1

RENATA CAMPOS NOGUEIRA

ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE DA

ESTABILIDADE CITOGENÉTICA APÓS EXPANSÃO IN

VITRO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS

DERIVADAS DO EPITÉLIO AMNIÓTICO, TECIDO

ADIPOSO E POLPA DE DENTE DECÍDUO HUMANO.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Dra. Milena Botelho Pereira Soares

Feira de Santana, BA

2009

2

Dedico este trabalho:

Aos meus queridos pais, José Eduardo

e Ana Beatriz, pelo apoio incondicional

para que eu seguisse o meu caminho...

... e ao meu amado marido, Emerson F. Queiroz,

por tornar os momentos difíceis mais amenos

e as pequenas vitórias tão especiais.

3

AGRADECIMENTOS

NINGUÉM É MAIS FORTE QUE TODOS NÓS JUNTOS!

Esse trabalho, realizado ao longo de dois anos e meio, só foi possível devido ao empenho e suporte de diversas pessoas. Foi um momento de aprendizado, convivência e renúncia. Aprendizado na área de pesquisa, convivência com os novos colegas e com a riquíssima cultura baiana e renúncia de uma zona de conforto ilusória que impede tantas pessoas de perseguirem seus sonhos. Minha conquista, intangível, vai muito além das páginas seguintes. Nunca me esquecerei desse período. Portanto, meus sinceros agradecimentos: À minha orientadora, Dra. Milena B. P. Soares, que se tornou uma grande amiga e companheira de projetos pessoais e profissionais. Difícil expressar em palavras o agradecimento por ter viabilizado o meu sonho orientando tanto o meu trabalho de mestrado como minha carreira científica e, principalmente, meu eterno reconhecimento por ter aberto sua família e amigos ao meu convívio. Finalizo esta etapa com a certeza de que alguns “projetos” aqui iniciados são para a vida inteira. Ao Dr. Ricardo Ribeiro do Santos, chefe do laboratório, por ter me acolhido no grupo com tanto carinho. Formador de recursos humanos me ensinou que a ciência pouco significaria se não fosse compartilhada. Meu eterno respeito. Ao querido colega Ricardo Santana de Lima pelo suporte nos primeiros dias no laboratório, um terreno completamente desconhecido, pela paciência com que me ensinou a trabalhar com cultura de células e principalmente pelo sentimento de amor ao grupo que hoje guardo comigo. À minha companheira de pesquisa Elisalva Guimarães (querida Liu). Pelo empenho incansável na citometria de fluxo, nas diferenciações, na cultura de células. Estabelecemos uma parceria de sucesso e amizade verdadeira! À Gisele Carvalho e Adriana de Oliveira pela colaboração no PCR. Sem a paciência e determinação de vocês eu não teria conseguido. À Carine Azevedo e Marcos Leal que tiveram participação efetiva na realização dos experimentos de imunofluorescência, demonstrando sempre muita consideração por mim. À Dra. Acácia de Carvalho e Dr. Spencer Payão pela fundamental contribuição na etapa de citogenética. Aos colegas de mestrado, Luís Flávio Maia e Cristina Menezes, por partilharem momentos alegres nesse período. A estrada Bahia-Feira não será mais a mesma! Aos colegas da “penúltima salinha do corredor”: Flávia Maciel, Denis Zubieta (que me ajudou na confecção das figuras), Dra. Mara Pires, Fernanda de Borba e mais recentemente

4

Dra. Zaquer Costa (que revisou profissionalmente meu manuscrito). Obrigada pela amistosa convivência. Às Dras. Fabiana Nonato e Cristiane Flora pela sincera amizade. Com vocês aprendi que é possível conciliar a responsabilidade de mãe, esposa, pesquisadora e continuar sendo, antes de tudo, você mesma. O tempo não pára! À Dra. Simone Macambira pelo amor ao ensino e formação de profissionais. Sua dedicação nos faz acreditar em sonhos e resistir aos percalços. À Roberta Couto e Lucyvera Imbroinise, em especial, pelo trabalho na administração do laboratório. Ao curso de Pós-graduação em Biotecnologia. Em especial ao Helton Ricardo, secretário, e Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto pela dedicação aos alunos. À FAPESB pelo apoio financeiro. Aos colegas do LETI por compartilharem os momentos nesta caminhada. Ao Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz por disponibilizar a excelente estrutura física. Agradecimentos especiais.... À minha amada família baiana: tia Eliane, tio Marcelo e Daniel que me receberam em Salvador onde eu me senti em casa desde o primeiro dia. Hoje, a sensação é de que vocês sempre fizeram parte da minha vida. Só precisava encontrá-los! Às tias Andréia e Vera que “me empurraram” para fora da zona de conforto numa tarde no Rio de Janeiro durante um dos muitos períodos de angústia. As palavras de apoio foram decisivas. À minha “Iazinha”, longe, porém não distante. Você tem o meu amor incondicional. Ao amor dos meus irmãos, Cecília e Duda. Por causa desse sentimento de família tenho certeza de que nunca estou sozinha. À minha avó Landa que, sabiamente, diz: “Dá liberdade ao Pai para que Ele conduza a trama dos teus dias...” Aos meus sogros e cunhados que me receberam com tanto amor na família. Aos meus amigos, em especial minhas amigas de longa data: Alessandra Lima, Larissa Lima e Patrícia Achtschin, por entenderem meus períodos de ausência em prol da pesquisa.

A Deus e aos Orixás por colocarem todas estas pessoas no meu caminho. Não existe acaso!

5

"Morre lentamente quem não viaja, quem não lê, quem não ouve música, quem não encontra graça em si mesmo. Morre lentamente quem destrói o seu amor-próprio, quem não se deixa ajudar. Morre lentamente quem se transforma em escravo do hábito, repetindo todos os dias os mesmos trajetos, quem não muda de marca, não se arrisca a vestir uma nova cor ou não conversa com quem não conhece. Morre lentamente quem faz da televisão o seu guru. Morre lentamente quem evita uma paixão, quem prefere o negro sobre o branco e os pontos sobre os "is" em detrimento de um redemoinho de emoções, justamente as que resgatam o brilho dos olhos, sorrisos dos bocejos, corações aos tropeços e sentimentos. Morre lentamente quem não vira a mesa quando está infeliz com seu trabalho, quem não arrisca o certo pelo incerto para ir atrás de um sonho, quem não se permite pelo menos uma vez na vida fugir dos conselhos sensatos. Morre lentamente, quem passa os dias queixando-se da sua má sorte ou da chuva incessante. Morre lentamente, quem abandona um projeto antes de iniciá-lo, não pergunta sobre um assunto que desconhece ou não responde quando lhe indagam sobre algo que sabe. Evitemos a morte em doses suaves, recordando sempre que estar vivo exige um esforço muito maior que o simples fato de respirar. Somente a perseverança fará com que conquistemos um estágio esplêndido de felicidade."

Pablo Neruda

6

RESUMO

Encontrar a fonte de célula-tronco mais apropriada para uso terapêutico depende da

investigação de diversos fatores, como a sua capacidade de proliferação e estabilidade

citogenética quando expandidas in vitro, assim como suas características fenotípicas e

potencial de diferenciação. Neste estudo nós comparamos características de células-tronco

mesenquimais isoladas do epitélio amniótico, tecido adiposo e polpa de dente decíduo em

momentos diferentes após expansão in vitro. Células-tronco mesenquimais (CTM) obtidas do

epitélio amniótico foram facilmente isoladas, mas, expandidas in vitro com dificuldade. A

expressão de Oct-4, um fator de transcrição relacionado ao fenótipo de célula-tronco

indiferenciado, foi observado em culturas de CTM do tecido adiposo e polpa dentária em

diferentes passagens. Estas células também apresentaram capacidade de diferenciação

osteogênica e adipogênica in vitro. A análise de marcadores de superfície celular por

citometria de fluxo foi realizada, confirmando a presença de células expressando fenótipo

característico de CTM, com identificação de diferenças entre tecido adiposo e polpa dentária.

Esta fração correspondeu a uma pequena porcentagem de células (em torno de 2%). Após

expansão in vitro, foram analisadas preparações cromossômicas por técnica de bandeamento

G. Cariótipos normais foram encontrados em metáfases de células do tecido adiposo e polpa

dentária em diferentes passagens in vitro, exceto na passagem mais avançada (20°) da CTM

derivada do tecido adiposo. Os resultados indicam que células-tronco humanas derivadas do

tecido adiposo e polpa de dente decíduo possuem muitas características similares, mas não

são iguais e ambas podem ser expandidas em cultura por pelo menos dez passagens sem

apresentarem sinais de anormalidades cromossômicas. Apesar de muitos avanços terem sido

realizados nesse campo, a correlação entre a informação experimental gerada e a aplicação

clínica adequada permanece um desafio para pesquisas futuras.

Palavras- chave:

Tecido adiposo • polpa de dente decíduo • epitélio amniótico • células-tronco mesenquimais •

expansão in vitro • estabilidade citogenética •

7

ABSTRACT

Finding the most appropriate source of stem cells for therapeutic use depends on investigation

of many factors, such as their capacity to proliferate and cytogenetic stability when in vitro

expanded, as well as their phenotypic characteristics and differentiation potential. In this

study we compared features of mesenchymal stem cells (MSC) isolated from human amniotic

epithelium, adipose tissue and deciduous dental pulp different times after in vitro expansion.

Mesenchymal stem cells from human amniotic epithelium were easily isolated, but difficult to

expand in vitro. The other two sources of cells were easy to expand and used in a series of

analyses. The expression of Oct-4, a transcription factor related to undifferentiated stem cell

phenotype, was observed in cultures of MSC from adipose tissue and dental pulp in different

passages. These cells had also osteogenic and adipogenic differentiation capacity in vitro.

Analysis of cell surface markers by flow cytometry was performed, confirming the presence

of cells expressing phenotype characteristic of MSC, although differences between adipose

tissue and dental pulp. These corresponded to a small percentage of the cells (about 2%).

After in vitro expansion, chromosome preparations were analyzed by G-banding techniques.

Normal kariotypes were found in metaphases of cells from adipose tissue and dental pulp in

different in vitro passages, except for a late passage (20th) of adipose tissue derived MSC. The

results indicate that human adipose tissue and deciduous dental pulp derived stem cells posses

many similarities regarding their characteristics but they are not equal and both cultures can

be expanded for at least ten passages without signs of chromosomal abnormalities. Although

many advances have been made in this field, connection between the experimental

information generated and the suitable clinical application remains a challenge for future

research.

Keywords

Adipose tissue • deciduous dental pulp • amniotic epithelium • mesenchymal stem cells • in

vitro expansion • cytogenetic stability •

8

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Plasticidade de acordo com o grau de especialização celular. 18

Figura 2 Método de obtenção de CTM de diferentes fontes pela seleção de

células aderentes.

23

Figura 3 Isolamento de células-tronco mononucleares humanas pela técnica

de Boyum utilizando sucessivas centrifugações.

25

Figura 4 Esquema de diferenciação de CTM em linhagem osteogênica,

adipogência e condrogênica quando expostas aos diferentes meios

indutores de diferenciação.

28

Figura 5 Delineamento experimental do processo de extração, análise e

diferenciação osteogênica e adipogênica das CTM.

30

Figura 6 Isolamento de CTM da membrana placentária. 31

Figura 7 Isolamento de CTM do tecido adiposo. 32

Figura 8 Isolamento de CTM da polpa de dente decíduo. 33

Figura 9 Cultura de CTM aderentes provenientes do tecido adiposo. 40

Figura 10 Cultura de CTM aderentes provenientes da polpa de dente decíduo. 40

Figura 11 Cultura de CTM aderentes provenientes do epitélio amniótico. 40

Figura 12 Micrografias de culturas de CTM 41

Figura 13 Análise de CTM do epitélio amniótico na 10 a passagem de cultura

in vitro.

42

Figura 14 Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas do tecido adiposo

na 4° passagem.

44

Figura 15 Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas do tecido adiposo

na 10° passagem.

45

Figura 16 Comparação do percentual de expressão de antígenos de superfície

característicos de CTM.

46

Figura 17 Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas da polpa de dente

decíduo na 4° passagem.

47

Figura 18 Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas da polpa de dente

decíduo na 10° passagem.

48

Figura 19 Comparação do percentual de expressão de antígenos de superfície

característicos de CTM.

49

9

Figura 20 RT-PCR de culturas de CTM provenientes do tecido adiposo e polpa

de dente decíduo.

49

Figura 21 Diferenciação adipogênica de CTM derivadas do tecido adiposo. 51

Figura 22 Diferenciação osteogênica de CTM derivadas do tecido adiposo. 51

Figura 23 Diferenciação osteogênica de CTM derivadas da polpa de dente

decíduo.

51

Figura 24 Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo

in vitro na 2a passagem.

53

Figura 25 Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo

in vitro na 10a passagem.

53

Figura 26 Cariótipo de cromossomo pela técnica de bandeamento G de CTM

derivada do tecido adiposo.

54

Figura 27 Cariótipo de cromossomo pela técnica de bandeamento G de CTM

derivada da polpa de dente decíduo.

54

Figura 28 Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo

in vitro na 20a passagem.

55

Figura 29 Características das culturas de CTM derivada de epitélio amniótico,

tecido adiposo e polpa do dente decíduo.

10

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Anticorpos e seus fornecedores utilizados na citometria de fluxo. 35

Tabela 2 Condições empregadas na reação de PCR. 37

Tabela 3 Análise por citometria de fluxo de CTM do epitélio amniótico na

10° passagem de cultura in vitro.

