ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT …digilib.unila.ac.id/37328/6/SKRIPSI TANPA BAB...
Transcript of ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT …digilib.unila.ac.id/37328/6/SKRIPSI TANPA BAB...
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTATAMILOLITIK FERMENTASI GROWOL SEBAGAI ANTIMIKROBA
( Skripsi )
OLEH
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG2018
RIYAN WAHYUDI
ABSTRACT
ISOLATION AND CHARACTERIZATION LACTIC ACID BACTERIAAMYLOLYTIC GROWOL FERMENTED AS AN ANTIMICROBIAL
By
RIYAN WAHYUDI
Lactic acid bacterial a (LAB) which grown during growol fermentation(traditional food made by cassava from Kulon Progo Yogyakarta) is an indigenusbacteria, it can grow on starch medium with the amylolytics ability and potentiallyto be used to produce lactic acid from starch. The aims of this study were toisolate amylolytics LAB, to characterize the isolates for degradating starch and todetermine it’s antimicrobial activity. The ability of LAB isolates in starch wasmeasured based on it’s amylolytics index (IA) on agar starch’s medium of thecolonies and the amylase enzymatic activity on dissolved starch as substrate. Theresult showed that 15 isolates were obtained and 2 selected isolates had highamylolytics activity on solid and liquid medium. Two isolates were IG-8-7 andIG-9-7 have IA 6,0 and 3,3 and the unit activity of α-amylase were 18,8 µ/mLand 16,6 µ/mL, respectively the IG-8-7 has antimicrobial activity showed by it’sinhibition zone diameter for 2,8 cm and it was better than IG-9-7 (2,2 cm), andpositive control chloramphenicol of (2,5 cm).
Keywords : Fermentation, Growol, Isolation, Lactic acid bacterial (LAB),Antimicrobial
ABSTRAK
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTATAMILOLITIK FERMENTASI GROWOL SEBAGAI ANTIMIKROBA
Oleh
RIYAN WAHYUDI
Bakteri asam laktat (BAL) yang tumbuh selama fermentasi growol (makanantradisional berbasis singkong khas kulon Progo Yogyakarta) merupakan bakteriindiginus, yang mampu tumbuh pada media pati dengan kemampuan amilolitikdan berpotensi dimanfaatkan untuk produksi asam laktat dari pati. Tujuanpenelitian ini adalah untuk mengisolasi BAL amilolitik dan mengkarakterisasiisolat dalam mendegradasi pati dan isolat yang memiliki aktivitas antimikroba.Kemampuan BAL dalam mendegradasi pati diukur berdasarkan nilai indeksamilolitik (IA) koloni pada medium pati agar dan aktivitas enzim amilase padasubstrat pati terlarut. Hasil penelitian ini diperoleh 15 isolat dan terpilih 2 isolatyang memilki aktivitas amilolitik tertinggi pada medium padat dan medium cair.Dua isolat tersebut yaitu IG-8-7 dan IG-9-7 yang memiliki nilai IA sebesar 6,0dan 3,3, kedua isolat memiliki aktivitas unit enzim amilase berturut-turut sebesar18,8 U/ml dan 16,6 U/ml. IG-8-7 mempunyai aktivitas antimikroba dengandiameter zona hambat sebesar 2,8 cm lebih baik dari IG-9-7 (2,2 cm), maupunkontrol positif kloramfenikol (2,5 cm).
Kata kunci : Fermentasi, Growol, Isolasi, Bakteri Asam Laktat (BAL), Antimikroba
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT
AMILOLITIK FERMENTASI GROWOL
SEBAGAI ANTIMIKROBA
Oleh
Riyan wahyudi
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar
SARJANA SAINS
Pada
Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG
2018
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pujodadi Kecamatan Trimurjo Lampung
Tengah pada tanggal 16 maret 1995 sebagai anak pertama
dari tiga bersaudara dari pasagan bapak Ismanto dan Ibu
Sriwiyanti.
Jenjang pendidikan diawali dari taman kanak kanak pada tahun 2000 di TK
Dharma Wanita Pujodadi, tahun 2007 menyelesaikan sekolah dasar di SD Negeri
1 Pujodadi Kec. Trimurjo Lampung Tengah, tahun 2010 menyelesaikan
pendidikan tingkat pertama di SMP Negeri 1 Trimurjo dan tahun 2010
menyelesaikan Sekolah Menengah Atas di SMA Muhammadiyah 1 Metro. Tahun
2013 penulis terdaftar sebagai mahasiswa Universitas Lampung melalui jalur
SNMPTN (Seleksi Nilai Masuk Perguruan Tinggi Negeri).
Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten praktikum pada mata
kuliah Biokimia 1 Prodi Kimia dan Biokimia 1 Prodi Biologi. Pengalaman
organisasi dimulai dari kader muda himpunan mahasiswa kimia (KAMI) jurusan
Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam pada periode 2013/2014.
Penulis juga aktif di Himpunan Mahasiswa Kimia (HIMAKI) FMIPA sebagai
anggota bidang SPIK kepengurusan tahun 2014/2015 - 2015/2016. Penulis juga
Dengan Rahmat Allah yang Maha Pengasih dan PenyanyangKupersembahkan Karya Sederhanaku ini
Kepada:
Allah SWT pemilik jiwa ragaku, yang telah menganugerahkan begitu banyak kebahagiaan danpelajaran dalam hidupku serta Nabi Muhammad SAW sebagai suri tauladanku,
Kedua orang tuakuBapakku Ismanto dan Ibuku Sriwiyanti
Tak akan pernah ada sesuatu yang bisa menggantikan kasih sayang, kesabaran, kebaikan dankeikhlasan kalian, semoga Allah membalas dengan sebaik-baiknya pembalasan.
Membahagiakan kalian adalah tujuan utamaku.
Kedua adikku tersayangLeni Indriani dan Dani Prayuga
Terima kasih atas canda tawa, keceriaan yang kalian berikan semoga kalian selalu diberikankemudahan dan kesuksesan dalam menggapai cita dan cinta.
Segenap Keluarga besarku yang selalu mendoakan keberhasilanku,
Guru-guru dan Dosen-Dosen yang selalu membagi ilmunya untukku
Sahabat- sahabat terbaik yang berjuang bersamaku
dan Almamater tercinta Universitas Lampung
MOTTO
لكم خیر لكم إن ك ذ انفروا خفافا وثقاال وجاھدوا بأموالكم وأنفسكم في سبیل هللا
نتم تعلمون
“Berangkatlah kamu baik dalam keadaan merasa ringan maupun berat, danberjihadlah kamu dengan harta dan dirimu di jalan Allah. Yang demikian ituadalah lebih baik bagimu, jika kamu mengetahui”(At Taubah ayat 41).
Agama tanpa ilmu adalah buta, Ilmu tanpa agama adalah lumpuh
(Albert Einstein).
SANWACANA
Segala puji hanya milik Allah SWT yang telah memberikan begitu banyak nikmat,
sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi dengan judul ”Isolasi dan
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Amiloitik Fermentasi Growol Sebagai
Antimikroba ” sebagai syarat untuk mencapai gelar Sarjana Sains pada Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
Dalam pelaksanaan dan penulisan skripsi ini tidak lepas dari kesulitan dan rintangan.
Namun, dengan kehendak Allah SWT maka skripsi ini terselesaikan. Penulis
menyadari sepenuhnya bahwa terselesaikannya penyusunan skripsi ini tidak
terlepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima
kasih kepada:
1. Kedua orang tua yang sangat aku cintai dan sangat berjasa dalam hidupku, Bapak
Ismanto dan Ibu Sriwiyanti serta kedua adikku Leni Indriani dan dani Prayoga
yang telah memberikan kasih sayang, perhatian, semangat, motivasi, dukungan
moril maupun materil, dan doa untuk keberhasilanku.
2. Bapak Mulyono, Ph.D., selaku pembimbing utama yang telah banyak
memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan, gagasan, bantuan, dukungan,
semangat, kritik dan saran kepada penulis dalam proses perencanaan dan
pelaksanaan penelitian serta dalam penulisan skripsi ini.
3. Ibu Dr. Nurhasanah, M.Si., selaku pembahas pertama yang telah memberikan
kritik, saran dan arahan kepada penulis sehingga skripsi ini terselesaikan dengan
baik.
4. Bapak Dr. Novyani, M.Si., selaku pembahas kedua yang telah memberikan
semangat, kritik, saran dan bimbingan kepada penulis sehingga skripsi ini
terselesaikan dengan baik.
5. Ibu Prof. Dr. Ir. Yandri, A.S., M.S. selaku Pembimbing Akademik atas
kesediaannya untuk memberikan bimbingan, bantuan, nasehat dan informasi
yang bermanfaat kepada penulis.
6. Bapak Prof. Warsito, D.E.A., Ph.D. selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
7. Bapak Dr. Suripto Dwi Yuwono, M. T., selaku Ketua Jurusan Kimia FMIPA
Universitas Lampung yang telah memberikan bantuan kepada penulis dalam
menyelesaikan skripsi ini.
8. Seluruh dosen dan staff administrasi di Jurusan Kimia FMIPA Unila yang telah
membantu, mendidik, dan memberikan ilmu pengetahuan yang sangat berguna
kepada penulis selama kuliah.
9. Mas Pendi, Mas Eko, Mba Cici yang selalu memberikan perhatian, pengertian,
doa, semangat, motivasi dan menantikan keberhasilanku.
10. Keponakan Om dewi, anis, Rachel, Nayla yang menjadi penghibur dan
keceriaan bagi om disaat kejenuhan.
11. Keluarga besar Mbah karyo Utomo dan Mbah Sarman yang selalu memberikan
nasehat, motivasi, dukungan, doa dan kasih sayang kepada penulis
12. Sesorang yang selalu setia mendengarkan keluh kesah penulis, Atikah Nur Azizah
S.Pd. Terima kasih untuk nasehat, motivasi, semangat, perhatian dan doanya.
Semoga Allah swt selalu memberikan keberkahannya untuk dirimu.
13. Untuk teman-teman sepermainan dan seperjuanganku yang suka berkumpul di
“Markas” yaitu “THE INCRIDIBLE SIX”, yang terdiri atas Yudha Ari Satria
(The Strongman), Ferdian Dicky Permana (Pemilik Markas yang mungkin bosan
dijadikan tempat tongkrongan), Rezky Adji Pratama (Penakluk Wanita), Christian
Paul PS (Laki-laki telat nakal dan the important man), dan Radho Al-Kausar
(Seorang yang sering linglung). Terimakasih atas kebersamaannya, keceriaan,
dukungan, perhatian, doa, nasihat, kritik, saran, dan waktu yang telah kita
habiskan bersama selama masa perkuliahan. Aku tidak akan melupakan kalian
dan semoga kita dapat bertemu kembali dengan masing-masing pribadi sudah
menjadi orang yang sukses Amiiin.
14. Mulyono’s Research Group, mba Ajeng, mba Ayu Imani, mba Meta, kak Aziez,
Shelta, Melia, Monica, Vyna, Tyas, Bidari, Asrul, Jefry, dan Fernando atas
kerjasama, motivasi dan kebersamaan yang selalu diberikan.
15. Para penyayang bakteri dan jamur (2014) di Lab. Biokimia, Agung Cordova,
Asrul, Luthfi, Rahma, Rica, Riza, Bunga, Bidari, Erika, Ayuning, Hesti, Diva,
Leony atas kebersamaan, canda tawa, bantuan dan semangatnya. Semoga kalian
selalu diberikan kelancaran dalam penelitiannya dan segala urusan dalam
menyelesaikan studi.
