7/24/2019 Isolasi Dan

1/4

PendahuluanEkstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satuteknik dasar yang harus dikuasai dalam mempelajari

teknik biologi molekular. Ekstraksi atau isolasi asam

nukleat dapat membuang dan memisahkan asam nukleat

dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak,

dll) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapatdianalisis atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik

biologi molekular lainnya. Ekstraksi asam nukleat ini

berguna untuk meneliti bahan yang bersifat mikro dengan

alat-alat yang bersifat mikro.

Ada dua metode ekstraksi asam nukleat yaitu ekstraksi

DNA dan RNA. Kedua metode tersebut hampir mirip

dalam prosesnya, namun molekul RNA relatif pendek danlebih sulit rusak dengan shearing sehingga disrupsi sel

dapat dilakukan dengan lebih agresif. Meskipun molekul

RNA relatif pendek, tetapi RNA sangat mudah didigesti

oleh RNAse yang terdapat endogen dengan konsentrasi

yang bervariasi di dalam sel dan di eksogen di jari.Sehingga, untuk ektraksi RNA harus menggunakan

sarung tangan dan medium yang digunakan untuk isolasi

harus mengandung detergen kuat untuk segera

mendenaturasi RNAse yang ada. Proses deproteinisasi

harus dilakukan secara lebih agresif karena RNA seringberikatan kuat dengan protein. Penambahan DNase dapat

digunakan untuk menghilangkan DNA. RNA kemudian

dipresipitasi dengan etanol. Reagen yang seringdigunakan untuk ekstraksi RNA adalah guanidinium

thiocyanate yang merupakan inhibitor kuat RNase dan

merupakan denaturan protein. Integritas RNA dapat dicek

dengan elektroforesis menggunakan gel agarose.

Spesies RNA yang terbanyak (molekul rRNA) berukuran

23S dan 16S untuk prokariot dan 18S dan 28S untuk

eukariot. RNA tersebut akan tampak sebagai pita yang

diskrit dalam gel agarose dan mengindikasikan RNAlainnya masih utuh. Proses ini biasanya dilakukan dalam

keadaan denaturasi untuk mencegah terjadinya formasi

struktur sekunder pada RNA (Brown et al2009).

Aktivitas nuklease selama proses ekstraksi asam

nukleat dapat dikurangi dengan cara: Mempertahankan

suhu inkubasi dan sentrifugasi di bawah suhu optimum

nuklease (370C), misalnya dengan mempertahankan

larutan ekstrak pada suhu es atau 40

C. Menginaktivasinuklease pada permukaan gelas, air dan bahan habis

pakai dengan bahan kimia seperti DEPC

(diethylpyrocarbonate). Selanjutnya inaktivasi dan ataupenghambatan secara kimiawi, misalnya dengan fenol

atau garam guanidinium. Penghilangan ion logam ko-

faktor untuk nuklease dengan chelating agent. Untuk

mengisolasi mRNA eukariotik (yang hanya 2-5% dari

RNA selular) dari campuran molekular RNA total dapat

dilakukan dengan afinitas kromatografi terhadap kolumnoligo(dT)-selulosa. Pada konsentrasi garam yang tinggi,

mRNA yang mengandung ekor poli(A) akan berikatan

dengan molekul oligo(dT) komplementer pada kolumn

afinitas, sehingga mRNA tetap tertinggal, sedangkanmolekul RNA lainnya dapat dicuci bersih dari kolumn

menggunakan larutan tinggi garam. Selanjutnya, mRNA

Laporan Praktikum m.k Bioteknologi AkuakulturLaboratorium Reproduksi dan Genetika Ikan

Departemen Budidaya Perairan

Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

Institut Pertanian Bogor

2014

Isolasi dan Kuantifikasi RNA pada organ usus ikan betok (Anabas testudineus) dengan

menggunakan metode Isogen/Genezol

Shinta Tiara N. (C14120012)1, Arini Arziani K. (C14120014)1, Nurfitriani Siti Y. (C14120017)1, Eka Aprilia

W. (C14120022)1, Savni Retalia S. (C14120023)

1, Deni Yunus W. (C14120032)

1, Mohammad Sapta J.