43

11

LISTA DE ABREVIATURAS

CTE Célula-tronco embrionária

CTM Célula-tronco mesenquimal

MO Medula óssea

CTDA Célula-tronco derivada do tecido adiposo

LIF Leukemia inhibitory factor

TGF-β Transforming growth factor-β

IBMX Isobutil metil xantina

CD Grupo de diferenciação

PCR Reação da cadeia em polimerase

HBSS Hank´s balanced salt solution

SBF Soro bovino fetal

MEM Minimum essential medium

12

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 14

2 OBJETIVOS 17

3 REVISÃO DA LITERATURA 18

3.1 CÉLULAS TRONCO 18

3.1.1 Células-tronco adultas

19

3.2 CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS 20

3.2.1 Obtenção 23

3.2.2 Caracterização 25

3.2.3 Marcadores de superfície 26

3.2.4 Expressão de fatores de transcrição 27

3.2.5 Potencial de diferenciação 27

4 MATERIAL E MÉTODOS 30

4.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 30

4.2 ISOLAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS 31

4.2.1 Epitélio amniótico 31

4.2.2 Tecido adiposo 32

4.2.3 Polpa de dente decíduo. 33

4.3 SELEÇÃO E EXPANSÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS

34

4.4 CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS 35

4.4.1 Coloração por Giemsa 35

4.4.2 Citometria de fluxo 35

4.4.3 Análise da expressão do Oct-4 por RT-PCR semi-quantitativo.

37

4.4.4 Diferenciação osteogênica 38

13

4.4.5 Diferenciação adipogênica 39

4.5 ESTABILIDADE CITOGENÉTICA 39

5 RESULTADOS 40

5.1

ANÁLISE QUALITATIVA DAS CTM DERIVADAS DO EPITÉLIO AMNIÓTICO, TECIDO ADIPOSO E POLPA DE DENTE DECÍDUO.

40

5.2 SELEÇÃO DE CTM ADERENTES 40

5.3 MORFOLOGIA DE CTM DERIVADA DO TECIDO ADIPOSO E POLPA DE DENTE DECÍDUO.

42

5.4 MARCADORES DE SUPERFÍCIE – CITOMETRIA DE FLUXO 43

5.5 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA 50

5.6 DIFERENCIAÇÃO INDUZIDA 51

5.7 ESTABILIDADE CITOGENÉTICA 53

6 DISCUSSÃO 57

7 CONCLUSÕES 62

8 REFERÊNCIAS 63

9 ANEXOS 70

9.1 ARTIGO 1 - EARLY TOXICITY SCREENING AND SELECTION OF LEAD COMPOUNDS FOR PARASITIC DISEASES.

71

9.2 ARTIGO 2 - CURRENT STATUS OF STEM CELL THERAPY FOR LIVER DISEASES

80

14

1 INTRODUÇÃO ______________________________________________________________________

As células-tronco podem ser classificadas em duas grandes categorias, de acordo com

seu estágio de desenvolvimento: embrionárias e não embrionárias, ou adultas. As células-

tronco embrionárias (CTE) são isoladas da massa celular interna do embrião no estágio de

blastocisto (MARTIN, 1981; NAGY et al., 1990). As células-tronco adultas estão presentes

no organismo após o nascimento. Dentre os principais tipos de células-tronco adultas

identificadas temos as células-tronco mesenquimais (CTM), que atuam no reparo e

homeostase em vários tecidos do corpo. São células precursoras capazes de se diferenciar em

vários tipos celulares diferentes, mas não em todas as células do organismo (DAN et al.,

2008). Atualmente, as células-tronco têm sido objeto de crescente estudo pela suas potenciais

aplicações na área biomédica.

Na literatura existem relatos da segurança clínica da utilização de terapia com células-

tronco, como, por exemplo, a transfusão autóloga de células mononucleares da medula óssea

na artéria hepática em pacientes com doenças crônicas do fígado (LYRA et al., 2007), nas

coronárias em pacientes com cardiopatia chagásica crônica (VILAS-BOAS et al 2006) assim

como em pacientes com infarto crônico do miocárdio (YAO et al 2008) e na via intramuscular

e intra-arterial de membros inferiores isquêmicos de pacientes diabéticos (GU et al 2008),

dentre outros. O fato das células serem autólogas, eliminando assim o risco de rejeição

imune, e representarem uma fonte acessível e isenta de complicações éticas também contribui

para o crescente interesse da comunidade científica em terapia celular. Casos de sucessos de

transplantes alogênicos, como na estimulação do crescimento em crianças com osteogenesis

imperfecta (HORWITZ et al., 2002) pelo tratamento com CTM isoladas da medula óssea e

expandidas in vitro, reforçam o cenário de um futuro promissor para a terapia celular.

A identificação de novas fontes de CTM é imprescindível para o sucesso da terapia

celular. As células devem possuir boa capacidade proliferativa, manutenção das

características imunofenotípicas quando cultivadas in vitro e estabilidade citogenética.

O futuro aponta para a existência de uma fonte preferencial para uma dada terapia,

estabelecendo assim uma correlação entre marcadores imunofenotípicos e reparação tecidual.

Estudos recentes sinalizam o potencial de CTM proveniente da polpa dentária na regeneração

óssea pela sua expressão de marcadores ósseos (GRONTHOS et al., 2002) e habilidade em

regenerar o complexo de polpa da dentina composto de matriz mineralizada (GRONTHOS et

al., 2000).

15

A medula óssea (MO) é a principal fonte de CTM utilizadas até o momento. Porém, o

procedimento de obtenção dessas células é invasivo, e o número e o potencial de

diferenciação e proliferação diminuem com a idade (STENDERUP et al., 2003).

O método padrão de isolamento de CTM baseia-se na sua capacidade de aderência ao

plástico (FRIEDENSTEIN et al., 1970). Relatos na literatura demonstram o isolamento de

CTM provenientes de outras fontes facilmente accessíveis, tais como a membrana placentária

(MIKI et al., 2005), tecido adiposo (ZUK et al., 2001) e polpa dentária (GRONTHOS et al.,

2002).

O potencial proliferativo de uma célula é inversamente proporcional ao nível de

especialização da mesma (DAN et al., 2008). Espera-se, portanto, que células com fenótipo

indiferenciado possuam alta capacidade de expansão. A estabilidade cromossômica em

culturas de CTM após sucessivas passagens também deve ser avaliada, uma vez que, in vivo,

mudanças cromossômicas geralmente resultam em carcinogênese (CATALINA et al., 2007).

As CTM devem possuir capacidade de diferenciação nas linhagens osteogênica,

adipogênica e condrogênica, de acordo com critérios propostos pelo Comitê de Célula Tronco

Tecidual e Mesenquimal da Sociedade Internacional para Terapia Celular (DOMINICI et al.,

2006).

A caracterização das CTM através da análise da expressão de antígenos de superfície

por citometria de fluxo, foi proposta pelo Comitê de Célula Tronco Tecidual e Mesenquimal

da Sociedade Internacional para Terapia Celular (DOMINICI et al., 2006). Esse comitê

estabeleceu critérios para caracterizar CTM humana baseado nos estudos com CTM

proveniente de medula óssea. Até o momento não foi identificado nenhum marcador

específico para as CTM e na literatura encontram-se proposições para isolar uma população

pura de CTM de um tecido (PITTENGER et al., 1999; ALSALAMEH et al., 2004), mas,

ainda não existe um consenso. Já foi demonstrado que a expressão de antígenos pode mudar

com o cultivo in vitro (FIBBE, 2003) e que pode haver variação na expressão de acordo com

o tipo de tecido em que foi extraída a célula (GRONTHOS et al., 2001).

A presença de reguladores centrais, como Oct-4, Nanog e Sox-2 responsáveis pela

manutenção do estado pluripotente e de autorenovação de CTE humanas (NIWA et al 2000)

também pode ser investigada nas culturas de CTM. Já foi demonstrado na literatura a

expressão dos marcadores de células-tronco embrionárias em CTM proveniente da polpa

dentária (KERKIS et al., 2006) e da membrana placentária (MIKI et al., 2005).

Portanto, nesse estudo investigamos as características das CTM provenientes de três

fontes: membrana placentária, tecido adiposo e polpa de dente decíduo. Foram avaliados a

16

expressão gênica e de marcadores de superfície, o potencial proliferativo e de diferenciação e

a manutenção da estabilidade citogenética quando expandidas in vitro.

17

2 OBJETIVOS

_____________________________________________________________________

GERAL

Caracterizar comparativamente fontes de células-tronco mesenquimais para utilização em

terapia celular.

ESPECÍFICOS

• Extrair células-tronco do epitélio amniótico, da polpa do dente decíduo e do tecido

adiposo humanos;

• Caracterizar fenotipicamente as células-tronco adultas provenientes desses tecidos, de

acordo com sua morfologia e expressão de antígenos característicos;

• Identificar a expressão de fatores de transcrição responsáveis pela manutenção do

estado indiferenciado das células;

• Investigar o potencial de diferenciação destas células nas linhagens osteogênicas e

adipogênicas.

• Analisar a manutenção numérica e estrutural do cariótipo normal das células após

sucessivas passagens.

18

3 REVISÃO DA LITERATURA

______________________________________________________________________

3.1. CÉLULAS-TRONCO

As células-tronco têm sido objeto de interesse científico crescente pela sua utilidade

em inúmeras aplicações biomédicas. São definidas por duas características essenciais: 1º - são

capazes de gerar cópias idênticas de si mesmas, se autorenovando; 2º - originam diferentes

tipos celulares mais especializados do corpo humano, tais como cardiomiócitos, hepatócitos,

ilhotas pancreáticas e células nervosas (GROVE et al., 2004).

Diferenciação é o processo através do qual uma célula adquire nova morfologia e

característica funcional (THEISE & KRAUSE, 2002). A diferenciação in vivo leva ao

estabelecimento de linhagens celulares somáticas da camada precursora germinativa durante o

desenvolvimento dos mamíferos. De qualquer modo, o processo é também prevalente no

reparo e manutenção de tecidos durante a vida pós-natal e adulta, assim como na

diferenciação de células-tronco da medula óssea em células sanguíneas eritróides e mielóides

funcionais (GROVE et al, 2004).

As células-tronco podem ser classificadas em duas grandes categorias, de acordo com

seu estágio de desenvolvimento: embrionárias e não embrionárias, ou adultas. As células-

tronco embrionárias (CTE) são isoladas da massa celular interna do embrião no estágio de

blastocisto (MARTIN, 1981; NAGY et al., 1990). São células capazes de originar todos os

tecidos do organismo, incluindo o tecido extraembrionário durante o desenvolvimento.

Thomson e colaboradores (1998) isolaram células-tronco embrionárias humanas pela primeira

vez, e posteriormente foi demonstrado que estas células possuem a mesma plasticidade

encontrada nas células-tronco embrionárias de camundongos, ou seja, a habilidade de se

diferenciar em vários tipos de células somáticas com características funcionais, tais como

neurônios, hepatócitos e cardiomiócitos (MULLER et al.,2002; XU et al., 2002).

As células-tronco podem, ainda, ser classificadas quanto ao seu potencial de

diferenciação e plasticidade, ou seja, o potencial de formação de diferentes tipos de células

maduras (figura 1). Por exemplo, uma célula multipotente possui a capacidade de se

diferenciar em múltiplos tipos celulares não restritos a uma única camada germinativa. Tem

sido demonstrada a diferenciação de células-tronco residentes de um determinado tecido em

células características de outro tecido (SNYKERS et al., 2007; TALÉNS-VISCONTI et al.,

2006). Uma célula é dita pluripotente quando se diferencia em todos os tipos celulares

19

encontrados no organismo. Uma célula totipotente pode dar origem a um organismo inteiro,

incluindo membranas extra-embrionárias e placenta. As CTE são classificadas como

pluripotentes (SOLTER, 2006), pois mesmo sendo possível obter um embrião e camundongos

adultos das CTE, estas não podem derivar as membranas extra-embrionárias e placenta

(NAGY et al, 1993). Essa classificação está em constante mudança com os avanços das

pesquisas na área. Outros autores já classificam as CTE como totipotentes (DAN et al.2008).

Figura 1. Plasticidade de acordo com o grau de especialização celular.

3.1.1 Células-tronco adultas

A célula-tronco adulta é uma célula indiferenciada encontrada em um tecido

diferenciado do organismo. Elas são responsáveis pela auto-renovação e homeostase do seu

tecido de origem ao longo da vida (MINGUELL et al., 2001).

As células-tronco adultas mais estudadas são as células-tronco da medula óssea. A

medula óssea humana, derivada do mesoderma embrionário, é um tecido complexo formado

por uma população de células-tronco hematopoiéticas, tendo como suporte o estroma

mesenquimal. O estroma da medula óssea possui uma composição heterogênea, sendo

reservatório de várias populações de células-tronco, entre elas as CTM e as células-tronco

progenitoras multipotentes adultas (JIANG et al., 2002). A medula óssea foi a primeira fonte

de CTM relatada na literatura. Hoje existem referências de propagação de CTM a partir de

PLASTICIDADE

PLASTICIDADE DE ACORDO COM O GRAU DE ESPECIALIZAÇÃO CELULAR

20

inúmeros tecidos e órgãos, tais como o cérebro (CLARKE et al., 2000), o fígado (YANG et

al., 2002), a pele (TOMA et al., 2001), o tecido adiposo (ZUK et al., 2001), o músculo

esquelético (JACKSON et al., 1999), e o sangue (ZHAO et al., 2003). Jiang e colaboradores

(2002) descreveram que as CTM mantêm sua morfologia, o comprimento de telômero (27

kb), e a habilidade de se diferenciar mesmo depois de 60 divisões celulares. Já foi

demonstrada in vitro a diferenciação dessas células em uma enorme variedade de tipos

celulares, tais como osteoblastos, adipócitos, condrócitos, células endoteliais, miócitos

esqueléticos, glia, neurônios e cardiomiócitos (ALVAREZ-DOLADO et al., 2003).

3.2. CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS

As células-tronco mesenquimais (CTM) são células especializadas que atuam no

reparo e homeostase de vários tecidos do corpo. São células precursoras, capazes de se

diferenciar em vários tipos celulares diferentes, mas não em todas as células do organismo. As

CTM podem ser extraídas de diversos órgãos, expandidas em cultura como uma população

aderente de células com formato fusiforme semelhante ao de fibroblastos, e induzidas a se

diferenciar em múltiplos tipos celulares (BAKSH et al. 2004; DOCHEVA et al., 2007).

A utilização das CTM na medicina regenerativa para indução de reparo tecidual tem

sido objeto de estudo em diversos grupos de pesquisa no mundo. Uma série de trabalhos

experimentais envolvendo o uso terapêutico destas células tem demonstrado sua eficiência,

por exemplo, em doenças cardíacas (DAI et al., 2005), hepáticas (KUO et al., 2008)

neurológicas (CHOPP & LI, 2002) e renais (MORIGI et al. 2008). Esse procedimento tem

sido promissor também na esfera clínica, onde se observa um crescimento exponencial de

trabalhos publicados nos últimos anos (HORWITZ et al., 2002; KHARAZIHA et al., 2009).