16. Para penghuni Lab. Biokimia terdahulu (2012 dan 2013), mbk Arum, S.Farm,
Putri Amalia, M.Si., Ana Febrilianti W., S.Si., Aprilia Isma D.,S.Si , Uswatun
Khasanah, S.Si, Rizky Putri Y., S.Si., Syathira Assegaf., S.Si., Fifi Ardhyanti.,
S.Si, Diani Iska M., S.Si., Mia Permatasari, S.Si., Sinta Dewi O, S.Si., Fathaniah
Sejati, S.Si., Maya Retna S., S.Si., Khomsatun Khasanah, S.Si., Ezra Rhienzky,
S.Si., Sri Wahyuni, C.S.Si. Terima kasih atas bantuan, canda, tawa, motivasi yang
diberikan selama penelitian kepada penulis.
17. Teman-teman Kimia angkatan 2013, Dona, Aulia, Badiatul, Dewi Rumondang,
Fatimah, Fera, Fika, Hermayana, Khalimatus, Indah, Yudha, Esti, Kiki, Nova,
Linda, Lulu, Anita, Megafit, Mawar, Nabilla, Renita, Siti, Tyagita, Yulia, Uut,
Vero, Widya, Yunitri, Della, Eky, Yuvica, Inggit, Awan, Vicka, Arief, Oci,
Maya, Nora, Atun, Diki, Shela, Vyna, Bara, Ridho, Nurpadilla, Wahyuni, Kurnia,
Yolanda, Murnita, Nurma, Erva, Ismi, Eka Oso, Febri, Paul, Fentri, Riska, Eka,
Shelta, Nia, Nurul, Ana, Nita, Anggi, Gesa, Tika, Yuni, Celli, Melia, Anggun,
Radho, Arni, Sinta, Anton, Melita, Monica, Tyas, Citra, Kartika, Ezra, Yunita,
Verdi, Korina, Doddy, dan Ryan Amha atas untuk motivasi dan pengalaman luar
biasa serta kebersamaan yang telah terjalin.
18. Sahabat-sahabatku, Padil, Galih, Dinda, Betty yang telah memberikan semangat,
motivasi, doa dan selalu menghibur penulis. Semoga persahabatan kita terus
terjalin dengan baik sampai tua.
19. Kakak-kakak dan Adik-adik Angkatan 2010, 2011, 2012, 2014, 2015, 2016, dan
2017 yang telah membantu serta mendoakan.
20. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis dalam penyusunan
skripsi ini.
Semoga segala bentuk bantuan dan dukungan yang diberikan mendapat balasan
pahala dari Allah SWT. Akhir kata, penulis menyadari bahwa skripsi ini masih sangat
jauh dari kata sempurna, namun penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat
dan memiliki nilai guna khususnya rekan-rekan mahasiswa dan pembaca pada
umumnya. Amin.
Bandar Lampung, Juli 2018Penulis
Riyan Wahyudi
melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) selama 40 hari di Desa Dharma Agung,
Seputih Mataram, Kabupaten Lampung Tengah pada tahun 2016.
DAFTAR ISI
HalamanABSTRAK
DAFTAR ISI.............................................................................................................i
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................iii
DAFTAR TABEL ....................................................................................................v
I. PENDAHULUANA. Latar Belakang..................................................................................................1B. Tujuan Penelitian ..............................................................................................4C. Manfaat Penelitian ............................................................................................5
II. TINJAUAN PUSTAKAA. Makanan Fermentasi ......................................................................................6B. Fermentasi ......................................................................................................7C. Growol............................................................................................................9D. Pati..................................................................................................................10E. Bakteri.............................................................................................................12
1. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme ..........................................................132. Identifikasi Bakteri.....................................................................................15
F. Bakteri Asam LAktat BAL .............................................................................15G. Pengertian Asam Laktat ..................................................................................18H. Probiotik ..........................................................................................................19I. Enzim..............................................................................................................20J. Enzim Amilase ...............................................................................................22K. Spektrofotometer UV-VIS ..............................................................................23L. Metode Fuwa ..................................................................................................26M. Aktivitas Antimikroba dan Efeknya ...............................................................26N. Metode Difusi..................................................................................................28
III. METODELOGI PENELITIANA. Waktu dan Tempat Penelitian........................................................................30B. Alat dan Bahan...............................................................................................30
1. Alat-alat yang digunakan...........................................................................302. Bahan-bahan yang digunakan....................................................................31
C. Prosedur Penelitian ........................................................................................31
ii
1. Tahap Persiapan.........................................................................................312. Isolasi Mikroba dari Growol......................................................................333. Koleksi Koloni Tunggal Hasil Isolasi .......................................................354. Penyimpanan Isolat....................................................................................355. Uji Hidrolisi Pati BAL Amilolitik Metode Iodin ......................................356. Penentuan Kurva Pertumbuhan dan Waktu Optimum Aktivitas Enzim
Amilase ....................................................................................................367. Uji Aktivitas Amilase BAL Amilolitik secara Kuantitatif ........................378. Uji Akivitas Antimikroba ..........................................................................379. Identifikasi Bakteri ....................................................................................38
D. Diagram Alir Penelitian.................................................................................40
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Isolasi dan Skrining Bakteri Asam Laktat (BAL) Amilolitik PendegradasiPati ................................................................................................................41
B. Hasil Uji Kualitatif Isolat BAL Pendegradasi Pati Metode Iodin..................45C. Uji Aktivitas Enzim Amilase BAL Amilolitik ..............................................48D. Kurva Pertumbuhan dan Waktu Optimum Degradasi Pati BAL Amilolitik
Dua Isolat Terpilih .........................................................................................56E. Uji Antimikroba .............................................................................................59F. Karakterisasi BAL Amilolitik Pendegradasi Pati...........................................61
1. Morfologi ...................................................................................................612. Motilitas .....................................................................................................63
V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan ....................................................................................................65B. Saran ..............................................................................................................65
DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................................67
LAMPIRAN..............................................................................................................72
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Growol ...................................................................................................................10
2. Struktur Amilum ....................................................................................................11
3. Pati Singkong .........................................................................................................12
4. Struktur Sel Bakteri................................................................................................13
5. Fase Pertumbuhan Mikroorganisme ......................................................................14
6. Skema Alat Spektoskopi UV-VIS..........................................................................26
7. Diagram Alir ..........................................................................................................40
8. Isolat BAL pada Media MRSA a). Pengenceran 10-5, b). Pengenceran 10-6, c).Pengenceran 10-7, d). Pengenceran 10-8, e). Pengenceran 10-9, f). Pengenceran10-10........................................................................................................................42
9. Pemilihan Isolat Amilolitik a). BAL amilolitik menunjukan warna bening (IG-9-13) b). semua isolat menunjukan hasil negatif ..................................................42
10. Penapisan Kultur Tunggal beberapa Isolat a). kontrol negatif b). (i) Isolat IG-9-13 c). Isolat IG-10-1 ...........................................................................................44
11. Lima Belas Stok Isolat BAL Amilolitik ..............................................................45
12. Kurva Standar Glukosa ........................................................................................50
13. Aktivitas Amilolitik 8 Isolat Terpilih...................................................................50
14. Hubungan Indeks Amilolitik dan Aktivitas Unit (U/ml) 8 Isolat ........................51
15. Degradasi BAL Amilolitik a). Kontrol negatif b). Isolat IG-6-10 c). Isolat IG-9-13 ......................................................................................................................53
16. Tanda Panah Menunjukan IG-6-10, IG-8-7, IG-9-7,IG-9-13, IG-10-1, IG-10-5,IG-10-12, IG-11-2. ...............................................................................................53
iv
17. Mekanisme Kerja Enzim Amilase .......................................................................55
18. Kurva Pertumbuhan Sel Isolat IG-8-7 dan Isolat IG-9-7 Terhadap WaktuInkubasi ................................................................................................................57
19. Aktivitas Unit Enzim Amilase Isolat IG-8-7 dan IG-9-7.....................................58
20. Grafik Profil Pertumbuhan Sel dan Aktivitas Unit Enzim Amilase Isolat IG-8-7 dan IG-9-7 terhadap Waktu Inkubasi ................................................................58
21. Uji Antimikrobia Isolat BAL terhadap E. coli (a) Isolat IG-8-7 (b) Isolat IG-9-7............................................................................................................................60
22. Morfologi Makroskopik Isolat (a) IG-8-7 dan (b) IG-9-7 pada Medium PatiAgar dengan Waktu Inkubasi 24-48 jam .............................................................62
23. Pewarnaan Gram a). Isolat IG-8-7, b). Isolat IG-9-7 ...........................................63
24. Hasil Uji Moltilitas pada Isolat (a) IG-8-7 dan (b) IG-9-7 setelah diinkubasiselama 48 jam.......................................................................................................64
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Kandungan Gizi Pati Singkong per 100 gr ................................................................. 12
2. Perbedaan Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. ................................................. 16
3. Indeks Amilolitik 15 Isolat Hasil Isolasi ..................................................................... 48
4. Nilai Absorbansi Larutan Standar Glukosa ................................................................ 49
5. Nilai Indeks Amilolitik 8 Isolat ........................................................................................ 52
6. Nilai IA dan Perkiraan Spesies 8 Isolat Mikroorganisme Amilolitik sertaPigmentasi dengan Waktu Inkubasi 24 jam............................................................... 54
7. Karakterisasi Morfologi secara Makroskopik pada Cawan Petri............................. 62
8. Karakteristik Morfologi secara Mikroskopik ............................................................. 63
1. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Pola hidup masyarakat Indonesia yang cenderung menyadari akan pentingnya
kesehatan menyebabkan kebutuhan pangan tidak terbatas. Pangan diharapkan
mampu berfungsi menjaga kesehatan dan kebugaran tubuh. Salah satunya
makanan fermentasi, produk pangan fermentasi ini biasa disebut sebagai pangan
fungsional. Produk pangan yang banyak yang dikembangkan sebagai pangan
fungsional antara lain adalah produk-produk probiotik. Banyak spesies bakteri
telah lama digunakan manusia, seperti Lactobacillus casei dan Lactobacillus
bulgarius. Bakteri probiotik yang sebagian besar merupakan bakteri asam laktat
misalnya, Lactobacillus sp dan Streptococcus sp (Winarno et al., 2003).
Cartney (1997) melaporkan bahwa bakteri probiotik dapat membantu menjaga
kesehatan usus, penyerapan makanan, produksi vitamin, dan mencegah
pertumbuhan bakteri patogen. Selain itu, dapat meningkatkan fungsi sistem
kekebalan tubuh, metabolisme kolesterol, anti karsinogen, dan menghambat
penuaan dini. Produk makanan fermentasi yang mengandung probiotik ini
dikenal dengan istilah makanan fungsional (Fueller, 1989).
Makanan fungsional lain yang mengandung probiotik, yaitu komponen pangan
yang tidak dapat terhidrolisis oleh enzim-enzim pencernaan dalam saluran
2
pencernaan manusia. Komponen ini menguntungkan tubuh dengan cara
menstimulasi pertumbuhan atau aktivitas sejumlah bakteri misalnya Bakteri Asam
Laktat, Bifidobacterium, Enterococcus, Bacteroides, dan Eubacterium di dalam
usus besar yang pada akhirnya dapat meningkatkan kesehatan tubuh (Gibson &
Roberfroid 1995).
