ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER …digilib.unila.ac.id/58576/3/3. SKRIPSI FULL...

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDERDARI KULIT BATANG TUMBUHAN TURI MERAH

(Sesbania grandiflora L. Pers.) SERTA UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

(Skripsi)

Oleh

Hidayatul Mufidah

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2019

ABSTRACT

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF SECONDARY METABOLITECOMPOUNDS FROM THE STEM BARK OF RED TURI (Sesbania

grandiflora L. Pers.) AND ANTIOXIDANT ACTIVITY ASSAY

By

Hidayatul Mufidah

Red turi (S. grandiflora) is one species of the Fabaceae’s family. This studies aimare to isolate and identify chemical compound from ethyl acetate extract of redturi (S. grandiflora) stem bark which is from Purwodadi, Central Lampung andantioxidant activity assay. Purification of obtained were followed by successiveprocess consist of vacuum liquid chromatography and column chromatographywhich was guided by thin layer chromatography and melting point assay.Identification of purified were determined based on 1H-NMR spectroscopicanalysis and compared to the references. The studies have showed a steroid groupcompound that had been successfully isolated, that is yellowish white crystal solid(m.p. 151-154oC). Based on the analysis result, it’s known that the compoundsare the mixture of β-stigmasterol and β-sitosterol as much 3.7 mg. Theantioxidant activity assay of the compounds mixture of β-stigmasterol and β-sitosterol on DPPH had a strong antioxidant activity level with IC50 values of16.13 µg/mL.

Keyword : S. grandiflora, β-stigmasterol and β-sitosterol, antioxidant, DPPH.

ABSTRAK

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDERDARI KULIT BATANG TUMBUHAN TURI MERAH (Sesbania grandiflora

L. Pers.) SERTA UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

Oleh

Hidayatul Mufidah

Turi merah (S. grandiflora) merupakan salah satu spesies dari famili Fabaceae.Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa kimiadari ekstrak etil asetat kulit batang turi merah (S. grandiflora) yang berasal daridesa Purwodadi, Lampung Tengah serta uji aktivitas antioksidan. Pemurniansenyawa menggunakan metode kromatografi cair vakum dan kromatografi kolomyang dipandu dengan kromatografi lapis tipis dan pengukuran titik leleh.Identifikasi senyawa ditentukan berdasarkan analisis spektroskopi 1H-NMR sertadibandingkan dengan referensi. Hasil penelitian menunjukkan terdapat senyawagolongan steroid yang berhasil diisolasi yaitu padatan kristal berwarna putihkekuningan dengan titik leleh 151-154oC. Berdasarkan hasil analisis data,senyawa yang diperoleh merupakan campuran antara β-stigmasterol dan β-sitosterol sebanyak 3,7 mg. Uji aktivitas antioksidan senyawa campuran β-stigmasterol dan β-sitosterol terhadap DPPH memiliki tingkat aktivitasantioksidan kategori kuat dengan nilai IC50 16,13 μg/mL.

Kata kunci : S. grandiflora, β-stigmasterol dan β-sitosterol, antioksidan, DPPH.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER DARI KULITBATANG TUMBUHAN TURI MERAH

(Sesbania grandiflora L. Pers.) SERTA UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

OlehHidayatul Mufidah

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelarSARJANA SAINS

padaJurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG2019

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Sukanegara, Lampung Tengah pada

tanggal 15 November 1996. Penulis merupakan anak ketiga

dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Asief Widodo dan

Ibu Rahmawati. Penulis mengawali pendidikan formal di

Taman Kanak-Kanak (TK) Darussalam Sukanegara yang

diselesaikan pada tahun 2002. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan Sekolah

Dasar (SD) di SD Negeri 1 Sukanegara yang diselesaikan pada tahun 2008.

Sekolah Menengah Pertama (SMP) di SMP Ma’arif 10 Bangurejo yang

diselesaikan pada tahun 2011, dan Sekolah Menengah Atas (SMA) di SMA

Negeri 1 Bangunrejo yang diselesaikan pada tahun 2014. Penulis diterima sebagai

mahasiswa Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Lampung pada tahun 2014 melalui jalur Seleksi Bersama Masuk

Perguruan Tinggi Negeri (SBMPTN).

Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah aktif dalam organisasi kemahasiswaan

yaitu sebagai Kader Muda Himaki (2014-2015), dan anggota bidang

Kesekretariatan Himaki (2015-2016). Penulis juga pernah menjadi Sekretaris

Umum dalam organisasi Ikatan Mahasiswa Alumni SMA Negeri 1 Bangunrejo

(2016-2017).

Pada bulan Agustus – September 2017 penulis pernah mengikuti Kuliah Kerja

Nyata (KKN) BNP2TKI di desa Cintamulya, Kecamatan Candipuro, Kabupaten

Lampung Selatan.

MOTTO

“...And Allah is the best of planners”.

(QS. Al-Anfaal: Verse 30)

The Prophet (Peace Be Upon Him) said, “Make things easy and do not makethem difficult, cheer the people up by conveying glad tidings to them and do

not repulse (them)”.

(Muslim, Book 1, Hadith 637)

Tak perlu terlalu keras berusaha jadi berbeda. Jadi dirimu, yang palingjarang dimiliki oranglain.

(Marchella FP)

Setiap manusia diciptakanNya dengan porsi yang berbeda. Jangan pernahragu untuk terus menggali potensi dalam diri. Sebab porsimu bisa saja lebih

banyak manfaatnya. Tapi jangan mencoba membandingkannya denganmilik yang lain. Karena takkan pernah sama.

(Hidayatul Mufidah)

PERSEMBAHAN

Alhamdulillahirabbil’alamiin. Puji syukur kepada Allah SWT atas limpahanberkah dan rahmatNya sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik.

Dengan kerendahan hati dan mengharap ridho Allah SWT, kupersembahkanseluruh karya ini teruntuk:

Kedua orangtuaku, Ayah Asief Widodo dan Bunda Rahmawati tercinta yangmenjadi sumber do’a terbaik bagi ananda sehingga ananda bisa menyelesaikan

skripsi ini dengan baik. Segala dukungan, semangat dan segala energi positif yangselalu berhasil menguatkan ananda.

Saudara-saudara kandungku tercinta, Mba Eka Wulandari, Mba Nofrita Maulidiadan Adik Syawlifa Anzumi yang selalu mendo’akan, menyayangi, dan menjadi

energi positif bagi ananda.

Ibu Noviany, S.Si., M.Si., Ph.D. yang telah banyak memberikan ilmu, bimbingan,motivasi, dan do’a selama penyelesaian penelitian dan penulisan skripsi.

Sahabatku dan teman-teman yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telahbanyak memberikan do’a, dukungan dan semangat bagi penulis.

Serta

Almamater tercinta, Universitas Lampung.

SANWACANA

Assalamu’alaikum wa rahmatullahi wa barakatuh.

Alhamdulillahirabbil’alamin, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah

SWT atas rahmat dan hidayahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi

yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder dari

Kulit Batang Tumbuhan Turi Merah (Sesbania grandiflora L. Pers.) serta Uji

Aktivitas Antioksidan” yang merupakan salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Sarjana Sains pada Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

Penulis menyadari bahwa penyelesaian skripsi ini tidak lepas dari bimbingan dan

bantuan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan

terimakasih kepada:

1. Kedua orangtua yang menjadi panutan dalam hidup, Ayah Asief Widodo dan

Bunda Rahmawati. Terimakasih atas segala pengorbanan, kasih sayang, serta

semangat yang selalu diberikan kepada penulis. Segala do’a baik yang selama

ini mengantarkan penulis menggapai satu per satu impian. You’re my best

support system, jazakumullahu khayr.

2. Ibu Noviany, S.Si., M.Si., Ph.D. selaku pembimbing pertama yang telah

banyak memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan, gagasan, bantuan,

dukungan, semangat, kritik dan saran kepada penulis dalam proses

perencanaan dan pelaksanaan penelitian serta dalam penulisan skripsi ini.

3. Ibu Prof. Dr. Tati Suhartati, M.S. selaku pembimbing kedua yang telah

memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan, kritik dan saran kepada penulis

sehingga penelitian dan skripsi ini terselesaikan.

4. Bapak Prof. Dr. Sutopo Hadi, S.Si., M.Sc. selaku pembahas yang telah

memberikan semangat, kritik dan saran kepada penulis.

5. Bapak Andi Setiawan, M.Sc., Ph.D. selaku pembimbing akademik atas

kesediaannya untuk memberikan bimbingan, bantuan, serta nasehat kepada

penulis.

6. Bapak Dr. Suripto Dwi Yuwono, M.T., selaku ketua Jurusan Kimia, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

7. Bapak Drs. Suratman, M.Sc., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

8. Seluruh dosen FMIPA Universitas Lampung yang dengan senang hati

memberikan ilmu pengetahuan yang sangat berguna kepada penulis selama

kuliah.

9. Kakak-kakakku tersayang, Eka Wulandari dan Nofrita Maulidia serta adikku

Syawlifa Anzumi, terimakasih atas doa dan semangat yang selalu diberikan

kepada penulis. Keponakanku: Mba Nazwa, Kakak Fayya, Mas Altair, Kakak

Ibra, Mba Rara, Adik Kahfi. Terimakasih atas segala tingkah lucu yang selalu

berhasil menghibur penulis.

10. Om Rahmad Hardiyanto dan bulek Titin Zaenuddin yang telah banyak

memberikan dukungan, doa, serta membantu penulis dengan sangat tulus.

11. Partner NRG: Ela, Dicky, Risa, Rizky, Wahyu, Tosa, Isnaini, Santi, Eva, dan

Hanif. Terimakasih atas kerjasama dan bantuannya selama proses penelitian.

12. Teman-teman Kimia 2014, terimakasih atas kebersamaan, dukungan serta

bantuannya selama masa perkuliahan.

13. Partner di dalam dan di luar Laboratorium, Nur Laelatul K. We did it so well,

coy! And see you on TOP!

14. Avengers Team: Desi Sulistyawati dan Febriana Citra. Terimakasih telah

membantu penulis di balik layar drama skripsi.

15. Laboran Lab. Kimia Organik, Mba Wit. Terimakasih atas dukungan dan

bantuannya selama masa penelitian.

16. Rekan-rekan penelitian di Laboratorium Kimia Organik, terimakasih atas

kebersamaan, dukungan serta bantuannya selama masa penelitian.

17. Almamater tercinta Universitas Lampung.

18. Semua pihak yang tidak dapat diucapkan satu per satu yang telah membantu

penulis selama kuliah, penelitian, hingga penulisan skripsi ini.

Semoga Allah SWT membalas segala kebaikan yang telah diberikan kepada

penulis. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan, akan

tetapi sedikit harapan semoga skripsi sederhana ini dapat berguna dan bermanfaat

bagi penulis secara pribadi maupun pembaca. Aamiin.

