Isolation and characterization of bacteria producing Isolation and characterization of bacteria producing substances against gram negative bacteriasubstances against gram negative bacteria

組員：郭政儒、盧俊仲報告時間： 2004/12/28

FrameworkFramework

土壤採樣土壤採樣

選擇性培養基篩菌選擇性培養基篩菌

純化細菌純化細菌 純化放線菌純化放線菌

指標菌測試抑菌效果指標菌測試抑菌效果

過篩處理

SCATSA, 1/10 TSA

MaterialMaterial

培養基培養基

Media used to enumerate soil bacteriaMedia used to enumerate soil bacteriaTryptic Soy AgarTryptic Soy Agar + 100ppm cycloheximide + 100ppm cycloheximide

1/10 Tryptic Soy Agar1/10 Tryptic Soy Agar + 100ppm cycloheximide+ 100ppm cycloheximide

Media for isolation and enumeration of soil ActinomycetesMedia for isolation and enumeration of soil ActinomycetesStarch-Casein agarStarch-Casein agar (kuster and Williams, 1964)(kuster and Williams, 1964)

StarchStarch

KNOKNO33

KK22HPOHPO44

CaCOCaCO33

AgarAgar

10.0 g10.0 g

2.0 g 2.0 g

2.0 g2.0 g

0.02 g0.02 g

15 g15 g

Casein(vitamin free)Casein(vitamin free)

NaClNaCl

MgSOMgSO44 ．． 7H7H22OO

FeSOFeSO44 ．． 7H7H22OO

Distilled waterDistilled water

0.3 g0.3 g

2.0 g2.0 g

0.5 g0.5 g

0.01 g0.01 g

1.0 L1.0 L

MethodMethod

分離純菌分離純菌

採樣土壤－陽明山、將軍嶺採樣土壤－陽明山、將軍嶺↓↓

土壤過篩土壤過篩 (2×2mm)(2×2mm)↓↓

取新鮮土壤樣本取新鮮土壤樣本 1 g1 g↓↓

將土樣加入將土樣加入 9 ml9 ml 無菌食鹽水中無菌食鹽水中 (0.85 %)(0.85 %) 震盪混合震盪混合↓↓

土壤懸浮液土壤懸浮液↓↓

再以再以 9 ml9 ml 無菌食鹽水做連續稀釋無菌食鹽水做連續稀釋↓↓

震盪懸浮之後取不同稀釋濃度混合液震盪懸浮之後取不同稀釋濃度混合液 0.1 ml0.1 ml 置入選擇培養基置入選擇培養基↓↓

28 – 30℃28 – 30℃培養四天並觀察結果培養四天並觀察結果↓↓

取平板上單一菌落做四區劃線分離純菌取平板上單一菌落做四區劃線分離純菌↓↓

培養數天後挑出單一菌落培養數天後挑出單一菌落↓↓

接至接至 TSATSA 做繼代培養做繼代培養

將軍嶺將軍嶺

採土樣的地點 － 將軍嶺

柏園山莊柏園山莊

另一採樣地點 － 陽明山

陽明山之採樣點

ResultsResults

TSA 培養一天

104 105 106

1/10 TSA 培養一天

104 105 106

SCA 培養一天

101 102 103

TSA 培養三天

104 105 106

1/10TSA 培養三天

104 105 106

SCA 培養三天

101 102 103

A. faecalis S. marcescens

Y. enterolitica

K. pnenmoniae

P. vulgaris

Ps. fluorescens

N.mucosa

Ps. aeruginosa

E. aerogenes

Sal

Ent.

E. coli 10675

E. coli 11848

E. cloacae

菌株測試的情形

Ps. aeruginosa

E. aerogenes

Sal

Ent.