Em conjunto, os estudos experimentais e clínicos parecem indicar um efeito protetor das

CTM decorrente de fatores por elas secretados. Existem algumas barreiras técnicas

importantes a serem superadas na implantação desta terapia, tais como o alto custo de

expansão das células, presença reduzida nos tecidos e dificuldades na caracterização das

mesmas. No entanto, espera-se que a terapia celular com CTM seja uma opção terapêutica em

um médio a longo prazo.

A geração de linhagens celulares humanas para teste de drogas é outro campo onde se

espera grande emprego das CTM (DAVILA et al, 2004). O estabelecimento de testes

toxicológicos in vitro com células humanas especializadas, ao invés de células animais, pode

21

representar um enorme avanço na predição de efeitos colaterais em humanos. Por exemplo,

hepatócitos e cardiomiócitos provenientes de células-tronco in vitro podem ser utilizados

rotineiramente para excluir novas entidades químicas que estejam no processo de screening

baseado na hepatotoxicidade e cardiotoxicidade observada, duas maiores causas de falha do

desenvolvimento pré-clínico de novas drogas terapêuticas. Portanto, uma triagem in vitro

baseada em células hepáticas humanas, visando à identificação de hepatotoxicidade nos

estágios iniciais de desenvolvimento de um medicamento, pode representar uma economia de

tempo e recursos (NOGUEIRA et al., 2009). A diferenciação de CTM em hepatócitos tem

sido largamente investigada (SNYKERS et al 2009) tendo sido objeto de inúmeras revisões,

inclusive pelo nosso grupo (SOUZA et al 2009 aguardando impressão), e já se observam

depósitos de patentes de testes in vitro utilizando estas células (PCT/EP2004/012134).

O método tradicional de obtenção de células a partir da medula óssea por punção da

crista ilíaca é invasivo e sabe-se que o número de células obtidas por procedimento é

influenciado pela idade do paciente (STENDERUP et al., 2003).

Assim como a medula óssea, o tecido adiposo é um órgão derivado do mesoderma e

contém uma população estromal de células endoteliais microvasculares, células do músculo

liso e células-tronco (ZUK et al., 2001). Essas células podem ser dissociadas enzimaticamente

do tecido adiposo (comumente obtido por lipoaspiração) e separada dos adipócitos por

centrifugação. Uma população celular é obtida quando submetida a condições de crescimento

seletivas para CTM. Essa população chamada célula-tronco derivada de tecido adiposo

(CTDA), possui muitas características em comum com as células derivadas da medula óssea,

tais como um extenso potencial proliferativo e capacidade de diferenciação em tipos celulares

característicos de outros tecidos (DE UGARTE et al., 2003).

A descoberta das CTDA pode ser de grande importância para a terapia celular.

Enquanto a idade do paciente limita a quantidade de medula que pode ser obtida e aumenta o

tempo em cultura necessário para se atingir a dose celular terapêutica, a obtenção de CTM

derivadas do tecido adiposo representa uma fonte alternativa de células que podem ser obtidas

em grande quantidade com anestesia local e desconforto mínimo (STREM et al., 2005).

Dentre as fontes de células-tronco mesenquimais está o epitélio amniótico placentário.

A placenta contém três camadas, o âmnion, o córion e a decídua. Cada camada é derivada de

várias fontes diferentes. Apesar de a decídua ser de derivação materna, o âmnion e o córion se

derivam do embrião. Enquanto o córion é derivado do trofoblasto, o âmnion é derivado do

epiblasto oito dias após a fertilização. Portanto, o epiblasto origina o âmnion, assim como

todas as camadas germinativas do embrião. A gastrulação ocorre aproximadamente três

22

semanas após a fertilização, quase duas semanas após a formação de células epiteliais a partir

do epiblasto (DIWAN et al., 1976). Portanto, foi especulado que o âmnion retém a

propriedade pluripotente de células epiblásticas jovens (MIKI et al., 2005).

Estudos recentes demonstraram que a placenta, o sangue do cordão umbilical e o

líquido amniótico contêm células-tronco multipotentes (IN´T ANKER et al., 2004;

ROMANOV et al., 2003). Em 2005, Miki e colaboradores demostraram que as células

epiteliais isoladas da placenta humana expressam marcadores de superfície normalmente

presentes em células-tronco embrionárias e germinativas, e que as células epiteliais

amnióticas expressam Oct-4 e Nanog, que são fatores de transcrição característicos de células-

tronco pluripotentes. Além disso, esses autores demonstraram que, em certas condições de

cultura, as células epiteliais amnióticas formam estruturas esferóides que retêm as

características de células-tronco, que as células amnióticas são não tumorigênicas após

transplante, e que estas têm o potencial de se diferenciar in vitro em tipos celulares

encontrados nos três folhetos germinativos – endoderma (fígado e pâncreas), mesoderma

(cardiomiócito), e ectoderma (células neuronais). Estes achados confirmam que o epitélio

amniótico derivado da placenta após o parto pode ser uma fonte útil e não controversa de

células-tronco para transplante celular e utilização na medicina regenerativa (MIKI et al.,

2005).

Outra fonte promissora de células-tronco é a polpa dentária, que é derivada de

componentes ectodérmicos e mesenquimais que contêm células da crista neural com

capacidade plástica e multipotente (KERKIS et al., 2006). Ela é dividida em quatro camadas,

da mais externa para a interna: a primeira, composta de odontoblasto produzindo dentina; a

segunda camada, pobre em células e rica em matriz extracelular; a terceira camada, que

contém células progenitoras com plasticidade e pluripotencialidade; e a camada mais interna,

que compreende a área vascular e o plexo nervoso (D`AQUINO et al., 2008) . Recentemente

foi descoberto que a polpa de dentes decíduos (dentes de leite) é uma rica fonte de CTM. O

seu acesso fácil e o fato de não serem órgãos vitais provêm um atrativo para utilização destas

células na terapia celular. A coleta de células dos dentes decíduos tem ainda a vantagem de

utilizar um tecido que normalmente seria descartado. As suas limitações são a possibilidade

de contaminação na coleta e a quantidade de células disponível para terapia. Foi demonstrado

que CTM da polpa dentária possuem capacidade de auto-renovação e diferenciação em

adipócitos (GRONTHOS et al., 2002).

A instabilidade genética e cromossômica representa uma preocupação em se tratando

de futuras aplicações terapêuticas baseadas em linhagens de células-tronco. Essa instabilidade

23

cromossômica pode ser a causa da propriedade tumorigênica observada em linhagens de

células embrionárias (MITALIPOVA et al., 2005). Para o emprego de células-tronco

mesenquimais como terapia celular pode ser necessário o cultivo in vitro extenso, aumentando

assim a probabilidade de transformação e instabilidade genética. A estabilidade cromossômica

em linhagens celulares consiste na manutenção numérica e estrutural do cariótipo normal após

sucessivas passagens. A identificação de anormalidades cromossômicas em células-tronco

com potencial emprego terapêutico é preocupante, uma vez que, in vivo, essas mudanças

cromossômicas geralmente resultam em carcinogênese (CATALINA et al., 2007). Portanto,

as células devem ser avaliadas por meio de técnicas citogenéticas para que os métodos de

cultivo e propagação sejam otimizados para cada linhagem celular, de modo a eliminar a

possibilidade de utilização de células portadoras de alterações cromossômicas.

3.2.1. Obtenção

Friedenstein e cols. (1970) desenvolveram um método de isolamento de CTM de

medula óssea baseado na sua capacidade de aderência ao plástico, que é utilizado até hoje

como o método padrão de isolamento destas células. O procedimento de isolamento das CTM

de outros tecidos é muito semelhante e envolve pelo menos duas etapas: isolamento das

células; e aderência em plástico, variando apenas na fase inicial, a depender da origem das

células (figura 2).

Para a obtenção de CTM a partir de fragmentos teciduais realiza-se geralmente o

tratamento com colagenase, que permitirá o desprendimento celular. Após esse processo,

realiza-se a etapa de aderência ao plástico. Utilizando abordagens semelhantes, com

adaptações, encontramos inúmeros exemplos de protocolos de extração de células a partir de

diversos fragmentos teciduais na literatura (TOMA et al., 2001; ZUK et al., 2001; IN´T

ANKER et al., 2004; MIKI et al., 2005).

24

Figura 2. Método de obtenção de CTM de diferentes fontes pela seleção de células aderentes.

Quando as CTMs são purificadas do tecido hematopoético, seja ele aspirado da

medula óssea, sangue de cordão umbilical ou periférico, é realizada a separação da fração de

células mononucleares baseada na técnica originalmente descrita por Boyum (1968), que

emprega centrifugação em gradiente de Ficoll-Hypaque (figura 3). Após esse processo,

realiza-se a etapa de aderência em plástico. Encontram-se na literatura diversos artigos que

utilizam variações dessa técnica (ZHAO et al., 2003; ROMANOV et al., 2003; STENDERUP

et al., 2003; JACKSON et al., 1999).

25

ISOLAMENTO DE CÉLULAS TRONCO MONONUCLEARES HUMANAS

•Sangue periférico

•Sangue de cordão umbilical

•Medula óssea

PBS + Sangue

Ficoll -Hypaque

Células mononucleares

Lavagem com PBS

Sedimentadas após centrifugação

Figura 3. Isolamento de células-tronco mononucleares humanas pela técnica de Boyum utilizando

sucessivas centrifugações.

3.2.2. Caracterização

As CTM constituem uma população heterogênea de células, em termos de morfologia,

fisiologia e expressão de antígenos de superfície (BAKSH et al. 2004). Enquanto as CTM

provenientes da medula óssea já foram amplamente descritas fenotipicamente, a

caracterização fenotípica de CTM provenientes do tecido adiposo, polpa dentária, membrana

placentária e outras fontes ainda não foi estabelecida (BOBIS et al., 2006).

O Comitê de Célula Tronco Tecidual e Mesenquimal da Sociedade Internacional para

Terapia Celular (Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society

for Cellular Therapy) propôs recentemente quatro critérios para caracterizar CTM humanas

(DOMINICI et al., 2006), sendo eles:

1- devem ser aderentes ao plástico quando mantidas em condições padrão de cultura.

2- devem possuir capacidade de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica.

3- devem expressar CD73, CD90 e CD105.

4- não devem expressar marcadores de linhagem hematopoiéticas; c-kit, CD14, CD11b,

CD34, CD45, CD19, CD79 alfa, e antígeno leucocitário humano (HLA)-DR

26

3.2.3. Marcadores de superfície

Até o momento não foi identificado nenhum marcador específico para as CTM, que

expressam um grande número de moléculas de adesão, proteínas de matriz extracelular,

citocinas e receptores de fatores de crescimento, associados à sua função e interações

celulares no estroma da medula óssea (DEVINE et al., 2000). A população de CTM isolada

da medula óssea expressa: CD44, CD105 (SH2; endoglina), CD106 (molécula de adesão

celular vascular; VCAM-1), CD166, CD29, CD73 (SH3 e SH4), CD90 (Thy), CD117, STRO-

1 e Sca-1 (BADDOO et al., 2003). Paralelamente, as CTM não possuem marcadores típicos

de linhagens celulares hematopoiéticas e endoteliais, tais como CD11b, CD14, CD31, CD33,

CD34, CD133 e CD45 (PITTENGER et al., 1999). De acordo com Baddoo e cols. (2003), a

ausência de antígenos CD14, CD34 e CD45 na sua superfície as distingue de precursores

hematopoiéticos.

Diversos estudos foram realizados com o objetivo de identificar um número restrito de

antígenos para isolar uma população pura de CTM de um tecido. Com os dados disponíveis

até o momento, algumas opções foram propostas nesse contexto. Uma delas sugere que a co-

expressão de CD105 e CD73 seria suficiente para a sua caracterização (PITTENGER et al.,

1999). A outra infere que a análise da expressão de CD166 e CD105 torna possível a

separação de precursores de CTM das células mais maduras (ALSALAMEH et al., 2004).

Para a caracterização fenotípica das CTM, deve-se empregar um conjunto de

anticorpos monoclonais que permitirão a avaliação quantitativa e qualitativa da expressão dos

antígenos por citometria de fluxo, caracterizando um perfil imunofenotípico das células

(DOMINICI et al., 2006).

É importante observar que o perfil de expressão gênica e de marcadores de superfície

se aplica às células expandidas in vitro. Todas as tentativas de se estabelecer tanto uma

definição fenotípica exata das CTM quanto uma diferenciação entre as mesmas e os

fibroblastos não obtiveram êxito até o momento. De qualquer forma, a presença de alguns

antígenos pode mudar in vitro devido a condições de cultura específicas e a duração das

passagens. É interessante que alguns antígenos podem ser encontrados em CTM recém-

isoladas, mas sua expressão desaparece quando estas são mantidas em cultura. Esse fenômeno

foi observado no caso do antígeno CD34. Essa molécula foi expressa em CTM obtidas de

pulmão fetal de camundongos, mas não foi encontrada em culturas in vitro de CTM (FIBBE,

2003). Apesar do CD34 ser um marcador utilizado na identificação de células-tronco

hematopoiéticas, a sua expressão em CTDA já foi demonstrada (GRONTHOS et al., 2001).

27

3.2.4. Expressão de fatores de transcrição

Oct-4, Nanog e Sox-2 são reguladores centrais responsáveis pela manutenção do

estado de pluripotencialidade e de auto-renovação de CTE humanas e de camundongos

(RODDA et al., 2005). A proteína Oct-4 (Octamer-binding transcription factor 4) é um fator

de transcrição presente na massa interna do blastocisto e epiplasto. De acordo com o nível de

Oct-4, a célula permanece em estado indiferenciado ou se diferencia em outro tecido. A perda

da expressão dessa proteína indica que a célula entrou no processo de diferenciação (NIWA et

al 2000; LEE et al., 2006). A superexpressão de Nanog permite que as CTE de camundongo

se mantenham pluripotentes sem a necessidade de suplementação do meio de cultivo através

da adição do fator inibidor de leucemia (leukemia inhibitory factor, LIF) (MITSUI et al.,

2003). O Sox-2 é um fator de transcrição regulatório expresso durante o desenvolvimento

primário em vários tecidos, sendo expresso também nas CTE (AVILION et al., 2003). Há

evidências de que estes fatores trabalham de forma coordenada na regulação da expressão de

vários genes (BOYER et al., 2005).