Bandar Lampung, Agustus 2019Penulis

Hidayatul Mufidah

i

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL .................................................................................................... iv

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ v

I. PENDAHULUAN ................................................................................................. 1

A. Latar Belakang .................................................................................................. 1

B. Tujuan Penelitian............................................................................................... 4

C. Manfaat Penelitian............................................................................................. 4

II. TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................................... 5

A. Fabaceae........................ .................................................................................... 5

B. Sesbania grandiflora.................... ..................................................................... 6

C. Senyawa Kimia dan Efek Farmakologis dari S. grandiflora............................. 8

D. Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder pada Famili Fabaceae.............. ...... 11

E. Steroid................................................................................................................ 16

F. Ekstraksi............................................................................................................. 17

G. Kromatografi........... .......................................................................................... 19

1. Kromatografi Cair Vakum (KCV) ................................................................. 192. Kromatografi Kolom (KK)........... ................................................................. 203. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)........... ........................................................ 20

H. Identifikasi Spektroskopi........... ....................................................................... 21

1. Spektroskopi UV-Vis........... ......................................................................... 212. Spektroskopi Inframerah........... .................................................................... 223. Spektroskopi Massa........... ........................................................................... 23

ii

4. Spektroskopi NMR ........... ........................................................................... 23

I. Antioksidan........... ............................................................................................... 25

1. Antioksidan Enzimatis dan Antioksidan Non Enzimatis……….. ................ 252. Antioksidan Primer, Sekunder, dan Tersier……..............................… ........ 26

2.1 Antioksidan Primer….. ........................................................................... 262.2 Antioksidan Sekunder....................................................……… ............. 262.3 Antioksidan Tersier...................................................……… .................. 26

3. Antioksidan Sintetik dan Antioksidan Alami..............................……… ..... 273.1 Antioksidan Sintetik..........................................................……….......... 273.2 Antioksidan Alami....................................................……… .................. 27

J. Mekanisme Kerja Antioksidan........... ................................................................ 27

K. Metode Pengujian Antioksidan........... ............................................................... 29

III. METODE PENELITIAN ................................................................................. 33

A. Waktu dan Tempat Penelitian.............. .......................................................... 33

B. Alat dan Bahan........... .................................................................................... 33

1. Alat-alat yang digunakan.......................... ................................................. 332. Bahan-bahan yang digunakan.................. .................................................. 34

C. Prosedur Penelitian....................... .................................................................. 34

1. Persiapan Sampel.................... ................................................................... 342. Ekstraksi dengan Berbagai Pelarut............ ................................................ 353. Kromatografi Cair Vakum (KCV)....................... ...................................... 354. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)....................... ........................................ 365. Kromatografi Kolom (KK)....................... ................................................. 366. Analisis Kemurnian.................................................................................... 377. Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti (RMI)....................... .................... 388. Uji Antioksidan dengan Metode Transfer Elektron .................................. 38

a. Pembuatan Larutan DPPH....................... .............................................. 38b. Pembuatan Larutan Uji....................... ................................................... 39c. Pembuatan Larutan Blanko.................................................................... 39d. Pembuatan Larutan Kontrol Positif dan Negatif................... ................ 39e. Pengujian Antioksidan....................... .................................................... 39

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN.......................................................................... 41

A. Isolasi Senyawa.............. ................................................................................ 41

B. Penentuan Titik Leleh........... ......................................................................... 57

C. Identifikasi Senyawa dengan Metode 1H-NMR........... .................................. 58

D. Uji Aktivitas Antioksidan............................................................................... 62

iii

V. SIMPULAN DAN SARAN ................................................................................. 68

A. Simpulan.............. .......................................................................................... 68

B. Saran........... .................................................................................................... 69

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................... 70

LAMPIRAN .............................................................................................................. 76

1. Diagram Alir Penelitian.................................................................................. 76

2. Skema Tahapan Isolasi ................................................................................... 77

3. Pembuatan Larutan yang diperlukan pada Uji Antioksidan........................... 82

4. Perhitungan Nilai Persen Inhibisi ................................................................... 84

5. Perhitungan Nilai IC50 .................................................................................... 90

6. Perhitungan Tetapan Kopling 1H-NMR ......................................................... 94

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Beberapa Kromofor dan Absorbansi Maksimumnya pada Spektrum UV-Vis................................................................................................................. 22

2. Letak Pergeseran Kimia dalam Spektra 1H-NMR ....................................... 24

3. Letak Pergeseran Kimia dalam Spektra 13C NMR....................................... 24

4. Geseran Kimia Proton β-stigmasterol, β-sitosterol dan Senyawa N-21....... 60

5. Absorbansi senyawa N-21a pada panjang gelombang 517 nm........................ 63

6. Absorbansi ekstrak metanol pada panjang gelombang 517 nm.. ..................... 63

7. Absorbansi ekstrak etil asetat pada panjang gelombang 517 nm ..................... 64

8. Absorbansi ekstrak n-heksana pada panjang gelombang 517 nm .................... 64

9. Absorbansi larutan standar pada panjang gelombang 517 nm ........................ 64

vi

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Tumbuhan Turi Merah ............................................................................... 8

2. Struktur Senyawa α-5-metil-5-pentakosanol atau grandiflorol.................. 9

3. Struktur Senyawa Galaktomanan ............................................................... 11

4. Senyawa sesbagrandiflorain A ................................................................. 12

5. Senyawa sesbagrandiflorain B ................................................................... 12

6. Struktur Senyawa Alkaloid Dienoid Tetrasiklik Baru ............................... 13

7. Senyawa 3-ß-hidroksi-28-p-hidroksifenoksiolean-12-en .......................... 13

8. Struktur Senyawa Steroid β-sitosterol........................................................ 14

9. Struktur Senyawa Anisaldehid-Asam Sulfat.............................................. 16

10. Struktur Dasar Senyawa Steroid ................................................................ 17

11. Reaksi antara DPPH dengan Antioksidan.................................................. 30

12. Mekanisme Reaksi Asam Askorbat dengan DPPH ................................... 32

13. KLT Ekstrak Kasar n-heksana, Etil Asetat, dan Metanol dengan EluenEtil Asetat/ n-heksana 2:8 .......................................................................... 43

14. Proses KCV Ekstrak Kasar Etil Asetat dengan Eluen Etil Asetat/ n-heksana(0-100%)........................................................................................ 44

15. KLT Hasil KCV Ekstrak Etil Asetat di Bawah Lampu UV 254 nm ......... 44

vi

16. Kromatogram Fraksi Utama Hasil KCV Ekstrak Etil Asetat yang dielusidengan Etil Asetat/ n-heksana (3:7) ........................................................... 45

17. KLT Fraksi B Menggunakan Eluen Etil Asetat/ n-heksana (3:7) .............. 47

18. Kromatogram Hasil KK Fraksi BB Menggunakan Eluen Aseton/ n-heksana (5:95) ............................................................................................ 48

19. Kromatogram Perbandingan Fraksi BB7 dengan Senyawa Standar........... 48

20. Kromatogram Hasil KK Fraksi BC Menggunakan Eluen Aseton/ n-heksana (5:95) ........................................................................................... 49

21. KLT Kristal BC5......................................................................................... 50

22. KLT Subfraksi BC5 dengan Eluen Diklorometana/ n-heksana(1:9) ........................................................................................................... 50

23. Kromatogram Kristal BC5O-BC5V Menggunakan Eluen Diklorometana/n-heksana (1:1) ......................................................................................... 51

24. KLT Fraksi BC5RST dan BC5UV dengan Eluen Diklorometana/ n-heksana (3:7) ............................................................................................. 52

25. Kromatogram Hasil KK Fraksi BD Menggunakan Eluen Aseton/ n-heksana (1:9) ............................................................................................. 53

26. Kromatogram Fraksi Utama Hasil KK Fraksi BD ...................................... 54

27. Kromatogram Hasil KK Fraksi BDF, BDG, BDH, BDI, dan BDB ............... 55

28. Kromatogram Kristal BDB10 dan BDB11 .................................................. 56

29. Wujud Visual Kristal N-21b ...................................................................... 57

30. Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi ................................................ 58

31. Struktur Senyawa N-21 .............................................................................. 62

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Indonesia merupakan negara yang memiliki keanekaragaman hayati yang sangat

tinggi. Keanekaragaman hayati yang ada di bumi ini tidak hanya digunakan

sebagai bahan pangan ataupun untuk dinikmati keindahannya saja, tetapi juga

dapat bermanfaat sebagai bahan untuk mengobati berbagai jenis penyakit.

Tanaman obat sudah sejak dulu digunakan oleh masyarakat Indonesia sebagai

salah satu terapi alternatif dalam menangani masalah penyakit. Walaupun industri

obat modern semakin meningkat bukan berarti penggunaan obat tradisional

kemudian ditinggalkan. Pada saat ini, dorongan kembali ke alam semakin

menguasai masyarakat. Pengobatan secara sintesis dirasakan terlalu mahal

dengan efek samping yang serius.

Berbagai spesies dari berbagai famili tumbuhan banyak ditemukan di seluruh

wilayah Indonesia dan diketahui memiliki manfaat yang baik sebagai obat

tradisional, salah satunya tumbuhan dari famili Fabaceae. Famili Fabaceae

merupakan salah satu famili tumbuhan terbesar ketiga (setelah Orchidaceae dan

Asteraceae) yang terdiri atas 730 genus dan 19.400 spesies (Danarto, 2005).

2

Tumbuhan dari famili Fabaceae dikenal memiliki potensi yang sangat baik

sebagai obat alternatif. Bagian-bagian yang banyak dimanfaatkan oleh

masyarakat diantaranya batang, akar, bunga, dan daun digunakan untuk

mengobati berbagai penyakit. Pemanfaatan tumbuhan dari famili Fabaceae ini

tidak terlepas dari senyawa kimia yang terkandung di dalamnya. Kelompok

senyawa bahan alam yang telah diisolasi dari famili Fabaceae cukup beragam,

dilihat dari golongan senyawa yang telah diisolasi terdiri dari senyawa metabolit

sekunder yaitu alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan steroid.

Salah satu spesies dari famili tumbuhan Fabaceae adalah turi (Sesbania

grandiflora). Tumbuhan ini dapat ditemukan hampir diseluruh wilayah

Indonesia. Senyawa kimia yang telah berhasil diisolasi dari tumbuhan S.

grandiflora diantaranya yaitu tanin dan saponin dari bagian daun (Makalalag,

2010). Pada bagian bunga telah berhasil diisolasi senyawa β-stigmasterol dan β-

sitosterol (Cayme and Ragasa, 2004). Senyawa lain yang telah dilaporkan yaitu

galaktomanan dari biji kacang tumbuhan S. grandiflora (Srivastava et al., 1968).

Noviany et al (2018) menemukan dua senyawa arilbenzofuran baru, yaitu

sesbagrandiflorain A dan B dari ekstrak etil asetat kulit batang tumbuhan S.

grandiflora.

Turi adalah salah satu tumbuhan famili Fabaceae yang hampir seluruh bagiannya

bermanfaat bagi manusia khususnya dalam pengobatan. Efek farmakologis kulit

batang turi adalah mengurangi rasa sakit (analgetik), penurun panas, meredakan

disentri dan mengobati cacar air. Bagian akar secara umum juga digunakan

sebagai anti inflamasi dan penurun demam (Wagh et al., 2009). Bunga turi

3

digunakan untuk pengobatan tradisional mengatasi flu, demam, sakit perut, diare

dan kulit kusam (Powthong et al., 2013). Ramesh et al., (2006) menyatakan

bahwa suplemen daun turi menunjukkan pencegahan oksidasi yang dapat merusak

paru-paru, hati, dan ginjal. Pengujian pada mencit menunjukkan bahwa daun

tumbuhan turi memiliki potensi sebagai antioksidan. Adanya efek antioksidan ini

disebabkan karena terkandungnya senyawa flavonoid.