(C14120034)1, Adi Nur Huda (C14120036)

1, Muhammad Alkahfi (C14134006)

1

1Departemen Budidaya Perairan, FPIK, IPB

ABSTRAK

Isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik yang dapat membuang dan memisahkan asam nukleat dari

komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis atau

dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi molekular lainnya. Ada dua metode isolasi asam nukleat yaitu isolasiDNA dan RNA. Untuk mengisolasi mRNA eukariotik (yang hanya 2-5% dari RNA selular) dari campuran molekularRNA total dapat dilakukan dengan afinitas kromatografi terhadap kolumn oligo(dT)-selulosa. Isolasi RNA yang

dilakukan menggunakan sampe MHC nila dengan metode gemzole mendapatkan hasil yang paling baik, yaitu dengan

jumlah RNA yang mencapai mencapai nilai 145,66 dengan kemurnian RNA yang mencapai 94% dan rasio

perbandingan protein sebesar 1,705. sehingga tingkat kemurnian yang tinggi 94%. MHC (Mayor Hystocompatibility

Complex) merupakan molekul protein yang terdapat pada hampir semua permukaan sel-sel tubuh suatu organisme, maka

dari itu kemungkinan konsentrasi RNA pada bahan yang digunakan yaitu MHC nila dengan gemzole memiliki jumlahRNA yang lebih tinggi dibandingkan dengan sampel yang lainnya.

Kata kunci: Asam nukleat, DNA, Isolasi, MHC, Protein, RNA

7/24/2019 Isolasi Dan

2/4

yang terikat tadi dapat dilarutkan dengan garam

berkonsentrasi rendah (Theophilus 2008).

Material dan ProsedurIkan uji yang digunakan pada praktikum isolasi RNA

adalah ikan betok (Anabas testudineus). Organ yang

digunakan untuk pengamatan isolasi RNA adalah bagian

usus ikan betok. Alat yang digunakan yaitu mikrotube,mikropipet, vortex, sentrifuge, gene quant, grinder. Bahan

yang digunakan yaitu organ usus ikan betok, isogen,

kloroform, isopropanol, ethanol 70%, DEPC.

Pertama yang dilakukan adalah mengambil organ usus

ikan betok sebanyak 20 mg dan dimasukkan ke dalamtube yang sudah diisi dengan isogen 200l. Lalu usus

ikan betok di grinder menggunakan mikropestel sampai

halus. Setelah halus, isogen ditambahkan sebanyak

600l, lalu disimpan selama 5 menit dengan suhu

ruangan. Setelah 5 menit, kloroform ditambahkan

kedalam tube sebanyak 200l, lalu di vortex selama 15detik dan didiamkan selama 2-3 menit. Setelah itu sampel

di sentrifuge (HR-1500FR) selama 5 menit dengankecepatan 13000 rpm. Setelah itu supernatan yang

terbentuk dipindahkan kedalam tube yang baru yang

sudah berisi cairan isopropanol sebanyak 400l, lalu

sampel di vortex kembali dan dismpan dalam suhuruanng selama 5-10 menit. Setelah itu, sampel di

sentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan yang sama

13000 rpm, lalu supernatant dibuang. Setelah supernatant

dibuang, lalu tambahkan cairan ETOH 70% atau ethanol

dingin sebanyak 1 ml kedalam tube, lalu di sentrifuge

selama 5 menit dengan suhu 4C dan kecepatan 13000

rpm. Setelah itu buang supernatan, lalu keringkan di

udara selama 15-30 menit. Setelah itu, larutan DEPC

(Diethylpyrocarbonate) ditambahkan kedalam tubesebanyak 50l, lalu di vortex. Setelah itu pengukuran

sampel dengan menggunakan gene quant.

Hasil

Berikut merupakan tabel hasil isolasi dan kuantifikasi

RNA,

Tabel 1 Hasil isolasi dan kuantifikasi RNA

NO RNA PROTEIN RATIO PURITY

(%)

1 46,40 0,1 1,368 76

2 30,62 0,1 1,431 793 41,93 0,1 1,368 77

4 14,95 0,1 1,251 69

5 23,67 0,1 1,697 94

6 55,17 0,1 1,488 82

7 46,62 0,1 1,447 80

8 83,84 0,2 1,482 82

9 21,45 0,1 1,321 72

10 145,66 0,4 1,705 94

Berdasarkan tabel diatas dapat diketahui bahwa

sampel yang memiliki konsntrasi RNA paling besar

adalah pada percobaan menggunakan sampel MHC nila

dengan metode gemzole yang mencapai nilai 145,66

dengan kemurnian RNA yang mencapai 94% dan rasio

perbandingan protein sebesar 1,705. Sedangkan sampelyang memiliki konsentrasi RNA paling kecil adalah pada

percobaan menggunakan sampel usus ikan betook dengan

metode isogen sebesar 14,95 dengan kemurnian sebesar

69% dan rasio perbandingan dengan protein sebesar

1,251.

