 nm (400 milionesimi di millimetro), mentre la



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lunghezza d'onda associata all'elettrone in questi strumenti può essere di soli0,05 nm. Il potere di risoluzione del microscopio elettronico è pertanto note-volmente maggiore di quello dei microscopi ottici: si arrivano a percepiredettagli di qualche decimo di nm.

Esistono essenzialmente due tipi di microscopio elettronico: quello a tra-smissione (Transmission Electron Microscope, TEM) e quello a scansione(Scanning Electron Microscope, SEM).

TEMNel TEM gli elettroni che costituiscono il fascio attraversano completamen-

te il campione. Questo, dunque, deve avere uno spessore estremamente ridot-to, compreso tra 5 e 500 nm. Il potere d'ingrandimento arriva fino a un milio-ne di volte. La migliore prestazione di un microscopio elettronico a trasmissio-ne è stata ottenuta nel giugno 2003 con l'OAM (One Angstrom Microscope) inuso presso il Lawrence Berkeley National Laboratory negli Stati Uniti: lo stru-mento ha fornito un'immagine dei singoli atomi di litio di un campione di ossi-do di litio, l'elemento più leggero dopo l'idrogeno e l'elio (1).

SEMA differenza del TEM, che può esaminare zone estese, un SEM analizza la

superficie del campione porzione per porzione, mediante un “pennello” elet-tronico di sezione paragonabile alla risoluzione del microscopio (dell'ordinedei nm). Gli atomi della superficie, colpiti dagli elettroni del fascio, emettonoelettroni secondari che, insieme agli elettroni trasmessi, vengono raccolti daun rivelatore e convertiti in segnali elettrici. Ogni punto del campione ana-lizzato corrisponde a un pixel dello schermo televisivo, cosicché, man manoche il fascio elettronico scorre sul campione, sullo schermo si costruisceun'immagine completa. Un SEM ha fattore di ingrandimento pari a circa100.000 e fornisce un'immagine tridimensionale molto dettagliata (61,20).Con i modelli più recenti, è possibile anche seguire l'evolversi di un proces-so dinamico, come la reazione di un campione a una variazione di tempera-tura, a una trasformazione chimica o a una sollecitazione meccanica (12).



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Spettrofotometria

La fotometria è il processo che determina la quantità di luce assorbita daatomi, molecole e viene usata per la stima quantitativa di composti. Le mole-cole sono quantizzate e quindi assorbono solo la luce che ha l'esatta energiache causa transizioni da uno stato energetico all'altro. Ciascun composto chi-mico ha una serie propria di livelli di energia quindi assorbirà luce di lun-ghezze d'onda specifiche producendo qualità spettrali uniche che possonoessere usate anche per una analisi qualitativa che identifica e distinguemiscele di molecole non note.

Spettrofotometro

Lo spettrofotometro è uno strumento basilare nella chimica clinica inquanto può rilevare l'effetto dell'energia raggiante su atomi e molecole sulunghezze d'onda diverse da quelle rilevate dall'occhio umano ( da 400 a 700nm) (17,18).

Gli spettrofotometri sono caratterizzati da quattro complessi fondamen-tali: sorgente, monocromatore, portacampioni e fotometro.

La sorgente consiste in una lampada a filamento di tugsteno o da unalampada a scarica in idrogeno o deuterio.

Il monocromatore comunemente utilizzato è quello chiamato di Littrowcon prismi di quarzo alluminizzati su un lato o reticoli di diffrazione che per-mettono un'elevata dispersione e la correlazione della maggior parte delleaberrazioni.Nei monocromatori destinati all'impiego nel visibile e nell'ultra-violetto vengono usati prismi di quarzo che può essere sia naturale che sin-tetico.

Il fotometro è l'elemento più importante di uno spettrofotometro perchéad esso è legata la precisione quantitativa, la riproducibilità di misura e larisoluzione dell'intero apparecchio.

I sistemi fotometrici più comunemente usati sono di due tipi:o Sistema a compensazione potenziometrica: il segnale prelevato ai capi

del rilevatore può essere messo in opposizione al segnale prelevato aicapi di un potenziometro regolabile, alimentato da una tensionecostante; mentre un indicatore ad amplificazione indica il punto diequilibrio tra i due segnali



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o Sistema ad amplificazione diretta: il segmento fotometrico vieneamplificato direttamente e comanda gli spostamenti dell'indice dellostrumento di misura.

Quantificazione

In chimica clinica per quantificare è necessario conoscere le lunghezzed'onda assorbite dal composto in esame in modo massimale per generare lamigliore sensibilità d'analisi e conoscere l'entità dell'assorbimento dellamolecola stessa a concentrazioni note.

La misura fotometrica viene fatta introducendo nel raggio monocromati-co inizialmente una soluzione di riferimento ed in seguito la soluzione dellasostanza da esaminare; la differenza fra le due intensità determinate costitui-sce una misura della trasmittanza del composto, alla lunghezza d'onda allaquale è stata effettuata la detenzione.

Lo spettro di assorbimento è la traslazione dei valori dell'intensità dell'e-nergia radiante in funzione della lunghezza d'onda.

Gli spettrofotometri possono essere a singolo o doppio raggio, nel primocaso vi è un solo fotorilevatore che riceve la luca trasmessa dalla cuvetta.

Nel secondo vi è un altro fotorivelatore colpito dalla luce prima che que-sta attraversi la soluzione come sistema di confronto al fine di eliminare lelimitazione del singolo raggio.

Per ottenere la concentrazione di una determinata sostanza in soluzione,partendo dai valori di trasmittanza o di assorbanza si possono utilizzare tremetodiche:

o Utilizzando la legge di Lamber-Beer I=Io 10abc I= luce che emerge dallasoluzione; Io = luce che entra nella soluzione; a= una costante chedipende dalla natura del campione e dalla lunghezza d'onda impiega-ta, b=lunghezza del cammino ottico; c= concentrazione del soluto nelsolvente

o Confrontando le letture dei campioni con letture di standard a con-centrazioni note

o Estrapolando la concentrazione da curve di taratura ottenute con solu-zioni di riferimento.

Le applicazioni di questo strumento sono le più comuni nei Laboratori di chi-mica clinica; ad esempio per la determinazione di substrati come glucosio, urea,colesterolo con la metodica definita “end point” (che avvengono alla fine dellareazione) o per enzimi quali transaminasi, fosfatasi alcalina, LDH … con la meto-dica “rate” (che valuta le variazioni di assorbimento nell'unità di tempo).

Cromatografia

La cromatografia, nata come tecnica separativa e sviluppatasi in seguitoanche come tecnica analitica, si basa sul fatto che i vari componenti di unamiscela tendono a ripartirsi in modo diverso tra due fasi, in funzione dellaloro affinità con ciascuna di esse. Mentre una fase rimane fissa (la fase stazio-naria) ed è generalmente un solido o un gel, un'altra fase, liquida o gassosa, (lafase mobile) fluisce su di essa trascinando con sé in quantità maggiore i com-ponenti della miscela che più risultano affini ad essa. Quando il rivelatoreposto in fondo all'apparecchio registra il passaggio di una sostanza eluita, ela-bora i dati su di un cromatogramma. Ogni volta che una sostanza viene rive-lata, il cromatogramma registra un picco più o meno alto a seconda della suaconcentrazione. Perché un cromatogramma possa essere ritenuto accettabiledeve avere una buona risoluzione. Per risoluzione si intende un parametroche mette in relazione l'efficienza, la selettività ed il fattore di ritenzione.

Selettività: per avere una buona selettività i picchi del cromatogrammadevono essere il più distanti possibili, ovvero sostanze di specie diversadevono avere tempi di ritenzione diversi. Per tempo di ritenzione di unasostanza si intende il tempo impiegato dall'eluente (ovvero la fase mobile)per trascinarla via dalla fase fissa. E’ possibile migliorare la selettività dimi-nuendo la temperatura di lavoro.

Efficienza: avere una buona selettività non basta infatti, anche se i picchisono ben distanziati, è possibile che siano talmente larghi che si sovrappon-gano fra loro. Per questo è necessario che particelle di una stessa specie ven-gano eluite con la stessa velocità in modo che la banda all'interno della colon-na cromatografica sia il più stretta possibile. Esistono varie teorie su come siapossibile migliorare l'efficienza; la più comune viene chiamata "Teoria deipiatti teorici" e si rifà al metodo della distillazione frazionata, nel quale unmaggior numero di piatti permette una migliore separazione fra sostanze piùaltobollenti con le sostanze più bassobollenti.

Fattore di ritenzione: è un parametro che mette in relazione il tempo diritenzione di un analita col "tempo morto", ovvero il tempo impiegato da unasostanza non trattenuta dalla fase stazionaria per attraversare la colonna.

La cromatografia è una tecnica analitica piuttosto recente. Si tratta diun'invenzione che la letteratura scientifica fa risalire ai primi anni del vente-simo secolo, precisamente al Marzo 1903, quando il botanico russo MikhailTswett presentò al convegno della Società di Scienze Naturali di Varsaviauno studio sull'analisi dei pigmenti vegetali mediante adsorbimento sucolonna. Degno di nota fu l'ottenimento della separazione della clorofillanelle due diverse tipologie a e b. Uno dei principali detrattori di questa tec-



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nica, Willstätter, professore di chimica organica all'Università di Monaco diBaviera, non riuscì ad ottenere, mediante cristallizzazione frazionata, gli stes-si risultati di Tswett ed ipotizzò che la clorofilla subisse una decomposizionedurante il processo di adsorbimento. Il verdetto di Willstätter, convinto asser-tore della tecnica classica di purificazione, fu uno dei motivi per cui la cro-matografia, come tecnica d'analisi, fu lasciata nel dimenticatoio per quasiventicinque anni. Un'altra ragione è da attribuire al fatto che Tswett pubblicòla maggior parte dei suoi lavori in russo, rendendo così meno disponibili allacomunità scientifica i risultati delle sue ricerche.

Nel 1922 lo scienziato statunitense Palmer impiegò la tecnica di Tswett perl'analisi di prodotti naturali, ma fu solo dal 1931 in poi che alla cromatografia,grazie al lavoro di Richard Kuhn, venne riconosciuta dignità scientifica.

La tecnica di Tswett, oggi conosciuta come cromatografia di adsorbi-mento in fase normale, non poté essere impiegata con successo per la sepa-razione di analiti solubili in acqua. Questo problema tecnico fu risolto daMartin e Synge che, nel 1941, misero a punto la cromatografia di ripartizio-ne (nota anche come cromatografia liquido - liquido o LLC). L'originalità del-l'invenzione, che fruttò a Martin e Synge il premio Nobel nel 1952, riguardòl'utilizzo di un supporto solido che rese possibile la creazione di una fase sta-zionaria liquida.

La LLC non ebbe un'ampia diffusione, probabilmente per mancanza diaffidabilità e robustezza, a causa della rimozione fisica della fase stazionariada parte della fase mobile. Nel 1944 Martin e collaboratori svilupparono lacromatografia su carta che divenne la prima tecnica cromatografica microa-nalitica. (15)

A causa del lento processo di separazione, l'impiego della cromatografiasu carta subì una drastica riduzione con la nascita della cromatografia sustrato sottile (TLC), che ben presto divenne uno standard nei Laboratori dichimica organica e farmaceutica per la sua semplicità, velocità e universalitàe che ancora oggi non è stata totalmente rimpiazzata da altre metodologie. LaTLC annovera, tra i vantaggi, la possibilità di svolgere analisi multiple e, tragli svantaggi (ora colmati dalla tecnica HPLC), la mancanza di automazione,di riproducibilità e di accuratezza nella quantificazione. Recentemente laTLC si è dimostrata particolarmente utile nella separazione degli enantiome-ri, grazie all'adozione di speciali rivestimenti a base di ciclodestrine.

La cromatografia ionica fu sviluppata durante la seconda guerra mondia-le per separare e concentrare gli elementi radioattivi necessari alla prepara-zione della bomba atomica.

La cromatografia di affinità, messa a punto negli anni '30, fu impiegataper lo studio di enzimi ed altre proteine.

La cromatografia HPLC ebbe origine solo negli anni '70, quando la pro-duzione di silice silanizzata portò alla realizzazione di un materiale di impac-camento che permise l'impiego di colonne più lunghe e di volume ridotto.



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La gascromatografia ha invece solo sessant'anni di storia.Il primo gascro-matografo analitico ad adsorbimento gas - solido fu messo a punto da FritzPrior nel novembre 1945. Nel 1950 Martin e collaboratori svilupparono laGLC (cromatografia di ripartizione gas - liquido).

Solo nel 1979, con l'introduzione delle colonne in silice fusa, la gascroma-tografia ebbe una decisiva espansione. Il primo rivelatore per gascromato-grafia, il catarometro, fu messo a punto da Ray nel 1954. (3)

Il rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID), ancora oggi ampiamente uti-lizzato, fu realizzato quasi simultaneamente da due gruppi di ricerca capeg-giati rispettivamente da Harley, McWilliam e Dewar nel 1958.