Antioksidan adalah senyawa yang dapat menangkal atau meredam dampak negatif

oksidan. Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada

senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut dapat

dihambat (Winarti, 2010). Senyawa antioksidan dapat berperan untuk

mengurangi kerusakan oksidatif yang berkaitan dengan penyakit penuaan,

kardiovaskular, kanker, inflamasi, penyakit kulit, dan malaria yang mendorong

beberapa pencarian senyawa obat pada tumbuhan (Ouattara et al., 2011).

Senyawa antioksidan yang bersumber dari tumbuhan diantaranya berupa senyawa

fenolik dari golongan flavonoid, kumarin, tokoferol, asam sinamat dan asam-asam

organik polifungsional (Isnindar dkk., 2011). Flavonoid memiliki kemampuan

sebagai antioksidan karena dapat mereduksi radikal bebas (Zuhra dkk., 2008).

Berdasarkan pemaparan informasi di atas, diketahui bahwa hampir seluruh bagian

jaringan tumbuhan turi memiliki manfaat yang baik dalam bidang pengobatan dan

telah diketahui senyawa-senyawa yang terkandung dalam beberapa jaringan

tumbuhan turi. Namun untuk bagian jaringan kulit batang tumbuhan turi merah

belum dikaji lebih lanjut. Oleh karena masih banyak potensi tumbuhan turi selain

sebagai antibakteri maka dalam penelitian ini akan dilakukan isolasi dan

4

identifikasi senyawa metabolit sekunder pada bagian kulit batang tumbuhan turi

merah (S. grandiflora) dan dilanjutkan dengan pengujian senyawa sebagai

antioksidan dengan Electron Transfer Methods.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dilakukan penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa metabolit sekunder dari kulit

batang tumbuhan turi merah (S. grandiflora).

2. Menguji aktivitas antioksidan dari senyawa hasil isolasi dengan

menggunakan Electron Transfer Methods.

C. Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang

kandungan senyawa metabolit sekunder dari kulit batang turi merah (S.

grandiflora) dan dapat digunakan sebagai data tambahan sumber alami tumbuhan

yang berpotensi sebagai antioksidan.

5

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Fabaceae

Fabaceae adalah famili tumbuhan ketiga terbesar (setelah Orchidaceae dan

Asteraceae) yang termasuk dalam devisi Angiospermae atau tumbuhan berbunga.

Famili ini terdiri atas 730 genus dan 19.400 spesies dengan genus terbesarnya

adalah Astragalus (lebih dari 2000 spesies), Acacia (lebih dari 900 spesies),

Indigofera (lebih dari 700 spesies), Crotalaria (600 spesies), Mimosa (500

spesies). Famili ini merupakan komponen mayor dari vegetasi dunia yang sering

ditemukan pada lahan marginal karena kemampuannya memfiksasi nitrogen dari

atmosfer melalui inti akar. Famili Fabaceae dikelompokkan ke dalam 3 subfamili

yang didasarkan pada morfologi bunga khususnya pada bentuk kelopaknya.

Subfamili dari famili Fabaceae tersebut yaitu Mimosoidae, Caesalpiniodeae, dan

Papilionoideae. Ciri khas yang dapat diamati dari tumbuhan famili Fabaceae

yaitu adanya buah berbentuk polong serta karakteristik pada bunganya (Lewis et

al., 2005).

Beberapa penelitian telah dilakukan dan menyatakan bahwa famili Fabaceae

memiliki kandungan senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, terpenoid,

6

tanin, dan senyawa fenolik. Metabolit sekunder adalah molekul organik yang

tidak terlibat dalam pertumbuhan normal dan perkembangan organisme.

Selain mengandung senyawa metabolit sekunder, famili Fabaceae memiliki

kandungan metabolit primer seperti lectin, kitin, dan inhibitor -amilase.

Metabolit primer memiliki peran utama dalam pertahanan hidup spesies,

memainkan fungsi aktif dalam fotosintesis dan respirasi, tidak adanya metabolit

sekunder tidak mengakibatkan kematian, namun menimbulkan kerugian jangka

panjang dari kelangsungan hidup organisme, yang sering memainkan peran

penting dalam pertahanan tanaman (Agostini-Costa et al., 2012).

B. S. grandiflora

Turi dengan nama latin S. grandiflora (L.) Pers. termasuk ke dalam famili

tumbuhan Fabaceae (Cronquist, 1981). Terdapat beberapa nama daerah turi yaitu,

turi atau toroy (Jawa), turi (Sumatera), tuli, turi, turing (Sulawesi), tuwi palawu,

ghunga (Nusa Tenggara) (Agromedia, 2008).

Ciri-ciri umum dari tumbuhan ini di antaranya yaitu pohon berumur pendek,

tinggi 5-12 meter dan ranting seringkali menggantung. Kulit luar berwarna

kelabu hingga kecoklatan tidak rata dengan alur membujur dan melintang tidak

beraturan dan lapisan gabus mudah terkelupas (Agromedia, 2008). Batang dari

turi (Gambar 1a) berbentuk pohon dengan percabangan jarang, cabang mendatar,

batang utama tegak, dan tajuk cenderung meninggi. Tanaman ini dapat

ditemukan di bawah 1.200 meter di atas permukaan laut (Yuniarti, 2008).

7

Bunga turi (Gambar 1b) berbentuk seperti kupu-kupu, dan bunga turi dibagi

menjadi dua jenis warna yang berbeda, yaitu bunga merah jingga dan putih.

Menurut Yuniarti (2008) bunga turi besar dalam tandan yang keluar dari ketiak

daun, letaknya menggantung dengan 2-4 bunga yang bertangkai, kuncupnya

berbentuk sabit, panjangnya 7-9 cm. Apabila mekar, bunganya berbentuk kupu-

kupu. Daun dari turi (Gambar 1c) berdaun majemuk yang letaknya tersebar,

dengan daun penumpu yang panjangnya 0,5-1 cm. Panjang daun 20-30 cm,

menyirip genap, dengan 20-40 pasang anak daun yang bertangkai pendek.

Helaian anak daun berbentuk jorong memanjang, tepi rata, panjang 3-4 cm, lebar

0,8-1,5 cm. Buah berbentuk polong (Gambar 1d) yang menggantung vertikal,

berbentuk pita dengan sekat antara, panjang 20-25 cm, lebar 7-8 mm. Biji 15-50

terletak melintang di dalam polong, berbentuk agak mengginjal dan berwarna

coklat gelap.

Klasifikasi tanaman turi merah menurut sistem Cronquist (1981):

Kerajaan : Plantae

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Bangsa : Fabales

Suku : Fabaceae

Marga : Sesbania

Jenis : S. grandiflora (L.) Pers.

8

(a) (b)

(c) (d)

Gambar 1. Tumbuhan turi merah; (a) batang, (b) bunga, (c) daun, (d) biji

C. Senyawa Kimia dan Efek Farmakologis dari S. grandiflora

Senyawa kimia yang terkandung pada setiap jaringan tumbuhan turi merah

berbeda-beda begitu pula dengan efek farmakologisnya.

Hasil isolasi pada bagian jaringan akar tumbuhan turi mengandung senyawa 5,7-

dihidroksi-6,2'-dimetoksiisoflavon-7-O-α-L-ramnopiranosida dan senyawa 3,7-

dihidroksi-8-metoksiflavon-7-O-β-D-galaktosida yang merupakan jenis lain dari

9

flavon glikosida. Akar turi memiliki efek farmakologis untuk meredakan nyeri

sehingga akar turi dapat digunakan untuk mengatasi pegal linu. Bagian akar

secara umum juga digunakan sebagai anti inflamasi dan penurun demam (Wagh et

al., 2009). Kulit akar turi mengandung zat yang dapat menyebabkan jaringan

biologis berkontraksi, mendinginkan, pahit, tonik, anthelmintik dan obat penurun

panas. Serbuk kulit akar dapat diterapkan untuk menyembuhkan kudis. Jus kulit

kayu bagus untuk dispepsia, diare, dan gastralgia (Bhoumik and Jaya, 2014). Akar

turi juga digunakan untuk pengobatan tradisional mengatasi flu, sakit perut dan

kulit kusam (Powthong et al., 2013).

Hasil isolasi pada bagian jaringan daun tumbuhan turi mengandung senyawa

alkohol sederhana α-5-metil-5-pentakosanol atau grandiflorol (Gambar 2). Daun

turi mengandung senyawa fitokimia tanin dan saponin (Makalalag, 2010). Efek

farmakologis daun turi adalah dapat mencairkan gumpalan darah, mempunyai efek

deuretik, mengatasi radang tenggorokan, menyembuhkan luka yang tidak terlalu

dalam. Selain itu daun turi juga mempunyai manfaat sebagai antioksidan,

mengatasi keputihan, memperbanyak produksi asi dan meredakan demam. Bidang

kedokteran di India telah menggunakan daun turi sebagai media penyembuhan

penyakit epilepsi (Kasture et al., 2002).

Gambar 2. Struktur senyawa α-5-metil-5-pentakosanol atau grandiflorol

10

Suplemen daun turi menunjukkan pencegahan oksidasi yang dapat merusak paru-

paru, hati, dan ginjal. Pengujian pada mencit menunjukkan bahwa daun

tumbuhan turi memiliki potensi sebagai antioksidan. Efek antioksidan dari turi

kemungkinan dikarenakan kandungan senyawa flavonoid yang mampu

menangkap radikal bebas melalui donor proton hidrogen dari gugus hidroksil

flavonoid (Ramesh et al., 2006).

Pada bagian jaringan bunga turi mengandung senyawa metabolit sekunder di

antaranya alkaloid, tanin, polifenol, flavonoid, kuinon, dan triterpenoid (Asmara,

2017). Bunga turi mengandung zat antimikrobial (Avalaskar et al., 2011). Bunga

turi digunakan untuk pengobatan tradisional mengatasi flu, demam, sakit perut,

diare dan kulit kusam (Powthong et al., 2013). Efek farmakologi bunga turi

adalah sebagai anti kanker, anti mikroba, analgesik dan anti piretik.

Hasil isolasi pada biji kacang tumbuhan turi menghasilkan senyawa galaktomanan

(Gambar 3) (Srivastava et al., 1968). Pada bagian jaringan biji turi mengandung

senyawa metabolit sekunder di antaranya alkaloid, flavonoid, steroid dan kuinon.

Biji turi kaya akan protein sehingga baik untuk kesehatan jantung, pencernaan dan

mencegah kanker usus besar. Asam lemak penyusun trigliserida biji turi yaitu

asam palmitat (14,25%), asam linoleat (39,13%), asam elaidat (31,09%), asam

stearat (13,97%), dan asam arakidat (1,55%) (Ismiyarto dan Wibawa, 2006).