PembahasanAsam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari

unit-unit mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya

deoksinukleotida maka asam nukleat itu disebutdeoksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit

mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA). DNA

dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika

yang sama sebab antara unit-unit mononukleotidaterdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan

fosfodiester antara posisi 3 suatu mononukleotida dan

posisi 5 pada mononukleotida lainnya, Asam-asam

nukleat seperti asam deoksiribosa nukleat (DNA) dan

asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagipemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam

nukleat merupakan molekul makro yang memberi

keterangan tiap asam nukleat mempunyai urutan

nukleotida yang unik sama seperti urutan asam aminoyang unik dari suatu protein tertentu karena asam nukleat

merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan

monomer yang disebut nukleotida. Dua tipe utama asam

nukleat adalah asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam

ribonukleat (RNA) (Fried dan George 2011). DNA

adalah sejenis asam nukleat yang tergolong

biomolekul utama penyusun berat kering setiap

organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di

dalam inti sel. Secara garis besar, peran DNA di dalam

sebuah sel adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA

menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini

berlaku umum bagi setiap organisme. Di antara

perkecualian yang menonjol adalah beberapa jenis virus(dan virus tidak termasuk organisme) seperti HIV

(Human Immunodeficiency Virus). DNA terutamaditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban

kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi

dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk

memproduksi organisme itu dalam sebagian besar

organisme, DNA suatu sel mengerahkan sintesis molekul

RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA(mRNA),

meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari

berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan

kode DNA-nya (Fried dan George 2011). Struktur dasar

RNA mirip dengan DNA. RNA merupakan bahan

genetik. Ia berfungsi sebagai penyimpan informasigenetik, sebagaimana DNA pada organisme hidup lain.

Ketika virus ini menyerang sel hidup, RNA yang

dibawanya masuk ke sitoplasma sel korban, yang

kemudian ditranslasi oleh sel inang untuk menghasilkan

virus-virus baru. Namun demikian, peran penting RNAterletak pada fungsinya sebagai perantara antara DNA

dan protein dalam proses ekspresi genetik karena ini

berlaku untuk semua organisme hidup. Dalam peran ini,

RNA diproduksi sebagai salinan kode urutan basa

nitrogen DNA dalam proses transkripsi. Kode urutan basa

ini tersusun dalam bentuk triplet, tiga urutan basa N,

yang dikenal dengan nama kodon. Setiap kodon berelasi

dengan satu asam amino (atau kode untuk berhenti),

monomer yang menyusun protein. RNA merupakan

polimer yang tersusun dari sejumlah nukleotida. Setiap

7/24/2019 Isolasi Dan

3/4

nukleotida ,fmemiliki satu gugus fosfat, satu gugus gula

ribosa, dan satu gugus basa nitrogen (basa N). Polimer

tersusun dari ikatan berselang-seling antara gugus fosfat

dari satu nukleotida dengan gugus gula ribosa darinukleotida yang lain. Perbedaan RNA dengan DNA

terletak pada satu gugus hidroksil tambahan pada cincin

gula ribosa (sehingga dinamakan ribosa). Basa nitrogen

pada RNA sama dengan DNA, kecuali basa timin pada

DNA diganti dengan urasil pada RNA. Jadi tetap ada

empat pilihan: adenin, guanin, sitosin, atau urasil untuksuatu nukleotida.Selain itu, bentuk konformasi RNA

tidak berupa pilin ganda sebagaimana DNA, tetapi

bervariasi sesuai dengan tipe dan fungsinya

Menurut Sambrook dan Russel (2001) Penentuan

kemurnian RNA berdasarkan ratio antara A260/A280.

