lsolasi Kloroplas

entrifugasi bertahap merupakanmetoda yang umum untuk isolasiorganel. Metoda ini melibatkan

beberapa kali sentrifugasi dengan kecepatandan waktu yang berbeda. Prinsip kerja darisentrifugasi bertahap ini adalah

: pemisahan organel-organel di dalam sel

berdasarkan ukuran dan berat molekulnya.Sentrifugasi pada tahap pertama

umumnya memisahkan antara membran-membran sel ataupun pengotor lainnyadengan organelyang ukurannya lebih kecil.Sentrifugasi berikutnya dilakukan untukmemisahkan organel-organel kecil sampai

organel target yang akan diisolasi.

Pada praktikum kali ini, akan dilakukan isolasi

kloroplas dari tanaman bayam. Selanjutnya isolatkloroplas yang didapatkan akan dicek aktivitasnya

dengan mengguna kan spektrofotometer. Prinsip yang dig unakanadalah prinsip reaksi hills (reaksiterang fotosintesis). Pada metodaini, akseptor elektron (NADP) diganti dengan larutan DPIP (2,6,-

dichlorophenol-indophenol), dengan maksud agar dapatmenunjukkan adanya reduksi elektron, yang diketahui dariperubahan warna DPIP yang berwarna biru menjaditidakberwarna ketika daun disinari. Perubahan warna inidibaca denganmen g g u na ka n spektrofotometer.

Alat dan bahan

-SgBayam -Akuades- Sukrosa 0.5 M - Sentrifuga- Kain kassa 2lapis -Tabung eppendorf- Buffer Fosfat - Mortar- DPIP - Spektrofotometer dan Cuvet

nnLV

"Menggunakan teknik sentrifugasi bertahap"

FisiologiTumbuhan lsolasi kloroplas

lsolasi Kloroplas

Persiapan, Penimbangan, danHomogenisasi1 . Timbang sebanyak 8 gr daun bayam

yang telah dipisahkan tulangdaunnya.

2. Simpan didalam mortar3. Gerus daun bayam sambil

ditambahkan sebanyak 16 mlSukrosa0.5M dingin secara perlahan-lahan

Filtrasi4. Siapkan 8 (4lapis cukup) lapis kain

kassa diatas wadah tabung dingin5. Saringlah campuran daun bayam yang

telah homogen tersebut ke dalamtabung

6. Simpan tabung berisifiltrat di atas es7. Ambil sebanyak satu tetes filtrat,

simpan diatas kaca objek8.Tutup kaca objekdengan kaca

penutup, lalu amatidi bawahmikroskop dengan perbesaran 400x

9. Gambarlah hasil pengamatan anda10. Tandai adanya kloroplas, dan

mitokondria1 1. Beritahu asisten dan biarkan asisten

untuk mengecek hasil kerja anda

Sentrifugasi t12. Ambil filtrat sebanyak 1.5 ml, lalu

pindahkan ke dalam tabungeppendorf 1.5 ml(masing-masing peserta melakukanduplo = 2 tabung 1.5 ml eppendorfuntuk setiap peserta)

13. Sentrifugasi pada 50 g selama 10menit

14. Ambil supernatan, lalu pindahkanke dalam tabung eppendorf 1.5 mlyang baru

15. Simpan tabung supernatan di atases

16. Ambil supernatan sebanyak satutetes,lalu simpan diatas kacaobjek

17.Tutup kaca objekdengan kacapenutup, lalu amati di bawahmikroskop

18. Gambarlah hasil pengamatananda

Sentrifugasi219. Supernatan pada tahap

sebelu m nya disentrifugasikembali pada kecepatan 10009selama 10 menit

20. Bagaimana penampakan larutansetelah disentrifugasi? Gambarkanhasil pengamatan anda

21. Pisahkan supernatan denganpellet yang terbentuk (simpansupernatan pada tabung lain)

22. Suspensikan kembali pellet yangterbentuk dengan 1.5 ml sukrosa0.5M, lalu ambillah setetes larutandan amati di bawah mikroskop.Gambarkan hasil pengamatananda

23. Tentukanlah komposisi pellet yangterbentuk berdasarkan hasi I

pengamatan anda

FisiologiTumbuhan lsolosi kloroplas

Reaksi HilI

1. Spektrofotometer dinyalakan t 30 menit dan diatur pada panjang gelombang605 nm

2. Melakukan isolasi kloroplas daun bayam sesuai prosedur sebelumnya yaitudengan menggerus daun yang telah direndam diair dan disinari beberapajam (1 -2 jam) dalam mortar. Ekstrak disaring dengan 2 lapis kain kasa,

kemudian langsung diinkubasi dingin. Agar tidak terkena cahaya, ekstrakdisimpan dalam botol reagen gelap dan ditutup rapat.

3. Disediakan 3 kuvet, seluruh kuvet diberi label, Lihat tabel untuk

4. Setelah spektrofotometer diatur ke angka 0 o/o trdnsmittance ( 0 o/o T),tambahkan 1 mL kloroplas (1) ke dalam kuvet 1, lalu ditutup dengan parafilmdan dikocok hingga homogen. Kuvet 1 merupakan blanko untuk menentukannilai 1 00 o/o transmittance (100 o/o T)

5. Tambahkan kloroplas sebanyak 1 mL ke kuvet 2, kuvet segera ditutup parafilmdan dikocok hingga homogen, siap untuk dibaca nilaiT nya pada t = 0 danpanjang gel. 605. Hal tersebut dilakukan untuk cuvette 3sesuai tabel 1

6. Setelah dilakukan pembacaan nilaiT pada semua kuvet, maka kuvetdikembalikan pada rak tabung reaksi, cuvette berisi sampel kemudian disinari

Ket: :- flood light dapat diganti denganlampu meja belajar

-heat sink dapat menggunakanErlenmeyer atau bejana berisi air

7. Pembacaan nilaiT dilakukan kembali pada menit ke-5, 10, dan 15. Janganlupa untuk mengocok sampel hingga homogen dan me" reset"T ke angka 100o/o m€nggunakan blanko pada kuvet 1 sebelum melakukan sampling

8. Bandingkan hasil pengukuran T pada kelima kuvet tersebut pada waktu (T0),T5, T10 dan T15, lalu bahas dan simpulkan, pada jenis tanaman manaterjadinya reduksi DPIP yang peling cepat dan paling banyak

9. Data : NilaiT

mem persiapkan isi kuvet, tetapi jangan menam bah kan ekstrak kloroplasdahulu.

dengan posisi sebagai berikut:

t***ti*f-*Bu ':**w M*