11

Gambar 3. Struktur senyawa galaktomanan

Efek farmakologis pada bagian kulit batang turi dapat digunakan sebagai obat

kumur untuk sariawan karena mempunyai kandungan kimia saponin,

flavonoid, polifenol dan tanin yang diketahui dapat menghambat pertumbuhan

jamur penyebab sariawan dan berkhasiat sebagai obat (Hariana, 2006). Selain

itu dapat mengurangi rasa sakit (analgetik), penurun panas, disentri dan mengobati

cacar air. Di Filipina serbuk batang turi digunakan sebagai obat borok atau bisul

yang terdapat dalam mulut dan sistem pencernaan sedangkan di Kamboja

potongan batang turi digunakan sebagai media penyembuhan penyakit kudis

(Wagh et al., 2009). Sedangkan di daerah pulau Jawa serbuk batang turi

digunakan sebagai obat sariawan, polio, dan sakit perut.

D. Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder pada Famili Fabaceae

Tumbuhan famili Fabaceae mengandung senyawa metabolit sekunder yang

cukup banyak dan beragam, dari susunan molekul sederhana hingga molekul yang

paling rumit sekalipun ada pada famili ini. Secara garis besar senyawa metabolit

sekunder terdiri dari flavonoid, alkaloid, terpenoid, steroid, tanin dan saponin.

Baru-baru ini Noviany et al. (2018) juga telah berhasil mengisolasi dua senyawa

baru yaitu sesbagrandiflorain A (6-metoksi-2-(2’,3’-dihidroksi-5’-metoksifenil)-1-

12

benzofuran-3-karbaldehida) (Gambar 4) dan sesbagrandiflorain B (6-hidroksi-2-

(2’,3’-dihidroksi-5’-metoksifenil)-1-benzofuran-3-karbaldehida) (Gambar 5) yang

merupakan jenis senyawa 2-aril benzofuran. Kedua senyawa ini berhasil diisolasi

dari kulit batang tumbuhan turi pada fraksi etil asetat.

Gambar 4. Senyawa sesbagrandiflorain A

Gambar 5. Senyawa sesbagrandiflorain B

Wanjala and Majinda (2000) melakukan isolasi pada biji Erythrina latissima dan

diperoleh dua jenis struktur alkaloid glikodienoid baru yaitu 16β-D-glukoerisopin

(6.1) dan 15β-D-glukoerisopin (6.2). Hasil pengukuran NOE menetapkan bahwa

senyawa (6.1) dan (6.2) adalah isomer posisi. Struktur keduanya dijelaskan

berdasarkan data spektroskopi 1D NMR dan 2D NMR homonuklear dan

heteronuklear. Berikut adalah hasil isolasi dari dua alkaloid dienoid tetrasiklik

baru (6.1 dan 6.2) dari biji E. latissima.

13

(6.1) R1 = glc, R2 = H

(6.2) R1 = H, R2 = glc

Gambar 6. Struktur senyawa alkaloid dienoid tetrasiklik baru

Senyawa terpenoid telah berhasil diisolasi dari tumbuhan turi yaitu senyawa

golongan triterpenoid, 3-ß-hidroksi-28-p-hidroksifenoksiolean-12-en

(Gambar 7) (Das and Tripathi, 1999).

Gambar 7. Senyawa 3-ß-hidroksi-28-p-hidroksifenoksiolean-12-en

Aqli (2014) menemukan senyawa steroid β-sitosterol pada tumbuhan nam-nam

(Cynometra cauliflora L.) yang merupakan salah satu spesies dari famili

Fabaceae. Tumbuhan ini dapat digunakan sebagai obat tradisional. Dalam

penelitian ini ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut

etil asetat, pemisahan dilakukan dengan metode kromatografi (kromatografi cair

14

vakum, kromatografi kolom gravitasi dan kromatografi lapis tipis). Hasil

pemurnian diperoleh kristal putih sebanyak 55 mg. Senyawa hasil isolasi

diidentifikasi dengan spektroskopi 1H NMR, 13C NMR dan DEPT.

Gambar 8. Struktur senyawa steroid β-sitosterol

Senyawa tanin dari daun trembesi (Samanea saman (Jacq.) Merr) berhasil

diisolasi dan diidentifikasi oleh Sari dkk (2015) serta dilakukan uji aktivitas

antibakteri terhadap Escherichia coli (E.coli). Daun trembesi diketahui

bermanfaat sebagai obat diare. Ekstraksi dilakukan dengan maserasi dan partisi,

pemisahan dengan KLT preparatif, uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi

sumur agar, dan identifikasi dilakukan dengan spektrofotometer UV-vis dan

FTIR. Maserasi dengan etanol menghasilkan 36,80 gram ekstrak pekat etanol.

Proses partisi menghasilkan fraksi n-heksana, kloroform, aseton, dan air. Uji

fitokimia masing-masing fraksi menunjukkan bahwa fraksi air dan aseton

memberikan hasil positif mengandung senyawa tanin terhidrolisis, namun fraksi

aseton menunjukkan hasil dengan konsentrasi lebih banyak dibandingkan fraksi

air. Hasil uji aktivitas antibakteri E.coli terhadap fraksi aseton menunjukkan

aktivitas sedang. Pemisahan dengan eluen n-butanol: asam asetat: air (4:1:5)

15

(BAA) diperoleh enam isolat namun hanya dua isolat (isolat 2 dengan Rf 0.61,

dan isolat 3 dengan Rf 0.65) yang memberikan positif mengandung tanin. Hasil

uji kemurnian isolat 2 dan 3 menunjukkan relatif murni secara KLT. Isolat 2 dan

3 menunjukkan aktivitas antibakteri E. coli yang lebih lemah dibandingkan

dengan fraksi aseton.

Identifikasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis menunjukkan isolat 2 dan 3

memberikan dua puncak yang sama dengan serapan maksimum pada panjang

gelombang 346.50 nm dan 347.00 nm karena transisi elektron nπ * dan ππ *

yang menunjukkan adanya kromofor C=O dan C=C. Sementara spektrum

inframerah isolat 2 dan 3 menunjukkan puncak yang sesuai dengan gugus fungsi

karakteristik tanin yaitu –O-H, C-H alifatik, C=O ester, C = C aromatik, C-O-H,

dan C-O-C eter.

Puspariani (2007) telah melakukan isolasi dan identifikasi saponin pada

kecambah kedelai (Glycine max L.). Berdasarkan hasil penelitian, kecambah

kedelai mengandung saponin triterpenoid. Isolasi menggunakan KLT preparatif

menghasilkan isolat murni berwarna biru-ungu hasil reaksi dengan penampak

bercak anisaldehid-asam sulfat. Hasil spektroskopi UV menunjukkan puncak

tunggal isolat saponin kecambah kedelai dengan serapan maksimum pada panjang

gelombang 280,6 nm.

16

Gambar 9. Struktur senyawa anisaldehid-asam sulfat

E. Steroid

Senyawa steroid terdapat dalam setiap makhluk hidup. Steroid yang ditemukan

Dalam jaringan tumbuhan disebut fitosterol, sedangkan yang ditemukan dalam

jaringan hewan disebut kolesterol. Beberapa senyawa ini jika terdapat dalam

tumbuhan akan dapat berperan menjadi pelindung. Senyawa ini tidak hanya

bekerja menolak beberapa serangga tetapi juga menarik beberapa serangga lain

(Robinson, 1995).

Steroid merupakan salah satu kelompok senyawa lipid yang dapat dianggap

sebagai derivat dari senyawa perhidroksiklopentano fenantrena yang terdiri dari

tiga cincin sikloheksana dan sebuah cincin siklopentana yang terikat pada ujung

salah satu cincin sikloheksana tersebut seperti ditunjukkan pada Gambar 10

(Poedjiadi, 1994).

17

Gambar 10. Struktur dasar senyawa steroid

Berdasarkan sumbernya steroid dibedakan atas steroid sintetis dan alami. Steroid

sintetis yang umum digunakan adalah glukokortikosteroid, estrogen,

metilprednisolon, kortikosteroid, androgen, squalamina, dan hidrokortison.

Senyawa ini juga digunakan untuk pengobatan penyakit akibat kelebihan atau

kekurangan hormon, penyakit berbahaya serta penyakit lainnya seperti radang

sendi dan alergi (Bhawani et al., 2011). Sterol tumbuhan yang telah lama dikenal

adalah campesterol, stigmasterol dan β-sitosterol. Sterol ini menunjukkan efek

menurunkan kolesterol dan antikarsinogenik. Efek antiangiogenik diduga

melibatkan aksi senyawa tersebut sebagai antikanker (Choi et al., 2007).

Stigmasterol dimungkinkan untuk mencegah penyakit kanker tertentu, misalnya

kanker ovarium, prostat, payudara dan kanker usus besar karena mempunyai

potensi antioksidan, hipoglikemik, dan mampu menghambat tiroid (Panda et al.,

2009).

F. Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses pemisahan komponen-komponen terlarut dari

komponen yang tidak larut dari suatu campuran dengan pelarut yang sesuai

18

(Leniger and Beverloo, 1975). Proses ekstraksi dipengaruhi oleh lama

ekstraksi, suhu dan jenis pelarut yang digunakan. Semakin lama waktu yang

digunakan dan semakin tinggi suhu yang digunakan, semakin sempurna

proses ekstraksi. Semakin dekat tingkat kepolaran pelarut dengan komponen

yang akan diekstrak, semakin sempurna proses ekstraksi. Untuk menemukan

senyawa pengekstrak yang baik diperlukan bahan pengekstrak yang memiliki

kepolaran yang sama dengan zat yang diekstrak. Jika komponen yang

diekstrak belum diketahui tingkat kepolarannya, biasanya digunakan beberapa

pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda.

Sebelum memulai ekstraksi, dilakukan persiapan bahan baku yang

mencakup pengeringan bahan sampai kadar air tertentu dan penggilingan

bahan untuk mempermudah proses ekstraksi. Selain itu, tingkat kemudahan

ekstraksi bahan kering masih ditentukan oleh ukuran partikel bahan. Bahan yang

akan diekstrak sebaiknya berukuran seragam untuk mempermudah kontak antar

bahan dengan pelarut (Purseglove et al., 1981).

Metode ekstraksi yang dilakukan tergantung pada beberapa faktor antara

lain tujuan ekstraksi, skala ekstraksi, sifat komponen yang akan diekstrak, dan

sifat pelarut yang akan digunakan. Terdapat beberapa cara ekstraksi dengan

menggunakan pelarut yaitu dengan menggunakan cara dingin dan cara panas.

Ekstraksi dengan cara dingin terbagi menjadi 2 yaitu maserasi dan perkolasi.

Sedangkan ekstraksi dengan cara panas terbagi menjadi 5 yaitu refluks, sokletasi,

digesti, infus dan dekok (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2000).

19

Prinsip ekstraksi menggunakan pelarut adalah bahan yang akan diekstrak kontak

langsung dengan pelarut selama selang waktu tertentu dan komponen yang akan

diekstrak akan terlarut dalam pelarut.

G. Kromatografi

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan campuran didasarkan atas

perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut di antara dua

fase yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Bila fase

diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal istilah kromatografi penyerapan

(adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini

disebut kromatografi pembagian (partition chromatography) (Hostettman et al.,

1986).