Bakteri asam laktat (BAL) berbentuk batang, tidak membentuk spora, tumbuh
pada suhu optimum ± 40 oC, pada umumnya tidak motil, bersifat anaerob,
katalase negatif, dan oksidase positif, dengan asam laktat sebagai produk utama
fermentasinya. Sifat-sifat khusus BAL adalah mampu tumbuh pada kadar gula,
alkohol, dan garam yang tinggi, dan mampu memfermentasikan karbohidrat
seperti polisakarida (Syahrurahman, 1994). Menurut Salminen et al. (2004),
syarat-syarat yang harus dipenuhi oleh bakteri asam laktat yang berfungsi
sebagai probiotik antara lain: (1) harus nonpatogenik yang mewakili
mikroorganisme normal usus dari inang tertentu dan masih aktif pada kondisi
asam lambung dan konsentrasi garam empedu yang tinggi di dalam usus
halus, (2) harus mampu tumbuh dan bermetabolisme dengan cepat dan
terdapat dalam jumlah yang tinggi pada usus, (3) dapat mengkolonisasi
beberapa bagian saluran usus untuk sementara, (4) probiotik dapat memproduksi
asam-asam organik secara efisien dan memiliki sifat antimikroba terhadap
bakteri yang merugikan, (5) mudah diproduksi, mampu tumbuh dalam sistem
produksi skala besar, dan dapat hidup selama kondisi penyimpanan.
BAL yang memiliki kemampuan memanfaatkan pati sebagai substratnya
dikenal sebagai BAL amilolitik. Aktivitas BAL pada fermentasi bahan berpati
3
berperan terhadap perubahan karakteristik produk untuk memproduksi asam
laktat, enzim spesifik, dan senyawa aromatik (Camargo et al., 1988; Demiate
et al., 1999; Marcon et al., 2006). BAL dapat menghasilkan amilase
ekstraseluler dan memfermentasi pati secara langsung menjadi asam laktat. Hal
ini disebabkan fermentasi dengan BAL amilolitik akan menggabungkan dua
proses yaitu hidrolisis enzimatis substrat karbohidrat (pati) sekaligus
fermentasi yang memanfaatkan gula yang dihasilkan menjadi asam laktat
(Reddy et al., 2008; Petrov et al., 2008).
BAL amilolitik telah diisolasi dari makanan tradisional berbasis serealia dan
kasava terfermentasi (Nwankwo et al., 1989; Olympia et al., 1995; Johansson et
al., 1995; Morlon-Guyot et al.,1998; Sanni et al., 2002). Kajian mikrobiologis
pada fermentasi alami pati kasava asam di Columbia mengarah pada isolasi BAL
amilolitik, Lactobacillus (L) manihotivorans, yang bersifat homolaktik dan
menghasilkan lebih dari 98% L(+)-asam laktat (Morlon-Guyot et al., 1998).
Penelitian selanjutnya berhasil menemukan tujuh isolat L. manihotivorans pada
proses produksi pati kasava asam yang enam di antaranya bersifat amilolitik dan
dua diantaranya dapat memfermentasi beragam karbohidrat (Guyot et al., 2003).
Lacerda et al. (2005) menemukan L. plantarum dan L. fermentum dominan pada
fermentasi alami kasava di Brazil, selain juga menemukan L. perolans dan L.
Brevis.
Salah satu makanan khas Indonesia berbasis kasava terfermentasi adalah
growol. Growol merupakan makanan fermentasi tradisional yang berasal dari
Yogyakarta khususnya Kulon Progo terbuat dari ketela dan mempunyai rasa asam.
4
Uji mikrobiologis yang pernah dilakukan menunjukkan bahwa BAL yang
tumbuh pada growol adalah jenis Lactobacillus yang bersifat homofermentatif
(Muttarokah, 1998; Ngatirah, 2000), akan tetapi kemampuan amilolitik BAL
tersebut belum diuji. Ngatirah (2000) mengidentifikasi satu isolat dari growol
sebagai Lactobacillus sake. Berbagai sampel bahan baku menentukan komposisi
mikrobiota, termasuk keberadaan BAL amilolitik (Guyot et al., 2000).
Pengembangan penelitian perlu dilakukan untuk mendapatkan strain BAL
dengan kemampuan mendegradasi pati (amilolitik) dan memiliki aktivitas
antimikroba. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat
BAL indigenus dari proses fermentasi pembuatan growol yang memiliki
kemampuan amilolitik dan antimikroba, sehingga dapat dimanfatkan sebagai
inokulum untuk produksi asam laktat dari pati yang sekaligus mempunyai
aktivitas antimikroba.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dilakukan penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. mengisolasi BAL Amilolitik dari air pada proses fermentasi pembuatan
growol.
2. mengidentifikasi BAL yang memiliki kemampuan amilolitik (mampu
mendegradasi pati).
3. mengkarakterisasi isolat BAL amilolitik yang diperoleh dari proses isolasi.
4. mengidentifikasi BAL amilolitik yang memiliki aktivitas antimikroba.
5
C. Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi ilmiah mengenai
keaneragaman BAL amilolitik yang memiliki aktivitas mengdegradasi pati dan
memiliki aktivitas antimikroba yang berasal dari proses fermentasi pada
pembuatan growol.
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Makanan Fermentasi
Indonesia merupakan negara multi pulau dan multi etnis. Keberagaman kondisi
lingkungan dan budaya secara tidak langsung mempengaruhi karakteristik produk
pangan masyarakatnya dan kondisi tersebut melahirkan banyak produk pangan
tradisional khas daerah. Ada banyak jenis pangan tradisional seperti tempe,
bekasam, tempoyak, terasi masih banyak yang lainya yang merupakan pangan
fermentasi (Hosono, 1989).
Pada awalnya tujuan fermentasi pangan adalah untuk mengawetkan pangan yang
bersifat musiman dan mudah rusak. Sejalan dengan perkembangan alternatif
pengawetan pangan maka pengembangan produk pangan fermentasi saat ini lebih
karena tekstur, aroma dan rasanya yang khas. Dampak positif dari produk
fermentasi terhadap kesehatan konsumen juga menjadi alasan pengembangan
produk fermentasi sekarang ini. Pemecahan komponen yang kompleks menjadi
komponen komponen yang lebih sederhana menyebabkan produk fermentasi lebih
mudah dicerna daripada produk pangan asalnya. Pada beberapa produk
fermentasi, dilaporkan pula adanya peningkatan kandungan beberapa vitamin,
antioksidan, dan senyawa lain yang bermanfaat bagi kesehatan. Selain itu, ketika
produk diproduksi sebagai produk probiotik, maka keberadaan mikroba baik yang
7
dapat mencapai usus dalam keadaan hidup dapat membantu menjaga kesehatan
saluran cerna dan tergantung dari jenis bakterinya, juga dapat mencegah
munculnya penyakit-penyakit degeneratif (Buckle et al., 2007).
B. Fermentasi
Fermentasi dapat didefinisikan sebagai perubahan gradual oleh enzim dari
beberapa bakteri, kamir, dan jamur di dalam media pertumbuhan. Perubahan
kimia dan fermentasi meliputi pengasaman susu, dekomposisi pati serta
perubahan gula menjadi alkohol dan karbondioksida. Fermentasi terjadi karena
adanya aktivitas suatu mikroorganisme terhadap substrat yang sesuai sebagai
media pertumbuhan mikroorganisme tersebut. Proses fermentasi menyebabkan
perubahan pada sifat substrat, contohnya pada fermentasi sari buah akan timbul
rasa dan bau alkohol, pada fermentasi ketela dan ketan akan menghasilkan bau
alkohol dan rasa asam yang khas (tape), pada fermentasi susu akan menghasilkan
bau dan rasa asam. Tujuan dilakukanya fermentasi adalah memperbanyak jumlah
mikroorganisme dan meningkatkan aktivitas metabolismenya terhadap media
fermentasi (Hidayat, 2006).
Fermentasi berdasarkan penambahan starter (kultur mikroorganisme), dibedakan
atas dua jenis, yaitu fermentasi spontan dan fermentasi tidak spontan. Fermentasi
spontan adalah fermentasi yang berjalan alami, tanpa penambahan starter,
mikroba yang tumbuh terdapat secara alami pada medium sehingga mikroba
tertentu yang melakukan fermentasi dapat tumbuh dengan baik (Prasetya, 1985
dalam Rustan 2013). Sedangkan fermentasi tidak spontan adalah fermentasi
8
yang berlangsung dengan penambahan starter misalnya tempe, yoghurt, roti dan
lain-lain (Dwiari et al, 2008).
Secara fisiologis dan berdasarkan aktivitas metabolismenya fermentasi terbagi
menjadi dua jenis yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. BAL
homofermentatif akan mengubah gula menjadi asam laktat, sedangkan
heterofermentatif akan memproduksi tidak hanya asam laktat namun juga asam
asetil, etanol dan karbon dioksida. Kedua jenis bakteri tersebut digunakan melalui
uji fermentasi. Apabila BAL yang di uji menghasilkan gas yang tertampung
dalam tabung durham maka bakteri tersebut dinyatakan sebagai heterofermentatif
sedangkan isolate yang tidak menghasilkan atau memprodksi gas disebut
homofermentatif (Suryani, 2008 dalam Nasution 2012).
Secara umum ada empat kelompok fermentasi yang penting secara ekonomi :
1. Fermentasi yang memproduksi sel mikroba (biomass)
Produk komersial dari biomass dapat dibedakan menjadi produksi yeast
untuk industri roti, dan produksi sel mikroba untuk digunakan sebagai
makanan manusia dan hewan.
2. Fermentasi yang menghasilkan enzim dan mikroba
Secara komersial, enzim dapat diproduksi oleh tanaman, hewan, dan
mikroba, namun enzim yang diproduksi oleh mikroba memiliki
beberapa keunggulan yaitu, mampu dihasilkan dalam jumlah besar dan
mudah untuk meningkatkan produktivitas bila dibandingkan dengan
tanaman atau hewan.
9
3. Fermentasi yang menghasilkan metabolit
Metabolit dapat dibedakan menjadi metabolit primer dan metabolit
sekunder. Produk metabolisme primer yang dianggap penting contohnya.
etanol, asam sitrat, polisakarida, aseton, butanol,dan vitamin. Sedangkan
metabolit sekunder yang dihasilkan mikroba contohnya antibiotik,
pemacu pertumbuhan, inhibitor enzim, dan lain-lain.
4. Proses Transformasi
Sel mikroba dapat digunakan untuk mengubah suatu senyawa menjadi
senyawa lain yang masih memiliki kemiripan struktur namun memiliki
nilai komersial yang lebih tinggi. Proses tranformasi dengan
menggunakan mikroba ini lebih baik bila dibandingkan dengan proses
kimia, berkaitan dengan penggunaan reagen kimia yang lebih sedikit.
Selain itu proses dapat berlangsung pada suhu rendah tanpa
membutuhkan katalis logam berat yang berpotensi menimbulkan
kerugian (Gandjar dkk, 2006).
C. Growol
Growol merupakan makanan fermentasi tradisional yang terbuat dari ketela dan
mempunyai rasa asam. Jenis makanan ini banyak dibuat di daerah Yogyakarta
khususnya Kulon Progo dan daerah sekitarnya. Proses pembuatan growol
berlangsung selama 4 hari yaitu dengan cara merendam ketela yang telah dikupas
dan diiris kecil-kecil di dalam air selama 4 hari, kemudian ditiriskan dan
dihancurkan sebelum akhirnya dikukus. Berikut growol seperti yang terlihat pada
Gambar 1.