Vários estudos da literatura relatam a expressão de fatores de transcrição relacionados

à pluripotência em CTM, dentre eles o Rex-1, o FGF-4, o Nanog, o Oct-4 e o SOX-2 (ZHU et

al., 2008; KERMANI et al., 2008; SHOCKLEY et al., 2007). Observou-se, em CTM

proveniente da polpa dentária, a expressão dos marcadores de células-tronco embrionárias

Oct-4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81 por mais de 25 passagens (KERKIS

et al., 2006). Em CTM provenientes da membrana placentária, foi relatada a expressão de

Oct-4 e Nanog (MIKI et al., 2005). Porém, até o momento não foi definido um conjunto de

fatores de transcrição característicos das CTM e não se sabe se essa expressão está

relacionada à fonte de obtenção das CTM, ao tempo e a condições de cultivo das células.

3.2.5. Potencial de diferenciação celular

Além da capacidade de auto-renovação, crescimento por aderência em plástico e

conjunto de marcadores de superfície, outro critério de caracterização das CTM é sua

capacidade de diferenciação nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro

(DOMINICI et al., 2006).

Pittenger e colaboradores (1999) demonstraram que aproximadamente um terço das

CTM se diferencia com sucesso nas linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica

(figura 4). A diferenciação in vitro em uma determinada linhagem celular requer o tratamento

28

das células com uma mistura específica de fatores de diferenciação. O meio basal, a densidade

celular, a organização espacial, fatores de crescimento e citocinas são fundamentais no

sucesso da diferenciação, devendo ser adaptados ao longo do experimento (MANNELLO et

al., 2007).

Quando as CTM provenientes da medula óssea são plaqueadas em uma densidade

baixa, ocorrem a proliferação e a secreção de Dkk1 (Dickkopf homolog 1) uma proteína

secretada que possui duas regiões ricas em cisteína, favorecendo o fenótipo indiferenciado das

células. Ao contrário, quando as células atingem confluência, a expressão de Wnt-5a, da via

de sinalização Wnt envolvida na embriogênese e em processos fisiológicos, que suprimem o

efeito da Dkk1 (GREGORY et al., 2003; LIE et al., 2005)

Para a obtenção da linhagem celular osteoblástica, uma camada confluente de CTM

deve ser incubada com uma mistura contendo β– glicerofosfato, ácido ascórbico e

dexametasona por um período de 2-3 semanas (DENNIS et al., 2000). A diferenciação na

linhagem osteogênica é medida pela atividade da fosfatase alcalina e pelo acúmulo de cálcio

(PITTENGER et al., 1999).

A diferenciação condrogênica é classicamente realizada em culturas de pellets de

CTM após a adição de Transforming Growth Factor-β (TGF- β) (DENNIS et al., 2000). O

TGF-β e outras citocinas indutoras ativam vias de sinalização intracelular que direcionam à

condrogênese, em sua maioria via ativação das quinases ativadas por mitógenos (mitogen-

activated protein - MAP kinases), tais como ERK-1, p38, PKC e Jun (SEKIYA et al., 2002).

A diferenciação condrogênica pode ser visualizada através de testes histológicos que detectam

a presença de proteoglicanos na matriz extracelular e cadeias de colágeno tipo II, típico de

cartilagem articular (PITTENGER et al., 1999).

A adipogênese in vitro pode ser induzida pelo tratamento de CTM com coquetel

contendo dexametasona, isobutil metil xantina (IBMX) e indometacina (DENNIS et al.,

2000). A diferenciação pode ser confirmada pela técnica de coloração oil red e pela expressão

de proteínas específicas, como receptor ativado de proliferação peroxisoma γ 2 (PPARγ2),

lipoproteína lipase e proteína ligante de ácido graxo (PITTENGER et al., 1999).

29

CÉLULA TRONCO MESENQUIMAL: DIFERENCIAÇÃO

Adipogênese OsteogêneseCondrogênese

Dexametasona

Isobutilmetilxantina

Indometacina

β glicerofosfato

Ácido Ascórbico

DexametasonaTGF-β

Tecido adiposo Osso Cartilagem

Figura 4. Esquema de diferenciação de CTM em linhagem osteogênica, adipogência e condrogênica

quando expostas aos diferentes meios indutores de diferenciação.

30

4 MATERIAL E MÉTODOS ______________________________________________________________________ 4.1. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

As CTM humanas foram isoladas de fragmentos teciduais obtidos de epitélio

amniótico, tecido adiposo e polpa do dente decíduo. Após o processo de isolamento, foi

estabelecida uma cultura de CTM para cada fonte investigada, através da aderência das

células mesenquimais ao plástico. Cada cultura foi expandida in vitro e seguiu-se, então, a

etapa de caracterização das células obtidas (Figura 5).

A caracterização nos estágios iniciais da cultura e após a expansão in vitro consistiu

na:

• Visualização da morfologia pela coloração das células com o método de

Giemsa;

• Análise da expressão de um painel de grupos de diferenciação (CD) propostos

na literatura para caracterizar CTM, utilizando a técnica de citometria de fluxo;

• Investigação da manutenção da expressão do fator de transcrição Oct-4, um

dos responsáveis pela característica indiferenciada, utilizando a técnica de

reação em cadeia da polimerase (PCR);

• Indução da diferenciação em células das linhagens osteogênica e adipogênica,

após cultura em meio contendo misturas específicas de fatores de

diferenciação;

Ao longo das passagens, a estabilidade genética dos cromossomas metafásicos foi realizada

para banda GTG (Sanchez et al., 1973) e as imagens foram capturadas em um microscópio

BX60 e analisadas pelo programa ImagePro.

31

DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Epitélio amniótico Tecido adiposo Decídua dentária

1) ISOLAMENTO E EXPANSÃO DAS CÉLULAS

2) CARACTERIZAÇÃO

-Citometria de fluxo

-PCR

- Microscopia

-Diferenciação osteogênica

e adipogênica

3) ESTABILIDADE

CITOGENÉTICA

Figura 5. Delineamento experimental do processo de extração, análise e diferenciação osteogênica e adipogênica das CTM.

4.2. ISOLAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS. O processo de isolamento das células-tronco mesenquimais é adaptado de acordo com

a origem do tecido e será descrito em detalhes, a seguir.

4.2.1. Epitélio amniótico

Placentas humanas obtidas após o parto por cesariana foram acondicionadas em saco

estéril e encaminhadas ao laboratório. O procedimento de obtenção das CTM amnióticas está

ilustrado na figura 6. A camada amniótica foi mecanicamente destacada do córion e lavada

várias vezes com solução salina balanceada de Hank ( Hanks´ balanced salt solution - HBSS)

sem cálcio e magnésio, para a remoção do sangue até que não se observou nenhuma coloração

vermelha e a membrana estava levemente rosada. Para o isolamento das células, a membrana

amniótica foi fracionada em pequenos pedaços com tesouras e pinças cirúrgicas estéreis e os

fragmentos foram então incubados a 37°C em banho maria, em tubos de centrifugação de 50

ml contendo solução de 0,05% de tripsina contendo 0,53 mM de EDTA4Na por 10 minutos.

Após esse período, foi realizada uma centrifugação a 800 rpm durante 5 minutos, sendo o

sobrenadante coletado e descartado. A membrana foi novamente incubada durante 30 minutos

nas mesmas condições, sendo o conteúdo do tubo homogeneizado a cada 10 minutos e. após

centrifugação a 800 rpm durante 5 minutos, o sobrenadante foi coletado e transferido para um

32

outro tubo para obtenção das células. O pellet obtido após a centrifugação foi novamente

ressuspendido em solução de 0,05% de tripsina contendo 0,53 mM EDTA4Na, sendo

realizada uma nova incubação com coleta do sobrenadante, conforme descrito anteriormente.

O tubo que recebeu a solução sobrenadante foi centrifugado a 1500 rpm durante 10 minutos, o

pellet foi ressuspendido em 1 mL de meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino

fetal (SBF, Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e lavado duas vezes para retirada da tripsina. Foi

feita a contagem na câmara de Neubauer e avaliação da viabilidade celular com azul de

Trypan.

Figura 6. Isolamento de CTM da membrana placentária. A) Destacamento da camada amniótica, B) Lavagem com HBSS, C) Membrana amniótica livre de sangue, D) Incubação com tripsina contendo 0,53 mM EDTA4Na, E) Pellet obtido após centrifugação e F) Visualização das CTM ao microscópio.

4.2.2. Tecido adiposo

Após o procedimento cirúrgico de lipoaspiração para retirada de tecido adiposo nas

instalações hospitalares, o material (em torno de 60 mL) foi transferido para um tubo falcon

estéril e levado ao laboratório (figura 7). No laboratório, o tecido adiposo foi lavado em salina

duas vezes por meio de centrifugação a 1000 RPM durante 5 minutos. A cada lavagem, o

sobrenadante (tecido adiposo) foi coletado e transferido para dois tubos de 50 mL perfazendo

a quantidade de aproximadamente 25 mL de material por tubo. Após a lavagem, os tubos

A B C

D E F

33

foram incubados com liberase a 2 mg/mL por 45 minutos a 37°C em banho-maria, sendo o

conteúdo homogeneizado a cada 10 minutos. Os tubos foram então centrifugados a 1500

RPM por 10 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspendido em 30 mL de

soro glicosado, sendo realizada duas lavagens por centrifugação a 1500 RPM durante 10

minutos. Após a centrifugação a suspensão de células foi contada na câmara de Neubauer e

foi realizada a avaliação da viabilidade celular com azul de Trypan. O plaqueamento foi

realizado em meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF, Cultilab,

Campinas, SP, Brasil).

Figura 7. Isolamento de CTM do tecido adiposo. A) Lipoaspiração para retirada de tecido adiposo, B) Transferência do material para um tubo falcon estéril, C) Lavagem com salina estéril, D) Centrifugação após incubação com 2 mg/mL de liberase, E) Pellet obtido com a centrifugação e F) Ressuspensão do pellet.

4.2.3. Polpa do dente decíduo

A extração de CTM da polpa dentária foi realizada conforme ilustrado na figura 8. As

unidades marcadas na radiografia foram selecionadas para a exodontia e a cirurgia foi

realizada em duas etapas em um intervalo de 15 dias com um controle rigoroso da cadeia

asséptica. O tecido pulpar foi extraído do interior do dente com lâminas endodônticas em

fluxo laminar e acondicionado em garrafas de cultura, em meio DMEM com 10% de soro

fetal bovino e 50 μg/ml de gentamicina. Células aderentes podem ser visualizadas

inicialmente próximas ao fragmento de tecido pulpar, ocupando progressivamente a superfície

da garrafa de cultura. Após a confluência da população de células aderentes, a cultura foi

tripsinizada e uma parte das células foi separada para criopreservação.

A B C

D E F

34

Figura 8. Isolamento de CTM da polpa dentária. A) Unidades marcadas na radiografia foram selecionadas para a exodontia, B) Arcada dentária e C) Extração do tecido pulpar do interior do dente. 4.3. SELEÇÃO E EXPANSÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS

Imediatamente após o isolamento das células, realizamos a seleção que consiste na

etapa de aderência ao plástico. Conforme mencionado anteriormente (Figura 2), essa etapa é

comum para todas as fontes de CTM. Cada pellet obtido no processo anterior foi

ressuspendido em meio DMEM suplementado com 10% de SBF (Cultilab, Campinas, SP,

Brasil) e as células foram plaqueadas em garrafa de cultura. O meio de cada garrafa foi

trocado após 72 horas para remoção das células não aderentes. No início da cultura, as células

possuem um forma ovalada. Após 72 horas as células-tronco mesenquimais já se encontravam

aderidas e adquiriram um formato fusiforme, semelhante ao de fibroblastos e, após

aproximadamente nove a doze dias, as culturas de CTM derivada do tecido adiposo e polpa

do dente decíduo atingem a confluência. As culturas de CTM derivadas do epitélio amniótico

possuem crescimento mais lento. Ao longo das sucessivas passagens, as células-tronco

mesenquimais aderentes foram selecionadas, enquanto que as células suspensas no meio de

cultura foram sendo descartadas.

Para a expansão das células-tronco mesenquimais foi necessário o cultivo em frascos

plásticos de cultura celular. As células que haviam atingido confluência entre 80-90% foram

lavadas duas vezes com salina estéril para retirada do meio DMEM suplementado com 10%

de SBF (Cultilab, Campinas, SP, Brasil). Após a remoção da solução salina, foi adicionado

solução de tripsina a 0,25% (Invitrogen) para que as ligações das células à matriz extracelular

fossem desfeitas permitindo o desprendimento celular. A solução de tripsina foi espalhada por

todo o frasco e o mesmo incubado na estufa a 37°C durante 2-5 minutos, para permitir a ação

enzimática. Em seguida, foi observado ao microscópio o desprendimento celular. Quando a

totalidade das células encontrava-se em suspensão, a enzima era inativada pela adição de

meio DMEM suplementado com 10% de SBF (Cultilab, Campinas, SP, Brasil) ao frasco de

cultivo. O meio da garrafa contendo as células foi coletado utilizando uma pipeta, e foi

A B C

35

centrifugado a 1500 RPM por 10 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o pellet

ressuspendido em 1 mL de meio DMEM suplementado com 10% de SBF. As células obtidas

eram mantidas em expansão, para realização dos experimentos, ou criopreservadas.

Para a criopreservação foi respeitada a concentração máxima de 106-107 células por

tubo, sendo adicionados em cada um volume final de 1 mL, sendo 900 µL de meio DMEM

suplementado com 10% de SBF contendo as células e 100 µL de DMSO. Os tubos de

criopreservação foram então submetidos a abaixamento criostático até atingirem a

temperatura de -70°C por 24 h, e posteriormente estocados em nitrogênio líquido.