1. Kromatografi Cair Vakum (KCV)

Kromatografi cair vakum merupakan salah satu kromatografi vakum khusus

yang biasanya menggunakan silika gel sebagai adsorben. Kelebihan KCV jika

dibandingkan dengan kromatografi kolom biasa terletak pada kecepatan proses

(efisiensi waktu) karena proses pengelusian dipercepat dengan memvakumkan

kolom selain itu KCV juga dapat memisahkan sampel dalam jumlah banyak.

Pemilihan jenis silika gel yang tepat merupakan faktor yang sangat penting untuk

mendapatkan hasil pemisahan yang baik. Ukuran partikel silika gel yang terlalu

kecil akan menyebabkan proses elusi berjalan sangat lambat. Urutan eluen yang

digunakan dalam kromatografi cair diawali mulai dari eluen yang mempunyai

20

tingkat kepolaran rendah kemudian kepolarannya ditingkatkan secara perlahan-

lahan (Hostettman et al., 1986).

2. Kromatografi Kolom (KK)

Metode yang dapat digunakan untuk pemisahan senyawa yang diperoleh dari

isolasi adalah menggunakan kromatografi kolom. Pada kromatografi kolom fasa

diam yang digunakan dapat berupa silika gel, selulosa atau poliamida sedangkan

fase geraknya dapat dimulai dari pelarut non polar kemudian ditingkatkan

kepolarannya secara bertahap, baik dengan pelarut tunggal ataupun kombinasi dua

pelarut yang berbeda kepolarannya dengan perbandingan tertentu sesuai tingkat

kepolaran yang dibutuhkan (Stahl, 1969). Pada metode kromatografi kolom,

pelarut akan mengalir ke bawah dan menyebabkan komponen campuran

terdistribusi di antara adsorben bubuk dan pelarut yang digunakan. Pemisahan

terjadi saat pelarut membawa komponen melalui ujung bawah kolom, beberapa

komponen akan keluar lebih dahulu dan ada beberapa komponen yang keluar

akhir. Laju elusi yang terjadi dipengaruhi juga oleh gaya gravitasi, oleh karena itu

kromatografi kolom biasa disebut juga kromatografi kolom gravitasi. Sebelum

menggunakan kromatografi kolom biasanya sebagian kecil sampel dipisahkan

menggunakan KLT terlebih dahulu untuk mengetahui pelarut yang cocok

digunakan (Hajnos et al., 2011).

3. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi lapis tipis adalah jenis kromatografi padat-cair, dengan fasa diam

21

biasanya berupa absorben polar dan fasa geraknya dapat berupa satu jenis pelarut

atau berupa campuran (Sastrohamidjojo, 2002). Sedangkan prinsip KLT yaitu

perpindahan analit pada fasa diam karena pengaruh fasa gerak, proses ini biasa

disebut elusi. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fasa diam dan semakin

sempit kisaran ukuran fasa diam maka semakin baik kinerja KLT dalam hal

efisien dan resolusinya (Gritter, 1991). Menurut Sastrohamidjojo (2002) untuk

menghitung secara kualitatif, KLT juga memiliki pengukuran secara kromatografi

yang dikenal sebagai nilai Rf. Nilai Rf merupakan nilai faktor retensi suatu

senyawa yang nilainya berupa angka desimal. Nilai Rf dapat dihitung dengan

cara:

Rf =

H. Identifikasi Spektroskopi

Salah satu teknik yang dapat digunakan dalam penentuan struktur dari suatu

senyawa organik adalah teknik spektroskopi. Teknik spektroskopi ini didasarkan

pada interaksi antara radiasi elektromagnetik (Fessenden and Fessenden, 1986).

Radiasi elektromagnetik tersebut dapat berupa radiasi sinar γ, sinar-X (X-ray),

ultra ungu-tampak (UV-Vis), infra merah (IR), gelombang mikro, dan gelombang

radio (Harvey, 2000).

1. Spektroskopi UV-Vis

Spektrofotometri UV-Vis merupakan salah satu teknik analisis spektroskopi yang

menggunakan sumber radiasi eleltromagnetik ultraviolet dekat (190 nm-380 nm)

22

dan sinar tampak (380 nm-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer.

Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada

molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai

untuk analisis kuantitatif daripada kualitatif (Mulja dan Suharman, 1995).

Spektrum UV-Vis umumnya hanya menampilkan beberapa pita absorbansi yang

melebar. Sebuah kromofor adalah kelompok molekul biasanya mengandung

ikatan π. Ketika dimasukkan ke dalam hidrokarbon jenuh, menghasilkan senyawa

dengan penyerapan antara 185 dan 1000 nm (Owen, 1996). Tabel 1 berisi

beberapa kromofor dan absorbansi panjang gelombang maksimum.

Tabel 1. Beberapa Kromofor dan Absorbansi Maksimumnya pada Spektrum UV-Vis (Owen, 1996).

Kromofor Formula Contoh λmaks

Karbonil (keton) RR’C=O Aseton 271Karbonil (aldehid) RHC=O Asetaldehid 293

Karboksil RCOOH Asam Asetat 204Amida RCONH2 Asetamida 208Etilena RCH=CHR Etilena 193

Asetilena RC=CR Asetilena 173Nitril RC=N Asetonitril < 160Nitro RNO2 Nitrometana 271

2. Spektroskopi Inframerah

Spektroskopi inframerah merupakan suatu analisis senyawa organik dan

anorganik yang berdasarkan pada interaksi antara gelombang elektromagnetik

inframerah (IR) dengan materi. Analisis secara spektroskopi inframerah

digunakan untuk menganalisis gugus fungsi yang terdapat pada zat yang diuji.

Setiap gugus fungsi akan memberikan puncak-puncak yang tetap, informasi inilah

23

yang digunakan untuk menganalisis secara kualitatif pada zat tersebut. Misalnya

gugus fungsi C=O akan memberikan puncak pada bilangan gelombang 1650 cm-1

sebagai asam karboksilat, 1700 cm-1 sebagai keton, dan 1800 cm-1 sebagai halida

asam (klorida asam) (Harvey, 2000).

3. Spektroskopi Massa

Analisis spektroskopi massa berfungsi untuk menghasilkan berkas sinar kation

dari zat, berkas kation menjadi bentuk spektrum massa (m/z), mendeteksi dan

mencatat nilai massa relatif (m/z) atau menentukan bobot molekul suatu senyawa.

Spektrum massa akan menghasilkan puncak-puncak yang tercatat dalam rekorder,

yang dipaparkan sebagai grafik batangan. Fragmen-fragmen disusun sedemikian

sehingga peak-peak ditata menurut kenaikan m/e dari kiri ke kanan dalam

spektrum. Intensitas peak sebanding dengan kelimpahan relatif fragmen-fragmen

yang bergantung pada stabilitas relatif senyawa (Larry, 1988).

4. Spektroskopi NMR

Spektroskopi NMR merupakan bentuk lain dari spektrometri serapan. Dalam

NMR senyawa menyerap energi pada daerah frekuensi radio dari spektrum

elektromagnetik di bawah pengaruh medan magnet yang kuat. Radiasi pada

daerah frekuensi radio digunakan untuk mengeksitasi atom, biasanya atom proton

atau karbon-13. Energi yang dipakai dalam pengukuran dengan metode ini berada

pada gelombang radio dengan daerah frekuensi 4-600 MHz, yang bergantung

pada jenis inti yang diukur (Silverstein et al., 2005). Tabel 2 menunjukkan letak

pergeseran kimia beberapa senyawa organik dalam spektra 1H NMR.

24

Tabel 2. Letak Pergeseran Kimia dalam Spektra 1H-NMR (Sudjadi, 1985).

Senyawa Proton 1H (δ) ppmC-CH3 (alkana) 0,5-2C≡C-H (alkuna) 2,5-3,5H3C-O- (eter) 3,5-3,8

H2C=C (alkena) 4,5-7,5Ar-OH (fenol) 4-8

R-OH (alkohol) 5-5,5Ar-H (aromatik) 6-9-CO-H (aldehid) 9,8-10,5

-CO-OH 11,5-12,5

Selain pergeseran kimia dalam spektra 1H-NMR terdapat pergeseran kimia

lainnya yaitu pada spektra 13C NMR. Melalui spektra ini maka dapat diketahui

jenis-jenis atom karbon yang terkandung dalam suatu senyawa. Letak pergeseran

kimia dalam spektra 13C NMR untuk beberapa senyawa organik dapat dilihat pada

Tabel 3.

Tabel 3. Letak Pergeseran Kimia dalam Spektra 13C NMR (Sudjadi, 1985).

Senyawa Karbon 13C (δ) ppmC=O (keton) 205-220

C=O (aldehid) 190-200C=O 170-185

C aromatik 125-150C=C (alkena) 115-140

RCH2OH 50-65RCH2Cl 40-45

RCH2NH2 37-45R3CH 25-35

CH3CO- 20-30R2CH2 16-25RCH3 10-15

25

I. Antioksidan

Senyawa antioksidan dapat didefinisikan secara kimia dan biologis. Secara kimia,

senyawa antioksidan adalah senyawa pemberi elektron (donor elektron),

sedangkan secara biologis pengertian antioksidan adalah senyawa yang dapat

menangkal atau meredam dampak negatif oksidan. Antioksidan bekerja dengan

cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan

sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut dapat di hambat (Winarti, 2010).

Ada dua macam antioksidan, antioksidan internal dan eksternal. Antioksidan

internal adalah antioksidan yang diproduksi oleh tubuh sendiri. Secara alami

tubuh mampu menghasilkan antioksidan sendiri, akan tetapi kemampuan ini ada

batasnya. Kemampuan tubuh untuk memproduksi antioksidan alami akan

semakin berkurang, dengan bertambahnya usia (Sayuti dan Yenrina, 2015).

1. Antioksidan Enzimatis dan Antioksidan Non Enzimatis

Antioksidan enzimatis misalnya enzim superoksida dismutase (SOD), katalase

dan glutation peroksidase. Antioksidan non enzimatis, dibagi dalam 2 kelompok,

yaitu antioksidan larut lemak, seperti tokoferol, karotenoid, flavonoid, quinon, dan

bilirubin serta antioksidan larut air, seperti asam askorbat dan protein pengikat

logam.

26

2. Antioksidan Primer, Sekunder, dan Tersier

2.1 Antioksidan Primer

Antioksidan primer adalah antioksidan yang sifatnya sebagai pemutus reaksi

berantai (chain-breaking antioxidant) yang bisa bereaksi dengan radikal-radikal

lipid dan mengubahnya menjadi produk-produk yang lebih stabil. Antioksidan

primer bekerja untuk mencegah pembentukan senyawa radikal baru, yaitu

mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang berkurang dampak

negatifnya sebelum senyawa radikal bebas bereaksi. Antioksidan primer

mengikuti mekanisme pemutusan rantai reaksi radikal dengan mendonorkan atom

hidrogen secara cepat pada suatu lipid yang radikal, produk yang dihasilkan lebih

stabil dari produk awal.