Tipi di cromatografia

Cromatografia su carta

Sostanzialmente si utilizza un foglio di carta da filtro (preparata apposi-tamente e leggermente differente dalla carta per filtrare), su un bordo dellaquale si deposita la soluzione da separare. Si sospende quindi il foglio dicarta in modo tale che il bordo inferiore peschi in una bacinella con la fasemobile lasciando che per capillarità il liquido salga lungo il foglio di carta(cromatografia in fase ascendente). Alternativamente si ripiega il bordo adia-cente la sostanza da separare facendolo pescare nella bacinella (contenente lafase mobile) posta in alto e facendo in modo che il resto del foglio scendaverso il basso. La fase mobile fluirà lungo il foglio scendendo verso il basso(cromatografia in fasce discendente).

La cromatografia su carta venne sviluppata soprattutto per le prime sepa-razioni di aminoacidi, usando come fase mobile una miscela di 1-butanolo,acido acetico ed acqua. Come fase mobile è possibile usare anche alcol etilico.

Cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC)

Si tratta di una tecnica cromatografica che permette di separare due o piùcomposti presenti in un solvente sfruttando l'equilibrio di affinità tra una"fase stazionaria" posta all'interno della colonna cromatografica ed una "fasemobile" che fluisce attraverso essa. Una sostanza più affine alla fase stazio-naria rispetto alla fase mobile impiega un tempo maggiore a percorrere lacolonna cromatografica (tempo di ritenzione) rispetto ad una sostanza conbassa affinità per la fase stazionaria ed alta per la fase mobile.



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Il campione da analizzare è iniettato all'inizio della colonna cromatogra-fica dove è "spinto" attraverso la fase stazionaria dalla fase mobile applican-do pressioni dell'ordine delle centinaia di atmosfere. Per ottenere un'elevataefficienza nella separazione è necessario che le dimensioni delle particelle delriempimento siano molto ridotte (di solito hanno diametri compresi da 3 a 10µm), per questo motivo è indispensabile applicare un'elevata pressione se sivuole mantenere una ragionevole velocità di flusso dell'eluente e quindi untempo di analisi adeguato.

Alla fine della colonna è applicato un rilevatore (IR, UV-VIS, spettrome-tro di massa) ed un calcolatore che permettono una analisi in continuo del-l'uscita della colonna e quindi di poter quantificare e/o identificare le sostan-ze iniettate.

I vantaggi principali di questa tecnica sono: la dimensione ridotta dellacolonna che evita problemi di deviazioni longitudinali (movimenti della fasemobile longitudinali) e di percorsi alternativi; velocità di eluizione (passag-gio della fase mobile attraverso la colonna) costante e regolabile; velocità diesecuzione ridotta; piccole quantità di composto necessaria all'analisi (nel-l'ordine dei 5-10 microgrammi di campione solubilizzato in apposito solven-te), tutto a favore di una maggiore accuratezza e precisione.

Lo svantaggio principale degli apparecchi per HPLC è il costo più eleva-to rispetto ad una cromatografia su colonna tradizionale, anche se non è pos-sibile paragonare le due metodiche poiché presentano campi di applicazionediversi.

Cromatografia su strato sottile (TLC)

La TLC è una tecnica cromatografica di semplice preparazione e rapidaesecuzione; questo la rende particolarmente adatta per l'esecuzione di valu-tazioni qualitative o semi-quantitative, nonché per seguire una reazione chi-mica durante il suo svolgersi.

La fase stazionaria è generalmente uno strato dallo spessore uniforme dicirca 1 mm di materiale adsorbente, depositato su una lastra di vetro. Il mate-riale adsorbente può essere gel di silice, allumina, cellulosa o polvere di dia-tomee (kieselguhr), a seconda dell'applicazione richiesta. La fase mobile è unsolvente opportunamente scelto (o una miscela di solventi), capace di sepa-rare i componenti della miscela da analizzare e poco affine per polarità allafase stazionaria scelta. Uno strato di fase mobile alto circa 1 cm viene postosul fondo di un contenitore nel quale si immerge l'estremità inferiore dellalastra di vetro preparata col materiale adsorbente, sulla quale è stata previa-mente posta una goccia del campione da separare o di una sua soluzione. Ilcontenitore viene poi chiuso in modo da mantenere l'ambiente saturo di



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vapori di solvente. Per effetto di capillarità il solvente sale lungo la lastrinatrascinando con sé in maniera differente i componenti della miscela e sepa-randoli. La corsa del solvente può durare da una decina di minuti ad oltreun'ora. Se la separazione non è stata sufficiente, si può ricorrere ad una sepa-razione bidimensionale: in questo caso la lastra è di forma quadrata ed in unangolo di questa si deposita in un unico punto la soluzione da separare.Dopo aver proceduto alla separazione si ruota la lastra in modo che le com-ponenti separate siano lungo una linea orizzontale, quindi si procede ad unanuova separazione con un differente solvente. Procedendo in questo modo siriescono a separare sostanze molto affini fra loro e non altrimenti separabili.

Cromatografia a scambio ionico

Questo tipo di cromatografia si basa sul principio di attrazione di ioni dicarica opposta. Molti composti organici, come ad esempio gli amminoacidi,possono avere parti della molecola polari favorendo quindi la loro separa-zione tramite questo metodo. La carica netta che questi composti presentanodipende dal loro pKa e dal pH della soluzione. Come nella normale croma-tografia si ha una colonna cromatografica impaccata con uno speciale tipo diresina in grado di scambiare ioni. Esistono due tipi di resine: scambiatricianioniche e scambiatrici cationiche. Queste ultime possiedono gruppi carichinegativamente ed attraggono quindi molecole cariche positivamente. Moltiscambiatori ionici sono costituiti da polimeri di stirene e di divinilbenzene(polistirene). Il polistirene essendo un polimero lineare è solubile in numero-si solventi. Condensando invece stirene con divinilbenzene si ottengono poli-meri con legami crociati e quindi insolubili; più è alto il numero di legamicrociati, maggiore sarà la capacità di trattenere composti ad alto peso mole-colare.

E’ un metodo che permette di separare molto semplicemente ioni. E’ utileper la purificazione di campioni analitici poiché, ad esempio, si potrebbeavere bisogno di analizzare un anione in una matrice di cationi.



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Metodiche immunologiche

Molte tecniche di Laboratorio si avvalgono del legame specifico antigene-anticorpo. Dal momento che è possibile produrre anticorpi nei confronti diqualunque tipo di macromolecola o sostanza chimica di piccole dimensioni,le tecniche basate sul loro impiego sono utili per rilevare e purificare i com-posti.

Legame antigene-anticorpo

Le Immunoglobuline o Anticorpi (Ab) sono proteine nelle quali sono indi-viduabili due regioni diverse per struttura e funzione:

- regione Fab: regione variabile che contiene la zona specifica per l'anti-gene

- regione Fc: regione a struttura costante presente all'interno della classee sottoclasse di Ab.

Gli anticorpi che vengono utilizzati nelle analisi di Laboratorio apparten-gono alla classe delle Immunoglobuline G.

Le forze che intervengono nel legame Ab-Ag sono: forze elettrostatiche,forze idrofobiche, legami idrogeno e forze di Van der Waals.

Nei confronti di queste forze agiscono in senso positivo o negativo altrecomponenti del campione: pH, temperatura, forza ionica, detergenti, protei-ne leganti, cross reagenti.

L'affinità è la forza di attrazione tra l'anticorpo ed un singolo sito antige-nico (epitopo). E' misurata dalla costante di affinità o di equilibrio K= [Ab-Ag] / [Ab] +[Ag]. Più elevata è K più forte è il legame.

L'avidità è la somma delle affinità tra un antigene (tutti i suoi epitopi) edun antisiero o un pool di Ab monoclonali. L'avidità è uno dei fattori princi-pali che condizionano la sensibilità analitica cioè la capacità di discriminaretra concentrazioni molto vicine.



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Tecniche per l’identificazione e laquantificazione di proteine

Gli anticorpi possono essere impiegati per identificare, caratterizzare equantificare antigeni specifici da una soluzione. Il principio fondamentaledella maggior parte di tali metodiche è la precipitazione.

La precipitazione interviene quando l'antigene in soluzione acquosaviene posto a contatto con l'anticorpo (cioè con un siero specifico) in presen-za di elettroliti, ad esempio in soluzione fisiologica. Affinché la reazioneavvenga devono essere opportunamente scelte sia la concentrazione di cia-scuno dei reagenti, che le altre condizioni sperimentali, quali temperatura edil tempo di incubazione.

In questa reazione l'antigene e l'anticorpo sono inizialmente in uno statodi soluzione colloidale.

Si possono ottenere reazioni anche con antigeni chimicamente purificaticome ad esempio un polisaccaride batterico.

In questo modo si riesce ad eliminare la complessità reattiva, indotta dal-l'enorme molteplicità degli antigeni presenti sulla superficie di un batterio odi un globulo rosso, come invece avviene nell'agglutinazione.

Il titolo precipitante di un siero può essere determinato valutando la piùpiccola quantità di esso che sia in grado di precipitare una quantità standardoppure si può, di fronte ad una quantità fissa di siero, porre quantità scalaridi antigene ed osservare fino a quale punto si ottenga ancora reazione. Ilgrado di attività di un siero o di un antigene viene indicato dall'ultima dilui-zione che consente di evidenziare la reazione.

Dean e Webb nel 1926 definirono l'optimal ratio: la proporzione ottimaleantigene-anticorpo, che dà luogo alla maggiore reattività. Essi fecero diversemiscele di egual volume e concentrazione di anticorpo ma con quantitàdecrescenti di antigene. Osservarono poi il tempo richiesto per la floccula-zione e definirono come optimal ratio la proporzione antigene - anticorpo incui la flocculazione avviene nel minor tempo (6). Optimal ratio corrisponde aduna miscela equivalente, ove si ha l'utilizzazione reciproca e completa ditutto l'antigene e di tutto l'anticorpo. Per “equivalenza” si intende che, nelliquido surnatante della provetta, non rimangono residui né di antigene nédi anticorpo, in quanto completamente utilizzati per formare il precipitato.



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Precipitazione

La reazione di precipitazione può essere evidenziata mescolando anticor-pi e antigeni solubili in provetta mediante il metodo delle diluizioni oppurecon la cosiddetta tecnica zonale ove il siero viene stratificato in provetta al disotto dell'antigene: in caso di positività si nota la comparsa, nella zona di con-tatto dei due reagenti, di un anello opalescente dovuto al fenomeno di preci-pitazione, assente in caso di reazione negativa.

La tecnica della precipitazione viene impiegata per diagnosticare diversemalattie infettive o per differenziare specie microbiche appartenenti allo stes-so genere come la reazione di Lancefield per gli Streptococchi.

La precipitazione può essere eseguita anche in substrati in gel o in agardove uno o entrambi i reagenti diffondono dando origine ad una reazione diprecipitazione nel punto in cui si incontrano in concentrazione ottimale.

Si formano così bande di precipitazione ben visibili e separate che permet-tono d'identificare i singoli componenti antigenici in una soluzione che li con-tenga contemporaneamente e nello stesso tempo stabilire le affinità esistenti.

Gel diffusione doppia bidimensionale

Questa metodica nota anche come metodo di Ouchtelony prevede la dif-fusione dell'antigene e dell'anticorpo da due pozzetti adiacenti ricavati inuno strato di agar. I due reagenti diffondono e formano un precipitato visibi-le nella zona del gel ove si incontrano in proporzione ottimale permettendonon solo di stabilire la presenza di più antigeni ma anche la loro eventualeparziale o totale identità.

Gel diffusione radiale

Il metodo, noto anche come tecnica di Mancini, consente una valutazionequantitativa della concentrazione dell'anticorpo o dell'antigene.

Uno dei due reagenti è incorporato nello strato di agar; dopo la solidifi-cazione si preparano numerosi pozzetti che vengono riempiti con i diversicampioni di antigene,di cui si vuole determinare la concentrazione.

L'antigene, diffondendo nel gel contenete l'anticorpo, dà origine ad anel-



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li di precipitazione il cui diametro è direttamente proporzionale alla concen-trazione dello stesso.

Immunoelettroforesi

Prevede due stadi successivi: 1) elettroforesi della miscela antigenica in unadatto gel in modo da separare i singoli costituenti in base alla loro mobilitàelettroforetica 2) deposito di un antisiero, specifico per alcune o tutte le com-ponenti proteiche, in una scanalatura laterale parallela alla direzione dellamigrazione elettroforetica. Diffondendo uno verso l'altro originano linee oarchi di precipitato nei punti in cui si incontrano in proporzioni ottimali.

Agglutinazione

La reazione di agglutinazione non differisce sostanzialmente nel mecca-nismo da quella di precipitazione.

Lo stesso anticorpo è in grado di esplicare azione precipitante o aggluti-nante in funzione solo dello stato fisico-chimico dell'antigene.

Se questo, anziché disciolto nel mezzo, è costituito da elementi corpusco-lari (es. globuli rossi o batteri) si avrà reazione di agglutinazione.

La reazione di agglutinazione può essere eseguita, oltre in provetta, anchesu vetrino (prova rapida) diluendo per raddoppio l'anticorpo. Una metodica diquesto genere viene impiegata spesso nella diagnosi di molte malattie soprat-tutto nell'identificazione di varie specie batteriche e dei gruppi sanguigni.

E’ possibile fissare determinanti antigeni alla superficie di globuli rossi odi particelle inerti (colloidi, lattice, bentonite) rendendoli così agglutinabilida parte degli anticorpi specifici.