10
Gambar 1. Growol
Selama perendaman ini terjadi fermentasi alami, berbagai jenis mikrobia yang
tumbuh pada awal fermentasi adalah Coryneform, Streptococcus, Bacillus,
Actinobacter, yang selanjutnya diikuti oleh Lactobacillus dan yeast sampai akhir
fermentasi. Selama proses fermentasi, bakteri asam laktat yang paling dominan
tumbuh, bakteri tersebut bersifat anaerob, amilolitik dan fermentatif. Jumlah
bakteri asam laktat pada growol tiap gramnya sebesar 1,64 ×10 6 (Suharni, 1984).
Jumlah BAL tersebut dapat mempertahankan keseimbangan mikroflora usus yang
sehat, bahwa bakteri probiotik harus hidup untuk dapat memberikan efek
kesehatan dan terdapat dalam konsentrasi minimal 10 6 cfu/g produk (Shah,
2001). Beberapa keuntungan Lactobacillus casei subsp.rhamnosus TGR2 yang
diisolasi dari growol adalah sifat metabolit ekstraseluler yang tetap stabil pada
suhu kamar, pada pemanasan 98ºC tahan selama 30 menit, pH 3 – 8, pada
pemanasan 2ºC selama 5 menit dan pada suhu 4ºC selama 2 hari (Rahayu, 1995).
D. Pati (amilum)
Pati adalah karbohidrat yang merupakan polimer glukosa, dan terdiri atas
amilosa dan amilopektin (Jacobs dan Delcour 1998). Struktur Amilum dapat
dilihat pada Gambar 2.
11
Gambar 2. Struktur Amilum
Pati dapat diperoleh dari biji- bijian, umbi-umbian, sayuran, maupun buah-
buahan. Sumber alami pati antara lain adalah jagung, labu, kentang, ubi jalar,
pisang, barley, gandul, beras, sagu, amaranth, ubi kayu, ganyong, dan sorgum.
Pemanfaatan pati asli masih sangat terbatas karena sifat fisik dan kimianya
kurang sesuai untuk digunakan secara luas. Oleh karena itu, pati akan
meningkat nilai ekonominya jika dimodifikasi sifat-sifatnya melalui perlakuan
fisik, kimia, atau kombinasi keduanya (Liu et al., 2005).
Pati singkong adalah pati yang didapatkan dari umbi singkong (Manihot
utilissima). Sampai saat ini, pati singkong telah banyak dieksploitasi secara
komersial dan masih merupakan sumber utama kebutahan pati. Pati yang
diperoleh dari ekstraksi umbi singkong ini akan memberikan warna putih jika
diekstraksi secara benar. Pati singkong memiliki granula dengan ukuran 5-35
μm dengan rata-rata ukurannya di atas 17 μm (Samsuri, 2008). Kandungan gizi
pati singkong dapat dilihat pada Tabel 1 dan pati singkong dapat dilihat pada
Gambar 3.
12
Gambar 3. Pati Singkong
Tabel 1. Kandungan Gizi Pati Singkong per 100gr
Komposisi Satuan Jumlah
Kalori Kcal 363Karbohidrat % 88,2kadar air % 9,0Lemak % 0,5Protein % 1,1Kalsium mg 84Fosfor mg 1225Besi mg 1,0Vitamin B1 mg 0,4Vitamin C mg 0
Sumber : (Soemarno, 2007)
E. Bakteri
Bakteri merupakan organisme bersel tunggal yang hidup bebas tanpa klorofil dan
memiliki DNA maupun RNA. Sebagian besar bakteri berukuran kecil, yaitu
hanya beberapa micron saja (Gupte, 1990). Beberapa kelompok memiliki
flagella dan dapat bergerak aktif. Bakteri memiliki berat jenis 1.05 – 1.1 g cm-3
dan berat sekitar10-12 g. Ukuran aktual tergantung dari laju pertumbuhan, media
tumbuh, dan sebagainya. Ada tiga bentuk dasar bakteri, yaitu bentuk bulat atau
kokus, bentuk batang silindris, bentuk lengkung atau vibril. Bentuk bakteri
13
dipengaruhi oleh umur dan syarat pertumbuhan tertentu (Hidayat dkk, 2006).
Berikut struktur sel bakteri seperti yang terlihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Struktur Sel Bakteri (Honeyman, 2001).
1. Fase pertumbuhan mikroorganisme
Ada empat macam fase pertumbuhan mikroorganisme yaitu fase lag, fase log
(fase eksponensial), fase stasioner, dan fase kematian:
a. Fase lambat (lag phase)
Fase lambat mengikuti inokulasi media nutrient, dan dapat merupakan
periode adaptasi. Bila suatu biakan dipindahkan dari suatu lingkungan
yang lain, maka mikroba itu perlu mengorganisasi kembali konstituen
mikro dan makromolekulnya. Selama fase ini massa sel mungkin saja
bertambah tanpa diikuti oleh pertumbuhan jumlah sel.
b. Fase Eksponensial (log phase)
Fase eksponensial merupakan fase pertumbuhan sel, ini merupakan
periode pertumbuhan yang stabil atau keadaan pertumbuhan yang tenang
dan laju pertumbuhan spesifiknya tetap. Komposisi kimia total cairan
14
fermentasinya sedang berubah, sebab nutrien-nutrien sedang dikonsumsi
mikroba dan produk-produk metabolik sedang diproduksi.
c. Fase Seimbang (stationary phase)
Fase seimbang ini terjadi bila semua sel telah mencapai kesetimbangan
dengan sel-sel yang mati. Pada inkubasi lebih lanjut, beberapa hal
mungkin dapat terjadi. Meskipun pertumbuhan bersihnya telah berhenti,
di sana masih mungkin terjadi metabolisme dan mengakumulasikan
produk-produk dalam sel atau cairan fermentasi. Massa total sel
mungkin tetap tetapi jumlah sel yang hidup mungkin menurun
(Supartono dkk, 2008).
f. Fase Kematian
Jumlah sel yang mati telah meningkat dan lebih banyak dari jumlah sel
yang hidup, faktor penyebabnya adalah ketidaktersediaan nutrisi dan
akumulasi produk buangan yang bersifat toksik (Pratiwi, 2007). Berikut
fase pertumbuhan bakteri dapat dilihat pada Gambar 5. seperti yang
terlihat dibawah ini :
Gambar 5. Fase pertumbuhan mikroorganisme (Pratiwi, 2007)
15
2. Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan cara mengamati morfologi sel,
pewarnaan gram, dan melakukan uji biokimia. Bentuk bakteri dibedakan menjadi
3 yaitu bentuk bulat (kokus), bentuk batang (basil), dan bentuk spiral (Pelczar dan
Chan, 1998). Basil berbentuk serupa tongkat pendek silindris, sebagian besar
bakteri berbentuk basil yang dapat bergandeng-gandeng panjang, bergandeng
dua-dua atau terlepas satu sama lain. Kokus merupakan bakteri dengan bentuk
menyerupai bola-bola kecil. Golongan ini tidak sebanyak golongan basil.
Sedangkan untuk bakteri spiral memiliki bentuk yang bengkok atau berbengkok-
bengkok menyerupai spiral. Bakteri golongan ini merupakan golongan yang
jumlahnya paling sedikit (Dwidjoseputro, 2005).
F. Bakteri Asam Laktat (BAL)
BAL merupakan bakteri Gram positif berbentuk kokus atau batang tidak
membentuk spora dan memiliki suhu optimum ±400 C. Pada umumnya non-motil
karena kemampuan biosintesisnya sangat terbatas, bersifat anaerob dan oksidasi
positif. BAL memiliki beberapa sifat khusus, anatra lain mampu tumbuh pada
kadar gula, alkohol, dan garam yang tinggi, mampu memfermentasikan
monosakarida dan disakarida (Syahrurahman, 2007 dalam Nasution 2012).
Berikut perbedaan antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif, seperti
yang terlihat pada Tabe 2. di bawah ini :
16
Tabel 2. Perbedaan bakteri gram positif dan gram negatif.
No Sifat Bakteri grampositif
Bakteri gramnegatif
1. Komposisi dinding sel Kandungan lipidrendah (1-4%)
Kandungan Lipidtinggi (11-22%)
2. Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan lama
3. Penghambat oleh pewarna biasa(misalnya violet kristal)
Lebih dihambat Kurang dihambat
4. Kebutuhan nutrien Kebanyakanspesies relatifkompleks
Relatif sederhana
5. Ketahanan terhadap perlakuanfisik
Lebih tahan Kurang tahan
(Fardiaz,1992).
BAL termasuk dalam kelompok bakteri yang memenuhi status GRAS (Generally
Recognized as Save), yaitu bakteri baik yang aman bagi manusia. Mekanisme
kerja BAL tidak membusukkan protein, melainkan bekerja dengan cara
memetabolisme berbagai jenis karbohidrat secara fermentative menjadi asam-
asam organik. Makanan atau produk pangan lainnya apabila telah tercemar oleh
BAL akan menjadi rusak karena asam-asam yang dihasilkan selama fermentasi
berlangsung dan jika bakteri pembusuk (bakteri pathogen) berada pada jumlah
yang lebih banyak dibandingkan jumlah BAL pada suatu produk pathogen, maka
produk tersebut akan menjadi busuk (Surono, 2004). Kondisi pH optimum BAL
adalah sekitar 4-5 sehingga bakteri asam laktat dapat berkompetitif dengan
bakteri lain terutama bakteri pathogen yang memiliki pH optimum 7,2-7,6
(Wibowo, 2012).
17
BAL terbagi menjadi delapan genus antara lain Lactobacillus, Streptococcus,
Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium, dan
Corinobacterium. Berdasarkan tipe fermentasinya, BAL terbagi menjadi
heterofermentatif yang menghasilkan asam laktat dan senyawa lain seperti CO2
dan homofermentatif menghasilkan asam laktat sebagai produk utama (Fardiaz,
1992).
Berdasarkan strain bakteri, suhu optimum pada pertumbuhan BAL juga beragam.
Beberapa suhu optimum dan berbagai jenis strain bakteri asam laktat yaitu:
Bakteri psikotropik (bakteri yang mampu tumbuh pada suhu 5o C atau
dibawahnya), seperti genus Leuconostoc dan beberapa spesies Lactobacillus
fakultatif heterofermentatif, khususnya Lactobacillus sake. Lactobacillus
bulgaricus dan Streptococcus thermophillus (kultur stater yogurt) dan beberapa
spesies Labtobacillus obligat homofermentatif tumbuh pada suhu optimum 45o C
dan tidak tumbuh pada suhu 15 o C. Beberapa strain bakteri asam laktat yang
memiliki sifat thermodhuric (tahan pada suhu tinggi) seperti Enterococcus dan
Streptococcus thermophillus dapat tumbuh pada suhu mencapai 50o C.
Berdasarkan suhu optimum dan suhu maksimum bakteri asam laktat secara
umum dibagi menjadi dua kelompok yaitu :
a) Bakteri Mesofilik, yaitu bakteri yang memiliki suhu optimum bagi
pertumbuhannya adalah 25oC dan suhu maksimum 37 oC-40 oC. Contoh
bakteri mesofilik adalah strain Lactococci dan Leuconostoc.
18
b) Bakteri Thermofilik, yaitu bakteri yang memliliki suhu optimum bagi
pertumbuhannya adalah 37 oC-45 oC dan suhu maksimum 45 oC-52 oC.
Contohnya adalah Streptococcus thermophiles (Surono, 2004).