2.2 Antioksidan Sekunder

Antioksidan sekunder bekerja dengan cara mengkelat logam yang bertindak

sebagai pro-oksidan, menangkap radikal dan mencegah terjadinya reaksi berantai.

Antioksidan sekunder berperan sebagai pengikat ion-ion logam, penangkap

oksigen, pengurai hidroperoksida menjadi senyawa non radikal, penyerap radiasi

UV atau deaktivasi singlet oksigen.

2.3 Antioksidan Tersier

Antioksidan tersier bekerja memperbaiki kerusakan biomolekul yang disebabkan

radikal bebas. Contoh antioksidan tersier adalah enzim-enzim yang memperbaiki

DNA dan metionin sulfida reduktase (Sayuti dan Yenrina, 2015).

27

3. Antioksidan Sintetik dan Antioksidan Alami

Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi dalam dua kelompok, yaitu

antioksidan sintetik (antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia)

dan antioksidan alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami).

3.1 Antioksidan Sintetik

Beberapa antioksidan sintetik yang lebih populer digunakan adalah senyawa

fenolik seperti butylated hydroxyl anisole (BHA), butylated hydroxyrotoluene

(BHT), propyl gallate (PG), tertiary butyl hydroquinone (TBHQ), nordihydro

guaretic acid (NDGA). Antioksidan fenolik sintetis selalu diganti oleh alkil untuk

meningkatkan kelarutannya dalam lemak dan minyak (Gordon et al., 2001).

3.2 Antioksidan Alami

Antioksidan alami umumnya bersumber dari hewan dan tumbuhan. Jenis

antioksidan ini biasanya mengandung suatu gugus hidroksi (-OH) pada struktur

senyawanya. Senyawa antioksidan yang bersumber dari tumbuhan diantaranya

berupa senyawa fenolik dari golongan flavonoid, kumarin, tokoferol, asam

sinamat dan asam-asam organik polifungsional (Isnindar dkk., 2011). Flavonoid

memiliki kemampuan sebagai antioksidan karena dapat mereduksi radikal bebas

(Zuhra dkk., 2008).

J. Mekanisme Kerja Antioksidan

Radikal bebas adalah molekul yang mengandung satu atau lebih elektron tidak

28

berpasangan pada orbital terluarnya, radikal bebas sangat reaktif dan tidak stabil,

sebagai usaha untuk mencapai kestabilannya radikal bebas akan bereaksi dengan

atom atau molekul di sekitarnya untuk memperoleh pasangan elektron. Reaksi ini

dalam tubuh dapat menimbulkan reaksi berantai yang mampu merusak struktur

sel, bila tidak dihentikan akan menimbulkan berbagai penyakit seperti kanker,

jantung, katarak, penuaan dini, serta penyakit degeneratif lainnya. Untuk

meredam aktivitas radikal bebas diperlukan antioksidan. Antioksidan adalah

senyawa yang dapat mendonorkan elektronnya (pemberi atom hidrogen) kepada

radikal bebas, sehingga menghentikan reaksi berantai, dan mengubah radikal

bebas menjadi bentuk yang stabil (Hamid et al., 2010). Reaksi berantai pada

radikal bebas (tanpa ada antioksidan) terdiri dari tiga tahap, yaitu:

1. Tahap inisiasi : RH → R* + H*

2. Tahap propagasi : R* + O2 → ROO*

ROO* + RH → ROOH + R*

3. Tahap terminasi : R* + R* → R – R

ROO* + R* → ROOR

ROO* + ROO* → ROOR + O2

Pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal bebas (R*) yang sangat reaktif,

karena (RH) melepaskan satu atom hidrogen, hal ini dapat disebabkan adanya

cahaya, oksigen atau panas. Pada tahap propagasi, radikal (R*) akan bereaksi

dengan oksigen membentuk radikal peroksi ( ROO*). Radikal peroksi

selanjutnya akan menyerang RH (misalnya pada asam lemak) menghasilkan

hidroperoksida dan radikal baru. Hidrogen peroksida yang terbentuk bersifat

29

tidak stabil dan akan terdegradasi menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai

pendek seperti aldehida dan keton.

Tanpa adanya antioksidan, reaksi oksidasi lemak akan berlanjut sampai tahap

terminasi, sehingga antar radikal bebas dapat saling bereaksi membentuk senyawa

yang kompleks. Antioksidan memberikan atom hidrogen atau elektron pada

radikal bebas (R*, ROO*), mengubahnya ke bentuk yang lebih stabil RH.

Sementara turunan radikal antioksidan (A*) memiliki keadaan lebih stabil

dibanding radikal semula R* (Inggrid dan Santoso, 2014).

Reaksi penghambatan antioksidan terhadap radikal lipid mengikuti persamaan

reaksi sebagai berikut:

Inisiasi : R* + AH → RH + A*

Radikal lipida

Propagasi : ROO* + AH → ROOH + A*

K. Metode Pengujian Antioksidan

Metode pengujian aktivitas antioksidan dikelompokkan menjadi 3 golongan.

Golongan pertama adalah Hydrogen Atom Transfer Methods (HAT), misalnya

Oxygen Radical Absorbance Capacity Method (ORAC) dan Lipid Peroxidation

Inhibition Capacity Assay (LPIC). Golongan kedua adalah Electron Transfer

Methods (ET), misalnya Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) dan 2,2-

diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH). Golongan ketiga adalah metode lain seperti

Total Oxidant Scavenging Capacity (TOSC) dan Chemiluminescence.

30

Dalam penelitian ini, pengujian aktivitas antioksidan yang terdapat pada senyawa

hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan Electron Transfer Methods (ET)

berbasis DPPH. Uji peredaman radikal bebas berdasarkan DPPH merupakan uji

untuk menentukan aktivitas antioksidan yang terdapat dalam suatu sampel dengan

cara melihat kemampuan senyawa tersebut dalam menangkal radikal bebas yang

berasal dari DPPH (Molyneux, 2004).

Electron Transfer Methods (ET) berbasis DPPH memberikan informasi reaktivitas

senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil. DPPH memberikan serapan kuat

pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap. Penangkap radikal

bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkan

penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang diambil.

Reaksi penghambatan radikal bebas oleh antioksidan melalui DPPH menurut

Prakash et al (2001) dapat dilihat pada Gambar 11.

DPPH (bentuk teroksidasi) Antioksidan DPPH (bentuk tereduksi)

Gambar 11. Reaksi antara DPPH dengan antioksidan

Hasil pengukuran dengan DPPH menunjukkan kemampuan antioksidan sampel

secara umum, tidak berdasarkan pada jenis radikal yang dihambat. Pada metode

31

lain selain DPPH membutuhkan reagen kimia yang cukup banyak, waktu analisis

yang lama, biaya yang mahal dan tidak selalu dapat diaplikasikan pada semua

sampel (Sayuti dan Yenrina, 2015).

Pada struktur radikal DPPH terjadi delokalisasi elektron sehingga membuat

larutan DPPH berwarna ungu. Ketika larutan DPPH dicampur dengan senyawa

yang dapat mendonorkan elektron, proses delokalisasi elektron akan terhenti dan

membuat DPPH menjadi bentuk tereduksi. Bentuk tereduksi membuat DPPH

kehilangan warna ungu. Hal tersebut yang menjadi dasar pengukuran berdasarkan

metode transfer elektron berbasis DPPH karena intensitas warna ungu berbanding

lurus dengan konsentrasi DPPH. Penurunan intensitas warna yang terjadi

disebabkan oleh adanya penangkapan satu elektron oleh senyawa radikal DPPH

dari zat antioksidan yang menyebabkan tidak adanya kesempatan elektron tersebut

untuk beresonansi (Rosahdi dkk., 2013). Mekanisme reaksi asam askorbat

dengan DPPH dapat dilihat pada Gambar 12.

32

1. Tahap Inisiasi

DPPH Hidrazin DPPH Hidrazil

2. Tahap Propagasi

Asam Askorbat DPPH Hidrazil Asam Askorbat DPP Hidrazin

3. Tahap Terminasi

Asam Askorbat DPP Hidrazin Asam Dehidroaskorbat DPP Hidrazin

Gambar 12. Mekanisme reaksi asam askorbat dengan DPPH

33

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan April 2018 – Maret 2019 yang bertempat di

Laboratorium Kimia Organik Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Lampung. Analisis spektroskopi yang

digunakan yaitu spektroskopi Resonansi Magnetik Inti (RMI) dilakukan di

Laboratorium NMR Institut Teknologi Bandung. Pengujian antioksidan

dilakukan di Laboratorium Botani Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

1. Alat-alat yang digunakan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi seperangkat alat gelas,

penguap putar vakum, satu set alat kromatografi cair vakum (KCV), satu set alat

kromatografi kolom (KK), pengukur titik leleh menggunakan melting point

apparatus gallenkamp, lampu UV, pipet kapiler, batang pengaduk, oven, dan

spektrofotometer NMR.

34

2. Bahan-bahan yang digunakan

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk kulit batang tumbuhan

turi merah (S. grandiflora) yang diperoleh di desa Purwodadi, Lampung Tengah

pada November 2017. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi dan kromatografi

berkualitas teknis yang telah didestilasi sedangkan untuk analisis spektrofotometer

dan uji antioksidan berkualitas pro-analisis (PA). Bahan-bahan kimia yang

digunakan antara lain etil asetat (CH3CO2C2H5), metanol (CH3OH), n-heksana (n-

C6H14), aseton (C3H6O), akuades (H2O), toluena, benzena (C6H6), serium sulfat

dalam asam sulfat (H2SO4) 2 N, diklorometana (CH2Cl2), silika gel Merck G60,

silika gel 60 GF254 (35-70 Mesh), plat KLT, asam askorbat dan DPPH.

C. Prosedur Penelitian

1. Persiapan Sampel

Kulit batang tumbuhan turi merah (S. grandiflora) dideterminasi di Herbarium

Bogoriensis bidang Botani Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan

Indonesia (LIPI) Cibinong, Jawa Barat. Kulit batang turi merah dicuci bersih

dengan air dan dipotong kecil-kecil kemudian dikeringkan dengan cara dijemur di

bawah panas sinar matahari selama satu minggu. Kulit batang yang sudah kering

kemudian digiling hingga menjadi serbuk halus, serbuk halus ini yang kemudian

digunakan sebagai sampel dalam penelitian ini.

35

2. Ekstraksi dengan Berbagai Pelarut

Serbuk halus kulit batang turi merah ditimbang sebanyak 2500 gram kemudian

direndam dengan menggunakan beberapa pelarut diantaranya n-heksana, etil

asetat, dan metanol. Sampel dimaserasi selama 1x24 jam sebanyak 3 kali

pengulangan untuk 1 pelarut. Ketiga ekstrak hasil maserasi disaring dengan

kertas saring. Masing-masing filtrat dari berbagai pelarut yang didapat kemudian

dipekatkan dengan rotary evaporator. Ekstrak pekat yang diperoleh kemudian

ditimbang untuk diketahui beratnya.