RNA dapat menyerap sinar ultraviolet pada panjanggelombang 260. Di dalam spektofotometer, sample

dilewatkan pada panjang gelombang 260 dan panjang

gelombang 280. Nisbah antara A260/A280 menentukan

tingkat kemurnian dari RNA, terdapat hubungan linear

positif antara kemurnian RNA dan nisbah A260/A280.Kemurnian RNA yang ideal didapatkan dari proses

isolasi RNA adalah 95-100% dengan nisbah absorbansi

sebesar 2.000.05, RNA dengan nilai nisbah A260/A280

sama dengan 2 memiliki tingkat kemurnian sebesar 100%

Pada praktikum kali ini didapatkan kemurnian RNA

terendah pada sample usus betok 69% dengan konsentrasiRNA 5,42 g/ml hal ini dikarenakan sample

mengandung kontaminan yang tinggi, proses pengerjaan

yang tidak steril dan diduga pada sel-sel di jaringan usus

materi genetik dari DNA tidak diekspresikan terlalu

banyak sehingga RNA yang didapatkan pada organ ini

sedikit dan tingkat kemurnian yang rendah. Hal ini

berlawanan dengan sample MHC ikan sehingga memilikitingkat kemurnian yang tinggi yaitu 94%.

Kuantifikasi RNA menggunakan alat yang disebut

Gene-Quant. Alat ini menggunakan prinsip

spektofotometer, seberkas cahaya UV dilewatkan pada

sampel dengan panjang gelombang tertentu untuk melihatkemurnian sampel tersebut. Kuantifikasi RNA umumnya

mengukur purity, Konsentrasi protein, Konsentrasi RNA,

dan Absorbansi. Purity merupakan tingkat kemurnian

sampel RNA, Purity didaptkan dari hasil ratio absorbansi

A260/A280. Tingkat kemurnian RNA berbanding lurus

dengan nilai absorbansi dan berkolerasi positif, dimana

nilai rasio absorbansi sama dengan 2 maka sample tidak

terkontaminasi (Sambrook dan Russel 2001). Proteinmerupakan makromolekul yang terdiri dari beberapa

asam amino yang telah memiliki fungsi tertentu. Pada

proses isolasi RNA, protein adalah salah satu molekulyang menyebabkan RNA terkontaminasi sehingga protein

harus dieleminasi pada sampel tersebut. Pengukuran

konsentrasi protein menggunakan panjang gelombang

280. Konsentrasi RNA merupakan banyaknya RNA (g)

pada sample tersebut (mL), banyaknya RNA pada suatu

sampel ditentukan oleh aktifitas organ sampel danpengekspresian gen tertentu pada suatu organ,.

Konsentrasi RNA diukur dengan panjang gelombang

260. Nilai absorbansi merupakan nilai yang diukur

menggunakan panjang gelombang 260, sehingga nilaiabsorbansi merupakan acuan banyaknya konsentrasi

RNA pada suatu sampel.

MHC (Mayor Hystocompatibility Complex)

merupakan molekul protein yang terdapat pada hampir

semua permukaan sel-sel tubuh suatu organisme, maka

dari itu kemungkinan konsentrasi RNA pada bahan yangdigunakan yaitu MHC nila dengan gemzole memiliki

jumlah RNA yang lebih tinggi dibandingkan dengan

sampel yang lainnya. Biasanya jumlah molekul MHC

pada setiap sel sangat banyak, yang paling utama pada

sel-sel limfoid. Jumlahnya dapat berkisar antara 10.000-

100.000 molekul setiap selnya. Dari hasil tabel yang didapat konsentrasi RNA yang tinggi terdapat di kelompok

10 menggunakan bahan MHC pada ikan Nila dengan

nilai konsentrasi yaitu 145,66 sedangkan nilai konsentrasi

RNA yang terkecil ada pada usus ikan betok dengan nilai

14,95. Menurut Ji-cai Pang et al (2013) MHC yang

paling tinggi terdapat dibagian perut ikan Nila haltersebut dapat terjadi karena MHC merupakan wilayah

genomik yang ditandai dengan polimorfisme yang sangat

tinggi dan memiliki peran penting dalam respon imun.

Bagian-bagian tubuh ikan yang memiliki MHC

konsentrasi tinggi yaitu perut, insang dan usus sedangkantingkat moderat dalam hati, ginjal, limpa dan hati lalu

ekspresi yang rendah terdapat pada otak, otot dan kulit.