G. Pengertian Asam Laktat
Asam laktat atau 2-hydroxypropanoic acid (CH3-CHOH-COOH) merupakan
senyawa kimia yang banyak digunakan dalam industri. Senyawa asam ini
mempunyai sifat antara lain tak berwarna sampai kekuningan, larut dalam air,
alkohol, eter dan korosif. Asam laktat digunakan sebagai bahan tambahan dalam
produk pangan, yaitu sebagai pengatur pH, bahan pengasam pada produk
kembang gula, jus, sirup, meningkatkan aroma dan rasa pada saus serta bumbu,
mengurangi resiko bakteri patogen pada produk daging. Selain itu asam laktat
juga digunakan sebagai bahan baku pada industri yang memproduksi senyawa
senyawa laktat, bahan baku pada industri farmasi sebagai larutan pengental dan
pembuatan tablet. Industri kosmetik sebagai pencampur zat yang membuat kulit
tampak bercahaya dan zat anti jerawat. Industri kimia sebagai pengatur pH,
penertal dan zat pembersih. Sebanyak 70% dari total asam laktat yang
diperdagangkan digunakan dalam makanan dan pengolahan makanan sebagai
pengatur pH, bahan pengawet dan buffer agent (Jin Bo et al., 2005).
Asam laktat di alam ada dalam dua bentuk optik isomer, yaitu D(-) lactic acid
dan L(+) lactic acid. D(-) lactic acid merupakan isomer yang dapat meracuni
manusia sedangkan L(+) lactic acid adalah isomer yang dipilih untuk makanan
dan industri farmasi karena tubuh manusia hanya menghasilkan enzim L-lactate
19
dehygronase. Isomer L(+) lactic acid juga merupakan bahan pembuatan poly
lactic acid (PLA) (Jin Bo et al., 2005).
H. Probiotik
Probiotik adalah mikroba hidup yang sangat menguntungkan bagi sel inang
karena dapat meningkatkan keseimbangan mikroflora usus. Seleksi mikroba
khususnya BAL sangat diperlukan untuk mendapatkan strain-strain probiotik
yang unggul. Hal tersebut dikarenakan tidak semua BAL berpotensi sebagai
probiotik (Fuller, 1989). Definisi lain probiotik menurut Winarno (2003) adalah
suatu preparat yang terdiri dari mikroba hidup yang dimasukkan ke dalam tubuh
manusia atau ternak secara oral. Probiotik diharapkan mampu memberikan
pengaruh positif terhadap kesehatan manusia atau ternak, dengan cara
memperbaiki sifat-sifat yang dimiliki oleh mikroba alami yang tinggal di dalam
saluran pencernaan makhluk hidup.
Banyak sekali manfaat kesehatan dari produk probiotik, antara lain meningkatkan
ketahanan terhadap penyakit infeksi saluran pencernaan dan menurunkan
risiko terjadinya tumor dan kanker kolon (Roos dan Katan, 2000; Rolfe, 2000),
menurunkan konsentrasi kolestrol serum darah (Rodas et al., 1996; Alkalin et
al.,1997), mengurangi reaksi lactose intolerance, menurunkan tekanan darah
antihipertensi, mempengaruhi respon imun, bersifat antimutagenik, serta bersifat
antikarsinogenik (Fernandes dan Shahani, 1990).
20
I. Enzim
Menurut kuhne (1878), enzim berasal dari kata in-zyme yang berarti sesuatu
didalam ragi. Berdasarkan penelitian maka dapat disimpulkan bahwa enzim
adalah suatu protein yang berupa molekul-molekul besar, yang berat molekulnya
ribuan. Sebagai contoh enzim katalase berat molekulnya 248.000 sedang enzim
urese beratnya adalah 438.000. Pada enzim terdapat bagian protein yang tidak
tahan panas yaitu disebut dengan apoenzim, sedangkan bagian yang bukan
protein adalah bagian yang aktif dan diberi nama gugus prostetik, biasanya
berupa logam seperti besi, tembaga, seng atau suatu bahan senyawa organik yang
mengandung logam. Apoenzim dan gugus prostetik merupakan suatu kesatuan
yang disebut holoenzim, tetapi ada juga bagian enzim yang apoenzim dan gugus
prospetiknya tidak menyatu. Contoh koenzim adalah vitamin atau bagian vitamin
misalnya : vitamin B1, B2, B6, niasin, dan biotin (Kartasapoetra, 1994).
Enzim merupakan substansi yang dihasilkan oleh sel-sel hidup dan berperan
sebagai katalisator pada reaksi kimia yang berlangsung dalam organisme.
Katalisator adalah substansi yang mempercepat reaksi tetapi pada hasil reaksi,
substansi tersebut tidak berubah. Enzim mempunyai ciri dimana kerjanya
dipengaruhi oleh lingkungan. Salah satu lingkungan yang berpengaruh terhadap
kerja enzim adalah pH. Enzim mempunyai pH optimal sekitar pH 7 dan jika
medium menjadi sangat asam atau sangat alkalis enzim mengalami inaktivasi
(Gaman and Sherrington, 1994).
Ada beberapa faktor untuk menentukan aktivitas enzim berdasarkan efek
katalisnya yaitu persamaan reaksi yang dikatalis, kebutuhan kofaktor, pengaruh
21
konsentrasi substrat dan kofaktor, pH optimal, daerah temperatur, dan penentuan
berkurangnya substrat atau bertambahnya hasil reaksi. Penentuan ini biasa
dilakukan di pH optimal dengan konsentrasi substrat dan kofaktor berlebih,
menjadikan laju reaksi yang terjadi merupakan tingkat ke 0 (zero order reaction)
terhadap substrat. Pengamatan reaksinya dengan berbagai cara kimia atau
spektrofotometri. Ada dua teori tentang mekanisme pengikatan substrat oleh
enzim, yaitu teori kunci dan anak kunci (lock and key) dan teori induced fit
(Wirahadikusumah, 1989).
Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi fungsi enzim diantaranya adalah
(Dwidjoseputro, 2005) :
1. Suhu
Oleh karena reaksi kimia itu dapat dipengaruhi suhu maka reaksi
menggunakan katalis enzim dapat dipengaruhi oleh suhu. Di samping
itu, karena enzim adalah suatu protein maka kenaikan suhu dapat
menyebabkan denaturasi dan bagian aktig enzim akan terganggu
sehingga konsentrasi dan kecepatan enzim berkurang.
2. pH
Umumnya enzim efektifitas maksimum pada pH optimum, yang
lazimnya berkisar antara pH 4,5-8.0. Pada pH yang terlalu tinggi atau
terlalu rendah umumnya enzim menjadi non aktif secara irreversibel
karena menjadi denaturasi protein.
3. konsentrasi enzim
Seperti pada katalis lain, kecepatan suatu reaksi yang menggunakan
enzim tergantung pada konsentrasi enzim tersebut. Pada suatu
22
konsentrasi substrat tertentu, kecepatan reaksibertambah dengan
bertambahnya konsentrasi enzim.
4. konsentrasi substrat
Hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi substrat akan
menaikkan kecepat reaksi. Akan tetapi, pada batas tertentu tidak terjadi
kecepatan reaksi, walaupun konsenrasi substrat diperbesar.
5. zat-zat penghambat
Hambatan atau inhibisi suatu reaksi akan berpengaruh terhadap
penggabungan substrat pada bagian aktif yang mengalami hambatan.
J. Enzim Amilase
Salah satu enzim yang diperlukan untuk pertumbuhan adalah amilase. Amilase
dapat diartikan sebagai segolongan enzim yang merombak pati, glikogen, dan
polisakarida yang lain. Tumbuhan mengandung α dan ß amilase; hewan memiliki
hanya α amilase, dijumpai dalam cairan pankreas dan juga (pada manusia dan
beberapa spesies lain) dalam ludah. Amilase memotong rantai polisakarida yang
panjang, menghasilkan campuran glukosa dan maltosa. Amilosa merupakan
polisakarida yang terdiri dari 100-1000 molekul glukosa yang saling berikatan
membentuk rantai lurus. Dalam air, amilosa bereaksi dengan iodine memberikan
warna biru yang khas. Pada manusia, α amilase pada ludah dan pankreas berguna
dalam hidrolisis pati yang terkandung dalam makanan ke dalam bentuk
oligosakarida, di mana dalam perubahan tersebut dapat dihidrolisis oleh
disakarida atau trisakarida dalam jumlah kecil. Contohnya, α amilase pada
23
mamalia memiliki pH optimum 6-7, bergantung pada ada atau tidaknya ion
halogen (Kartasapoetra, 1994).
Sumber enzim Amilase (alfa, beta dan glukoamilase) merupakan enzim yang
penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase dapat diperoleh dari
berbagai sumber seperti tanaman, binatang dan mikroorganisme. Saat ini
sejumlah enzim amilase telah diproduksi secara komersial. Penggunaan mikrobia
dianggap lebih prosepektif karena mudah tumbuh, cepat menghasilkan dan
kondisi lingkungan dapat dikendalikan ( Pujiyanti, 2007 ).
Produksi enzim amilase dapat menggunakan berbagai sumber karbon. Contoh-
contoh sumber karbon yang murah adalah sekam, molase, tepung jagung, jagung,
limbah tapioka dan sebagainya. Jika digunakan limbah sebagai substrat, maka
limbah tadi dapat diperkaya nutrisinya untuk mengoptimalkan produksi enzim.
Sumber karbon yang dapat digunakan sebagai suplemen antara lian : pati,
sukrosa, laktosa, maltosa, dekstrosa, fruktosa, dan glukosa. Sumber nitrogen
sebagai suplemen antara lain : pepton, tripton, ekstrak daging, ekstrak khamir,
amonium sulfat, tepung kedelai, urea dan natrium nitrat (Kartasapoetra, 1994).
K. Spektrofotometer UV-VIS
Spektrofotometri UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang, intensitas sinar
ultraviolet, dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinar ultraviolet dan
cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan elektron pada
kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektroskopi UV-Vis biasanya
digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks di dalam larutan.
Spektrum UV-Vis mempunyai bentuk yang lebar dan hanya sedikit informasi
24
tentang struktur yang bisa didapatkan dari spektrum ini sangat berguna untuk
pengukuran secara kuantitatif. Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang
200-400 nm, sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800
nm. Kebanyakan penerapan spektrofotometri UV-Vis pada senyawa organik
didasarkan n-π* ataupun π-π* karena spektrofotometri UV-Vis memerlukan
hadirnya gugus kromofor dalam molekul itu. Transisi ini terjadi dalam daerah
spektrum (200-700 nm) yang nyaman untuk digunakan dalam eksperimen.
Spektrofotometer UV-Vis yang komersial biasanya beroperasi dari sekitar 175 nm
atau 200-1000 nm. Identifikasi kualitatif senyawa organik dalam daerah ini jauh
lebih terbatas daripada dalam daerah inframerah. Ini karena pita serapan terlalu
lebar dan kurang terinci. Tetapi, gugus-gugus fungsional tertentu seperti karbonil,
nitro, sistem tergabung, benar-benar menunjukkan puncak yang karakteristik, dan
sering dapat diperoleh informasi yang berguna mengenai ada tidaknya gugus
semacam itu dalam molekul tersebut (Day dan Underwood, 1986).
Prinsip kerja spektrofotometer berdasarkan hukum Lambert Beer, yaitu bila
cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya
tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It)
(Seran, 2012).
Bagian-bagian dan cara kerja spektroskopi UV-VIS
Fungsi masing-masing bagian:
1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan
berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk spektrofotometer UV
menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavy hidrogen,
spektrofotometer VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu
25
wolfram, spektrofotometer UV-VIS menggunakan photodiode yang telah
dilengkapi monokromator.
2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu
mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya
monokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalah
gratting atau lensa prisma dan filter optik.
3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel UV, VIS, dan UV-VIS
menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari
kuarsa atau gelas, kuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1
cm.
4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel, dan
mengubahnya menjadi arus listrik.