3. Kromatografi Cair Vakum (KCV)

Ekstrak pekat dari masing-masing pelarut kemudian difraksinasi dengan proses

kromatografi cair vakum (KCV). Prinsip dari metode ini berupa distribusi

partikel pada fasa diam. Pada penelitian ini, fasa diam yang digunakan adalah

silika gel halus. Sampel dilarutkan dalam aseton dan diimpregnasikan dalam

silika gel kasar, kemudian dimasukkan pada bagian atas kolom yang telah berisi

fasa diam. Kolom dikemas secara kering menggunakan alat vakum. Apabila

kolom sudah padat maka dimasukkan eluen secara berurutan berdasarkan

kepolarannya yaitu dari kepolaran yang rendah, kemudian divakumkan kembali

dan dihisap sampai kering sehingga siap untuk digunakan. Setelah kolom siap

digunakan maka sampel yang sudah diimpregnasi dimasukkan ke dalam bagian

atas kolom. Selanjutnya dilakukan proses pengelusian menggunakan eluen etil

asetat:n-heksana 0% sampai etil asetat 100%. Hasil elusi dari masing-masing

pelarut ditampung dan dilakukan monitoring menggunakan metode KLT. Fraksi-

36

fraksi yang memiliki nilai Rf yang sama maka digabung dalam satu wadah

(Pratiwi dan Ersam, 2013).

4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Uji KLT terlebih dahulu dilakukan untuk melihat pola pemisahan komponen-

komponen senyawa yang terdapat dalam ekstrak kasar. Uji KLT juga dilakukan

terhadap fraksi-fraksi yang akan difraksinasi dan juga fraksi yang diperoleh

setelah fraksinasi sebelumnya. Uji KLT dilakukan dengan menggunakan sistem

campuran eluen menggunakan pelarut yang sesuai yaitu dapat berupa kombinasi

antara pelarut n-heksana, etil asetat, diklorometana, dan aseton dengan persentase

yang sesuai. Setelah dilakukan elusi terhadap plat KLT, bercak atau noda dilihat

di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm (Wulandari,

2011).

Untuk menampakkan noda hasil KLT, hasil kromatogram tersebut kemudian

disemprot dengan menggunakan larutan serium sulfat. Retention factor (Rf) dari

setiap noda yang terbentuk dihitung dan dicatat. Setiap fraksi yang menghasilkan

pola pemisahan dengan Rf yang sama pada kromatogram, disatukan dan

dipekatkan sehingga diperoleh beberapa fraksi gabungan yang akan difraksinasi

lebih lanjut.

5. Kromatografi Kolom (KK)

Setelah dihasilkan fraksi-fraksi dengan jumlah yang lebih sedikit, tahapan

fraksinasi selanjutnya dilakukan menggunakan teknik kromatografi kolom.

37

Adsorben silika gel Merck (35-70 Mesh) dilarutkan dalam pelarut yang akan

digunakan dalam proses pengelusian. Slurry dari silika gel dimasukkan terlebih

dahulu ke dalam kolom, fasa diam diatur hingga rapat (tidak berongga) dan rata.

Selanjutnya sampel yang telah diimpregnasi dimasukkan pada silika gel ke dalam

kolom yang telah berisi fasa diam. Pada saat sampel dimasukkan, kolom

diusahakan tidak kering atau kehabisan pelarut karena akan mengganggu fasa

diam yang telah dikemas rapat, sehingga proses elusi tidak akan terganggu

(Gritter et al., 1991).

6. Analisis Kemurnian

Identifikasi kemurnian dilakukan dengan metode KLT dan uji titik leleh.

Identifikasi kemurnian secara KLT menggunakan beberapa campuran eluen.

Kemudian suatu senyawa ditunjukkan dengan munculnya bercak tunggal pada

kromatogram menggunakan serium sulfat, cara pembuatannya adalah 1,5 gram

serium sulfat (Ce(SO4)2) dilarutkan dalam 10 mL akuades, lalu dimasukkan asam

sulfat (H2SO4) dengan konsentrasi 1,8 M lalu dihomogenkan (Khopkar, 2002).

Untuk identifikasi titik leleh, sebelum dilakukan pengukuran, alat pengukur titik

leleh tersebut dibersihkan terlebih dahulu dari pengotor, karena pengotor akan

menaikkan atau menurunkan temperatur titik leleh dari kristal yang diperoleh dari

perlakuan sebelumnya. Untuk kristal yang berukuran besar, kristal terlebih

dahulu digerus hingga berbentuk serbuk kemudian kristal yang akan ditentukan

titik lelehnya diletakkan pada lempeng kaca, diambil sedikit dengan menggunakan

pipet kapiler, alat dihidupkan dan titik leleh diamati dengan bantuan kaca

38

pembesar. Titik leleh dari senyawa tersebut adalah suhu pada saat kristal pertama

kali mulai meleleh sampai semua zat meleleh. Pengukuran titik leleh dilakukan

sebanyak tiga kali.

7. Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti (RMI)

Sampel berupa kristal murni yang akan diidentifikasi dilarutkan terlebih dahulu

dalam pelarut aseton, kemudian ditambahkan sedikit senyawa acuan. Selanjutnya

larutan diletakkan dalam tabung gelas tipis dengan ketebalan 5 mm di tengah-

tengah kumparan frekuensi radio (rf) di antara dua kutub magnet yang sangat

kuat, kemudian energi dari kumparan rf ditambahkan secara terus-menerus.

Energi pada frekuensi yang terpasang dari kumparan rf yang diserap oleh

cuplikan akan direkam dan ditunjukkan sebagai spektrum NMR (Silverstein et al.,

2005).

8. Uji Antioksidan dengan Metode Transfer Elektron

Pada penelitian ini, uji antioksidan dilakukan menggunakan metode transfer

elektron berbasis DPPH yang sudah dilakukan pada penelitian sebelumnya yaitu

Mensor et al (2001). Perhitungan untuk pembuatan larutan yang dibutuhkan

dapat dilihat pada Lampiran 3.

a. Pembuatan Larutan DPPH

Larutan DPPH yang digunakan adalah larutan DPPH 0,3 mM yang disiapkan

dalam pelarut metanol.

39

b. Pembuatan Larutan Uji

Larutan sampel dibuat dengan cara mengencerkan larutan stok (1,0 mg/mL) dalam

pelarut metanol menjadi beberapa konsentrasi yaitu 250, 200, 150, 100, dan 50

µg/mL.

c. Pembuatan Larutan Blanko

Larutan blanko dibuat dengan cara mencampurkan 2 mL metanol dengan 2 mL

larutan sampel.

d. Pembuatan Larutan Kontrol Positif dan Negatif

Pada penelitian ini, kontrol positif yang digunakan adalah larutan asam askorbat

yang dibuat dalam pelarut metanol dengan beberapa konsentrasi yaitu 250, 200,

150, 100, dan 50 µg/mL. Sedangkan kontrol negatif dibuat dengan cara

mencampurkan 2 mL larutan DPPH 0,3 mM dengan 2 mL metanol.

e. Pengujian Antioksidan

Uji antioksidan dilakukan dengan cara mencampurkan 2 mL larutan DPPH 0,3

mM dengan 2 mL larutan sampel dari beberapa konsentrasi. Campuran dibiarkan

bereaksi dalam suhu ruang selama 30 menit. Setelah itu masing-masing campuran

diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang

gelombang 517 nm. Pengujian yang sama juga dilakukan pada larutan blanko,

kontrol positif, dan kontrol negatif. Setelah diperoleh masing-masing serapannya,

ditentukan persentase inhibisi melalui rumus:

40

% Inhibisi = x 100 %Selanjutnya dilakukan perhitungan IC50 yang merupakan konsentrasi sampel

untuk dapat meredam 50 % aktivitas radikal DPPH. Nilai IC50 dapat dihitung

melalui persamaan regresi linear dari plot garis antara daya hambatan dan sumbu

konsentrasi.

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. SIMPULAN

Berdasarkan pembahasan hasil penelitian, maka dapat disimpulkan sebagai berikut:

1. Senyawa yang telah berhasil diisolasi pada penelitian ini yaitu senyawa N-21 yang

merupakan campuran senyawa β-stigmasterol dan β-sitosterol yang merupakan

golongan steroid.

2. Senyawa N-21 memiliki wujud visual berupa padatan kristal berwarna putih

kekuningan dengan titik leleh yang berkisar antara 151-154oC.

3. Hasil uji antioksidan dengan metode transfer elektron menunjukkan bahwa

senyawa N-21 memiliki tingkat aktivitas antioksidan kategori kuat dengan nilai

IC50 sebesar 16,13 μg/mL.

69

B. SARAN

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, didapatkan saran untuk penelitian

selanjutnya yaitu:

1. Perlu dilakukan pemurnian lebih lanjut terhadap campuran senyawa yang telah

diperoleh dari hasil penelitian ini dan dilakukan uji aktivitas antioksidan terhadap

masing-masing senyawa yang telah dimurnikan.

2. Penelitian lebih lanjut terhadap ekstrak kasar metanol dan n-heksana dari sampel

kulit batang tumbuhan turi merah (S. grandiflora L. Pers.) sehingga diperoleh

informasi lebih lanjut mengenai senyawa metabolit sekunder yang terkandung di

dalamnya.

3. Melakukan uji bioaktivitas lain terhadap senyawa hasil isolasi dari kulit batang

tumbuhan turi merah (S. grandiflora L. Pers).

70

DAFTAR PUSTAKA

Agostini-Costa, T. S., Vieira, R. F., Bizzo, H. R., Silveira, D., and Gimenes, M. A.2012. Secondary Metabolites. Embrapa Genetic Resources andBiotechnology. Brazil.

Agromedia. 2008. Buku Pintar Tanaman Obat: 431 Jenis Tanaman PenggempurAneka Penyakit. Agromedia Pustaka. Jakarta.

Aqli, A. B. N. 2014. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Steroid dari Ekstrak Etil AsetatDaun Nam-Nam (Cynometra cauliflora L.). (Skripsi). UIN Sunan GunungDjati. Bandung.

Asmara, A. P. 2017. Uji Fitokimia Senyawa Metabolit Sekunder dalam EkstrakMetanol Bunga Turi Merah (Sesbania grandiflora L. Pers). Universitas IslamNegeri Ar-Raniry. Aceh.

Avalaskar, A. N., Itankar, P. R., Joshi, V. S., Agrawal, M., and Vyas, J. 2011.Phytochemical and TLC Studies of Ethanolic Extract of Sesbania grandiflora(Fabaceae). Int. J. Pharm. Tech. Res. 3 (3) : 1346–1349.

Bhawani, S.A., Sulaiman, O., Hashim, R., and Ibrahim, M.N.M. 2011. ThinlayerChromatographic Analysis of Steroids. Trop. J. Pharm. Res. 9: 301-313.

Bhoumik, D. and Jaya, D. 2014. A Review on Pharmacological Activity ofSesbania grandiflora L. Columbia Journal of Pharmaceutical Sciences. 1 :40–43.

71

Cayme, J.C., and Ragasa, C. 2004. Structure Elucidation of β-stigmasteroland β-sitosterol from Sesbania grandiflora (Linn.) Pers. and β-carotene fromHeliotropium indicum Linn. by NMR Spectroscopy. Kimika. 20 : 5–12.