Se l'antigene viene legato ai globuli rossi, la sua reazione con l'anticorpoomologo determina un'emoagglutinazione passiva. Antigeni provenienti daimicrorganismi più diversi possono venire fissati ai globuli rossi, in genereprevio trattamento di questi ultimi con acido tannico, gli eritrociti così sensi-bilizzati possono venire poi impiegati nella prova di emoagglutinazione pas-siva per la sierodiagnosi di malattie infettive ed infestive.

La reazione di Middlebrook-Dubos cioè l'agglutinazione da parte delsiero di soggetti con tubercolosi, di eritrociti sensibilizzati da antigeni tuber-colari ha rappresentato il primo esempio di emoagglutinazione passiva.



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Inibizione dell’emoagglutinazione da virus

Alcuni virus sono capaci di legarsi ai globuli rossi in quanto dotati diemoagglutinine facendoli agglutinare. Visto che questa reazione viene inibi-ta dalla presenza di anticorpi virus-specifici è possibile titolare questi ultimicon una tecnica nota come reazione di Hirst.

Il test presenta elevate sensibilità, specificità e misura la quantità di anti-corpi che si legano direttamente all'emoagglutinina virale che è generalmen-te un antigene superficiale del virione.

La sua esecuzione consiste nell'aggiungere una sospensione di globulirossi ad una serie di miscele costituite da varie diluizioni, per raddoppio delsiero in esame e da una quantità standardizzata di virus: in genere quattrounità emoagglutinanti (UEA). Il titolo degli anticorpi inibenti l'emoagglutina-zione è rappresentata dalla più alta diluizione di siero capace di prevenire l'e-moagglutinazione da virus. In presenza di agglutinazione gli eritrociti sidispongono in un sottile strato granulare a margini irregolari che ricopre tuttoil fondo; al contrario, gli eritrociti normali si depositano sul fondo raccoglien-dosi nel centro a formare una specie di bottone a margini ben definiti.

Fissazione del complemento

A volte non è possibile evidenziare a occhio nudo una reazione antigene-anticorpo; essendo noto che tale complesso determina l'attrazione del com-plemento (C'). Aggiungendo quindi una quantità nota di C' questa viene fis-sata o consumata. Se dopo si aggiungono anche globuli rossi sensibilizzatidal rispettivo anticorpo non si avrà emolisi perché manca il C'. In caso dimancata reazione iniziale l'emolisi avverrà in quanto il C' è rimasto libero.

Quindi se non compare emolisi la reazione è positiva, cioè è precedente-mente intervenuta una reazione antigene-anticorpo; quando si verifica emo-lisi la reazione è negativa.

Questa metodica può essere utilizzata sia per la ricerca di anticorpi sia perindividuare gli antigeni, uno dei due deve quindi esser noto e servire peridentificare l'altro.

La prova di fissazione del complemento implica l'uso di quantità moltomodeste di C' (2 unità) perché una parte potrebbe non fissarsi al complessoantigene-anticorpo e potrebbe poi determinare l'emolisi generando una rea-zione falsamente negativa.



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Indispensabile è eliminare il complemento presente naturalmente nei sieriin esame sottoponendoli ad un trattamento termico di 56 °C per 30 minuti.

Le IgG4, le IgA, le IgD e le IgE non sono in grado di fissare il comple-mento, quindi questa reazione diagnostica solo gli anticorpi di classe IgM ele altre tre sottoclassi di IgG.

Sieroneutralizzazione

Con il termine prove di neutralizzazione si indicano tutte quelle proce-dure in cui un anticorpo specifico inibisce un effetto biologico che può esse-re provocato da un microrganismo o da una tossina.

Quando un antigene viene posto a contatto con il siero di un soggetto con-valescente o immunizzato perde del tutto o in gran parte il suo potere infet-tante. La spiegazione è che gli anticorpi specifici rivestono la superficie del-l'antigene impedendo stericamente la sua adesione alla cellula ospite. Il tassodi anticorpi neutralizzanti nel siero può essere valutato mettendo a contattodiluizioni seriali per raddoppio del siero con quantità standard di antigene(nel caso dei virus di solito 100 DITC50) e lasciate reagire per un tempo appro-priato ad una temperatura ottimale.

L'attività residua delle miscele antigene-siero viene valutata tramite unatitolazione detta al “punto-finale” sul substrato biologico più idoneo (colturecellulari, uova embrionale, animali da Laboratorio).

Titolo finale degli anticorpi neutralizzanti viene considerata la più altadiluizione del siero ancora capace di prevenire i fenomeni legati alle pro-prietà dell'antigene.

Immunofluorescenza

E’ possibile rendere visibile una reazione antigene -anticorpo marcandouno dei reagenti con sostanze chiamate fluorocromi (fluoresceina, rodamina)che hanno la capacità di emettere fluorescenza se osservate con un microsco-pio a luce ultravioletta .

La tecnica è applicabile a sezioni di tessuto, colture cellulari o strisci disospensioni di cellule di animali, batteriche e protozoarie.



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Immunodosaggi

Le metodiche immunologiche per la quantificazione della concentrazionedi antigene presentano un straordinaria sensibilità e specificità e sono oggitecniche di comune utilizzo sia in campo clinico che nella ricerca. Tutti imoderni metodi immunochimici quantitativi presuppongono la disponibilitàdi una preparazione purificata di antigene o di anticorpo la cui quantità puòessere misurata grazie ad una molecola indicatrice dell'avvenuto legameantigene-anticorpo. Costituenti degli immunodosaggi sono: l'antigene, ilreattivo anticorpale, il tracciante e la curva standard.

L'antigene è :o l'analita da misurareo il calibratoreo l'analita marcato che compete con l'analita da dosareo la molecola utilizzata per produrre gli anticorpi.Il reattivo anticorpale può essere costituito da un antisiero policlonale o

da anticorpi monoclonali.Il tracciante è il costituente che segnala la reazione antigene-anticorpo gra-

zie al suo legame con un marcatore (radioisotopo, enzima, fluoroforo) (23).La curva standard è la componente necessaria per l'attribuzione di una

“quantità” al segnale emesso dal tracciante.

Immunodosaggi diretti e indiretti

Un immunodosaggio può essere impiegato per una misurazione, all'in-terno di un campione, della quantità sia di un anticorpo che di un antigene.Si definisce metodo diretto una tecnica che mira alla quantificazione di unantigene che può essere ad esempio una proteina presente nel plasma oppu-re una componente microbica. Un immunodosaggio di tipo indiretto, invece,viene utilizzato con lo scopo di dimostrare l'avvenuto contatto di un antige-ne con un organismo attraverso la ricerca e la quantificazione degli anticorpispecifici. Quest'ultimo viene adoperato soprattutto in microbiologia clinicacon tecniche di immunofluorescenza o di ELISA ad esempio per valutare lasieroconversione o un'infezione pregressa.



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Immunodosaggi competitivi e non competitivi

Nei metodi competitivi l'analita (Ag) viene dosato grazie alla sua capacitàdi competere con un tracciante costituito da un antigene marcato (Ag*) performare un immunocomplesso con un Ab specifico presente in quantità limi-tata. La misura del segnale (Ab-Ag*) è in genere inversamente proporziona-le all'analita presente nel campione.

Nei metodi competitivi ad una fase l'analita (Ag) del campione e l'antige-ne marcato (Ag*) competono simultaneamente per una quantità limitata dianticorpi (Ab).

Nei metodi competitivi a due fasi, in una prima fase l'anticorpo (Ab) èincubato con il campione (Ag), mentre il tracciante (Ag*) viene aggiunto inuna seconda fase. Questi metodi possono essere usati per aumentare la pen-denza iniziale della curva (sensibilità).

Tali metodiche sono quasi limitate al dosaggio di apteni, i quali, non aven-do un numero di epitopi sufficienti ad essere legati da due Ab, presentanodifficoltà tecniche all'applicazione di metodi non competitivi.

Nei metodi non competitivi l'analita viene dosato mediante l'utilizzo didue diversi anticorpi, presenti in eccesso, specifici per due diversi epitopidello stesso antigene. Un anticorpo è marcato (Ab*) e l'altro è legato ad una“fase solida”. La misura del segnale (Ab*-Ag-Abfase solida) è direttamenteproporzionale all'analita presente nel campione.

Tali metodi sono anche chiamati “sandwich” perché l'antigene è legato fradue anticorpi. Anche questi, come quelli competitivi, possono essere ad unafase o a due fasi; questi ultimi migliorano la sensibilità e specificità.

I metodi non competitivi sono più sensibili dei metodi competitivi poichéin prossimità dello zero un piccolo incremento di segnale è più rilevabilerispetto ad un piccolo decremento.

Gli immunodosaggi sia competitivi che non competitivi possono esseredistinti in omogenei ed eterogenei.

Sono definiti omogenei gli immunodosaggi che per la lettura del segnalenon richiedono la separazione dell'immunocomplesso dalla frazione nonlegata. Sono più semplici e veloci e vengono utilizzati in genere per il dosag-gio di piccole molecole come: farmaci e droghe d'abuso.

Sono definiti eterogenei gli immunodosaggi che prima della lettura delsegnale richiedono la separazione dell'immunocomplesso che é in genereottenuta con un Ab o Ag adeso ad una fase solida.

Alla separazione segue nei metodi RIA (Radio Immuno Assay) il conteg-gio della radioattività, nei metodi alternativi, come nei metodi ELISA



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(Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay), segue l'aggiunta del reagentecomplementare → incubazione → blocco della reazione → lettura.

I marcatori non isotopici possono essere utilizzati nei dosaggi omogenei(non richiedono la separazione dell'immunocomplesso dalla frazione nonlegata) e nei dosaggi eterogenei (richiedono la separazione B/F).

I marcatori isotopici necessitano della separazione B/F (B= frazione; F=frazione legata).

La separazione B/F si può ottenere mediante:1) Cromatografia (carta, gel, resine) 2) Precipitazione di Bound (doppio Ab, salatura, PEG glicole polietileni-

co, solventi)3) Adsorbimento di Free (carbone-destrano, resine) 4) Cattura su fase solida (attualmente più usata) (Ab o Ag legato a micro-

particelle magnetiche,a biglie, a provette, a micropiastre).Nei metodi in fase omogenea la separazione dell'immunocomplesso non

è richiesta perché il segnale “aspecifico” viene neutralizzato,come:

EIA competitivo omogeneo: Ag*(con enzima), Ab che inibisce l'enzima,Ag analita; il segnale sarà dato dal solo Ag* libero.

FIA competitivo a smorzamento diretto: Ag*(con fluoroforo), Ab che ini-bisce la fluorescenza, Ag analita; il segnale sarà dato dal solo Ag* libero.

Non competitivo omogeneo: Ab* (con attivatore), Ab*(con fluoroforo), Aganalita, la reazione avviene solo se entrambi gli Ab sono legati a Ag (Ab*-Ag-Ab*); il segnale sarà dato dall'immunocomplesso.

In questi casi il segnale è direttamente correlato all'Ag del campione. Nei primi due casi è l'opposto di quanto avviene nei competitivi eteroge-

nei, nei quali il segnale è inversamente proporzionale al'Ag del campione.Altri esempi di neutralizzazione del segnale aspecifico sono:

FIA a smorzamento indiretto (competitivo): Ag*(con fluoroforo), Ag ana-lita, Ab antifluoresceina e Ab che protegge la fluorescenza nei confronti diquest'ultimo; il segnale sarà dato dal Ag* -Ab.

FPIA fluorescenza polarizzata (competitivo): Ag*(con fluoroforo), Ag ana-lita, Ab solo le molecole più grandi emettono luce polarizzata; il segnale saràdato da Ag*-Ab.

In questi casi il segnale è inversamente proporzionale all'Ag del campio-ne, come comunemente avviene nei metodi competitivi.



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FPIA

La Fluorescence Polarization Immunoassay (FPIA) è un immunodosaggiocompetitivo in fase omogenea in fluorescenza.

L'antigene del campione (Ag) e l'antigene marcato con fluoresceina (AgF)competono per i siti leganti dell'anticorpo. Essendo un immunodosaggio infase omogenea non è richiesto il lavaggio per separare l'immunocomplessoAb-AgF dall'AgF “free”.

La FPIA è una tecnica accurata e sensibile utilizzata per il dosaggio di far-maci, droghe d'abuso e di alcuni ormoni (estriolo, cortisolo).

I reagenti sono detti:S: l'antisiero specifico per l'analitaT: il tracciante cioè l'analita marcato con fluoresceinaP: il pretrattante che serve per facilitare il rilascio dell'analita dalle protei-

ne del siero. La FPIA utilizza tre concetti chiave: la fluorescenza, la rotazione delle

molecole in soluzione e la luce polarizzata.Fluorescenza: la fluoresceina è una sostanza che assorbe energia dalla luce

a 490nm e rilascia questa energia ad una lunghezza d'onda maggiore(520nm) come luce fluorescente.

La rotazione delle molecole in soluzione: in una soluzione le molecolegrandi ruotano più lentamente rispetto alle molecole piccole.

Questo fatto permette di distinguere nella stessa soluzione le molecolefluorescenti piccole (AgF) che ruotano rapidamente dalle molecole fluore-scenti grandi (Ab-AgF) che ruotano più lentamente.