5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat
listrik yang berasal dari detektor.
Cara kerja alat spektrofotometer UV-Vis yaitu sinar dari sumber radiasi
diteruskan menuju monokromator. Cahaya dari monokromator diarahkan terpisah
melalui sampel dengan sebuah cermin berotasi. Detektor menerima cahaya dari
sampel secara bergantian secara berulang-ulang. Sinyal listrik dari detektor
diproses, diubah ke digital dan dilihat hasilnya, selanjutnya perhitungan dilakukan
dengan komputer yang sudah terprogram (Harjadi, 1993). Skema alat
spektroskopi UV-VIS dapat dilihat pada Gambar 6.
26
Gambar 6. Skema alat spektroskopi UV-VIS (Seran, 2012).
L. Metode Fuwa
Pengujian aktivitas amilase dengan metode Fuwa. Aktivitas amilase ditentukan
dengan metode Fuwa (Fuwa, 1954). Metode ini berdasarkan pada pengurangan
jumlah pati hingga menghasilkan warna bening. Uji Fuwa merupakan uji yang
paling spesifik untuk mengidentifikasi aktivitas amilase karena waktu inkubasi
yang dibutuhkan hanya 10 menit. Semakin kecil absorbansi sampel maka akan
semakin baik aktivitas dari enzim tersebut.
M. Aktivitas Antimikroba dan Efeknya
Antibakteri adalah senyawa yang digunakan untuk mengendalikan pertumbuhan
bakteri yang bersifat merugikan. Pengendalian pertumbuhan mikroorganisme
bertujuan untuk mencegah penyebaran penyakit dan infeksi, membasmi
mikroorganisme pada inang yang terinfeksi, dan mencegah pembusukan serta
perusakan bahan oleh mikroorganisme (Sulistyo, 1971). Antimikrobia meliputi
golongan antibakteri, antimikotik, dan antiviral (Ganiswara, 1995).
Mekanisme penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri oleh senyawa
antibakteri dapat berupa perusakan dinding sel dengan cara menghambat
27
pembentukannya atau mengubahnya. Setelah selesai terbentuk, perubahan
permeabilitas membran sitoplasma sehingga menyebabkan keluarnya bahan
makanan dari dalam sel, perubahan molekul protein dan asam nukleat,
penghambatan kerja enzim, dan penghambatan sintesis asam nukleat dan protein.
Di bidang farmasi, bahan antibakteri dikenal dengan nama antibiotik, yaitu suatu
substansi kimia yang dihasilkan oleh mikroba dan dapat menghambat
pertumbuhan mikroba lain. Senyawa antibakteri dapat bekerja secara
bakteriostatik, bakteriosidal, dan bakteriolitik (Pelczar dan Chan, 1988).
Menurut Madigan dkk. (2000), berdasarkan sifat toksisitas selektifnya, senyawa
antimikrobia mempunyai 3 macam efek terhadap pertumbuhan mikrobia yaitu:
1. Bakteriostatik memberikan efek dengan cara menghambat pertumbuhan
tetapi tidak membunuh. Senyawa bakterostatik seringkali menghambat
sintesis protein atau mengikat ribosom. Hal ini ditunjukkan dengan
penambahan antimikrobia pada kultur mikrobia yang berada pada fase
logaritmik. Setelah penambahan zat antimikrobia pada fase logaritmik
didapatkan jumlah sel total maupun jumlah sel hidup adalah tetap.
2. Bakteriosidal memberikan efek dengan cara membunuh sel tetapi tidak terjadi
lisis sel atau pecah sel. Hal ini ditunjukkan dengan penambahan antimikrobia
pada kultur mikrobia yang berada pada fase logaritmik. Setelah penambahan
zat antimikrobia pada fase logaritmik didapatkan jumlah sel total tetap
sedangkan jumlah sel hidup menurun. Bakteriolitik menyebabkan sel
menjadi lisis atau pecah sel sehingga jumlah sel berkurang atau terjadi
kekeruhan setelah penambahan antimikrobia. Hal ini ditunjukkan dengan
penambahan antimikrobia pada kultur mikrobia yang berada pada fase
28
logaritmik. Setelah penambahan zat antimikrobia pada fase logaritmik,
jumlah sel total maupun jumlah sel hidup menurun. Mekanisme
penghambatan antibakteri dapat dikelompokkan menjadi lima, yaitu
menghambat sintesis dinding sel mikrobia, merusak keutuhan dinding sel
mikrobia, menghambat sintesis protein sel mikrobia, menghambat sintesis
asam nukleat, dan merusak asam nukleat sel mikrobia (Sulistyo, 1971).
Daya antimikrobia diukur secara in vitro agar dapat ditentukan kemampuan
suatu zat antimikrobia (Jawetz , 2001). Adanya fenomena ketahanan
tumbuhan secara alami terhadap mikrobia menyebabkan pengembangan
sejumlah senyawa yang berasal dari tanaman yang mempunyai kandungan
antibakteri dan antifungi (Griffin, 1981).
N. Metode Difusi
Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi dan metode
pengenceran. Disc diffusion test atau uji difusi disk dilakukan dengan mengukur
diameter zona bening (clear zone) yang merupakan petunjuk adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh suatu senyawa antibakteri dalam ekstrak.
Syarat jumlah bakteri untuk uji kepekaan/sensitivitas yaitu 105-108 CFU/mL
(Hermawan dkk., 2007).
Metode difusi merupakan salah satu metode yang sering digunakan. Metode
difusi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu metode silinder, metode lubang atau
sumuran dan metode cakram kertas. Metode lubang/sumuran yaitu membuat
lubang pada agar padat yang telah diinokulasi dengan bakteri. Jumlah dan letak
29
lubang disesuaikan dengan tujuan penelitian, kemudian lubang diinjeksikan
dengan ekstrak yang akan diuji. Setelah dilakukan inkubasi, pertumbuhan bakteri
diamati untuk melihat ada tidaknya daerah hambatan di sekeliling lubang
(Kusmayati dan Agustini, 2007).
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2017- April 2018, bertempat di
Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia dan Laboratorium Mikrobiologi Jurusan
Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.
Laboratorium Biokimia Jurusan kimia Universitas Lampung digunakan untuk
proses isolasi sampai mendapatkan isolat tunggal BAL amilolitik, sedangkan
Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Universitas Lampung digunakan
untuk proses karakterisasi BAL amilolitik.
B. Alat dan Bahan
1. Alat-alat yang digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas, mikropipet,
autoclave (model S-90N), laminar air flow (CURMA model 9005-FL),
spektrofotometer UV-VIS, pH meter, timbangan digital, sentrifuse, incubator,
shaker incubator, Mikroskop, vortex-mixer, thermometer, penangas air, lemari
pendingin, mikroskop, pembakar spritus, oven, kertas cakram, Hot Plate stirrer,
magnetic stirrer, kaca preparat, kasa, kapas, rak tabung , spreader, dan jarum ose.
31
2. Bahan-bahan yang digunakan
Sedangkan bahan-bahan yang digunakan adalah NaCl, pepton, yeast ektract, de
Man Rogosa Sharp Agar (MRSA), starch soluble, Nutrien Agar (NA), CaCO3,
Natrium azida, NaOH, HCL, safranin, akuades, air salin, iodine, KI2, kristal violet
MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, alkohol, akuades, dan air fermentasi growol.
C. Prosedur Penelitian
1. Tahap Persiapan
Seluruh alat gelas yang digunakan dicuci, dikeringkan dan disterilisasi
menggunakan autoclave selama 15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm.
Sterilisasi ini bertujuan untuk menghilangkan mikroba dan pengotor.
a. Pembuatan air salin
Air salin di buat dengan cara menimbang 0,85 gram NaCl dilarutkan
dalam 100 ml akuades lalu disterilkan dengan autoclave selama 15 menit
dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm.
b. Pembuatan Medium Padat de Man Rogose sharp Agar (MRSA)
Medium ini disiapkan dengan cara menimbang 6,2 gram MRSA,
dilarutkan dalam 100 mL air salin, lalu disterilisasi dengan autoclave
selama 15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm. kemudian di
tuang ke dalam cawan petri dan dibiarkan sampai mengeras.
c. Pembuatan Medium Kultur Cair
Medium ini disiapkan dengan cara menimbang 5 gram pati terlarut, 5 gram
pepton, 5 gram yeast ekstrak. 0,5 gram MgSO4.7H2O, 0,01 gram
FeSO4.7H2O dan 0,01 gram NaCl dilarutkan dalam 1000 mL aquades,
32
dipanaskan sampai homogen, lalu disterilisasi dengan autoclave selama 15
menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm. Medium yang telah
disterilisasi kemudian didinginkan.
d. Pembuatan Medium Penyimpanan
Pembuatan medium penyimpanan agar miring. Cara membuatnya yaitu
dengan cara menyiapkan 10 gram pati larut, 10 gram pepton, 5 gram yeast
extract, dan 15 gram agar pada 1000 ml akuades aquades. Dipanaskan
sampai homogen, dimasukan ke dalam tabung reaksi, dan ditutup dengan
sumbat. Medium tersebut kemudian disterilisasi dengan autoclave selama
15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm. Medium yang telah
disterilisasi diberi label nama (jenis media) dan diletakan miring. Medium
dapat digunakan setelah 3 sampai 4 hari dan telah mengeras seperti agar.
e. Pembuatan Medium Pati Agar
Pembuatan medium ini digunakan untuk uji amilolitik, medium ini
disiapkan dengan cara 10 gram pati larut, 10 gram pepton, 5 gram yeast
extract, dan 15 gram agar pada 1000 ml akuades. Kemudian disterilisasi
dengan autoclave selama 15 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 1 atm.
kemudian di tuang ke dalam cawan petri dan dibiarkan sampai mengeras
Putri (2012).
f. Persiapan sampel
Pada penelitian ini bahan baku singkong berasal dari desa Pujodadi,
Kecamatan Trimurjo Kabupaten Lampung Tengah Provinsi Lampung.
Proses diawali dengan sortasi bahan baku, yaitu pemilihan singkong yang
masih segar dengan kondisi fisik yang masih utuh, kemudian dikupas.
33
Bahan singkong yang telah dikupas dipotong-potong dengan ukuran ± 5
cm, sehingga diperoleh ukuran bahan yang seragam. Selanjutnya
dilakukan pencucian hingga 2-3 kali dengan air mengalir. Singkong yang
telah bebas dari kontaminan direndam dengan menggunakan air sumur
dengan perbandingan 1: 3 (b:v) selama empat hari (Luwihana, 2011).
Sampel yang digunakan pada penelitian ini dibuat secara mandiri sebelum
dilakukanya proses isolasi.
g. Pembuatan pereaksi untuk pengukuran aktivitas α-amilase metode Fuwa
1. Pereaksi Iodin
Dimasukan 2 gram KI dalam labu takar 100 mL dan dilarutkan
dalam 10 mL akuades, ditambahakan 0,2 gram I2. Kemudian
ditambahkan akuades sampai btas miniskus.
2. Larutan Pati
0,1 gram pati dilarutkan dalam 100 mL akuades dan dipanaskan
hingga larut.
3. Larutan HCL
Dihitung pengenceran HCL pekat 12 N menjadi 1N. Maka akan
Diperoleh 8,3 mL HCL pekat yang akan ditambah akuades hingga
batas miniskus pada labu ukur 100 mL.