4.4. CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS 4.4.1. Coloração por Giemsa

Para a visualização da morfologia das células, CTM em cultura foram tripsinizadas e

ressuspensas em DMEM suplementado com 10% SBF. Lâminas de vidro contendo células

foram preparadas por citocentrifugação com 200 µL dessa suspensão e centrifugação a 5000

RPM, durante 5 minutos. As lamínulas foram secas e fixadas com metanol por 10 minutos a

4°C e coradas com 100 µL de solução de Giemsa (50 µL de corante em 1 mL de solução

salina) por 30 minutos. Após esse procedimento, as lâminas foram observadas ao microscópio

óptico.

4.4.2. Citometria de fluxo

As subpopulações celulares podem ser identificadas e caracterizadas por modelos de

maturação dos antígenos. As células da amostra são marcadas com anticorpos monoclonais

específicos para designar grupos de diferenciação celular (CD) ligados a fluorocromos, que

permitem a identificação e a quantificação das células pelo tamanho, granulosidade e

intensidade dos diversos fluorocromos.

36

Tabela 1. Anticorpos e seus fornecedores utilizados na citometria de fluxo. Anticorpo Fornecedor Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD90 humano FITC BD Pharmingen

Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD34 humano PE Becton Dickinson Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD54 humano PE-CY5 BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD45 humano APC BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti- CD105 humano FITC R&D Systems Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD166 humano PE BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD117 humano PE-CY5 BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD44 humano FITC BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD73 humano PE BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD31 humano FITC BD Pharmingen Anticorpo IgG1 de camundongo anti-CD133 humano PE MACS® Abreviações: FITC, isotiocianato de fluoresceína; PE, ficoeritrina; APC, aloficocianina; ; IgG, imunoglobulina G

As células com confluência abaixo de 100% foram tripsinizadas, conforme descrito

anteriormente. Imediatamente após o desprendimento, as células foram ressuspensas em meio

DMEM suplementado com 10% de SBF e permaneceram na estufa em repouso por 2 horas.

Após o período de repouso, as células foram lavadas com salina a 4°C or 2 vezes a 3000 rpm

por 2 minutos a 10oC e ressuspensas em 1mL de salina. Foram adicionados 200 μL da

solução em 5 tubos e em cada um deles recebeu 2 μL dos anticorpos segundo o seguinte

esquema de distribuição: tubo 1- controle, tubo 2- CD90 FITC/ CD34 PE/ CD54 PE-CY5/

CD45 APC, tubo 3- CD105 FITC/ CD166 PE/ CD117 PE-CY5/ CD45 APC, tubo 4 - CD44

FITC/ CD73 PE/ CD45 APC e tubo 5 CD31 FITC/CD133 PE/ CD45 APC. Os tubos foram

incubados a 4 oC ao abrigo da luz por 30 minutos.Os tubos foram então lavados por duas

vezes com salina a 4 oC (1 mL) por centrifugação a 2000 rpm, 10oC, durante 2 minutos. Após

esse procedimento, foi realizada a aquisição dos dados e as análises no citômetro de fluxo

FACScalibur (Becton Dickinson, San Diego, CA) utilizando o programa CellQuest. Pelo

menos 50.000 eventos foram coletados e analisados.

37

4.4.3. Análise qualitativa da expressão do Oct-4 por RT-PCR.

A extração de RNA foi realizada com o Rneasy® Mini Kit (Qiagen, EUA), com

pequenas modificações do protocolo recomendado pelo fabricante.

As células foram tripsinizadas e, após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado.

Ao tubo falcon contendo o pellet de células, foram adicionados 700 µl de tampão RLT e

homogeneizado por agitação em vórtex durante um minuto. Foram adicionados 700 µl de

etanol 70% preparado com água DEPC, e o conteúdo foi homogeneizado imediatamente com

uma pipeta. Foram adicionados 1.400 µl da amostra na minicoluna acoplada ao tubo coletor

de 2 mL presente no Kit e realizada uma centrifugação por 30 segundos a 10.000 RPM. O

conteúdo do tubo coletor foi descartado e foram adicionados 350 µl de tampão RW1 na

coluna e centrifugado por 30 segundos a 10.000 RPM sendo esse procedimento repetido duas

vezes. A coluna foi transferida para um novo tubo de 2 ml e 500 µl de tampão RPE foram

adicionados à coluna e o tampão no tubo com a coluna foram centrifugados por 30 segundos a

10.000 RPM, sendo o conteúdo do tubo coletor descartado após o processo. Quantidade

adicional de 500 µl de tampão RPE foi adicionado a coluna e centrifugado por 2 minutos a

10.000 RPM para secagem da membrana de gel-sílica. A coluna foi então removida para um

tubo de 1,5 mL e foram adicionados 40 µl de água livre de Rnases diretamente na membrana

gel-sílica, seguido de centrifugação por 5 minutos a 10.000 RPM. Após esse procedimento, a

coluna foi descartada. O RNA foi eluído em água livre de Rnases e a quantificação e o grau

de pureza do RNA foram determinados por espectofotometria utilizando o instrumento

Nanodrop (ND-1000, NanoDrop Technologies, EUA).

Para o preparo do RNA, foram adicionados em um tubo de 0,5 mL 1µg de RNA 1 µl

10X DNase I Reaction Buffer (Invitrogen), 1 µl Dnase I, Amp. Grade 1 U/µl (Invitrogen) e

água DEPC para completar o volume de 10 µl. Os tubos permanecem à temperatura ambiente

por 15 minutos e 1 µl de EDTA 25 mM (Invitrogen) é adicionado para inativação da Dnase.

Segue-se um aquecimento por 10 minutos a 65°C no Thermomix (Eppendorf, Germany) e,

após esse período as amostras permanecem em gelo até o início da transcrição reversa.

No banho de gelo, em um tubo de 0,65 mL autoclavado, foi adicionado 1 µl de Oligo

(dT)12-18 (Invitrogen), 10 µl da solução de RNA tratado com Dnase (Invitrogen) , 1 µl dNTP

10mM (Invitrogen) . O mix foi aquecido por 5 minutos a 70°C e quando a reação acabou o

tubo foi rapidamente colocado no gelo. Logo em seguida, o tubo foi centrifugado e foram

adicionados 4 µl do primeiro tampão 5x concentrado (Invitrogen) e 2 µl DTT 0,1 M

(Invitrogen), sendo o volume homogenizado cuidadosamente com a pipeta e incubado por 2

38

minutos a 42°C. Após a incubação, foi adicionado 1 µl da SuperScript II (Invitrogen) e

homogeneizado cuidadosamente com a pipeta. A mistura foi, então, incubada por 2h a 42°C e

logo em seguida por 15 minutos a 70°C. Após a síntese, as amostras foram mantidas

congeladas no freezer a -70°C para posterior realização da reação.

A reação da polimerase em cadeia para amplificação dos genes da β-actina e Oct-4

continham 1 µL do mix deoxinucleosídeo trifosfato (10 mM de cada dNTP), 2 µL com 20

pmol de cada primer; 0,5 µl (5 IU/µL) de Taq polimerase recombinante (Invitrogen, Carlsbad,

CA), 2 µL contendo 50 mM MgCl2 e 3 µL de DNA total em 50 µL da solução de reação. A

temperatura de anelamento da reação de PCR consistiu de 58°C para Oct-4 e 56°C para β-

actina durante 45 segundos. O tamanho do produto esperado foi de 150 e 103 pares de base

respectivamente. Os produtos de PCR foram visualizados com brometo de etídeo em gel de

agarose a 1.5% submetido à eletroforese (110V, 1 hora). A sequência de primers encontra-se

listada na tabela 3.

Tabela 2. Primers empregadas na reação de PCR.

Gene Primer senso Primer anti-senso Oct-4 GAGGAGTCCCAGGACATCAA GATGGTCGTTTGGCTGAACACCTT

β-actina AGGCATCCTCACCCTGAAGTA CACACGCAGCTCATTGTAGA

4.4.4. Diferenciação osteogênica

As células foram cultivadas em placa de seis poços, em meio DMEM suplementado

com 10% de soro bovino fetal até atingirem 100% de confluência. Em seguida, as células

foram estimuladas, por até quatro semanas, com meio DMEM modificado contendo 10% de

soro bovino fetal, 100 nM dexametasona (Sigma- Aldrich), 0,05 de mM L-ácido ascórbico 2-

fosfato (Sigma- Aldrich) e 10 mM de β-glicerofosfato (Sigma - Aldrich). Em todos os

experimentos foi mantido um grupo controle cultivado em meio DMEM suplementado com

10% de soro bovino fetal (SBF, Cultilab, Campinas, SP, Brasil). O meio das culturas era

trocado a cada dois dias.

A evolução da diferenciação foi acompanhada diariamente através do microscópio

ZEISS, modelo axiovert 25. A deposição de cálcio foi observada através da coloração com

Alzarin Red S (Sigma-Aldrich). Para isso, foi feita a lavagem da cultura com PBS, fixação

39

com paraformaldeído (PFA) 4% (Electron Microscopy Sciences) durante 15 minutos,

aplicação do Alzarin Red S por 5 minutos e, por último, a lavagem com água destilada para

remoção de resíduos.

4.4.5. Diferenciação adipogênica

As células foram cultivadas em placa de seis poços, em meio DMEM suplementado

com 10% de soro bovino fetal até atingirem 100% de confluência. Em seguida foram

estimuladas, por até quatro semanas, com meio DMEM modificado contendo: 10% de soro

bovino fetal, 60 µM de indometacina (Sigma – Aldrich), 0,5 de µM isobutilmetilxantina

(Sigma – Aldrich) e 0,5 µM de hidrocortisona (Sigma – Aldrich). Em todos os experimentos

foi mantido um grupo controle cultivado em meio DMEM suplementado com 10% de soro

bovino fetal. O meio de cultura era trocado a cada dois dias.

A evolução da diferenciação foi acompanhada diariamente em microscópio invertido.

Para observar a deposição de gordura, os poços foram lavados com PBS, as células foram

fixadas com PFA 4% durante 1 hora à temperatura ambiente e coradas com solução de Oil

Red (Sigma – Aldrich) (3 volumes de 3,75% Oil Red O em isopropanol e 3 volumes de água

destilada) por 5 minutos à temperatura ambiente, seguido de lavagem com água destilada para

remoção de resíduos.

4.5. ESTABILIDADE CITOGENÉTICA

As CTM, após extração e isolamento na segunda, quinta e décima passagens foram

cultivadas em meio Minimum Essential Medium (MEM) Alpha suplementado com 10% de

soro fetal bovino (Gibco), 1% de glutamina (200 mM) (Gibco) e 1% de gentamincina (Gibco)

(BARCH et al., 1997). Células em divisão celular ativa foram bloqueadas na metáfase por

colcemida a 0,1 µg/mL (Gibco) destacadas da superfície de crescimento com tripsina a 0,25%

(Gibco) e subsequentemente infladas pela exposição a solução hipotônica de KCl a 0,057 M

(Merck). As células foram fixadas em solução 3:1 de metanol e ácido acético. A análise

citogenética dos cromossomas metafásicos foi realizada pelo bandeamento GTG (Sanchez et

al., 1973) e as imagens foram capturadas no microscópio BX60 (Olympus), com o programa

ImagePro Plus.

40

5 RESULTADOS_______________________________________________________

5.1. ANÁLISE QUALITATIVA DAS CTM DERIVADAS DO EPITÉLIO AMNIÓTICO,

TECIDO ADIPOSO E POLPA DE DENTE DECÍDUO.

Uma avaliação da etapa de extração e rendimento após o isolamento das células

estromais foi realizada para se determinar qual fonte possibilita a obtenção do maior número

de células aderentes. O procedimento com menor número de etapas é o de extração de CTM

da polpa de dente decíduo, seguido pelo tecido adiposo, e o mais trabalhoso a extração de

células do epitélio amniótico. Foi observado que a capacidade proliferativa das CTM varia de

acordo com a sua origem. O processo de isolamento das CTM do epitélio amniótico fornece

uma pequena quantidade de células, após grande número de etapas de isolamento, com

reduzida capacidade proliferativa. Essa característica inviabilizou a continuidade dos estudos

com essa fonte de células. A excelente capacidade proliferativa das CTM derivadas da polpa

de dente decíduo, aliada à facilidade de isolamento, suplanta a baixa quantidade de células

obtidas por procedimento devido à pequena quantidade de tecido disponível para isolamento

das células. As CTM derivadas do tecido adiposo apresentam um alto potencial proliferativo,

e o seu processo de isolamento é fácil e de bom rendimento devido à facilidade de se obter

boas quantidades de material lipoaspirado e pela riqueza de células estromais do tecido

adiposo. O tecido adiposo fornece o maior número de células por extração, enquanto a polpa

de dente decíduo fornece o menor número.

5.2 SELEÇÃO DE CTM ADERENTES

Após o processo de isolamento e início do cultivo celular, as células estromais

aderentes obtidas das diferentes fontes adquiriram um padrão morfológico semelhante.

Podemos observar as células com formato oval no momento da semeadura (Figuras 9A, 10A

e 11A), com formato fibroblastóide após 12 horas de cultivo (Figuras 9B, 10B, 11B) e quando

a confluência da cultura foi atingida (Figuras 9C, 10C, 11C) , a partir das três fontes de

células estudadas.

A liberação das células no plástico de cultura foi realizado através do tratamento com

tripsina, no momento em que a cultura atingiu a confluência. O EDTA também foi testado,

mas não foi eficiente, provocando o desprendimento de um aglomerado de células que não se

dissociavam facilmente e que não se aderiam na garrafa subseqüentemente.

41

Figura 9. Cultura de CTM aderentes provenientes do tecido adiposo. A) Células no momento da semeadura, B) Células com característica fibroblastóide, após 72 horas de cultivo, C) Cultura de células confluentes.

Figura 10. Cultura de CTM aderentes provenientes da polpa de dente decíduo. A) Células no momento da semeadura, B) Células com característica fibroblastóide, após 72 horas de cultivo, C) Cultura de células confluentes.

Figura 11. Cultura de CTM aderentes provenientes do epitélio amniótico. A) Células no momento da semeadura, B) Células com característica fibroblastóide, após 72 horas de cultivo, C) Cultura de células confluentes.