La luce polarizzata: l'energia emessa a 520nm come luce fluorescentedagli immunocomplessi Ab-AgF passa attraverso il polarizzatore, perché lamolecola non fa in tempo a ruotare ed emette luce nello stesso piano dellaluce assorbita; le piccole molecole AgF assorbono la luce polarizzata ma ruo-tano prima di emetterla come fluorescenza e quindi la stessa viene diretta inaltre direzioni e dispersa come luce non polarizzata.

La FPIA è un metodo competitivo perciò il segnale è inversamente corre-lato con l'analita nel campione.

MEIA

Microparticle Enzyme Immunoassay (MEIA) è un metodo di immunodo-saggio che utilizza delle microparticelle come fase solida per la separazionedell'immunocomplesso (Ab-Ag).



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33Caleidoscopio

Il metodo è automatizzato e viene utilizzato per il dosaggio di ormoni,marcatori cardiaci, marcatori tumorali, test sierologici.

I reagenti sono costituiti da:1) Fase solida anticorpo-microparticelle: microparticelle di latex coniu-

gate con l'anticorpo specifico per l'analita2) Coniugato anticorpo-enzima: anticorpo coniugato con fosfatasi alcali-

na3) Substrato per l'enzima: 4-Metil Umbelliferone fosfato (MUP).

CMIA

Chemiluminescent Magnetic Immunoassay (CMIA) è metodo di immu-nodosaggo che utilizza un anticorpo clegato a microparticelle magnetiche, unanticorpo coniugato con un composto chemiluminescente ed un reagenteattivatore (trigger).

CMIA e MEIA possono utilizzare il metodo non competitivo sandwich; laquantità di segnale è direttamente proporzionale alla quantità di analita.

Gli immunodosaggi di routine risalgono agli anni '60 con lo sviluppodella Radioimmunologia (RIA) la quale utilizza come traccianti degli isotopiradioattivi legati all'Ag* (competitivi) o all'Ab* (non competitivi).

La concentrazione dell'analita è correlata direttamente o inversamentealla radioattività misurata dal Gamma-counter (I 125,Co57) o Beta-counter(H3) a seconda del tipo di isotopo.

La tecnologia RIA è ancora usata (aldosterone, testosterone libero, corti-solo), ma per le normative che regolano la gestione del materiale radioattivo,l'instabilità del marcato e le difficoltà di automazione, è sempre più sostitui-ta dalla tecnologia che utilizza traccianti alternativi al RIA .

La tecnologia RIA è applicata a metodi competitivi (RIA), non competiti-vi (IRMA), entrambi eterogenei.

Nei dosaggi alternativi vengono usati come marcatori degli enzimi (fosfa-tasi alcalina, perossidasi di rafano, beta-galattosidasi), molecole fluorescentio luminescenti.

La concentrazione dell'analita è direttamente (metodi non competitivi) oinversamente (metodi competitivi) correlata alla variazione di colore o emis-sione di luce misurata dall'analizzatore.

ELISA

ELISA o Enzyme Linked Immunosorbant Assay è una tecnica alternativache ha avuto una maggior applicazione nella diagnostica di Laboratorio. Essa

consiste in un immunodosaggio eterogeneo, sandwich o competitivo, in cuiun anticorpo o un antigene sono immobilizzati ad una fase solida (micropia-stra). Attualmente è utilizzato soprattutto in sierologia infettiva ed autoim-munità (27, 28).

Presenta una sensibilità notevole per il fatto che una sola molecola dienzima può reagire con un elevato numero di molecole di substrato, deter-minando, anche in presenza di titoli anticorpali modesti, una reazione colo-rimetrica amplificata.

A partire dagli anni '70 e negli anni '80 e '90 si sono ottenuti notevoli pro-gressi nella sensibilità, specificità dei dosaggi, nella loro automazione e sonostate introdotte altre tecnologie come: FIA (Fluorescent ImmunoAssay) eCLIA (ChemiLuminescent ImmunoAssay).



34 Caleidoscopio

Costituenti degli immunodosaggi

Antigeni marcati

Devono avere la reattività immunologica dell'analita ed il marcatore nondeve alterare la reattività immunologica.

Reagenti anticorpali

Anticorpi policlonali: sono miscele di Immunoglobuline (classe IgG)diverse per struttura e capacità legante. Hanno una bassa riproducibilità,un'elevata specificità (ottenuta anche con l'eventuale aggiunta di antigeni peri siti aspecifici, per neutralizzare gli interferenti), sono stabili e si possonoottenere in titoli elevati. Tali Immunoglobuline vengono prodotte immuniz-zando un animale di specie eterologa con l'analita, se immunogenico (PM>4000), o con l'accoppiamento analita-proteina (nel caso di apteni: PM<2000).

Si ottiene così l'antisiero e da questo gli anticorpi policlonali (cioè unamiscela di anticorpi prodotti da più cloni plasmacellulari). L'antisiero vienevalutato in base al titolo (reciproco della diluizione del reattivo anticorpale),alla specificità cioè alle reazioni crociate (rapporto percentuale tra l'analita edinterferenti che danno la stessa risposta), all'affinità (forza del legame Ab-Ag)espressa dalla costante di associazione o di affinità-equilibrio.

Anticorpi monoclonali: hanno una specificità maggiore, ma non assoluta;anche un Ab monoclonale può reagire con affinità diversa, con vari Ag (56).

Sono assolutamente riproducibili ed ottenibili in quantità illimitata.La maggiore specificità pone problemi in caso di eterogenità o isoforme

dell'Ag (es.forme tumorali) a questo si ovvia con opportune miscele di Abmonoclonali.

La tecnica di produzione più celebre è quella degli ibridomi, introdotta daKohler e Milstein nel 1975 (22). Gli ibridomi derivano dalla fusione di linfo-citi sensibilizzati con l'antigene (capacità di produrre Ab), con cellule mielo-matose non secernenti (capacità di vita “illimitata”).

Queste cellule vengono poi diluite fino ad ottenere delle singole plasma-cellule che moltiplicandosi danno origine a singoli cloni che vengono poiselezionati in base alle caratteristiche di specificità ed affinità più adatte al



35Caleidoscopio

sistema. Si ottiene così l'anticorpo monoclonale (Immunoglobuline prodotteda un solo clone di plasmacellule).

Gli anticorpi monoclonali non sono necessari di solito nei dosaggi com-petitivi o con antigeni a struttura semplice come negli apteni. Sono vantag-giosi, per la maggiore specificità, in caso di antigeni che hanno epitopi simi-li ad altri (HCG, LH, TSH, marcatori neoplastici mucinici). Sono utili, per lamaggiore specificità, in genere nei dosaggi non competitivi sandwich, dovedue Ab si legano allo stesso Ag su epitopi diversi (24).

Questo tipo di immunoglobuline sono quelle maggiormente utilizzate neiLaboratori clinici perché essendo più standardizzate agevolano la riproduci-bilità fra i lotti di reagenti.

Marcatori

Il marcatore è un rivelatore della reazione Ag-Ab, che viene legato al trac-ciante (Ag o Ab) mediante procedimenti di tipo fisico o chimico.

Marcatori sotopici: - I 125 (γ emittente, T 1/2 60 gg)- H 3 (β emittente, T 1/2 12.26 anni)- Co 57 (γ emittente, T 1/2 267 gg)

Marcatori non isotopici:- Enzimi (fosfatasi alcalina, perossidasi di rafano, galattosidasi, G6PD,

glucosio ossidasi, lisozima). - Fluorofori (fluoresceina, europio, isotiocianato, umbelliferoni).- Chemiluminescenti (isoluminolo, luminolo, esteri di acridinio).Il marcatore non deve compromettere l'immunoreattività del marcato:

l'Ag* dovrà essere “uguale” all'analita (dosaggi competitivi), l'Ab* dovràmantenere la maggiore reattività possibile (56).

Il marcatore deve possedere elevata attività specifica (segnale per massadi tracciante): essa determina la sensibilità del sistema di rivelazione. Se ilmarcatore è un enzima deve avere una elevata attività molare (elevato rap-porto tra molecole di substrato attivato per molecola di enzima) e deve esse-re diverso dagli enzimi del campione. Il sistema meno sensibile è laPerossidasi/Fotometria, il più sensibile è la Fosfatasi alcalina/Chemilumi-nescenza.

Il marcatore deve possedere inoltre elevata stabilità, durata del reagente enon subire interferenze da fattori presenti nel campione o nei reagenti (44).



36 Caleidoscopio

Calibratori

Il calibratore è un materiale con caratteristiche ben conosciute: concentra-zione, reattività antigenica, che viene utilizzato per calibrare una procedura,ad esempio per correlare il segnale alla dose. Il calibratore dovrebbe avere lestesse caratteristiche dei campioni anche se in realtà l'identità antigenica nonè assoluta (vari epitopi, isoforme, materiale degradato nel calibratore) edanche la matrice è diversa.

Testando un numero adeguato di calibratori il software dell'analizzatoreelabora una curva di calibrazione cioè una curva di segnale-dose che costi-tuisce il codice per il dosaggio dei campioni.

I valori dei calibratori vengono assegnati utilizzando una delle seguentitre metodiche:

1) Standardizzazione con metodo di riferimento (es. GC-MS per testoste-rone, estradiolo); i calibratori master (pool di sieri, siero free addizio-nato) vengono dosati in Laboratori di riferimento.

2) Standardizzazione verso materiale di riferimento (standard internazio-nali): si preparano diluizioni dello standard di riferimento in sieroumano free ed i calibratori master vengono dosati contro questo stan-dard con il “sistema” di routine.

3) Standardizzazione con metodo candidato come riferimento: quandonon è possibile si utilizzano le metodiche precedenti. Una volta asse-gnati i valori ai calibratori master questi vengono utilizzati come rife-rimento per il dosaggio, con i diversi lotti di reagenti, dei calibratoriche vengono distribuiti agli utilizzatori.



37Caleidoscopio

Curve di calibrazione negli immunodo-saggi

Mettendo in relazione il segnale ottenuto con la dose attribuita ai calibra-tori si ottiene un grafico che è la curva di calibrazione. Scopo della curva dicalibrazione è la stima del vero rapporto segnale-concentrazione che permet-te il dosaggio dei campioni.

I passaggi per ottenere una corretta curva di calibrazione sono:1) Misura dei calibratori2) Applicazione di un modello che permette una relazione continua

segnale-concentrazione3) Assegnazione del valore ai campioni.

La qualità della calibrazione, cioè la capacità di stimare il vero rapportosegnale-concentrazione, dipende soprattutto da:

1. Qualità del calibratore (“identità” immunologica con il campione)2. Concentrazione dei calibratori usati3. Qualità del reagente anticorpale4. Modello di curva usata (algoritmo): la curva più frequentemente

usata è la Rodbard a quattro parametri.Le Aziende produttrici dei sistemi analitici utilizzano simulazioni per sce-

gliere l'algoritmo ed i livelli di standard adatti per ottimizzare la curvasoprattutto nella zona dove è richiesta la migliore precisione.

La curva di calibrazione deve essere ripetuta quando viene modificata lacorrelazione tra segnale analitico e concentrazione dell'analita; questa corre-lazione può essere modificata da:

1. Variabili inerenti ai reagenti (radiolisi primaria o secondaria, instabi-lità dei reagenti, differenze tra i lotti)

2. Variabili della procedura (temperatura, incubazioni)3. Variabili strumentali (temperatura, umidità, condizione del sistema di

rivelazione).Se non si possono eliminare le variabili, come ad esempio nei dosaggi con

tracciante radioattivo (RIA, IRMA), o nei dosaggi manuali, i calibratori ed icampioni devono essere processati insieme cioè eseguendo la curva ad ogniseduta e verificandola con i controlli.

Con l'utilizzo dei traccianti non radioattivi (stabilità del tracciante) esoprattutto con l'automazione dei dosaggi (standardizzazione delle procedu-re e delle condizioni ambientali, memorizzazione della curva) le variabilisono state in parte eliminate o attenuate, permettendo di utilizzare la stessa



39Caleidoscopio

curva per più sedute e per tempi più o meno lunghi a seconda dello stru-mento e degli analiti.

Tipologie di curve di calibrazione

Curva classica

Esistono sul mercato analizzatori che richiedono la classica curva a piùpunti (5-7); altri che richiedono l'utilizzo della Master curve .

Nel caso della curva classica si possono avere due possibilità:Esecuzione e memorizzazione della curva → utilizzo della curva nelle

sedute successive verificandola con i controlli.Esecuzione e memorizzazione della curva → aggiornamento della curva

nelle sedute successive mediante utilizzo di 1-2 punti di calibrazione e veri-fica con i controlli. (41)

Master curve

La Master Curve è una curva fornita dall'Azienda produttrice del sistema(reagente-strumento).

I più moderni strumenti richiedono da parte del produttore del sistemauna calibrazione multipoint (Master curve ) e da parte dell'utilizzatore dellecalibrazioni a due punti che servono ad allineare le variabili locali (strumen-tali) alla Master curve.

Ovviamente la scelta del livello dei due calibratori è ottimizzata alloscopo di garantire la precisione, l'accuratezza e la linearità dichiarate per iltest (41).

Criticità teoriche della Master curve:- Numero di analizzatori utilizzati: può essere utilizzato uno o più ana-

lizzatori- Numero dei calibratori: in genere da 7 a 20, compresi i due punti (adju-

stors )che saranno utilizzati in periferia per gli allineamenti- Numero dei replicati: vengono usati numerosi replicati in più seduteUna adeguata gestione di queste criticità da parte del produttore del siste-

ma permette ottimi livelli di precisione de accuratezza.