E. coli 10675

E. coli 11848

E. cloacae

A. faecalis

S. marcescens

Y. enterolitica

K. pnenmoniae

P. vulgaris

Ps. fluorescens

N.mucosa

測試菌株測試的情形 (正面圖 )

分離株四區劃線

經純化之分離株

菌落特徵菌落特徵乳白色菌落乳白色菌落中心突起中心突起邊緣不規則形邊緣不規則形粉狀表面粉狀表面

革蘭氏染色

孢子染色

菌種鑑定菌種鑑定　 　 此菌為桿狀革蘭氏陽性菌此菌為桿狀革蘭氏陽性菌、產孢、、產孢、 CatalaseCatalase 反應陽性、有反應陽性、有

氧狀態下生長氧狀態下生長

　 符合此桿狀革蘭氏陽性、產孢的菌屬有　 符合此桿狀革蘭氏陽性、產孢的菌屬有 BacillusBacillus sp. sp. 、、 ClostridClostridiumium sp. sp. ，但，但 ClostridiumClostridium sp. sp. 為厭氧菌且無為厭氧菌且無 CatalaseCatalase 故推測該故推測該菌為菌為 BacillusBacillus sp. sp.

DiscussionDiscussion

本次實驗只篩到一株具有些微抑制革蘭氏陰性菌效果的本次實驗只篩到一株具有些微抑制革蘭氏陰性菌效果的菌，比起抑制陽性菌菌株難找。其原因可能為菌，比起抑制陽性菌菌株難找。其原因可能為

　　 (1)(1) 未大規模取樣，菌相歧異度不夠大、樣本不夠多未大規模取樣，菌相歧異度不夠大、樣本不夠多

(2)(2) 抑制革蘭氏陰性菌的菌株本來就較少抑制革蘭氏陰性菌的菌株本來就較少

(3)(3) 培養基無法培養出所有的菌，某些帶有抗生素的菌無培養基無法培養出所有的菌，某些帶有抗生素的菌無法 法

在在 TSATSA 、、 1/10TSA1/10TSA 或或 SCASCA 上生長上生長

抗陰性菌菌株難以篩到的原因抗陰性菌菌株難以篩到的原因

(1)(1) 細胞壁組成較為複雜。比起一般的陽性菌只有單純的一細胞壁組成較為複雜。比起一般的陽性菌只有單純的一層層 peptidoglycanpeptidoglycan ，陰性菌還多了一層，陰性菌還多了一層 outer membraneouter membrane ，，使抗生素難以進入菌體作用使抗生素難以進入菌體作用

(2)(2) 有研究指出，在一些陰性菌中帶有一些抗抗生素的質體，有研究指出，在一些陰性菌中帶有一些抗抗生素的質體，如如 PseudomonasPseudomonas spp. spp. ，會使抗生素失效，可能也是難以，會使抗生素失效，可能也是難以篩到抗陰性菌抗生素的原因篩到抗陰性菌抗生素的原因

本次實驗所篩到的抗陰性菌經由鑑定後發現為本次實驗所篩到的抗陰性菌經由鑑定後發現為 BacillusBacillus s sp.p. ，對，對 S. marcescensS. marcescens 、、 P. vulgarisP. vulgaris 、、 Y. enterolitica 具具有些微的抑制效果。除了這株菌外，先前還發現另外兩有些微的抑制效果。除了這株菌外，先前還發現另外兩株可能有抑制效果的陽性菌，但在觀察數天後發現並無株可能有抑制效果的陽性菌，但在觀察數天後發現並無抑制的效果抑制的效果。。

在抑制的菌株中，有些只是生長情形較為不良，其生長在抑制的菌株中，有些只是生長情形較為不良，其生長不良的原因除了受到抗生素的抑制之外，也可能接種過不良的原因除了受到抗生素的抑制之外，也可能接種過度密集造成兩菌株間競爭養分，而使生長情形不良度密集造成兩菌株間競爭養分，而使生長情形不良。。

疑似具抗革蘭氏陰性菌能力的菌株後來失效的原因，可疑似具抗革蘭氏陰性菌能力的菌株後來失效的原因，可能是菌株在受到抗生素的抑制之後，開啟了一些抗抗生能是菌株在受到抗生素的抑制之後，開啟了一些抗抗生素的基因，而使菌株能夠抵抗抗生素的作用素的基因，而使菌株能夠抵抗抗生素的作用。。