Choi, J.M., Lee, E.O., and Lee, H.Y. 2007. Identification of Campesterol fromChrysanthemum coronarium L. and its Antiangiogenic Activities. Phytother.Res. 21: 954-959.

Cronquist, A. 1981. An Integrated System of Clasification of Flowering Plants.Columbia University Press. New York.

Danarto, S.A. 2005. Keragaman dan Potensi Koleksi Polong-Polongan (Fabaceae)di Kebun Raya Purwodadi. Balai Konservasi Tumbuhan Kebun RayaPurwodadi. Pasuruan.

Das, K. C. and Tripathi, A. K. 1999. A New Triterpenoid of Sesbania grandiflora.Oriental J. Chem. 15 (3) : 561-562.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar Umum EkstrakTumbuhan Obat. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta.

Fessenden, R. J. dan Fessenden, J. S. 1986. Kimia Organik Jilid I. Erlangga. Jakarta.

Gordon, M., Porkony, J., and Yanishlieva, N. 2001. Introduction of Antioxidant.Antioxidants in Food: Practical Applications. CRC Press. New York.

Gritter, R. J., Bobbit, J. M., and Schwarting, A. E. 1991. Pengantar Kromatografi.Alih Bahasa Kosasih Padmawinata. Institut Teknologi Bandung. Bandung.Hlm 266.

Hajnos, M., Waksmundzka, and Sherma, J. 2011. High Performance LiquidChromatography in Phytochemical Analysis. CRC Press Taylor and FrancisGroup. Boca Raton. 13-15.

72

Hamid, A. A., Aiyelaagbe, O. O., Usman, L. A., Ameen, O. M., and Lawal, A. 2010.Antioxidants: Its Medicinal and Pharmacological Applications. Afr. J. PureAppl. Chem. 4 (8) : 142–151.

Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern MenganalisisTumbuhan. Alih Bahasa Kosasih Padmawinata. Institut Teknologi Bandung.Bandung. Hlm 9-71.

Hariana. 2006. Tumbuhan Obat dan Khasiatnya. Penebar Swadaya. Jakarta.

Harvey, D. 2000. Modern Analitical Chemistry. McGraw-Hill Companies, Inc.New York. Pp 816.

Hostettman, K., Hostettman, M. and Marston, A. 1986. Preparative ChromatographyTechniques : Applications in Natural Product Isolation. Springer-VerlagBerlin Heidelberg. New York. Pp 146.

Inggrid, H. M. dan Santoso, H. 2014. Ekstraksi Antioksidan dan Senyawa Aktif dariBuah Kiwi (Actinidia deliciosa). Universitas Katolik Parahyangan. Bandung.

Ismiyarto dan Wibawa, P. J. 2006. Identification of Fatty Acid Compotition in TuriSeed Oil (Sesbania grandiflora L. Pers ). Universitas Diponegoro. Semarang.

Isnindar., Wahyuono, S. dan Setyowati, E. P. 2011. Isolasi dan Identifikasi SenyawaAntioksidan Daun Kesemek (Diospyros kaki Thunb) dengan Metode DPPH(2,2-difenil-1-pikrilhidrazil). Majalah Obat Tradisional. 16 (3) : 161-169.

Kasture, V. S., Deshmukh,V. K. and Chopde, C. T. 2002. Anxiolytic andAnticonvulsive Activity of Sesbania grandiflora Leaves in ExperimentalAnimals. Phytotherapy Research. 16 (5) : 455–460.

Khopkar, S. M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia. Jakarta.

Larry, H. 1988. Analytical Chemistry Principles and Technigues. Prentice HallInc. New Jersey.

73

Leniger, H.A. and Beverloo, W. A. 1975. Food Process Engineering. D. ReidelPublishing Company. Dordrecht – Holland.

Lewis, E.G., Schrire, B. and Mackinder, B. 2005. Legume of The World. KewPublishing. London.

Makalalag, A. K., Sangi, M. dan Kumaunang, M. 2010. Skrining Fitokimia dan UjiToksisitas Ekstrak Etanol dari Daun Turi (Sesbania grandiflora Pers.). JurnalKimia. Hlm 38–46.

Mensor, L. L., Menezes, F. S., Leitao, G. G., Reis, A. S., dos Santos, T. C., Coube, C.S. and Leitao, S. G. 2001. Screening of Brazilian Plant Extracts forAntioxidant Activity by the Use of DPPH Free Radical Method. PhytotherapyResearch. 15 : 127-130.

Minami, H. K. H., Kubo, M. and Fukuyama, Y. 1998. A Benzophenoneand a Xanthone from Garcinia. Phytochemistry. 49(6):1783–1785.

Molyneux, P. 2004. The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Journal of Science andTechnology. 26 (2) : 211-219.

Mulja, M. dan Suharman. 1995. Analisis Instrumental. Universitas Airlangga.Surabaya. Hlm 26-34.

Noviany, N., Nurhidayat, A., Hadi, S., Suhartati, T., Azis, M., Purwitasari, N. andSubasman, I. 2018. Sesbagrandiflorain A and B : Isolation of Two New 2arylbenzofurans from the Stem Bark of Sesbania grandiflora. Nat. Prod. Res.pp. 1-7.

Nurmalasari, F., Ersam, T. dan Fatmawati, S. 2016. Isolasi Senyawa Antioksidan dariKulit Batang Sonneratia ovata Backer. Jurnal Sains dan Seni ITS. 5 (2):2337-3520.

74

Ouattara, M. B., Konate, K., Kiendrebeogo, M., Ouattara, N., Compaore, M. andMeda, R. 2011. Antibacterial Potential and Antioxidant Activity ofPolyphenols of Sesbania grandiflora. Curr. Res. J. Biol. Sci. 3(4):351–356.

Owen, T. 1996. Fundamental of UV-Visible Spectroscopy. Hewlett-PackardCompany. German. 18-19.

Panda, S., Jafri, M., Kar, A., and Meheta, B.K. 2009. Thyroid Inhibitory,Antiperoxidative and Hypoglycemic Effects of Stigmasterol Isolated fromButea monosperma. Fitoterapia. 80: 123-126.

Pateh, U. U., Haruna, A. K., Garba, M., Iliya, I., Sule, I. M., Abubakar, M. S. andAmbi, A. A. 2009. Isolation of Stigmasterol, β-sitosterol and 2-Hydroxyhexadecanoic Acid Methyl Ester from The Rhizomes of Stylochitonlancifolius Pyer and Kotchy (Araceae). Nigerian Journal of PharmaceuticalSciences. 8(1) : 19-25.

Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. UI Press. Jakarta.

Powthong, P., Jantrapanukorn, B., Thongmee, A. and Suntornthiticharoen, P. 2013.Screening of Antimicrobial Activities of The Endophytic Fungi Isolated fromSesbania grandiflora (L.) Pers. Journal of Agricultural Science andTechnology. 15 : 1513-1522.

Prakash, A., Rigelhof, F. and Miller, E. 2001. Antioxidant Activity. Eur. Rev. Med.Pharmacol. Sci. 15 (4) : 376–378.

Pratiwi, A. dan Ersam, T. 2013. Uji Kemurnian Dua Senyawa dari Ekstrak MetanolKayu Batang Garcinia cylindrocarpa. Jurnal Sains dan Seni Pomits. 2(1):1-4.

Purseglove, J. W., Brown, E. G., Green, C. L. and Robins, S. R. J. 1981. Spice.Longman. London.

Puspariani, Y. S. 2007. Isolasi dan Identifikasi Saponin pada Kecambah Kedelai(Glycine max L.). (Skripsi). Universitas Sanata Dharma. Yogyakarta.

75

Ramesh, T., Mohaideen, V. and Begum, H. 2006. Hypolipidemic Effect of Sesbaniagrandiflora on Cigarette Smoke Exposed Rats. Pharmacology. 3: 309–323.

Robinson, T. 1995. Kandungan Senyawa Organik Tumbuhan Tinggi. Alih BahasaKosasih Padmawinata. Institut Teknologi Bandung. Bandung.

Rosahdi, T. D., Kusmiyati, M. and Wijayanti, F. R. 2013. Uji Aktivitas DayaAntioksidan Buah Rambutan Rapiah dengan Metode DPPH. UIN SunanGunung Djati. Bandung. ISSN 1979-8911.

Saputra, D. E., Handayani, N. dan Wartono, M. W. 2014. Isolation and Identificationof β-Sitosterol and Stigmasterol Mixture from Root Bark of Slatri(Calophyllum soulattri Burm). ALCHEMY Jurnal Penelitian Kimia. 10(1): 87.

Sari, P. P., Rita, W. S. dan Puspawati, N. M. 2015. Identifikasi dan Uji AktivitasSenyawa Tanin dari Ekstrak Daun Trembesi (Samanea saman (Jacq.) Merr)sebagai Antibakteri Escherichia coli (E. coli). Universitas Udayana. Bali.ISSN 1907-9850. Hlm 27–34.

Sastrohamidjojo, H. 2002. Kromatografi. Liberty. Yogyakarta. Hlm 35-36.

Sayuti, K., dan Yenrina, R. 2015. Antioksidan Alami dan Sintetik. UniversitasAndalas. Padang.

Silverstein, R. M., Webster, F. X. and Kiemle, D. J. 2005. SpectrometricIdentification of Organic Compounds. John Wiley and Sons, Inc. New York.Hlm. 191-195.

Srivastava, P. H. C., Singh, P. and Subba, P. V. 1968. A Galactomannan From TheSeeds of Sesbania grandiflora Pers. Carbohyd Res. 6: 361–366.

Stahl, E. 1969. Thin-Layer Chromatography. Springer-Verlag. Berlin.

Sudjadi. 1985. Penentuan Struktur Senyawa Organik. Ghalia Indonesia. Jakarta. Hlm283.

76

Wagh, V. D., Wagh, K. V., Tandale, Y. N., Salve, S. A., Linn, A. and Poir, S. 2009.Phytochemical, Pharmacological and Phytopharmaceutics Aspects ofSesbania grandiflora (Hadga). J. Pharm. Res. 2 (5): 889–892.

Wagner, H. and Bladt, S. 1996. Plant Drug Analysis, A Thin Layer ChromatographyAtlas, 2nd Ed. Springer Verlag. Berlin. Hlm 195-197.

Wanjala, C. C. W. and Majinda, R. R. T. 2000. Two Novel Glucodienoid Alkaloidsfrom Erythrina latissima Seeds. J. Nat. Prod. 63 (6): 871–873.

Winarti, S. 2010. Makanan Fungsional. Graha Ilmu. Yogyakarta.

Wulandari, L. 2011. Kromatografi Lapis Tipis. PT. Taman Kampus Presindo.Jember.

Yuniarti, T. 2008. Tanaman Obat Tradisional. Media Pressindo. Yogyakarta.

Zuhra, C. F., Tarigan, J. Br. dan Sihotang, H. 2008. Aktivitas Antioksidan SenyawaFlavonoid dari Daun Katuk (Sauropus androgunus (L.) Merr). Jurnal BiologiSumatera. 3 (1): 7-10.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER …digilib.unila.ac.id/58576/3/3. SKRIPSI FULL...

Documents

Transcript of ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER …digilib.unila.ac.id/58576/3/3. SKRIPSI FULL...