40 Caleidoscopio

Linee guida per i criteri di accettabilità della calibrazione a due punti:- Tutti i livelli dei controlli devono rientrare nel range.- La Slope dell'aggiustamento deve rientrare nel range definito

dall'Azienda (es. 20% del valore medio di slope ottenuto da almeno 10aggiustamenti dello strumento in Laboratorio).

- L'Intercetta dell'aggiustamento deve rientrare nel range di accettabi-lità ( diverso per metodi competitivi e sandwich).



41Caleidoscopio

Interferenze nel dosaggio immunometrico

Nella maggior parte dei casi le interferenze sono dovute a sostanze cheostacolano il legame Ab-Ag o Ab-Ag* o entrambi in modo diverso. In altricasi l'interferente ostacola l'attivazione del segnale o altera in modo aspecifi-co il legame con la fase solida.

Sono soprattutto gli immunodosaggi ad una fase i più sensibili agli inter-ferenti; quelli a due fasi, grazie ai lavaggi, riescono meglio a ridurre le inter-ferenze.

Tra gli interferenti ricordiamo: l' ”effetto matrice”, farmaci, autoanticorpi,fattore reumatoide e gli anticorpi eterofili.

Autoanticorpi

Gli autoanticorpi legano l'antigene in maniera più o meno specifica.Nei metodi competitivi interferiscono legandosi all' Ag competitivo (Ag*

o Ag in fase solida) ed all'Ag freddo e danno sovrastima o sottostima a secon-da dell'affinità maggiore per l'uno o per l'altro.

Nei metodi non competitivi l'interferenza da autoanticorpi determina sot-tostima dell'Ag poiché legandosi ad esso vengono bloccati gli epitopi perl'Ab* o per l'Ab della fase solida.

Un tipo particolare di interferenza è quella provocata da autoanticorpipolispecifici nei confronti dei dosaggi di Ab. In questo caso si ha sempresovrastima perché gli autoanticorpi simulano gli Ab da dosare (legame conAg*, Ag, Ab*, Ab di cattura).

Anticorpi eterofili

Gli anticorpi eterofili legano gli Ab analitici (cioè il reattivo anticorpale).Nei metodi competitivi l'interferenza è, in genere, meno importante per-

ché viene disturbato in ugual misura sia il legame Ab-Ag* che Ab-Ag.Nei metodi non competitivi si avrà sottostima o sovrastima a seconda del

loro meccanismo di azione, come si ha a proposito degli HAMA.



43Caleidoscopio

Anticorpi umani anti-topo (HAMA)

Gli anticorpi anti-topo (HAMA) sono un interferente che può essere pre-sente nel sangue umano come risposta immune all'esposizione con antigenidel topo.

L'esposizione a questi antigeni può essere iatrogena (scintigrafia, immu-nochemioterapia ed immunoradioterapia), lavorativa (addetti agli stabulari)o ambientale (agricoltori).

I campioni contenenti HAMA possono provocare falsi incrementi o falsidecrementi in immunodosaggi che utilizzano Ab di topo.

I dosaggi sandwich sono i più suscettibili a questi interferenti.

Eccesso di antigene: Fenomeno Prozona o EffettoGancio

In caso di concentrazioni molto elevate di Ag può accadere che una parteva a saturare l'Ab legato alla fase solida ed una parte satura l'Ab* impeden-do la formazione del sandwich. Ne risulta un segnale corrispondente ad unadose falsamente bassa, all'interno della linearità del metodo. I dosaggisandwich ad una fase sono potenzialmente esposti a questo fenomeno.

L'effetto Prozona può essere evitato con metodo sandwich a due fasi nelquale l'Ag in eccesso viene eliminato mediante lavaggi.

Gli immunodosaggi sono inoltre influenzati da altri fattori quali tempe-ratura, pH, tempo di incubazione, detergenti per i lavaggi. Tutte questevariabili sono ottimizzate dalla strumentazione.

Gli immunodosaggi risentono dell'“effetto matrice”determinato dallacomponente proteica e lipidica.

L'“effetto matrice” può interferire col legame Ab-Ag, con l'attivazione delsegnale e con la fase di separazione della frazione libera da quella legata.Anche l'effetto matrice contribuisce alla non identità campione-calibratore aquesto si compensa in parte aggiungendo proteine alla soluzione standard.



44 Caleidoscopio

Aspetti che caratterizzano la qualitàdegli immunodosaggi

La specificità è data dalla capacità di distinguere l'analita in esame da altriaventi struttura simile e dipende essenzialmente dal reagente anticorpale.

La sensibilità analitica di un metodo analitico è data dalla minima quan-tità di analita determinabile significativamente diversa da zero e discrimina-bile tra concentrazioni contigue: si è passati dai mg/ml della spettrofotome-tria, ai ºg/ml della fluorimetria, ai pg/ml dei metodi immunometrici.

La sensibilità dipende dalla avidità del reagente anticorpale e dal trac-ciante. I metodi non competitivi sono più sensibili perché gli Ab, il marcatoed il legato alla fase solida, sono in eccesso e per la legge di azione di massaanche bassissime concentrazioni di analita vengono legate dall'Ab*.

I traccianti chemiluminescenti sono i più sensibili.

La sensibilità funzionale è la più bassa concentrazione alla quale ildosaggio mantiene un CV < 20% tra i saggi. Ricordiamo che quando si parladi 1° , 2° o 3° generazione a proposito di un test ci si riferisce a diversi livellidi sensibilità funzionale.

La precisione è l'inverso della varianza della misura di replicati dellostesso campione e dipende dalla standardizzazione del sistema analitico.

L'accuratezza è la attribuzione della corretta concentrazione dell'analitanel campione (media di consenso per il metodo). (29,63)

Dalla sensibilità, specificità, precisione, accuratezza analitiche e dalla cor-retta individuazione dei valori di riferimento dipendono la sensibilità e spe-cificità cliniche.

Immunodosaggi e compatibilità tra metodi

La comparabilità tra i metodi è ancora un problema irrisolto per la mag-gior parte dei dosaggi immunometrici.

Lo standard utilizzato è uno dei fattori più importanti che condizionano



45Caleidoscopio

la comparabilità tra i metodi; gli altri fattori sono gli anticorpi e la tecnologiastessa.

Lo standard internazionale porta i vari sistemi analitici ad allinearsi tra diloro per quanto riguarda il calibratore; rimane comunque la variabilità dovu-ta all'Ab (affinità diversa, reattività con epitopi diversi) e la variabilità dellatecnologia del test (effetto matrice, interferenza da farmaci, HAMA, autoan-ticorpi, marcatori).

Buoni risultati di comparabilità si sono ottenuti con vari analiti, come conTSH, PSA , HCG, AFP.



46 Caleidoscopio

Metodiche di biologia molecolare

Molti progressi delle tecniche analitiche nel corso degli ultimi 30 annisono stati ottenuti grazie alla scoperta della struttura e della funzionalitàdegli acidi nucleici con la conseguente introduzione della biologia molecola-re nei Laboratori clinici. Il DNA e l'RNA rappresentano il genoma ed il tra-scrittoma degli organismi e la loro manipolazione permette una precisa erapida valutazione sia dei geni che della loro espressione.

Storia

Una delle prime scoperte che ha condotto alla realizzazione della tecno-logia del DNA ricombinante furono, alla fine degli anni '60, le endonucleasidi restrizione batteriche, enzimi in grado di tagliare il DNA in siti specificiche furono il primo passo verso il clonaggio di geni all'interno di vettori (53).Un successivo passo in avanti nello studio del trascrittoma si verificò con lascoperta della trascrittasi inversa (54), enzima virale in grado di copiare lemolecole di RNA, che rappresentano la porzione espressa dei geni, in mole-cole di DNA più stabili. Poi ancora nel 1972 furono prodotte le prime mole-cole di DNA ricombinante ed i primi vettori plasmidici in grado di replicareframmenti di menoma all'interno di cellule batteriche. Nel 1975 E.M.Southern pubblicò la prima procedura che consentiva di riconoscere ed iso-lare un gene da una molecola di DNA complessa tramite ibridazione consonda radioattiva: il “Southern blotting” (51).

Successivamente, tra il 1983 e il 1985, Mullins (32) ideò la reazione a cate-na della polimerasi (PCR): una nuova tecnica che ha reso possibile sintetiz-zare grandi quantità di un frammento di DNA senza clonarlo. La PCR si èdimostrata di eccezionale utilità in molti campi della Medicina e dellaBiologia e costituisce ad oggi la base per la maggior parte delle tecniche dia-gnostiche molecolari (30). Negli ultimi anni le conoscenze in campo moleco-lare si sono ulteriormente arricchite attraverso la conclusione nel 2000 delsequenziamento del genoma umano e grazie alla nascita di numerose tecni-che supportate da sofisticati softwares (40) per lo studio del trascrittomaquali i microarrays ed i microchip (10).



47Caleidoscopio

PCR

La reazione a catena della polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction)è un metodo semplice e rapido per copiare ed amplificare specifiche sequen-ze di DNA di peso molecolare variabile tra le 100 paia di basi fino a 1Kb. Pereffettuare tale reazione è necessario conoscere la sequenza di una breve regio-ne di DNA a ciascuna delle estremità del tratto di interesse sulla base di cuivengono sintetizzati due piccole molecole di DNA complementari dette pri-mers. I primers ibridano le regioni adiacenti la sequenza da amplificare e fun-zionano come innesto per l'enzima DNA polimerasi che viene introdottonella miscela di reazione contenente quantità appropriate dei 4 deossinu-cleotidi trifosfati, i monomeri che costituiscono il DNA. Per effettuare la PCRvengono utilizzate DNApolimerasi estratte da batteri termofili (45) in gradodi funzionare ad elevate temperature. La reazione di PCR avviene all'internodi termociclatori e consiste nella successione di più cicli a 3 fasi regolate dallatemperatura:

1. Denaturazione ad elevata temperatura2. Appaiamento ai primers abbassando la temperatura3. Sintesi di copie di DNA da parte della polimerasi che lega il DNA gra-

zie ai primers a partire dai deossinucleotidi liberi nella miscela di rea-zione.

Una reazione di 30 cicli è in grado di produrre circa un miliardo di copiedel DNA oggetto di studio che può così essere identificato anche se presentein concentrazioni minime nel campione di partenza. L'amplificato può esse-re rilevato tramite una separazione elettroforetica su gel oppure attraversosonde marcate nelle più recenti applicazioni (35,57).

La PCR si è dimostrata di eccezionale utilità nella diagnostica diLaboratorio in particolare nei campi della Genetica medica e nellaMicrobiologia (19). Negli ultimi anni si sono sviluppate diverse varianti diPCR tra cui si possono ricordare:

Nested PCR: due reazioni successive dello stesso tratto DNA per otteneresensibilità maggiore. Viene utilizzata ad esempio nella Microbiologia perdimostrare la presenza del genoma di virus presenti in bassa concentrazionein un campione biologico.

Multiplex PCR: amplificazione contemporanea di più segmenti. E' estre-mamente utile ad esempio per lo studio delle varianti alleliche nella diagno-si di malattie genetiche.

PCR real time: amplificazione a scopo quantitativo. La miscela di reazio-ne comprende sonde che sono in grado di emettere segnali di fluorescenzadopo ciascuna amplificazione. Esistono sistemi omogenei che monitorano laPCR ad ogni ciclo per la rilevazione in tempo reale dei prodotti di reazione



48 Caleidoscopio

pertanto non è necessaria alcuna manipolazione successiva come la separa-zione elettroforetica. Con la tecnologia Real time è anche possibile effettuarePCR multiplex, utilizzando fluorofori diversi.

Alternative alla PCR

Il 90% della diagnostica molecolare si basa sulla PCR in quanto sono incommercio kit di reagenti ed apparecchiature standardizzati in base a questatecnologia (39). Tuttavia esistono metodiche di amplificazione alternativeugualmente sensibili:

LCR: è una reazione a cicli di calore simile alla PCR in cui la DNA poli-merasi è sostituita dalla DNAligasi e sono presenti 4 primers, due per ciascunfilamento di templato. Il prodotto della reazione è il dimero che la ligasiforma su ciascun filamento. Esiste anche in versione Real time ma è poco uti-lizzata in diagnostica a causa della difficoltà di reperire la DNA ligasi termo-stabile (25).

NASBA: è una reazione che ha come scopo l'amplificazione dell'RNA.Anche questa tecnica è ciclica e per questo necessita, anziché di calore, di treenzimi quali una trascrittasi inversa che forma un ibrido DNA/RNA a dop-pia elica, una RnasiH che degrada in modo selettivo l'RNA che si trova in unadoppia elica ed una trascrittasi inversa che retrotrascrive il DNA a singolaelica in RNA (11). Tale tecnica è utile per l'amplificazione dei virus a RNA asingolo filamento, è più rapida di una RT-PCR rapida e non necessita di ter-mociclatore in quanto la reazione è isotermica (62).

BRANCH DNA: è una amplificazione del segnale anziché dell'acidonucleico. Ciò avviene grazie a 2 sonde complementari al target delle qualiuna è immobilizzata su un supporto solido e l'altra lega sonde di secondolivello marcate con enzimi e rilevabili tramite ELISA (9).