42

5.3 MORFOLOGIA DE CTM DERIVADAS DO TECIDO ADIPOSO E DA POLPA DE

DENTE DECÍDUO

Para a melhor visualização da morfologia celular foi empregada a técnica de coloração

das células com solução de Giemsa. CTM de tecido adiposo e polpa de dente decíduo foram

cultivadas em placas de cultura contendo lamínulas de vidro no fundo dos poços. Após a

coloração com Giemsa e montagem em lâminas as células foram observadas ao microscópio

óptico e fotografadas. Nota-se que a morfologia das células-tronco mesenquimais derivadas

do tecido adiposo e polpa de dente decíduo é muito semelhante. Ambas apresentam formato

fibroblastóide com núcleo volumoso, independente do tecido de origem (Figuras 12 A, B).

Essa morfologia também foi observada em CTM derivadas do epitélio amniótico (dados não

mostrados).

Figura 12. Micrografias de culturas de CTM. A) CTM provenientes da polpa de dente decíduo decíduo humana, B) CTM provenientes do tecido adiposo humano. Coloração de Giemsa, aumento de 60X.

43

5.4 MARCADORES DE SUPERFÍCIE – CITOMETRIA DE FLUXO

A expressão de marcadores de superfície característicos de CTM também foi

investigada por citometria de fluxo, que permite a análise da porcentagem de células

expressando um determinado marcador, assim como da intensidade de marcação em cada

célula. Dois experimentos independentes foram realizados para cada passagem das culturas de

CTM derivada do tecido adiposo e polpa de dente decíduo. Um experimento foi realizado

para cultura de CTM derivada do epitélio amniótico.

Cultura de CTM derivadas do epitélio amniótico humano

As análises de CTM derivadas do epitélio amniótico realizadas por citometria de fluxo

revelaram uma cultura relativamente homogênea, em que aproximadamente 70% das células

expressavam CD105 (Figura 13 e Tabela 3).

Figura 13. Análise de CTM do epitélio amniótico na 10a passagem de cultura in vitro. Análises realizadas por citometria de fluxo utilizando anticorpos anti-CD90, CD117, CD73, CD105, CD54, CD45 e CD34 conjugados a fluorocromos. A linha cheia corresponde ao controle e a linha vazia corresponde à expressão do antígeno.

CD90 CD117 CD73

CD105 CD54 CD45

CD34

CD90 CD117 CD73

CD105 CD54 CD45

CD34

44

Tabela 3. Análise por citometria de fluxo de CTM do epitélio amniótico na 10a passagem de cultura in vitro.

CTM derivadas do epitélio amniótico MARCADOR P10 (%) CD90 28,83 CD117 13,97 CD73 0,17 CD105 70,02 CD54 1,10 CD45 0,0 CD34 0,16 Cultura de CTM derivada do tecido adiposo humano

A cultura de CTM derivadas do tecido adiposo humano se mostrou uma população

heterogênea fenotipicamente. Apenas uma pequena porcentagem do número total de células

aderentes apresentou marcadores de superfície atribuídos a CTM. Essas células estavam

localizadas na região direita superior do dot-plot para FSCxSSC, correspondendo às células

de maior tamanho e granulosidade. Portanto, as células desta região, que contém menos de

2% dos eventos positivos, foram analisadas (Figuras 14A e 15A). A análise da região descrita

revelou uma alta frequência (maior do que 90%) de expressão de antígenos característicos de

CTM (CD166, CD105, CD90, CD73 e CD54) na quarta passagem (Figura 14). Também

nesta passagem observou-se uma alta porcentagem de expressão de um antígeno característico

de células da linhagem hematopoiética, o CD45 (Figuras 14B e 14C).

A expressão de antígenos de superfície relacionados à CTM, na população de maior

tamanho e granulosidade, aumentou da quarta para a décima passagem. Além disso, na

décima passagem observou-se uma diminuição na expressão de CD45 e aumento de CD133 e

CD44, marcadores expressos em mais de 90% das células desta região (Figuras 15B e 15C).

A figura 16 permite uma melhor visualização das alterações na expressão de antígenos de

superfície entre a 4° e 10° passagens.

45

Figura 14. Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas do tecido adiposo na 4° passagem. A, Dot-plot para FSC x SSC. Em azul, região contendo as células de maior tamanho e granulosidade. B, Porcentagem de células positivas para CD105, CD166, CD34, CD133, CD45, CD31, CD73, CD44, CD90, CD117 e CD54 na população total e na região de células de maior tamanho e granulosidade. C, Histogramas da análise da expressão de CD31, CD90, CD34, CD117, CD54, CD73, CD44, CD133, CD45, CD105 e CD166 em células da região de maior tamanho e granulosidade.

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CTR.001FSC-Height ->

A B

FSC

SSC

C

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CTR.001FSC-Height ->

A B

FSC

SSC

C

46

Figura 15. Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas do tecido adiposo na 10° passagem. A, Dot-plot para FSC x SSC. Em azul, região contendo as células de maior tamanho e granulosidade. B, Porcentagem de células positivas para CD105, CD166, CD34, CD133, CD45, CD31, CD73, CD44, CD90, CD117 e CD54 na população total e na região de células de maior tamanho e granulosidade. C, Histogramas da análise da expressão de CD105, CD34, CD45, CD166, CD90, CD31, CD133, CD44, CD73, CD54 e CD117 em células da região de maior tamanho e granulosidade.

B

10 10 10 10 100 1 2 3 4

FL3 H i ht10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD105 CD34Controle CD45

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD166 CD90

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD31

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD73

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD54

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD117

C

10 10 10 10 100 1 2 3 4

31FITC/133PE/45APC.006FSC-Height ->

A

SSC

FSC85,43±10,433,79±3,03CD54

35,53±1,150,27±0,09CD117

95,19±4,811,42±0,45CD90

95,31±3,010,86±0,45CD44

95,73±4,261,88±0,45CD73

92,98±7,020,92±0,21CD31

4,88±1,790,15±0,05CD45

99,68±0,321,02±0,23CD133

26,55±13,440,27±0,10CD34

98,29±1,411,03±0,38CD166

99,78±0,221,02±0,4CD105

RegiãoTotal 

85,43±10,433,79±3,03CD54

35,53±1,150,27±0,09CD117

95,19±4,811,42±0,45CD90

95,31±3,010,86±0,45CD44

95,73±4,261,88±0,45CD73

92,98±7,020,92±0,21CD31

4,88±1,790,15±0,05CD45

99,68±0,321,02±0,23CD133

26,55±13,440,27±0,10CD34

98,29±1,411,03±0,38CD166

99,78±0,221,02±0,4CD105

RegiãoTotal 

B

10 10 10 10 100 1 2 3 4

FL3 H i ht10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD105 CD34Controle CD45

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD166 CD90

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD31

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD73

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD54

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD117

FL3 H i ht10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD105 CD34Controle CD45

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD166 CD90

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD31

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD73

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD54

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD117

C

10 10 10 10 100 1 2 3 4

31FITC/133PE/45APC.006FSC-Height ->

A

SSC

FSC10 10 10 10 100 1 2 3 4

31FITC/133PE/45APC.006FSC-Height ->

A

SSC

FSC

A

SSC

FSC85,43±10,433,79±3,03CD54

35,53±1,150,27±0,09CD117

95,19±4,811,42±0,45CD90

95,31±3,010,86±0,45CD44

95,73±4,261,88±0,45CD73

92,98±7,020,92±0,21CD31

4,88±1,790,15±0,05CD45

99,68±0,321,02±0,23CD133

26,55±13,440,27±0,10CD34

98,29±1,411,03±0,38CD166

99,78±0,221,02±0,4CD105

RegiãoTotal 

85,43±10,433,79±3,03CD54

35,53±1,150,27±0,09CD117

95,19±4,811,42±0,45CD90

95,31±3,010,86±0,45CD44

95,73±4,261,88±0,45CD73

92,98±7,020,92±0,21CD31

4,88±1,790,15±0,05CD45

99,68±0,321,02±0,23CD133

26,55±13,440,27±0,10CD34

98,29±1,411,03±0,38CD166

99,78±0,221,02±0,4CD105

RegiãoTotal 

47

0

20

40

60

80

100

120

CD166

CD45CD34

CD105

CD133

CD31CD73

CD44CD90

CD117

CD54

Expr

essã

o (%

)P4P10

Figura 16. Comparação do percentual de expressão de antígenos de superfície característicos de CTM. Análise por citometria de fluxo de culturas in vitro de 4° e 10° passagens de células-tronco mesenquimais obtidas do tecido adiposo na região de maior tamanho e granulosidade marcadas com anticorpos anti-CD166, CD45, CD34, CD105, CD133, CD31, CD73, CD44, CD90, CD117 e CD54. Valores representam as médias±SD de duas determinações. Cultura de CTM derivada da polpa de dente decíduo humano

A cultura de CTM derivada da polpa de dente decíduo se mostrou uma população

bastante heterogênea, com baixos níveis de expressão dos antígenos analisados. Apenas uma

pequena porcentagem do número total de células aderentes apresentou marcadores de

superfície atribuídos a CTM. Assim como na cultura de CTM derivada do tecido adiposo,

essas células também estavam localizadas na região direita superior do dot-plot para

FSCxSSC e, portanto, uma região de análise contendo menos de 2,0 % dos eventos positivos

foi estabelecida (Figuras 17A e 18A). Não foi identificada a expressão de CD45 em nenhuma

das passagens das células da polpa de dente decíduo. Os antígenos de superfície que

apresentaram maior expressão na quarta passagem foram o CD105 e o CD90 (Figuras 17B e

17C).

Na décima passagem observou-se uma diminuição da expressão de CD34 e também de

outros antígenos, tais como CD166, CD105, CD44 e CD90, enquanto CD31, CD73, CD117 e

CD54 apresentaram um aumento da sua expressão na região de maior tamanho e

granulosidade. Os antígenos de superfície que apresentaram maior expressão nesta passagem

foram o CD105 e o CD73 (Figuras 18B e 18C). A figura 19 permite uma melhor visualização

das alterações na expressão de antígenos de superfície entre a 4° e 10° passagens.

48

Figura 17. Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas da polpa de dente decíduo na 4° passagem. A, Dot-plot para FSC x SSC. Em azul, região contendo as células de maior tamanho e granulosidade. B, Porcentagem de células positivas para CD105, CD166, CD34, CD133, CD45, CD31, CD73, CD44, CD90, CD117 e CD54 na população total e na região de células de maior tamanho e granulosidade. C, Histogramas da análise da expressão de CD117, CD166, CD45, CD105, CD44, CD73, CD90, CD34, CD54, CD31 e CD133 em células da região de maior tamanho e granulosidade.

B

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

A

FSC

SSC

7,72±3,540,98±0,91CD54

10,63±1,630,5±0,31CD117

56,34±8,162,54±0,56CD90

29,17±6,150,33±0,33CD44

41,56±9,193,15±0,16CD73

14,32±0,560CD31

0,24±0,240CD45

25,73±8,270,26±0,26CD133

8,99±5,810CD34

32±2,00,02±0,02CD166

53,24±19,240,06±0,06CD105

RegiãoTotal 

7,72±3,540,98±0,91CD54

10,63±1,630,5±0,31CD117

56,34±8,162,54±0,56CD90

29,17±6,150,33±0,33CD44

41,56±9,193,15±0,16CD73

14,32±0,560CD31

0,24±0,240CD45

25,73±8,270,26±0,26CD133

8,99±5,810CD34

32±2,00,02±0,02CD166

53,24±19,240,06±0,06CD105

RegiãoTotal 

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD166

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Controle CD45

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD90

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD73

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34 CD54 CD31 CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD105

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD117

B

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

A

FSC

SSC

7,72±3,540,98±0,91CD54

10,63±1,630,5±0,31CD117

56,34±8,162,54±0,56CD90

29,17±6,150,33±0,33CD44

41,56±9,193,15±0,16CD73

14,32±0,560CD31

0,24±0,240CD45

25,73±8,270,26±0,26CD133

8,99±5,810CD34

32±2,00,02±0,02CD166

53,24±19,240,06±0,06CD105

RegiãoTotal 

7,72±3,540,98±0,91CD54

10,63±1,630,5±0,31CD117

56,34±8,162,54±0,56CD90

29,17±6,150,33±0,33CD44

41,56±9,193,15±0,16CD73

14,32±0,560CD31

0,24±0,240CD45

25,73±8,270,26±0,26CD133

8,99±5,810CD34

32±2,00,02±0,02CD166

53,24±19,240,06±0,06CD105

RegiãoTotal 

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD166

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Controle CD45

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD90

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD73

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34 CD54 CD31 CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD105

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD117

10 10 10 10 100 1 2 3 4

A

FSC

SSC

10 10 10 10 100 1 2 3 4

A

FSC

SSC

7,72±3,540,98±0,91CD54

10,63±1,630,5±0,31CD117

56,34±8,162,54±0,56CD90

29,17±6,150,33±0,33CD44

41,56±9,193,15±0,16CD73

14,32±0,560CD31

0,24±0,240CD45

25,73±8,270,26±0,26CD133

8,99±5,810CD34

32±2,00,02±0,02CD166

53,24±19,240,06±0,06CD105

RegiãoTotal 

7,72±3,540,98±0,91CD54

10,63±1,630,5±0,31CD117

56,34±8,162,54±0,56CD90

29,17±6,150,33±0,33CD44

41,56±9,193,15±0,16CD73

14,32±0,560CD31

0,24±0,240CD45

25,73±8,270,26±0,26CD133

8,99±5,810CD34

32±2,00,02±0,02CD166

53,24±19,240,06±0,06CD105

RegiãoTotal 

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD166

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Controle CD45

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD90

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD73

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34 CD54 CD31 CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD105

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD117

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD166

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Controle CD45

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD90

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD73

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34 CD54 CD31 CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD105

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD90

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD73

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34 CD54 CD31 CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 410 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34 CD54 CD31 CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD105

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD117

49

Figura 18. Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas da polpa de dente decíduo na 10° passagem. A, Dot-plot para FSC x SSC. Em azul, região contendo as células de maior tamanho e granulosidade. B, Porcentagem de células positivas para CD105, CD166, CD34, CD133, CD45, CD31, CD73, CD44, CD90, CD117 e CD54 na população total e na região de células de maior tamanho e granulosidade. C, Histogramas da análise da expressão de CD105, CD117, CD166, CD133, CD31, CD73 CD45, , CD44 , CD90, CD54 e CD34 em células da região de maior tamanho e granulosidade.