Asam ribonukleat (RNA) merupakan senyawa yang

berasal dari bahan genetik dan memiliki peran utama

dalam ekspresi gen. Dalam dogma pokok (central

dogma) genetika molekuler, RNA menjadi perantaraantara informasi yang dibawa DNA dan ekspresi fenotip

yang diwujudkan dalam bentuk protein. Asam

ribonukleotida (RNA) adalah salah satu molekul asam

nukleat yang dibentuk oleh asam dioksiribonukleotida

(DNA) yang berfungsi untuk mensintesis protein di

dalam inti sel. Molekul RNA merupakan polimer panjang

yang tidak bercabang dari gugus ribonukleotidamonofosfat yang digabungkan dengan ikatan fosfodiester.

Untuk mendapatkan RNA pada organisme yang akan

diamati dengan cara mengisolasi RNA dan untuk

menghitung jumlah RNA dilakukan kuantifikasi RNA.

Isolasi RNA merupakan teknik untuk memperoleh RNAyang diharapkan bebas dari kontaminan. Isolasi RNA

dapat di manfaatkan untuk mengetahui laju pertumbuhan

pada ikan, mendeteksi penyakit seperti virus, selain itu

digunakan untuk ekspresi gen dan isolasi gen. Contoh

dari isolasi RNA seperti dilakukannya kloning dan

ekspresi gen pada ikan nila. Kloning merupakan proses

pembuatan salinan dari suatu gen dengan prinsip

teknologi DNA atau RNA. Molekul DNA atau RNAdibuat dengan menyisipkan fragmen yang mengandung

gen target ke dalam vektor. Vektor berperan sebagai

pembawa gen yang akan dikloning ke dalam sel insang.Dalam proses ini metode yang digunakan yaitu dengan di

lakukannya isolasi DNA atau RNA, serta dilakukannya

proses elektroforesis (Soekarno 2011). Contoh yang

kedua yaitu mendeteksi virus pada ikan koi, metode yang

digunakan dalam mendeteksi virus yang digunakan yaitu

dengan isolasi DNA atau RNA, serta dilakukan prosesPCR. Proses PCR dilakukan setelah isolasi DNA atau

RNA, hasil dari isolasi tersebut dideteksi dengan

menggunakan PCR, lalu visualisasi dengan elektroforesis

(Mulyani et al 2011).

7/24/2019 Isolasi Dan

4/4

Kesimpulan

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat

disimpulkan bahwa sampel yang memiliki kemurnian

RNAyang paling baik adalah pada percobaan

menggunakan sampe MHC nila dengan metode gemzole

dengan jumlah RNA yang mencapai mencapai nilai

145,66 dengan kemurnian RNA yang mencapai 94% dan

rasio perbandingan protein sebesar 1,705. sehinggatingkat kemurnian yang tinggi 94%. MHC (Mayor

Hystocompatibility Complex) merupakan molekul protein

yang terdapat pada hampir semua permukaan sel-sel

tubuh suatu organisme, maka dari itu kemungkinan

konsentrasi RNA pada bahan yang digunakan yaitu

MHC nila dengan gemzole memiliki jumlah RNA yang

lebih tinggi dibandingkan dengan sampel yang lainnya.

Daftar PustakaBrown S M, Hay J G, Ostrer H. 2009. Essentials of

Medical Genomics. New Jersey [USA]: Second ed.

John Wiley & Sons, Inc.

Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993. A simple and

efficient method for isolating RNA from pine trees.

Journal Plant Mol Biol Rep. 11(1993): 98 100.

Fried G H, George J H. 2011. Schaums Tss Biologi Ed.2.

Jakarta [ID]: Penerbit Erlangga.

Ji-cai Pang et al. 2013. Major Histocompability complex

class IIA and IIB genes of nile tilapia Oreochromisniloticus : Genomic structure, molecular

polymorphism and expression patterns. Journal

Fish & Shellfish Immunology. 34 (2013): 486-496.

Sambrook J, Russel D W. 2001. Molecular Cloning: A

Laboratory Manual 3rd edition. New York (USA) :

Cold Spring Harbor

Soekarno M T. 2011. Kloning dan ekspresi gen tilapia

Growth Hormone (tiGH) untuk memproduksi

protein rekombinan hormon pertumbuhan ikan nila(Oreochromis niloticus, Linnaeus 1758) [Skripsi].

Depok (ID): Universitas Indonesia.

Theophilus B D M. 2008. Principles and Medical

Applications of the Polymerase Chain Reaction. In:

Molecular Biomethods Handbook Second Edition.Ed: Walker, J.M., Rapley, R. New Jersey

[USA].Humana Press.