Ibridizzazione degli acidi nucleici

Le molecole degli acidi nucleici formate da doppie eliche, se scaldate atemperature elevate, sono in grado di dissociarsi in due filamenti separati:tale processo è detto denaturazione. La denaturazione di un acido nucleiconon è irreversibile: infatti filamenti singoli di DNA o RNA sono in grado di



49Caleidoscopio

ibridizzare con molecole ad essi complementari (50). Il processo di rinatura-zione è correlato alla temperatura ed alla concentrazione delle molecole per-tanto è possibile trovare delle condizioni cosiddette di “stringenza” per lequali due filamenti di acido nucleico si appaiano tra loro solo se perfettamen-te complementari. L'estrema specificità dell'ibridizzazione degli acidi nucleicipermette che sequenze di DNA sintetico marcato possano essere usate comesonde per l'identificazione di molecole complementari. Le sonde marcate ven-gono utilizzate nei Laboratori clinici per individuare acidi nucleici che corri-spondono a sequenze specifiche, soprattutto per la ricerca di mutazioni nelladiagnosi prenatale e nello studio dell'espressione dei geni (59).

Southern e Northern Blot

La tecnica di Laboratorio più antica che si basa sull'ibridizzazione degliacidi nucleici è il Southern blot. Lo scopo di tale tecnica è l'individuazione disequenze specifiche note di DNA, che possono essere gli alleli di un gene omutazioni, all'interno di un estratto. L'estratto di DNA viene tagliato conenzimi di restrizione ed i frammenti separati mediante elettroforesi su gel. IlDNA viene così trasferito dal gel ad una membrana di nitrocellulosa la qualeviene fatta reagire con una soluzione contenente sonde marcate con isotopiradioattivi complementari alla sequenza da ricercare e la rivelazione avvienetramite autoradiografia (51).

Un metodo analogo di ibridizzazione a bande trasferite da gel, chiamatoNorthern blot, analizza l'RNA anziché il DNA. Tale metodo è utilizzato pervalutare l'espressione dei geni a partire da un estratto di RNA (2).

Il Southern e il Northern blot sono metodiche che ormai vengono utiliz-zate raramente nei Laboratori sia a causa dei rischi dal maneggiamento edallo smaltimento del materiale radioattivo che per merito del miglioramen-to e dell'evoluzione di altre tecniche come la PCR.

Ibridizzazione in situ

Gli acidi nucleici si trovano in posizioni precise all'interno di cellule e tes-suti ed una grande quantità di informazioni viene perduta quando tali mole-cole vengono estratte. Per questa ragione sono state sviluppate tecniche incui sonde di acidi nucleici vengono utilizzate in modo simile agli anticorpimarcati per la localizzazione di sequenze specifiche in situ (34).

Le sonde vengono generalmente marcate chimicamente con catene late-rali riconoscibili a loro volta da anticorpi fluorescenti.

Nella diagnostica prenatale l'assetto cromosomico dell'embrione può



50 Caleidoscopio

essere determinato tramite la tecnica di ibridizzazione in situ. LaFluorescente In-Situ (FISH) e' la tecnica più diffusa per la diagnosi di aneuo-ploidie su nuclei interfasici da singole cellule di origine embrionale. Essevengono fissate su vetrini da microscopia e fatte reagire con una soluzionecontenente una serie di sonde di DNA marcate con fluorocromi diversi, consequenza complementare specifica alle regioni cromosomiche che interessa-no la diagnosi. Tali sonde si legano alle regioni cromosomiche per cui pre-sentano omologia, ed eccitate da lampade che emettono luce a diverse lun-ghezze d'onda, emettono un segnale osservabile al microscopio a fluorescen-za, di colore diverso per ciascun marcatore (49). Attraverso la FISH è possi-bile ad esempio stabilire lo stato di ploidia di un blastomero utilizzandosonde che differenziano i diversi cromosomi.



51Caleidoscopio

Microarrays

La tecnologia dei microarray a cDNA, nata nel 1995 (48), rappresenta unmetodo semplice ed economico per lo studio dell'espressione genica. Conquesta tecnica vengono analizzati simultaneamente migliaia di geni:

- su un supporto solido vengono immobilizzate delle sonde costituiteda EST (frammenti amplificati di cDNA che derivano da mRNA retro-trascritti) ognuna delle quali rappresenta un determinato gene.

- Dal campione viene estratto l'RNA, che rappresenta la porzione tra-scritta del genoma. L'RNA viene retrotrascritto in cDNA, marcato efatto ibridare con le sonde immobilizzate.

- Il risultato è la marcatura di una parte delle sonde che rappresentanocosì i geni espressi nel campione.

- L'analisi finale dei dati consiste nel trasformare le intensità della fluo-rescenza associata a ciascuna sonda in una misura dell'abbondanzadei trascritti.

Tali metodi vengono generalmente utilizzati per confrontare simultanea-mente l'espressione genica di due campioni diversi, ad esempio cellule trat-tate con farmaci diversi (65). Una differenza fondamentale tra i microarray egli altri metodi di analisi tradizionali consiste infatti nella dimensione deidati e nella loro gestione.L'analisi simultanea si ottiene facilmente marcandocon coloranti differenti i cDNA dei diversi campioni. La differenza fonda-mentale tra i microarray e gli altri metodi di analisi tradizionali consisteinfatti nella dimensione dei dati e nella loro gestione.

Produzione

I microarrays vengono prodotti e commercializzati attraverso differentimetodiche che permettono di avere delle sonde immobilizzate su vetrini damicroscopio o supporti di silicio. Esistono principalmente due tecnologie pertale produzione:

- Gli SPOTTED MICROARRAYS comprendono sonde di cDNA presin-tetizzate che vengono immobilizzate da macchinari automatici suisupporti.

- Nei CHIP-ARRAYS (ARRAYS PER FOTOLITOGRAFIA) le sonde ven-gono sintetizzate in situ cioè direttamente sul supporto solido (37).



53Caleidoscopio

Tale metodo permette la sintesi di oligonucleotidi di una lunghezzamassima di 25 basi.

Tipologie di analisi

I MICROARRAYS A DOPPIO CANALE sono sempre spotted microarraysin cui l'ibridazione di due campioni avviene contemporaneamente su unostesso vetrino pertanto la valutazione finale dell'espressione è relativa: si ana-lizza unicamente in quale dei due campioni prevale l'espressione di ciascungene valutando la colorazione della sonda.

I MICROARRAYS A SINGOLO CANALE possono essere prodotti sia perfotolitografia che essere presintetizzati.

Vi sono sonde dette “perfect match” lunghe al massimo 25 nucleotidi eperfettamente complementari ad una porzione genica. Per ciascuna “perfectmatch” esiste una “miss match”, sonda che differisce dalla precedente per unnucleotide e non essendo perfettamente complementare serve a valutare l'a-specificità (52). Con questo metodo è possibile ibridare un solo campione allavolta e la valutazione finale dell'espressione è di tipo assoluto (64).

Marcatura dei campioni

I campioni da analizzare vengono marcati con coloranti fluorescenti, i piùutilizzati sono i fluorofori Cy3 e Cy5, oppure con basi biotinilate che vengo-no poi rivelate con streptoavidina.

La marcatura, solitamente, avviene contemporaneamente alla costruzionedelle sonde: durante la retrotrascrizione dell' mRNA in cDNA vengono inse-rite nella reazione basi azotate biotinilate o coniugate con fluorofori.

Applicazioni

La tecnologia dei microarrays viene utilizzata per studi comparativi del-l'espressione genica in campioni come potrebbero essere cellule trattate confarmaci o altre sostanze rispetto a materiale di controllo non trattato.



54 Caleidoscopio

I microarrays possono essere anche usati per lo studio di genotipi: gli SNPmicroarrays vengono usati per identificare i polimorfismi di singolo nucleo-tide, ovvero gli SNPs, tratti di DNA ipervariabili nell'ambito della stessa spe-cie, responsabili della variazione genetica (8) e della suscettibilità individua-le a manifestare determinate malattie (13).Gli SNP microarrays trovanoimpiego in genetica forense, in farmacogenetica, per lo studio di relazione traparticolari genotipi e diverse risposte ai farmaci e per tracciare i profili dimutazione somatica nelle cellule tumorali.

I Protein Microarrays si ottengono utilizzando proteine come sonde. Essisono usati per identificare le interazioni proteina-proteina o per identificare isubstrati degli enzimi o ancora per identificare i recettori di piccole molecolebiologicamente attive. Le proteine più comunemente nei protein microarrayssono gli anticorpi, usati come sonde per rilevare proteine da lisati cellulari (14).

Analisi dei dati

I livelli diversi di fluorescenza di un microarray indicano livelli diversi diibridizzazione e quindi di espressione genica. Il segnale viene rilevato da unoscanner ed in seguito sottoposto ad algoritmi di filtrazione e di pulizia delsegnale e convertito in valori numerici. Un esperimento di analisi dei profilidi espressione fornisce come risultato una matrice di dati, in cui le righe rap-presentano i geni monitorati e le colonne corrispondono alle diverse condi-zioni sperimentali: punti temporali, condizioni fisiologiche, tessuti. Ogni ele-mento della matrice rappresenta quindi il livello di espressione di un parti-colare gene in uno specifico stato fisiologico. Ciascuna colonna è data da unvettore che ha tante dimensioni quanti sono i geni o le sequenze immobiliz-zate sull'array. La gestione e l'interpretazione dell'enorme quantità di datigenerata dalle matrici ad alta densità rappresentano un aspetto fondamenta-le di questa tecnologia. Infatti, la loro applicazione nello studio dei profilidell'espressione genica produce volumi di informazioni tali da limitare l'ap-plicazione delle tecniche modellistiche classiche. Tali tecniche non sono gene-ralmente applicabili in maniera soddisfacente in presenza di sistemi pococaratterizzati e descritti da quantità grandissime di dati. E’ necessario, quin-di, avere a disposizione i database mining: una serie di tecniche computazio-nali capaci di gestire ed interpretare questi enormi database nonché di inter-facciarsi con gli strumenti bioinformatici per l'analisi funzionale. Si defini-scono tecniche di database mining gli strumenti informatici utilizzabili perl'esplorazione e l'analisi di grandi quantità di dati al fine di estrarre motivicaratteristici e persistenti, i patterns (46). Gli algoritmi che costituiscono il



55Caleidoscopio

database mining derivano da campi quali la statistica, la pattern recognition,l'intelligenza artificiale e l'analisi dei segnali; essi sfruttano le informazioniricavate direttamente dai dati per creare dei modelli empirici in grado didescrivere il comportamento di un sistema complesso. Nel caso dei profili diespressione genica, le tecniche di database mining rappresentano un utilestrumento per identificare ed isolare particolari pattern di espressione che difatto rappresentano delle vere e proprie impronte digitali genetiche di undeterminato stato fisiologico. L'analisi dei dati degli array di cDNA è nor-malmente basata sull'uso sinergico di test di ipotesi e di sistemi per l'estra-zione della conoscenza. I test di ipotesi sono sostanzialmente degli approccidi tipo top-down con i quali si ricercano nei dati le conferme sperimentali adipotesi precedentemente formulate. L'estrazione della conoscenza può essereintesa invece come un approccio bottom-up nel quale sono i dati stessi cheforniscono le indicazioni necessarie alla formulazione di nuove ipotesi. Unaspetto cruciale dell'applicazione di queste procedure è l'identificazione ditutti quei geni che manifestano un'elevata attività in un determinato statofisiologico (37). Questi geni attivi e le loro relazioni possono essere identifi-cati attraverso tecniche quali Mean Hypothesis Testing (MHT), ClusterAnalysis (CA), Principal Component Analysis (PCA) e Decision Tree (DT).