2. Isolasi Mikroba dari Air Proses Fermentasi Growol
Isolasi dilakukan dengan menggunakan medium padat MRSA dengan
pengenceran bertingkat dengan Metode Spread Plate. Sampel berupa air
rendaman pada proses fermentasi growol selama 4-5 hari. Sampel berupa 1 mL
34
air rendaman growol yang diencerkan sampai 10 kali. Proses pengenceran
bertujuan untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi
dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran
tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Pada proses
pengenceran digunakan perbandingan 1:9 untuk sampel dan pengenceran pertama
dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel
mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya. Cara kerja pengenceran
bertingkat yaitu sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung
reaksi pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi
suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1:9
dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah
termasuk pengencer 10-1. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan
mengocoknya. Satu ml diambil dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian
dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan
membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan
dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang
perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap
tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya
bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama
(ferdiaz, 1992). Selanjutnya 1 seri disetiap pengenceran diambil sebanyak 200 µL
dengan menggunakan mikropipet. Kemudian 200 µL sampel pengenceran
ditanamkan pada masing-masing plate yang berisi medium padat MRSA dan
diratakan dengan metode spreader. Inkubasi dilakukan selama 24-48 jam untuk
mengetahui pertumbuhan mikroba pada medium MRSA.
35
3. Koleksi Koloni Tunggal Hasil Isolasi
Dilakukan koleksi koloni tunggal dari hasil isolasi dengan streak plate method
pada medium MRSA. Bakteri isolat ditanamkan pada medium MRSA dengan
menggoreskan bakteri secara zig-zag dengan jarum ose. Cara ini dilakukan
dengan membagi 3-4 cawan petri. Ose steril yang telah disiapkan diletakkan pada
sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan petri berisi
media steril MRSA. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis
horisontal disatu cawan. Ose disterilkan kembali dengan api bunsen. Setelah
kering, ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi
cawan ke dua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores.
Diinkubasi selama 24-48 jam untuk mendapatkan koloni tunggal selektif yang
diinginkan.
4. Penyimpanan Isolat
Setelah didapatkan koloni tunggal dari metode Streak Plate, dilakukan
penyimpanan dengan cara menanamkan bakteri pada medium agar miring MRSA
dengan metode zig-zag dan agar tegak dengan metode tusuk. Setelah ditanam
medium agar miring dan agar tegak diinkubasi disimpan dalam incubator sebagai
stok.
5. Uji Hidrolisi Pati BAL Amilolitik dengan metode Iodin
Isolat BAL di goreskan pada MRSA dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24-
48 jam. Selanjutnya diambil dan digoreskan dalam bentuk garis lurus pada media
pati agar. Masing masing petri yang berisi isolat dituangi dengan larutan gram-
36
iodin untuk membentuk warna biru gelap karena terjadinya kompleks pati-iodin.
Koloni dengan kemampuan amilolitik akan menghidrolisis pati pada medium
disekeliling tempat tumbuhnya dan zona degradasi tidak terbentuk warna biru.
6. Penentuan Kurva Pertumbuhan dan Waktu Optimum aktivitas EnzimAmilase
Setelah diperoleh ekstrak kasar enzim dilakukan pengukuran pertumbuhan
mikroba yang dikenal dengan pengukuran OD (Optical Density). Pengukuran OD
(Optical Density) dilakukan dengan cara sebanyak 0,3 mL kultur diencerkan
dengan menambah 2,7 mL akuades steril lalu dihomogenkan. Kemudian di
masukkan ke dalam kuvet, lalu diukur serapannya menggunakan
Spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 600 nm. Sedangkan untuk
blanko digunakan media Pati terlarut cair tanpa isolat sebanyak 0,3 mL lalu
ditambahkan 2,7 mL akuades steril (Anitha et al., 2012).
Aktivitas enzim α-amilase ditentukan dengan menggunakan metode iodin (Fuwa,
1954). Sebanyak 0,1 mL larutan enzim ditambahkan 0,4 mL aquades dan 0,5 mL
pati, kemudian diinkubasi pada suhu 60°C selama 10 menit. Reaksi dihentikan
dengan penambahan 0,1 mL HCl 0,25 M dan kemudian ditambahkan 0,25 mL
larutan iodin dan 4 mL akuades ke dalam campuran reaksi. Campuran tersebut
dihomogenkan dan diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV-VIS
pada λ 600 nm. Kontrol dibuat dengan proses yang sama, namun menggunakan
0,25 mL larutan enzim yang sudah diinaktifkan. Penentuan aktivitas dengan
menggunakan metode iodin dilakukan pada tahapan isolasi, pemurnian dan
karakterisasi enzim.
37
7. Uji Aktivitas Amilase BAL Amilolitik secara Kuantitatif
Isolat yang analisis kualitatif amilolitiknya menunjukkan hasil positif diuji lebih
lanjut dengan analisis amilolitik kuantitatif. Masing-masing isolat berumur 24
jam diambil sebanyak 25 µL dan ditumbuhkan pada media pati terlarut cair media
cair. Diambil sebanyak 2 mL untuk diketahui profil degradasi pati. Untuk uji
degradasi pati 1 mL broth disentrifugasi untuk mengendapkan sel bakterinya,
kemudian supernatant diencerkan 100 kali dengan akuades. Sebanyak 10 mL
supernatan hasil pengenceran dimasukkan tabung reaksi dan ditambahkan 1 mL
larutan gram iodin. Campuran dihomogenisasi dan absorbansi larutan yang
membentuk senyawa kompleks berwarna biru diukur dengan spektrometer pada
panjang gelombang 585-600 nm. Kadar pati dalam sampel dihitung menggunakan
persamaan garis yang didapatkan dari kurva standar, yaitu:
y = a + bx
Keterangan :
y = absorbansix = kadar pati.
8. Uji aktivitas antimikroba BAL Amilolitik
Dilakukan pengujian dengan metode difusi agar dimana mikroba hasil isolasi
sebagai kontrol. Media NA (Nutrien Agar) sebanyak 15 mL dituang ke dalam
cawan petri steril, diinokulasikan masing-masing suspensi bakteri uji E.coli
sebanyak 0,1 mL, dihomogenkan kemudian didiamkan beberapa saat hingga
memadat. Kemudian pada permukaan media agar diletakkan kertas cakram,
ditetesi masing-masing dengan mikroba hasil isolasi yang telah ditentukan
38
sebanyak 20 µL. Pengujian juga dilakukan terhadap kontrol positif menggunakan
kloramfenikol 30 µg/mL dan kontrol negatif dengan menggunakan akuades.
Cawan petri yang sudah diberi perlakuan dengan berbagai konsentrasi, kontrol
positif, dan kontrol negatif diinkubasi pada 35°C selama 24-48 jam. Daerah
bening di sekitar cakram menunjukkan adanya daerah hambatan bakteri.
Diameter daerah hambat (DDH) diukur dalam satuan milimeter (mm)
menggunakan penggaris.
9. Karaterisasi Mikroba BAL Amilolitik
Identifikasi mikroba BAL amilolitik yang diperoleh dari hasil isolasi dan skrining
dilakukan pengamatan sifat morfologi koloni menurut Metode Bergey’s Manual
Systematic Bacteriology (1923). Karakterisasi morfologi mikroba dapat berupa
pengamatan makroskopik dan pengamatan mikroskopik (Cappucino and Sherman,
2001).
a. Karakterisasi secara Makroskopis
Karakterisasi mikroba secara makroskopis dapat dilakukan dengan melihat
morfologi mikroba pada medium agar dalam cawan petri, pengamatan
morfologi tersebut meliputi pigmentasi, bentuk koloni, elevasi dan tepian
koloni.
b. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan karakteristik mikroba secara mikroskopik.
Dengan cara, 1 ose mikroba diletakkan pada kaca preparat yang telah
dibersihkan dengan alkohol, diratakan hingga membentuk lapisan tipis.
39
Setelah kering, difiksasi dengan melewatkan kaca preparat di atas nyala api
spritus, kemudian ditetesi dengan larutan kristal violet, setelah itu dicuci
dengan air mengalir, kemudian diteteskan larutan iodin, setelah beberapa saat
dibilas kembali menggunakan air mengalir, dicuci lagi menggunakan alkohol.
Setelah kering, ditambahkan beberapa tetes larutan safranin, dan didiamkan
selama 1 menit, dibilas dengan air mengalir dan dikeringkan. Kemudian
dilakukan pengamatan menggunakan mikroskop. Selanjutnya diamati di
bawah mikroskop, bentuk dan penataan sel-selnya serta gramnya
(Cappuccino, 1983).
c. Uji Moltilitas
Moltilitas diamati dengan menggunakan medium semi padat Sulfide Indole
Moltility (SIM). Uji moltilitas dilakukan dengan cara menusukan 1 ose
mikroba secara tegak lurus hingga setengah tinggi dari media pada tabung
reaksi, kemudian diinkubasi selama 48 jam. Setelah itu diperhatikan jejak
pergerakan mikroba, apabila terdapat serat-seat halus disekitar daerah tusukan
berarti mikroba tersebut moltil (Cappucino, 1983).
40
D. Diagram Alir Prosedur Penelitian
Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian yang
ditunjukkan dalam Gambar 7.
Gambar 7. Diagram Alir Penelitian
Isolasi dan Skrining MikroorganismeBAL amilolitik
Koleksi Isolat Tunggal BALAmilolitik
Penentuan Kurva Pertumbuhan danWaktu Optimum aktivitas BAL
Amilolitik
Uji Degradasi BAL
Penyimpanan Isolat BALAmilolitik Perpilih
Uji Antimikroba BALAmilolitik
Identifikasi MikroorganismeBAL Amilolitik
Data
SecaraMikroskopik
UjiMoltilitas
SecaraMakroskopik
V. KESIMPULAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan maka dapat diperoleh kesimpulan
sebagai berikut :
1. Berdasarkan serangkaian proses isolasi dan skrining diperoleh 15 isolat
BAL amilolitik dan terpilih dua terbaik yaitu IG-8-7 dan IG-9-7
2. Isolat IG-8-7 dan isolat IG-9-7 memiliki IA berturut turut 6.0 dan 3.3.
3. Isolat IG-8-7 dan isolat IG-9-7 memiliki AU berturut turut 18.8 dan 16.6
U/ml.
4. Isolat IG-8-7 dan IG-9-7 memiliki aktivitas antimikroba dengan diameter
2.8 dan 2.2 cm.
5. Isolat IG-8-7 mempunyai aktivitas antimikroba berdiameter 2.8 cm lebih
baik dari kontrol positif kloramfenikol dengan zona hambat 2.5 cm.
6. Hasil karakterisasi menunjukan isolat IG-8-7 dan IG-9-7 diperkirakan
berjenis bacillus.
B. Saran
Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, maka untuk penelitian selanjutnya
disarankan perlu dilakukan karakterisasi mikroba lebih lengkap seperti pengujian
66
sifat-sifat fisologis dan biokimianya untuk mengetahui spesifikasi bakteri yang
diperoleh pada penelitian yang dilakukan.
DAFTAR PUSTAKA
Agustin dan Anthoni. 2000. Isolasi Dan Karakterisasi Enzim AmylaseTermostabil Dari Bakteri Isolate. UNAN. Sumbar.
Buckle, K.A., R.A. Edwards, G.H. Fleet, M. Wootton. 2007. Ilmu pangan.Terj,dari Food science oleh Purnomo, H. & Adiono. UI-Press, Jakarta.
Camargo C, Colona, P Buleon A, and Molard D.R. 1988. Fungtional Properties ofSour Cassava (mahilot utilissima) Starch: Polvilho Azedo.”Journal of theScience of Food and Agriculture 81: 429-435.
Cappuccino, J. G. and Sherman, N. 2001. Microbiology: A Laboratory Manual.Addison-Wesley Publishing Company. New York.