C

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 410 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Controle CD105 CD117 CD166

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD31

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD45

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD90 CD54

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34

CD73

B

15,21±9,430,44±0,14CD54

17,43±1,131,26±0,77CD117

37,65±2,343,71±0,36CD90

8,8±4,870,06±0,06CD44

66,08±8,229,23±0,67CD73

22,05±16,950,04±0,04CD31

00CD45

13,05±3,471,06±0,97CD133

6,24±0,170CD34

19,94±0,060,74±0,36CD166

45,14±2,240,21±0,1CD105

RegiãoTotal  

15,21±9,430,44±0,14CD54

17,43±1,131,26±0,77CD117

37,65±2,343,71±0,36CD90

8,8±4,870,06±0,06CD44

66,08±8,229,23±0,67CD73

22,05±16,950,04±0,04CD31

00CD45

13,05±3,471,06±0,97CD133

6,24±0,170CD34

19,94±0,060,74±0,36CD166

45,14±2,240,21±0,1CD105

RegiãoTotal  

10 10 10 10 100 1 2 3 4

A

FSC

SSC

C

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 410 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Controle CD105 CD117 CD166

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD31

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD45

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD90 CD54

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34

CD73

B

15,21±9,430,44±0,14CD54

17,43±1,131,26±0,77CD117

37,65±2,343,71±0,36CD90

8,8±4,870,06±0,06CD44

66,08±8,229,23±0,67CD73

22,05±16,950,04±0,04CD31

00CD45

13,05±3,471,06±0,97CD133

6,24±0,170CD34

19,94±0,060,74±0,36CD166

45,14±2,240,21±0,1CD105

RegiãoTotal  

15,21±9,430,44±0,14CD54

17,43±1,131,26±0,77CD117

37,65±2,343,71±0,36CD90

8,8±4,870,06±0,06CD44

66,08±8,229,23±0,67CD73

22,05±16,950,04±0,04CD31

00CD45

13,05±3,471,06±0,97CD133

6,24±0,170CD34

19,94±0,060,74±0,36CD166

45,14±2,240,21±0,1CD105

RegiãoTotal  

10 10 10 10 100 1 2 3 4

A

FSC

SSC

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 410 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Controle CD105 CD117 CD166

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD31

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD45

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD90 CD54

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34

CD73

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 410 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Controle CD105 CD117 CD166

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD31

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD45

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD90 CD54

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34

CD73

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 410 10 10 10 100 1 2 3 4

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD133

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Controle CD105 CD117 CD166

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD31

10 10 10 10 100 1 2 3 4 10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD45

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD44

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD90 CD54

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34

CD73

B

15,21±9,430,44±0,14CD54

17,43±1,131,26±0,77CD117

37,65±2,343,71±0,36CD90

8,8±4,870,06±0,06CD44

66,08±8,229,23±0,67CD73

22,05±16,950,04±0,04CD31

00CD45

13,05±3,471,06±0,97CD133

6,24±0,170CD34

19,94±0,060,74±0,36CD166

45,14±2,240,21±0,1CD105

RegiãoTotal  

15,21±9,430,44±0,14CD54

17,43±1,131,26±0,77CD117

37,65±2,343,71±0,36CD90

8,8±4,870,06±0,06CD44

66,08±8,229,23±0,67CD73

22,05±16,950,04±0,04CD31

00CD45

13,05±3,471,06±0,97CD133

6,24±0,170CD34

19,94±0,060,74±0,36CD166

45,14±2,240,21±0,1CD105

RegiãoTotal  

10 10 10 10 100 1 2 3 4

A

FSC

SSC

B

15,21±9,430,44±0,14CD54

17,43±1,131,26±0,77CD117

37,65±2,343,71±0,36CD90

8,8±4,870,06±0,06CD44

66,08±8,229,23±0,67CD73

22,05±16,950,04±0,04CD31

00CD45

13,05±3,471,06±0,97CD133

6,24±0,170CD34

19,94±0,060,74±0,36CD166

45,14±2,240,21±0,1CD105

RegiãoTotal  

15,21±9,430,44±0,14CD54

17,43±1,131,26±0,77CD117

37,65±2,343,71±0,36CD90

8,8±4,870,06±0,06CD44

66,08±8,229,23±0,67CD73

22,05±16,950,04±0,04CD31

00CD45

13,05±3,471,06±0,97CD133

6,24±0,170CD34

19,94±0,060,74±0,36CD166

45,14±2,240,21±0,1CD105

RegiãoTotal  

10 10 10 10 100 1 2 3 4

A

FSC

SSC

10 10 10 10 100 1 2 3 4

A

FSC

SSC

A

FSC

SSC

50

01020304050607080

CD166

CD45CD34

CD105

CD133

CD31CD73

CD44CD90

CD117

CD54

Expr

essã

o (%

)P4P10

Figura 19. Comparação do percentual de expressão de antígenos de superfície característicos de CTM. Análise por citometria de fluxo de culturas in vitro de 4° e 10° passagens de células-tronco mesenquimais obtidas da polpa de dente decíduo na região de maior tamanho e granulosidade marcadas com anticorpos anti-CD166, CD45, CD34, CD105, CD133, CD31, CD73, CD44, CD90, CD117 e CD54. Valores representam as médias±SD de duas determinações. 5.5 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA

O produto obtido pela reação de RT-PCR possuía uma banda única com tamanho específico e compatível com o marcador utilizado. Foi investigada a expressão do fator de transcrição Oct-4 nas culturas de CTM derivadas do tecido adiposo e polpa de dente decíduo. Três experimentos independentes foram realizados para cada cultura de células. A 1a, a 10a e a 16a passagens da cultura de CTM derivadas do tecido adiposo foram analisadas. A 1a e a 10a passagens da cultura de CTM derivadas da polpa de dente decíduo foram analisadas. Em todas as culturas foi observada a presença de mRNA para Oct-4 (Figura 20).

Figura 20. RT-PCR de culturas de CTM provenientes do tecido adiposo e polpa de dente decíduo. Eletroforese em gel de agarose para visualização dos produtos de amplificação para β-actina e Oct-4 nas culturas de CTM derivadas de tecido adiposo na primeira (1); décima (5) e décima-sexta (2) passagens e nas culturas de CTM derivada da polpa de dente decíduo na primeira (3) e décima (4) passagens.

1 2 3 4 5

51

5.6 DIFERENCIAÇÃO INDUZIDA

A capacidade de diferenciação das CTM de tecido adiposo e da polpa de dente decíduo

em osteócitos e adipócitos foi investigada. Culturas de CTM em meio suplementado com

fatores indutores de diferenciação específicos foram acompanhadas e analisadas.

Confirmação qualitativa de plasticidade

Culturas de CTM derivadas da polpa de dente decíduo e tecido adiposo, ambas na

terceira passagem, apresentaram diferenciação in vitro nas linhagens adipogênica e

osteogênica. Todas as culturas que apresentaram acúmulo intracelular lipídico marcado com o

corante Oil Red O foram consideradas positivas para diferenciação adipogênica. Após 10 dias

de cultura em contato com o coquetel indutivo adipogênico, gotículas lipídicas foram

identificadas em todas as culturas de CTM derivadas do tecido adiposo (Figura 21). Culturas

de CTM derivadas da polpa de dente decíduo apresentaram as mesmas gotículas, porém bem

menores e mais dispersas, após duas semanas (dados não mostrados). A diferenciação

osteogênica foi considerada positiva quando houve a formação de espículas que se coravam

após o tratamento com Alizarin Red S. Após aproximadamente dez dias de cultura em contato

com o coquetel indutivo osteogênico, foram identificadas espículas em todas as culturas de

CTM derivadas do tecido adiposo (Figura 22). Culturas de CTM derivadas da polpa de dente

decíduo apresentaram as mesmas formações, mas que foram visíveis apenas após três

semanas de indução (Figura 23). Independente da diferença entre os tempos em que se

identificou a presença de gotículas lipídicas ou espículas, todas as culturas foram coradas com

seus respectivos protocolos após 21 dias de cultura, para efeito de comparação. Culturas

controle também foram coradas para confirmar que não houve diferenciação espontânea.

52

Figura 21. Diferenciação adipogênica de CTM derivadas do tecido adiposo. As células de tecido adiposo de culturas na 3a passagem foram submetidas ao protocolo de indução de diferenciação adipogênica por 21 dias, quando o material foi preparado para análise. A, Cultura após 21 dias de indução, onde podem ser observadas gotículas lipídicas intracelulares por microscopia óptica com contraste de fase. B, Cultura após 21 dias de diferenciação adipogênica marcada com o corante Oil Red O. C, Cultura sem indução adipogênica. Aumento de 40X.

Figura 22. Diferenciação osteogênica de CTM derivadas do tecido adiposo. As células de tecido adiposo de culturas na 3a passagem foram submetidas ao protocolo de indução de diferenciação osteogênica por 21 dias, quando o material foi preparado para análise. A, Cultura em meio de indução de diferenciação observada por microscopia óptica com contraste de fase. B, Cultura após 21 dias de diferenciação osteogênica, onde pode-se visualizar a presença de depósitos de cálcio pela marcação com Alizarin Red S. C, Cultura sem indução osteogênica. Aumento de 40X.

Figura 23. Diferenciação osteogênica de CTM derivadas da polpa de dente decíduo. As células da polpa de dente decíduo de culturas na 3a passagem foram submetidas ao protocolo de indução de diferenciação osteogênica. A, Cultura após 21 dias de indução, observadas por microscopia óptica com contraste de fase B, Cultura após 21 dias de diferenciação osteogênica com detecção de depósitos de cálcio pela marcação com Alizarin Red S. C, Cultura sem indução osteogênica. Aumento de 40X para as fotos Ae C e 60X para a foto B.

53

5.7 ESTABILIDADE CITOGENÉTICA

Análise cariotípica

Culturas de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo e polpa de dente

decíduo foram analisadas durante a 2a, a 5a e a 10a passagens. A análise cariotípica de

bandeamento G mostrou que houve a manutenção do cariótipo diplóide com o cultivo das

CTM. Anormalidades estruturais cromossômicas, tais como translocação, inversão e deleção,

não foram observadas com essa técnica (Figuras 24-27). Nas culturas de CTM derivadas do

tecido adiposo de um doador do sexo feminino na 2a (Figura 24) e 10a passagens observamos

um cariótipo diplóide normal (46, XX) (Figuras 25 e 26). Da mesma forma, observamos um

cariótipo diplóide normal (46, XY) na cultura de CTM derivadas da polpa de dente decíduo

de doador do sexo masculino na 5a (Figura 27A) e 10a passagens (Figura 27B). As culturas de

CTM derivadas do tecido adiposo na 5a passagem, assim como da polpa de dente decíduo na

2a passagem, também apresentaram cariótipo diplóide normal (dados não mostrados).

Uma cultura de CTM derivada do tecido adiposo na 20a passagem foi analisada

empregando-se a mesma metodologia descrita anteriormente. Metáfase poliplóide, cariótipo

de 85 cromossomos com arranjos não identificados e associações teloméricas complexas com

considerável instabilidade cromossômica foram identificadas (Figura 28).

54

Figura 24. Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo in vitro na 2a passagem. Nas micrografias A e B observa-se cariótipo normal 46, XX.

Figura 25. Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo in vitro na 10a passagem. Nas micrografias A e B observa-se cariótipo normal 46, XX.

A B

BA B

55

Figura 26. Cariótipo de cromossomo pela técnica de bandeamento G de CTM derivada do tecido adiposo. A, Amostras cromossômicas de cultura de CTM na 10a passagem derivada de tecido adiposo de doador do sexo feminino. B, Micrografia reorganizada representando a décima passagem de cultura de CTM proveniente do mesmo doador, evidenciando um cariótipo diplóide normal (46 XX). Figura 27. Cariótipo de cromossomo pela técnica de bandeamento G de CTM derivada da polpa de dente decíduo. Amostras cromossômicas de cultura de CTM derivada da polpa de dente decíduo de paciente do sexo masculino. Cultura de 5a (A) e 10a (B) passagens do mesmo doador, evidenciando um cariótipo diplóide normal (46 XY).

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18 19 20

1 2 3 4 5

21 22 XX

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18 19 20

1 2 3 4 5

21 22 XX

B

B

A

A

56

Figura 28. Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo in vitro na 20a passagem. A) Metáfase poliplóide, B) Cariótipo de 85 cromossomos com rearranjos não identificados, C) Associações teloméricas complexas com evidência de considerável instabilidade cromossômica, D) Metáfase poliplóide, E) 81 cromossomos, F) Cariótipo: 43,XX,-4,del(12)(p11→pter),-15,-16,-17,-22,+r1,+mar1.

A

D

B

C

E F

D

57

6 DISCUSSÃO ______________________________________________________________________

As CTM representam atualmente uma fonte potencial de células para utilização na

área de terapia celular devido à sua capacidade de auto-renovação e diferenciação em células

especializadas do corpo humano (DAN et al., 2008). O epitélio amniótico (MIKI et al., 2005),

o tecido adiposo (ZUK et al., 2001) e a polpa dentária (GRONTHOS et al., 2002) são fontes

accessíveis de CTM. Os processos de coleta destas células apresentaram vantagens em relação

às CTM derivadas da medula óssea, por serem derivadas de tecidos normalmente descartados

(epitélio amniótico e polpa dentária) ou presentes em abundância no organismo (tecido

adiposo). Para se investigar as similaridades e diferenças existentes entre as CTM dessas

possíveis fontes de obtenção mencionadas, foi realizada uma avaliação da eficiência de

isolamento, indução de diferenciação das culturas obtidas em linhagem adipogênica e

osteogência, análise da expressão dos antígenos de superfície, acompanhamento da

manutenção da expressão do fator de transcrição Oct-4 e estabilidade citogenética após

expansão in vitro. O conhecimento dessas características poderá ajudar a definir a melhor

fonte de células a serem utilizadas e a sua correlação com o sucesso da sua aplicação em

terapia celular.