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Indice

Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . » 3

Scelta delle tecnologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 5

Modello di Stockmann . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 5

Microscopia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 7

Storia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 7

Funzionamento e tipologie dei microscopi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 7

Microscopio ottico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 8

Microscopio elettronico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 10

TEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 11

SEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 11

Spettrofotometria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 13

Spettrofotometro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 13

Quantificazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 14

Cromatografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 15

Tipi di cromatografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 17

Cromatografia su carta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 17

Cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 17

Cromatografia su strato sottile (TLC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 18

Cromatografia a scambio ionico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 19

Metodiche immunologiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 21

Legame antigene-anticorpo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 21

Tecniche per l'identificazione e la quantificazione di proteine . . . . . . . .» 23



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Precipitazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . » 24

Gel diffusione doppia bidimensionale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 24

Gel diffusione radiale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 24

Immunoelettroforesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 25

Agglutinazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 25

Inibizione dell'emoagglutinazione da virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 26

Fissazione del complemento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . » 26

Sieroneutralizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 27

Immunofluorescenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 27

Immunodosaggi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 29

Immunodosaggi diretti e indiretti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 29

Immunodosaggi competitivi o non competitivi . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 29

FPIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 32

MEIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 32

CMIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 33

ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 33

Costituenti degli immunodosaggi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 35

Antigeni marcati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 35

Reagenti anticorpali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 35

Marcatori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 36

Calibratori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 37

Curve di calibrazione negli immunodosaggi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 39

Tipologie di curve di calibrazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 40

Interferenze nel dosaggio immunometrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 43

Autoanticorpi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 43



65Caleidoscopio

Anticorpi esterofili . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 43

Anticorpi umani anti-topo (HAMA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 44

Eccesso di antigene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 44

Aspetti che caratterizzano la qualità degli immunodosaggi . . . . . . . . . .» 45

Immunodosaggi e comparabilità tra metodi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 45

Metodiche di biologia molecolare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 47

Storia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 47

PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 48

Alternative alla PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 49

Ibridizzazione degli acidi nucleici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 49

Southern e Northern blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 50

Ibridizzazione in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 50

Microarrays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 53

Produzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 53

Tipologie di analisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 54

Marcatura dei campioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 54

Applicazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 54

Analisi dei dati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . » 55

Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . » 57

Indice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .» 63



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C a l e i d o s c o p i oItal iano

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Novembre ’84.9. Kubasik N.P.: Il dosaggio radioimmunologico (1). Dicembre ’84.10. Kubasik N.P.: Il dosaggio radioimmunologico (2) parte prima. Gennaio’85.11. Kubasik N.P.: Il dosaggio radioimmunologico (2) parte seconda. Febbraio ’85.12.Kubasik N.P.: Il dosaggio radioimmunologico (3) parte prima. Aprile ’85.13. Nacamulli D, Girelli M.E, Zanatta G.P, Busnardo B.: Il TSH. Giugno ’85.14. Facchinetti F. e Petraglia F.: La ββ-endorfina plasmatica e liquorale. Agosto ’85.15. Baccini C.: Le droghe d’abuso (1). Ottobre ’85.16. Kubasik N.P.: Il dosaggio radioimmunologico (3) parte seconda. Dicembre ’85.17. Nuti R.: Fisiologia della vitamina D: Trattamento dell’osteoporosi post-menopausale.

Febbraio ’8618. Cavallaro E.: Ipnosi: una introduzione psicofisiologica. Marzo ’86.19. Fanetti G.: AIDS: trasfusione di sangue emoderivati ed emocomponenti. Maggio ’86.20. Fiorini I., Nardini A.: Toxoplasmosi, immunologia e clinica. Luglio ’86.21. Limone P.: Il feocromocitoma. Settembre ’86.22. Bulletti C., Filicori M., Bolelli G.F., Flamigni C.: Il Testicolo. Aspetti morfo-funzionali e

clinici. Novembre ’86.23. Bolcato A.: Allergia. Gennaio ’87.24. Kubasik N.P.: Il dosaggio enzimoimmunologico e fluoroimmunologico. Febbraio ’87.25. Carani C.: Patologie sessuali endocrino-metaboliche. Marzo ’87.26. Sanna M., Carcassi R., Rassu S.: Le banche dati in medicina. Maggio ’87.27. Bulletti C., Filicori M., Bolelli G.F., Jasonni V.M., Flamigni C.: L’amenorrea. Giugno ’87.28. Zilli A., Pagni E., Piazza M.: Il paziente terminale. Luglio ’87.29. Pisani E., Montanari E., Patelli E., Trinchieri A., Mandressi A.: Patologie prostatiche.

Settembre ’87.30. Cingolani M.: Manuale di ematologia e citologia ematologica. Novembre ’87.




67Caleidoscopio

31. Kubasik N.P.: Ibridomi ed anticorpi monoclonali. Gennaio ’88.32. Andreoli C., Costa A., Di Maggio C.: Diagnostica del carcinoma mammario. Febbraio ’88.33. Jannini E.A., Moretti C., Fabbri A., Gnessi L., Isidori A.: Neuroendocrinologia dello stress.

Marzo ’88.34. Guastella G., Cefalù E., Carmina M.: La fecondazione in vitro. Maggio ‘88.35. Runello F., Garofalo M.R., Sicurella C., Filetti S., Vigneri R.: Il gozzo nodulare. Giugno ’88.36. Baccini C.: Le droghe d’abuso (2). Luglio ’88.37. Piantino P., Pecchio F.: Markers tumorali in gastroenterologia. Novembre ’88.38. Biddau P.F., Fiori G.M., Murgia G.: Le leucemie acute infantili. Gennaio ’89.39. Sommariva D., Branchi A.: Le dislipidemie. Febbraio ‘89.40. Butturini U., Butturini A.: Aspetti medici delle radiazioni. Marzo ‘89.41. Cafiero F., Gipponi M., Paganuzzi M.: Diagnostica delle neoplasie colo-rettali. Aprile ‘89.42. Palleschi G.: Biosensori in Medicina. Maggio ‘89.43. Franciotta D.M., Melzi D’Eril G.V. e Martino G.V.: HTLV-I. Giugno ‘89.44. Fanetti G.: Emostasi: fisiopatologia e diagnostica. Luglio ‘89.45. Contu L., Arras M.: Le popolazioni e le sottopopolazioni linfocitarie. Settembre ‘89.46. Santini G.F., De Paoli P., Basaglia G.: Immunologia dell’occhio. Ottobre ‘89.47. Gargani G., Signorini L.F., Mandler F., Genchi C., Rigoli E., Faggi E.: Infezioni opportu-

nistiche in corso di AIDS. Gennaio ‘90.48. Banfi G., Casari E., Murone M., Bonini P.: La coriogonadotropina umana. Febbraio ‘90.49. Pozzilli P., Buzzetti R., Procaccini E., Signore E.: L’immunologia del diabete mellito.

Marzo ‘90.50. Cappi F.: La trasfusione di sangue: terapia a rischio. Aprile ‘90.51. Tortoli E., Simonetti M.T.: I micobatteri. Maggio ‘90.52. Montecucco C.M., Caporali R., De Gennaro F.: Anticorpi antinucleo. Giugno ‘90. 53. Manni C., Magalini S.I. e Proietti R.: Le macchine in terapia intensiva. Luglio ‘90.54. Goracci E., Goracci G.: Gli allergo-acari. Agosto ‘90. 55. Rizzetto M.: L’epatite non A non B (tipo C). Settembre ‘90.56. Filice G., Orsolini P., Soldini L., Razzini E. e Gulminetti R.: Infezione da HIV-1: patoge-

nesi ed allestimento di modelli animali. Ottobre ‘90.57. La Vecchia C. Epidemiologia e prevenzione del cancro (I). Gennaio ‘91.58. La Vecchia C. Epidemiologia e prevenzione del cancro (II). Febbraio ‘91.59. Santini G.F., De Paoli P., Mucignat G., e Basaglia G., Gennari D.: Le molecole dell’adesi-

vità nelle cellule immunocompetenti. Marzo ‘91.60. Bedarida G., Lizioli A.: La neopterina nella pratica clinica. Aprile ‘91.61. Romano L.: Valutazione dei kit immunochimici. Maggio ‘91.62. Dondero F. e Lenzi A.: L’infertilità immunologica. Giugno ‘91.63. Bologna M. Biordi L. Martinotti S.: Gli Oncogèni. Luglio ‘91.64. Filice G., Orsolini P., Soldini L., Gulminetti R., Razzini E., Zambelli A. e Scevola D.: In-

fezione-malattia da HIV in Africa. Agosto ‘91. 65. Signore A., Chianelli M., Fiore V., Pozzilli P., Andreani D.: L’immunoscintigrafia nella dia-

gnosi delle endocrinopatie autoimmuni. Settembre ‘91.66. Gentilomi G.A.: Sonde genetiche in microbiologia. Ottobre ‘91.67. Santini G.F., Fornasiero S., Mucignat G., Besaglia G., Tarabini-Castellani G. L., Pascoli

L.: Le sonde di DNA e la virulenza batterica. Gennaio ‘92.68. Zilli A., Biondi T.: Il piede diabetico. Febbraio ‘92.



68 Caleidoscopio

69. Rizzetto M.: L’epatite Delta. Marzo ‘92.70. Bracco G., Dotti G., Pagliardini S., Fiorucci G.C.: Gli screening neonatali. Aprile ‘92.71. Tavani A., La Vecchia C.: Epidemiologia delle patologie cardio e cerebrovascolari. Luglio ‘92.72. Cordido F., Peñalva A., De la Cruz L. F., Casanueva F. F., Dieguez C.: L’ormone della cre-

scita. Agosto ‘92. 73. Contu L., Arras M.: Molecole di membrana e funzione immunologica (I). Settembre ‘92.74. Ferrara S.:Manuale di laboratorio I. Ottobre ‘92.75. Gori S.: Diagnosi di laboratorio dei patogeni opportunisti. Novembre ‘92.76. Ferrara S.: Manuale di laboratorio II. Gennaio ‘93.77. Pinna G., Veglio F., Melchio R.: Ipertensione Arteriosa. Febbraio ‘93.78. Alberti M., Fiori G.M., Biddau P.: I linfomi non Hodgkin. Marzo ‘93.79. Arras M., Contu L.: Molecole di membrana e funzione immunologica (II). Aprile ‘93.80. Amin R.M., Wells K.H., Poiesz B.J.: Terapia antiretrovirale. Maggio ‘93.81. Rizzetto M.: L’epatite C. Settembre ‘93.82. Andreoni S.: Diagnostica di laboratorio delle infezioni da lieviti. Ottobre ‘93.83.Tarolo G.L., Bestetti A., Maioli C., Giovanella L.C., Castellani M.: Diagnostica con radio-

nuclidi del Morbo di Graves-Basedow. Novembre ‘93.84. Pinzani P., Messeri G., Pazzagli M.: Chemiluminescenza. Dicembre ‘93.85. Hernandez L.R., Osorio A.V.: Applicazioni degli esami immunologici. Gennaio 94.86. Arras M., Contu L.: Molecole di Membrana e funzione immunologica. Parte terza: I lnfo-

citi B. Febbraio ‘94.87. Rossetti R.: Gli streptoccocchi beta emolitici di gruppo B (SGB). Marzo ‘94.88. Rosa F., Lanfranco E., Balleari E., Massa G., Ghio R.: Marcatori biochimici del rimodel-

lamento osseo. Aprile ‘94.89. Fanetti G.: Il sistema ABO: dalla sierologia alla genetica molecolare. Settembre ‘94.90. Buzzetti R., Cavallo M.G., Giovannini C.: Citochine ed ormoni: Interazioni tra sistema

endocrino e sistema immunitario. Ottobre ‘94.91. Negrini R., Ghielmi S., Savio A., Vaira D., Miglioli M.: Helicobacter pylori. Novembre ‘94.92. Parazzini F.: L’epidemiologia della patologia ostetrica. Febbraio ‘95.93. Proietti A., Lanzafame P.: Il virus di Epstein-Barr. Marzo ‘95.94. Mazzarella G., Calabrese C., Mezzogiorno A., Peluso G.F., Micheli P, Romano L.: Im-

munoflogosi nell’asma bronchiale. Maggio ‘95.95. Manduchi I.: Steroidi. Giugno ‘95.96. Magalini S.I., Macaluso S., Sandroni C., Addario C.: Sindromi tossiche sostenute da prin-

cipi di origine vegetale. Luglio ‘95.97. Marin M.G., Bresciani S., Mazza C., Albertini A., Cariani E.: Le biotecnologie nella dia-

gnosi delle infezioni da retrovirus umani. Ottobre ‘95.98.La Vecchia C., D’Avanzo B., Parazzini F., Valsecchi M.G.: Metodologia epidemiologica e

sperimentazione clinica. Dicembre ‘95.99.Zilli A., Biondi T., Conte M.: Diabete mellito e disfunzioni conoscitive. Gennaio ‘96.100.Zazzeroni F., Muzi P., Bologna M.: Il gene oncosoppressore p53: un guardiano del genoma.

Marzo ‘96.101.Cogato I. Montanari E.: La Sclerosi Multipla. Aprile ‘96.102.Carosi G., Li Vigni R., Bergamasco A., Caligaris S., Casari S., Matteelli A., Tebaldi A.:

Malattie a trasmissione sessuale. Maggio ‘96.



69Caleidoscopio

103.Fiori G. M., Alberti M., Murtas M. G., Casula L., Biddau P.: Il linfoma di Hodgkin. Giu-gno ‘96.

104.Marcante R., Dalla Via L.: Il virus respiratorio sinciziale. Luglio ‘96.105.Giovanella L., Ceriani L., Roncari G.: Immunodosaggio dell’antigene polipeptidico tis-

sutale specifico (TPS) in oncologia clinica: metodologie applicative. Ottobre ‘96.106.Aiello V., Palazzi P., Calzolari E.: Tecniche per la visualizzazione degli scambi cromatici

(SCE): significato biologico e sperimentale. Novembre ‘96.107.Morganti R.: Diagnostica molecolare rapida delle infezioni virali. Dicembre ‘96.108.Andreoni S.: Patogenicità di Candida albicans e di altri lieviti. Gennaio ‘97.109.Salemi A., Zoni R.: Il controllo di gestione nel laboratorio di analisi. Febbraio ‘97.110.Meisner M.: Procalcitonina. Marzo ‘97.111.Carosi A., Li Vigni R., Bergamasco A.: Malattie a trasmissione sessuale (2). Aprile ‘97.112.Palleschi G. Moscone D., Compagnone D.: Biosensori elettrochimici in Biomedicina.

Maggio ‘97.113.Valtriani C., Hurle C.: Citofluorimetria a flusso. Giugno ‘97.114.Ruggenini Moiraghi A., Gerbi V., Ceccanti M., Barcucci P.: Alcol e problemi correlati.