Cartney, M.M. 1997. Enzymes probiotics and antioksidan. NewYork:Mediterranean synergy TM. Awarennes Corporation.USA.
Darkuni, Noviar. 2001. Mikrobiologi (Bakteriologi, Virologi dan Mikologi). UMPress. Malang.
Day, R. A., dan Underwood, A. L. 1986. Analisis Kimia Kuantitatif, Edisi Kelima.Penerbit Erlangga. Jakarta.
Day, R.A., dan Underwood, A.L. 2001. Analisis Kimia Kuantitas. Erlangga.Jakarta.
Dillon, V.M. and P.E. Cook. 2000. Biocontrol of undesirable microorganisms infood. In: Dillon, V.M. and R.E. Board (eds). Natural AntimicrobialSystems and Food Preservation. Wallingford: CAB International.
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.
Dwiari, dan Sri .R . 2008. Teknologi Pangan Jilid 1. Jakarta.
Dwidjoseputro, D. 1978. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan.Jakarta.
Elvira, I., 2016. Karakterisasi Sifat Biokimia Isolat Bakteri Asam LaktatHasil Fermentasi Wikau Maombo. Skripsi.Fakultas Teknologi Dan
68
Industri Pertanian, Jurusan Teknologi Pangan, Universitas Halu Oleo.Kendari.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Fernandes, F. Custy and Shahani, M. Khem. 1990. Anticarcinogenic andImmunological Properties of Dietary Lactobacilli. Journal of FoodProtection: August 1990, Vol. 53, No. 8, pp. 704-710
Fuller, R. 1989. History and development of probiotics. In: Probiotics TheScientific Basis. Fuller. (Ed). Chapman & Hall. London, New York,Tokyo, Melbourne, Madras.
Fuwa, H. 1954. A New Method For Microdetermination Of Amylase Activity byThe Use of Amylase As The Subsratre. J. Biochem. 41: 583-603.
Gandjar, I., W. Sjamsuridzal dan Oetari, A. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan.Yayasan Obor Indonesia. Jakarta.
Ganiswara, G., S. 1995. Faramakologi dan Terapi Edisi IV. UI. Jakarta.
Gaman, P.M & K.B. Sherrington, 1994, Ilmu Pangan, Pengantar Ilmu Pangan,Nutrisi dan Mikrobiologi . UGM-Press. Yogyakarta.
Gibson, G. R., and Roberfroid, M. B. 1995. Dietary Modulation of The HumanColonic Microbiota. Introducing The Concept of Prebiotics. Journal ofNutrition 125, 1401-1412.
Griffin, D.H., 1981. Fungal Pshysiology. John wiley and sons. Inc. New York.
Guyot, JP, Brizuela MA, Rodriguez-Sanoya R, and Morlon-Guyot J. 2003.Characteri- zation and differentiation of Lactobacil- lus manihotivoransstrains isolatd from cassava sour starch. International Jour- nal of FoodMicrobiology 87: 187-192.
Harjadi, W. 1990. Ilmu Kimia Analitik Dasar. PT Gramedia. Jakarta.
Hermawan, A., Hana. W, danWiwiek, T. 2007. Pengaruh Ekstrak Daun Sirih(piper battle L) Terhadap Pertumbuhan staphylococcus dan Eschrichiacoli dengan Metode Diffusi Disk. Unair. Surabaya.
Hidayat, H., Sekarini, dan Mageswari, A. 2006. Mikrobiologi Industri. PenerbitAndi. Yogyakarta.
Honeyman, A.L., Friedman H., dan Bendinelli M. 2001. Staphylococcus aureusinfection and disease. Plenum Publishers. New York.
Hosono, T.K. 1989. Makanan Tradisional Nusantara. Gramedia. Jakarta.
69
Jawets, E., Melnick, J. L., Adelberg, E. A., 2001. Mikrobiologi kedokteran, EdisiXXII, diterjemahkan oleh Bagian Mikrobiologi Fakultas KedokteranUniversitas Airlangga, 205-209. Penerbit Salemba Medika. Jakarta.
Jawetz, E, J. melnick, Adelberg. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. EGC : Jakarta.
Jin Bo, Pinghe Yin, Yibong Ma, Ling Zha O, Production of Lactic Acid andFungal Biomassa by Rhizopus Fungi from Food Processing wasteStreams, Jurnal Ind. Microbiol. Biotechnol, 2005, 32: 678 – 686,Enviromental Biotechnology. Australi.
Johansson, ML, Sanni A, Lonner C, and Mo- lin G. 1995. Phenotypically-basedtaxonomy using API 50 CH of lactobacilli from Nigerian ogi, and theoccurrence of starch fermenting strains. Int J Food Microbiol 25:159–68.
Kartasapoetra, A.G, 1994, Teknologi Penanganan Pasca Panen. Rineka Cipta.Jakarta.
Khopkar. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI Press. Jakarta.
Kusmayati, Agustini, N.W.R. 2007. Uji Aktivitas Senyawa Antibakteri dariMikroalga (Porphyridium cruentum). J Biod. 8(1) : 48 – 53.
Kusumaningrum. 2015. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Amilolitikdari Industri Pengolahan Pati Sagu. Jurnal Jom Faperta. 2(1):5-15.
Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Rajawali. Jakarta.
Luwihana, S. (2011). Perubahan Kimia dalam Proses Pembuatan Beras Oyekdari Singkong, Ubijalar dan Kimpul. Seminar Nasional PATPI, 16-17September 2011, Manado.
Marcon, MJA, Vieira MA, Santo K, De Simas KN, Amboni RDMC, and AmanteER. 2006. The effect of fermentation oncassava starch microstructure.Journal of Food Process Engineering 29: 362–372.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., dan Parker. J. 2000. Brock Biology ofMicroorganisms, 9 Edition. Prentice-Hall Inc. New Jersey.
Murphy, P. 2000. Handbook Of Hydrocolloids. Woodhead Publishing Ltd andCrc. Press Llc, New York.
Muttakaroh. 1998. Lactic Acid Bacteria in fermented food of Yogyakarta.Scription Faculty of Agricultural Technology. Gadjah Mada University,Yogyakarta.
Nasution, F. 2012. Identifikasi dan karakterisasi Bakteri Asam Laktat padakotoran ayam boiler sebagai agensi probiotik. Skripsi. UNM. Medan.
70
Ngatirah. 2000. Seleksi Bakteri Asam Laktat sebagai Agensia Probiotik YangBer-potensi Menurunkan Kolesterol. Tesis S-2. Pascasarjana. UGM,Yogyakarta.
Petrov K, Urshev Z, and Petrova P. 2008. L(+)-lactic acid production from starchby a novel amylolytic Lactococcus lactis subsp. lactis B84. FoodMicrobiology 25: 550– 557.
Pratiwi, S. 2007. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta.
Pelczar, M. dan Chan, E. 1988, Dasar-dasar Mikrobiologi, UI-Press, Jakarta.
Poedjiadi, A., dan Suprayanti, T. 2006. Dasar Dasar Biokimia . UI-Press. Jakarta.
Pujiyanti, S. 2007. Menjelajah Dunia Biologi. Platinum. Jakarta.
Putri, W.D.R., Marseno D.W., dan Cahyanto, M N., 2012. Isolasi danKarakterisasi Bakteri Asam Laktat Amilolitik selama FermentasiGrowol, Makanan Tradisional Indonesia. Jurnal Teknologi Pertanian.1(13):52-60.
Rahayu, E.S., T.F Djafar, D Wibowo, and S Sudarmadji.1995. LaporanPenelitian: Isolasi Bakteri Asam Laktat dan Karakterisasi Agensia yangberpotensi sebagai Biosafety makanan Indonesia. PAU Pangan dan GiziUGM. Yogyakarta.
Racmawati, D. 2008. Mikroba Endofit Solusi Bahan Baku Obat yang Murah danRamah Lingkungan. Djambatan. Jakarta
Ray, B. and M. Daeschel. 1992. Food Biopreservatives of MicrobialOrigin. CRC Press. Boca Raton.
Reddy, G, Altaf MD, Naveena BJ, Venkateshwar M, and Kumar EV. 2008.Amylolytic bacterial lactic acid fermentation, a review. BiotechnologyAdvances 26: 22–34.
Rolfe, R. D. 2000. The Role of Probiotic Cultures In The Control OfGastrointestinal Health. J. of Nutr 2000; 130: S396-4024.
Rodas, B. Z. de, Gilliland, S. E., and Maxwell, C. V. 1996. HypocholesterolemicAction of L. acidophilus ATCC 43121 and Calcium in Swine withHypercholesterolemia Induced by Diet. J. Dairy Sci 79:2121-2128.
Roos, N. M. de, and Katan, M. B. 2000. Effect of Probiotic Bacteria onDiarrhea, Lipid Metabolism, and Carcinogenesis: A Review of PapersPublished between 1988 and 1998. Am J Clin Nutr. 71:405-411.
71
Rustan, Idha, R. 2013. Studi Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dariFermentasi cabai Rawit (capsicum fructencens L). Skripsi FakultasPertanian Universitas Hasanudin. Makasar
Salminen, S., Wright, AV., Ouwehand, A. 2004. Lactic Acid Bacteria. MarckelDekker. New York.
Seran, E. 2012. Pengertian Dasar Spektrofotometer Vis, UV, UV-Vis.Https://wanibesak.wordpress.com/2011/07/04/pengertian-dasar-spektrofotometer-vis-uv-uv-vis/. Diakses pada tanggal 23 Februari 2017pukul 10.44 WIB.
Sukarminah, E., D.M. Sumanti dan I. Hanidah. 2010. Mikrobiologi PanganJurusan Teknologi Industri Pangan. Fakultas Teknologi IndustriPertanian. Universitas Padjajaran. Jatinagor.
Sulistyo. 1971. Farmakologi dan Terapi. EKG. Yogyakarta.
Supartono, Wijayati, N. Herlina L. dan Ratnaningsih, E. 2008. Produksi danKarakterisasi Antibiotika dari Bacillus subtilis BAC4 Galur Lokal Baru.Laporan Penelitian Hibah Bersaing. DP2M Dirjen Dikti Depdiknas RI.
Sorono, I. S. 2004. Probiotik, Susu Fermentasi dan Kesehatan. PT.Tri CiptaKarya. Jakarta.
Syafriani, Devi. 2013. Penapisan Bakteri Termo-amilolitik Dari Sumber AirPanas Sungai Medang Kerinci Jambi. Jurnal Biologi Universitas Andalas.Vol:2(2). Sumbar.
Syahrurachman, A. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. BinaRupa Aksara. Jakarta.
Teysset, C.M., F. de la Torre, and J.R. Garel. 2000. Increased production ofhydrogen peroxide by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus uponaeration: involvement of on NADH oxidase in oxidative stress.Journal of Applied Environmental Microbiology 66 (1): 262-267.
Winarno, F.G, Wida Winaryo A., dan Weni Widjajanto. 2003. Flora Ususdan Yoghurt. Cetakan satu. M-BRIO-Press. Bogor.
Wibowo, M.S. 2012. Pertumbuhan dan Kontrol Bakteri. Jurnal PertumbuhanBkteri Widyastuti, Yantyati dan Sofarianawati Eva. 1999. KarakterisasiBakteri Asam Laktat Entercocus sp. Yang diisolasi dari SaluranPencernaan Ternak.jurnal mikrobiologi Indonesia 4(2): 50-53.
Wirahadikusumah, M. 1989. Biokimia protein, enzim, dan asam nukleat. InstitutTeknologi Bandung. Bandung.