Settembre ‘97.115.Piccinelli M.: Depressione Maggiore Unipolare. Ottobre ‘97.116.Pepe M., Di Gregorio A.: Le Tiroiditi. Novembre ‘97.117.Cairo G.: La Ferritina. Dicembre ‘97.118.Bartoli E.: Le glomerulonefriti acute. Gennaio ‘98.119.Bufi C., Tracanna M.: Computerizzazione della gara di Laboratorio. Febbraio ‘98.120.National Academy of Clinical Biochemistry: Il supporto del laboratorio per la diagnosi ed

il monitoraggio delle malattie della tiroide. Marzo ‘98.121.Fava G., Rafanelli C., Savron G.: L’ansia. Aprile ‘98.122.Cinco M.: La Borreliosi di Lyme. Maggio ‘98.123.Giudice G.C.: Agopuntura Cinese. Giugno ‘98.124.Baccini C.: Allucinogeni e nuove droghe (1). Luglio ‘98.125.Rossi R.E., Monasterolo G.: Basofili. Settembre ‘98.126. Arcari R., Grosso N., Lezo A., Boscolo D., Cavallo Perin P.: Eziopatogenesi del diabete

mellito di tipo 1. Novembre ‘98.127.Baccini C.: Allucinogeni e nuove droghe (1I). Dicembre ‘98.128.Muzi P., Bologna M.: Tecniche di immunoistochimica. Gennaio ‘99.129.Morganti R., Pistello M., Vatteroni M.L.: Monitoraggio dell’efficacia dei farmaci antivi-

rali. Febbraio ‘99.130.Castello G., Silvestri I.:Il linfocita quale dosimetro biologico. Marzo ‘99.131.AielloV., Caselli M., Chiamenti C.M.: Tumorigenesi gastrica Helicobacter pylori - corre-

lata. Aprile ‘99.132.Messina B., Tirri G., Fraioli A., Grassi M., De Bernardi Di Valserra M.: Medicina

Termale e Malattie Reumatiche. Maggio ‘99.133.Rossi R.E., Monasterolo G.: Eosinofili. Giugno ‘99.134.Fusco A., Somma M.C.: NSE (Enolasi Neurono-Specifica). Luglio ‘99.135.Chieffi O., Bonfirraro G., Fimiani R.: La menopausa. Settembre ‘99.136.Giglio G., Aprea E., Romano A.: Il Sistema Qualità nel Laboratorio di Analisi. Ottobre

‘99.



70 Caleidoscopio

137.Crotti D., Luzzi I., Piersimoni C.: Infezioni intestinali da Campylobacter e microrganismicorrelati. Novembre ‘99.

138.Giovanella L.: Tumori Neuroendocrini: Diagnosi e fisiopatologia clinica. Dicembre ‘99.139.Paladino M., Cerizza Tosoni T.: Umanizzazione dei Servizi Sanitari: il Case Management.

Gennaio 2000.140.La Vecchia C.: Come evitare la malattia. Febbraio 2000.141.Rossi R.E., Monasterolo G.: Cellule dendritiche. Marzo 2000.142.Dammacco F.: Il trattamento integrato del Diabete tipo 1 nel bambino e adolescente (I).

Aprile 2000.143.Dammacco F.: Il trattamento integrato del Diabete tipo 1 nel bambino e adolescente (II).

Maggio 2000.144.Croce E., Olmi S.: Videolaparoscopia. Giugno 2000.145.Martelli M., Ferraguti M.: AllergoGest. Settembre 2000.146.Giannini G., De Luigi M.C., Bo A., Valbonesi M.: TTP e sindromi correlate: nuovi oriz-

zonti diagnostici e terapeutici. Gennaio 2001.147.Rassu S., Manca M.G., Pintus S., Cigni A.: L’umanizzazione dei servizi sanitari. Febbraio

2001.148. Giovanella L.: I tumori della tiroide. Marzo 2001.149.Dessì-Fulgheri P., Rappelli A.: L’ipertensione arteriosa. Aprile 2001.150. The National Academy of Clinical Biochemistry: Linee guida di laboratorio per lo scree-

ning, la diagnosi e il monitoraggio del danno epatico. Settembre 2001.151.Dominici R.: Riflessioni su Scienza ed Etica. Ottobre 2001.152.Lenziardi M., Fiorini I.: Linee guida per le malattie della tiroide. Novembre 2001.153.Fazii P.: Dermatofiti e dermatofitosi. Gennaio 2002.154.Suriani R., Zanella D., Orso Giacone G., Ceretta M., Caruso M.: Le malattie infiamma-

torie intestinali (IBD) Eziopatogenesi e Diagnostica Sierologica. Febbraio 2002.155. Trombetta C.: Il Varicocele. Marzo 2002.156.Bologna M., Colorizio V., Meccia A., Paponetti B.: Ambiente e polmone. Aprile 2002.157. Correale M., Paradiso A., Quaranta M.: I Markers tumorali. Maggio 2002.158. Loviselli A., Mariotti S.: La Sindrome da bassa T3. Giugno 2002.159. Suriani R., Mazzucco D., Venturini I., Mazzarello G., Zanella D., Orso Giacone G.:

Helicobacter Pylori: stato dell’arte. Ottobre 2002.160. Canini S.: Gli screening prenatali: marcatori biochimici, screening nel 1° e 2° trimestre di

gravidanza e test integrato. Novembre 2002.161. Atzeni M.M., Masala A.: La ββ-talassemia omozigote. Dicembre 2002.162. Di Serio F.: Sindromi coronariche acute. Gennaio 2003.163. Muzi P., Bologna M.: Il rischio di contaminazione biologica nel laboratorio biosanitario.

Febbraio 2003.164. Magni P., Ruscica M., Verna R., Corsi M.M.: Obesità: fisiopatologia e nuove prospettive

diagnostiche. Marzo 2003.165. Magrì G.: Aspetti biochimici e legali nell’abuso alcolico. Aprile 2003.166. Rapporto dello Hastings Center: Gli scopi della medicina: nuove priorità. Maggio 2003.167. Beelke M., Canovaro P., Ferrillo F.: Il sonno e le sue alterazioni. Giugno 2003.168. Macchia V., Mariano A.: Marcatori tumorali nel cancro della vescica. Luglio 2003.169. Miragliotta G., Barra Parisi G., De Sanctis A., Vinci E.: La Turbercolosi Polmonare:

Diagnostica di Laboratorio. Agosto 2003.



71Caleidoscopio

170. Aebischer T.: Il Comitato Internazionale della Croce Rossa ed il Diritto InternazionaleUmanitario. Settembre 2003.

171. Martino R., Frallicciardi A., Tortoriello R.: Il manuale della sicurezza. Ottobre 2003.172. Canigiani S. e Volpini M.: Infarto acuto del miocardio: biochimica del danno cellulare e

marcatori di lesione. Novembre 2003.173. La Brocca A. Orso Giacone G. Zanella D. Ceretta M.: Laboratorio e clinica delle princi-

pali affezioni tiroidee. Dicembre 2003.174. Savron G.: Le Fobie. Gennaio 2004.175. Paganetto G.: Evoluzione storica del rischio di patologie umane per contaminazione chi-

mica ambientale. Febbraio 2004.176. Giovanella L.: Iperparatiroidismo e tumori paratiroidei. Marzo 2004.177. Severino G., Del Zompo M.: Farmacogenomica: realtà e prospettive per una “Medicina

Personalizzata”. Aprile 2004.178 Arigliano P.L.: Strategie di prevenzione dell’allergia al lattice nelle strutture sanitarie.

Maggio 2004.179. Bruni A.: Malattia di Alzheimer e Demenza Frototemporale. Giugno 2004.180. Perdelli F., Mazzarello G., Bassi A.M., Perfumo M., Dallera M.: Eziopatogenesi e dia-

gnostica allergologica. Luglio 2004.181. Franzoni E., Gualandi P. Pellegrini G.: I disturbi del comportamento alimentare. Agosto

2004.182. Grandi G., Peyron F.: La toxoplasmosi congenita. Settembre 2004.183. Rocca D.L., Repetto B., Marchese A., Debbia E.A: Patogeni emergenti e resistenze batte-

riche. Ottobre 2004.184. Tosello F., Marsano H.: Scientific English Handout. Novembre 2004.185. La Brocca A., Orso Giacone G., Zanella D.: Ipertensione arteriosa secondaria: clinica e

laboratorio. Dicembre 2004.186. Paganetto G.: Malattie Neoplastiche: dalla Paleopatologia alle Fonti Storiche. Gennaio

2005.187. Savron G.: La sindrome dai mille tic: il disturbo di Gilles de la Tourette. Febbraio 2005.188. Magrì G., Baghino E., Floridia M., Ghiara F.: Leishmania. Marzo 2005.189. Lucca U., Forloni G., Tiraboschi P., Quadri P., Tettamanti M., PasinaL.: Invecchiamen-

to, deterioramento cognitivo e malattia di Alzheimer. Aprile 2005.190. Volpe G., Delibato E., Orefice L., Palleschi G.: Tossinfezioni alimentari e metodiche

recenti ed innovative per la ricerca dei batteri patogeni responsabili. Maggio 2005.191. Mazzarello M.G., Albalustri G., Audisio M., Perfumo M., L. Cremonte G.: Aerobiologia

ed allergopatie. Giugno 2005.192. Scalabrino G., Veber D., Mutti E.:Nuovi orizzonti biologici per la vitamina B12. Luglio

2005.193. Zepponi E.: Guida pratica per gli utenti del laboratorio analisi. Settembre 2005.194. Faricelli R., Esposito S., Martinotti S.: La sindrome da anticorpi anti-fosfolipidi. Ottobre

2005.195. Baccini C., Bezzi F., Conti M., Tazzari V.: Doping e antidoping nello sport. Novembre

2005.196. Lozzi M.: La Mediazione pacifica dei conflitti. Una risorsa socio-relazionale in ambito

medico-sanitario. Dicembre 2005.



72 Caleidoscopio

197. Bracco G.: Progettare un Laboratorio di Analisi. Gennaio 2006.198. Angelucci A.: Apoptosi e sistema immunitario: regolazione e patologie associate.

Febbraio 2006.199. Commissione Tecnica sul Rischio Clinico: Risk management in Sanità. Il problema

degli errori. Marzo 2006200. Casati G., Marchese E., Roberti V., Vichi M.C.: La gestione dei processi clinico

assistenziali per il miglioramento delle prassi. Aprile 2006.201. Zanella D., Ceretta M., Orso Giacone G.: Peptidi natriuretici: nuove frontiere in

cardiologia? Maggio 2006.202. Cicala M., Dal Lago U., Vinci P., Maggiorotti M.: L’accusa di malpractice in ambi-

to medico. Giugno 2006.203. Martino R.: Manuale Qualità UNI EN ISO 9001. Luglio 2006.204. Mazzarello M.G., Arata M., Perfumo M., Marchese A., Debbia E.A.: Tubercolosi

e micobatteri. Settembre 2006.205. Matrullo R.: Anoressia: la negazione della sessualità come difesa narcisistica.

Ottobre 2006.206. Crotti D.: Le parassitosi intestinali ed uro-genitali. Novembre 2006.207. Orso Giacone G., Zanella D., Ceretta M.: Il referto interpretativo in infettivologia.

Dicembre 2006.208. Baghino E., Magrì G., Nicoletti L., Novaro G., Vignale C., Mazzei C.: Stato del-

l’arte delle aneuploidie fetali, dall’indagine clinica prenatale alla diagnosi anatomo-patologica. Gennaio 2007.

209. Mazzarello M.G., Brunetti R., Perfumo M., Torriglia A.M., Montresor G.:Principali Tecniche Analitiche in uso nei Laboratori di Analisi Chimico Cliniche eMicrobiologiche. Febbraio 2007.

I volumi disponibili su Internet nel sito www.medicalsystems.itsono riportati in nero mentre in grigio quelli non ancora dispo-nibili su Internet.

Inoltre sono disponibili un limitato numero di copie di alcuninumeri del Caleidoscopio che ormai sono “storiche”. Qualoramancassero per completare la collana potete farne richiesta alcollaboratore Medical Systems della Vostra zona. I numerisono: Caleidoscopio 14, 18, 33, 40, 48, 49, 50, 54, 65, 68, 84, 100,106, 118, 121, 126, 129, 130, 131, 132, 133, 134. I volumi verran-no distribuiti sino ad esaurimento e non verranno ristampati senon in nuove edizioni.

CaleidoscopioRivista mensile di Medicina

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21-11-2007 Miglioramento delle competenze professionali nell’uso del PathFinder (corso avanzato). Genova

07-11-2007 Miglioramento delle competenze professionali di base nell’uso dell’Immulite Genova



17-10-2007 Metodiche di trasformazione dei dati Genova


16-10-2007 Miglioramento delle competenze professionali di base nell’uso del PathFinder Genova

11-10-2007 Comunicazione efficace in sanità: dinamiche di relazione (Direzione - Staff - Paziente) Caltagirone (CT)





19-09-2007 Utilizzo di curve ROC nell’analisi di dati di microarrays Genova




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ISSN 0394 3291 Caleidoscopio - Medical Systems SpA · Maria Gabriella Mazzarello, Rinaldo Brunetti,...

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