Eficiência de isolamento

O tecido adiposo fornece o maior número de células por extração, enquanto a polpa de

dente decíduo fornece o menor número. Foi relatado que a quantidade de células por grama

presente no tecido adiposo pode ser cerca de cinco vezes maior do que a quantidade obtida

por mililitro extraído da medula óssea (STREM et al., 2005). Apesar de a polpa de dente

decíduo ser a fonte onde se obtém o menor número de CTM pela reduzida quantidade de

tecido, a capacidade proliferativa das CTM obtidas desta fonte é tão boa quanto aquela

observada nas células isoladas do tecido adiposo. As células isoladas do epitélio amniótico

possuem uma reduzida capacidade proliferativa, apesar de se obter um número considerável

de células por procedimento. O lento crescimento dessas células e baixa eficiência de extração

também foram observados por outros autores (BILIC et al 2008). Tal característica, aliada à

dificuldade na etapa de extração inviabilizou a utilização dessas células no estudo. Talvez isso

explique o reduzido número de trabalhos nos últimos anos utilizando células provenientes

dessa fonte, em contraste com as publicações utilizando células provenientes do tecido

adiposo e até mesmo polpa dentária.

58

O tempo entre coleta e isolamento, a baixa freqüência de CTM nesse tecido em

comparação com os outros e o crescimento lento, dificultando a expansão e estabelecimento

da cultura, podem ser fatores que contribuem para o insucesso na expansão de CTM de

epitélio amniótico. A dificuldade no estabelecimento da cultura também foi relatada

anteriormente (BILIC et al 2008). No entanto, uma vez que o processo se inicia, observamos

que as células podem ser mantidas por várias passagens. Assim como reportado por outros

autores (REBELATTO et al., 2008; GRONTHOS et al., 2002), não foi observada diferença

morfológica entre as fontes pesquisadas e todas as culturas possuíam formato fibroblastóide

característico de CTM, tanto nas passagens recentes quanto nas mais avançadas.

Marcadores de superfície

As culturas de CTM derivadas do epitélio amniótico foram submetidas à análise por

citometria de fluxo e o perfil de expressão de antígenos de superfície foi condizente com o

descrito na literatura: positivo para CD90 e CD105 e negativo para CD45 e CD34

(PAROLINI et al., 2008).

Passagens recentes e avançadas de culturas de CTM derivadas de tecido adiposo e

polpa dentária foram analisadas por citometria de fluxo. Nenhum dos marcadores analisados é

específico de CTM e existem relatos conflitantes na literatura à respeito da sua expressão em

culturas de CTM. A expressão de CD34, por exemplo, é controversa em culturas de CTM

derivadas do tecido adiposo. Alguns autores reportam pouca ou nenhuma expressão (ZUK et

al., 2002; DE UGARTE et al., 2003), enquanto que outros relatam altos níveis de expressão

deste marcador (VARMA et al 2007; MITCHELL et al 2006). As variações encontradas na

literatura talvez possam estar relacionadas a diferentes técnicas de análise por citometria de

fluxo, procedimento de extração empregado e até mesmo escolha do soro na cultura (ASTORI

et al 2007; SHAHDADFAR et al 2005). Em nossos estudos detectamos a expressão de CD34

quando a cultura de células foi analisada por citometria de fluxo. Também identificamos uma

população heterogênea comparável a relatos anteriores (ASTORI et al 2007). A grande

heterogeneidade encontrada leva alguns autores a afirmar que não se estabelece uma cultura

de CTM, mas sim uma cultura de células onde estão presentes CTM que possuem

heterogeneidade, inclusive no que diz respeito à sua capacidade de renovação e

multipotencialidade (BIANCO 2001; DOCHEVA 2006). Observamos que, ao longo da

expansão in vitro das culturas de CTM derivadas do tecido adiposo, ocorre uma diminuição

da expressão de CD45 e o aumento de expressão do conjunto de moléculas que caracterizam

59

CTM, ao compararmos a 4a e 10a passagens. As mudanças de expressão ao longo da expansão

in vitro podem ser decorrentes de uma flutuação dinâmica entre um tipo de célula mais

diferenciado e outro mais característico de célula-tronco indiferenciada, hipótese essa já

previamente especulada (KURTZ 2008).

As culturas de CTM derivadas da polpa dentária apresentaram o mesmo padrão de

heterogeneidade observado nas culturas de CTM derivadas do tecido adiposo. Distintas

populações de células-tronco já foram isoladas por separação com bolinhas magnéticas

(WADDINGTON et al 2009). Em muitos trabalhos encontrados na literatura observam-se

etapas de purificação da população celular estabelecida em culturas de CTM derivadas de

polpa dentária através de seleção por anticorpos contra marcadores como STRO-1 (SHI and

GRONTHOS 2003) e cKit, CD34, STRO-1 (LAINO et al 2006). Esses dados corroboram o

fato de que as culturas de CTM derivadas da polpa de dente decíduo por nós obtidas

apresentaram um padrão heterogêneo após o isolamento.

Diferenciação induzida

As culturas de CTM derivadas de tecido adiposo e polpa dentária se diferenciaram em

células das linhagens adipogênica e osteogênica quando submetidas a protocolos indutores

descritos na literatura (JONES et al., 2002). Para a confirmação da plasticidade foram

utilizados métodos padrão de análise qualitativa, onde observamos que as culturas de CTM

derivadas da polpa dentária produziram pequenas e esparsas gotículas lipídicas quando

comparadas às culturas de CTM derivada do tecido adiposo. Isso impossibilitou a coloração

pelo método clássico onde se utiliza o corante Oil Red O. Apesar de as duas culturas terem

apresentado diferenciação osteogênica, houve diferença em relação ao tempo necessário para

aparecimento dos primeiros nódulos. Enquanto nas culturas de CTM derivadas do tecido

adiposo os nódulos puderam ser visualizados a partir do décimo dia, nas culturas de CTM

derivadas da polpa dentária isso só foi possível após 3 semanas. Esta diferença observada nos

testes de diferenciação induzida sugere que as populações celulares das duas fontes testadas,

apesar de serem capazes de se diferenciar em múltiplas linhagens, variam em relação à sua

potência. Um trabalho recente, ao analisar CTM provenientes de medula óssea, cordão

umbilical e tecido adiposo, relatou que a capacidade de diferenciação varia de acordo com a

fonte de obtenção dessas células (REBELLATO et al., 2008). Outra explicação para o atraso

observado na diferenciação das culturas de CTM derivadas da polpa dentária pode ser a baixa

porcentagem de células que apresentam o padrão de expressão de antígenos característicos de

60

CTM. Ou seja, a pequena quantidade de CTM na cultura poderia ter comprometido a

velocidade de diferenciação dessas células.

Expressão de Oct-4

A manutenção da expressão do fator de transcrição relacionado ao estado

indiferenciado, Oct-4, ao longo da expansão in vitro, é crucial para a confirmação da

qualidade das células. A sua expressão desaparece à medida que a célula começa a se

diferenciar e, como esperado, esse fator não se encontra expresso em fibroblastos (Niwa

2007). A expressão de Oct-4 persistiu até a 16a passagem nas culturas de CTM derivadas do

tecido adiposo e até a 10a passagem na cultura de CTM da polpa dentária, indicando que as

células permaneceram indiferenciadas após a expansão in vitro. A manutenção da expressão

de Oct-4 na 5a e 25a quinta passagem foi evidenciada em culturas de CTM derivadas da polpa

dentária em estudos anteriores, porém com um protocolo de extração diferente do realizado

em nosso estudo (KERKIS et al, 2006). Essa análise revelou que a expressão de Oct-4 é

mantida ao longo da expansão in vitro, tanto de culturas de CTM derivadas de tecido adiposo

quanto de polpa de dente decíduo.

Avaliação citogenética

O controle da estabilidade genética de culturas de células expandidas antes do

transplante é determinante na terapia celular, para se evitar o aparecimento de tumores

causados por possíveis alterações cromossômicas (MITALIPOVA et al 2005). A análise

citogenética de culturas de CTM derivadas da medula óssea após a expansão in vitro por 3

(ZHANG et al 2007) e 25 passagens (BERNARDO et al 2007) apresentou cariótipo diplóide

normal. Pouco se encontra na literatura à respeito da estabilidade genética de culturas de CTM

derivadas de tecido adiposo e da polpa de dente decíduo. Dois grupos independentes

analisaram a variabilidade cromossômica de culturas de CTM derivadas do tecido adiposo.

Mudanças cariotípicas, tais como monossomia e translocação, foram detectadas na 11a e 14a

passagens (BOCHKOV et al 2007), enquanto que outro grupo relatou que a incidência de

aberrações era negligenciável na maioria das culturas de longa duração (MEZA-ZEPEDA et

al 2008). Um único trabalho sobre cultura de CTM da polpa dentária relatou a presença de

cariótipo normal na 25a passagem (KERKIS et al., 2006). Nossos resultados corroboram com

esse último relato sobre a manutenção do cariótipo normal nas duas culturas testadas, já que

nas três passagens analisadas (2a, 5° como 10°) não foram observadas alterações nas condições

de culturas empregadas. É possível que os resultados conflitantes na literatura ocorram em

61

decorrência das diferenças nas condições de cultura (escolha do soro e meio de culturas),

assim como número de células analisadas.

Figura 29. Características das culturas de CTM derivada de epitélio amniótico, tecido adiposo e polpa do

dente decíduo.

Considerações finais

A pesquisa translacional representa uma nova perspectiva em que todos devem

trabalhar de forma complementar e sinérgica para que o paciente seja beneficiado. A

rastreabilidade das células é peça fundamental para se entender os mecanismos pelos quais

elas estão atuando no organismo e exercendo o seu papel reparador. A instabilidade genética

que leva a tumorigenicidade poderia ser rotineiramente avaliada através da citogenética

utilizando-se a técnica do bandeamento-G, pois é sabido que fatores externos podem induzir

mutações e aneuploidias na cultura. As características fenotípicas de cada fonte de CTM

talvez seja um fator determinante na atividade terapêutica. Entender as similaridades e

diferenças entre elas poderá ser útil na composição de uma correlação entre o sucesso

terapêutico encontrado e uma determinada fonte de células. Possivelmente no futuro, as

informações referentes à definição do tecido de origem, via de administração, biodistribuição

das células e estabilidade das culturas de CTM serão exaustivamente avaliadas antes do

estabelecimento do protocolo clínico.

62

7 CONCLUSÕES

______________________________________________________________________

• As CTM isoladas do tecido amniótico possuem reduzida capacidade proliferativa

quando comparado às CTM isoladas do tecido adiposo e polpa de dente decíduo

humano;

• A expressão de antígenos de superfície das culturas de CTM possui um padrão similar

em todas as fontes pesquisadas. No entanto, cada cultura pode apresentar

particularidades inerentes à sua origem ou ao meio de cultivo e processo analítico.

• As CTM derivadas do tecido adiposo e polpa de dente decíduo se diferenciaram em

linhagem adipogênica e osteogênica quando cultivadas com meio específico para

diferenciação.

• A expressão do fator de transcrição Oct-4 é mantida após expansão in vitro até a 10a

passagem em culturas de CTM derivadas da polpa de dente decíduo e 16a passagem

em culturas de CTM derivadas do tecido adiposo.

• A análise citogenética revelou manutenção do cariótipo normal nas culturas de CTM

derivadas do tecido adiposo e polpa de dente decíduo até a 10a passagem, nas

condições de culturas empregadas.

63

8 REFERÊNCIAS ______________________________________________________________________ ALSALAMEH, S.; et al. Identification of mesenchymal progenitor cells in normal and osteoarthritic human articular cartilage. Arthritis Rheum., v. 50, p. 1522-1532, 2004. ALVAREZ-DOLADO, M.; et al. Fusion of bone marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature, v. 425, p. 968-973, 2003. ASTORI, G.; et al. "In vitro" and multicolor phenotypic characterization of cell subpopulations identified in fresh human adipose tissue stromal vascular fraction and in the derived mesenchymal stem cells. J. Transl. Med., v. 5, p. 55. 2007. AVILION, A.A.; et al. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. Genes, v. 17, n. 1, p. 126-140, 2003. BADDOO, M.; et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J. Cell. Biochem., v. 89, p. 1235-1249, 2003. BAKSH, D., SONG, L., TUAN, R.S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J. Cell. Mol. Med., v. 8, n. 3, p. 301-316, 2004. BARCH, M.J., KNUTSEN, T., SPURBECH, J. L. The AGT Cytogenetics Laboratory Manual. Third Edition. Philadelphia, 666p, 1997. BERNARDO, M.E.; et al. Human bone marrow derived mesenchymal stem cells do not undergo transformation after long-term in vitro culture and do not exhibit telomere maintenance mechanisms. Cancer Res.,v. 67, n. 19, p. 9142-9149, 2007. BIANCO, P., ROBEY, P.G. Stem cells in tissue engineering. Nature, v. 414, n. 6859, p. 118-121, 2001. BILIC, G.; et al. Comparative characterization of cultured human term amnion epithelial and mesenchymal stromal cells for application in cell therapy. Cell Transplant., v. 17, n. 8, 955-968, 2008. BOBIS, S., JAROCHA, D., MAJKA, M. Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical applications. Folia Histochem. Cytobiol., v. 44, n. 4, p. 215-230, 2006. BOCHKOV, N.P.; et al. Chromosome variability of human multipotent mesenchymal stromal cells. Bull. Exp. Biol. Med., v. 143, n. 1, p. 122-126, 2007. BOYER, L.A.; et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell, v. 122, n. 6, p. 947-956, 2005. BOYUM, A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Lab. Invest., v. 97, n. 7, 1968.

64

CATALINA, P.; et al. Conventional and molecular cytogenetic diagnostic methods in stem cell research: A concise review. Cell Biology International, v. 31, n. 9, p. 861-869, 2007. CHOPP, M., L.I, Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet Neurol., v. 1, n. 2, p. 92-100, 2002. CLARKE, D.L.; et al. Generalized potential of adult neural stem cells. Science, n. 288, p. 1660-16663, 2000. DAI, W.; et al. Allogeneic mesenchymal stem cell transplantation in postinfarcted rat myocardium: short- and long-term effects. Circulation, v. 112, n. 2, p. 214-223, 2005. DAN, Y.Y., YEOH, G.C. Liver stem cells: a scientific and clinical perspective. J Gastroenterol Hepatol., v. 23, n. 5, p. 687-698, 2008. D'AQUINO, R.; et al. Dental Pulp Stem Cells: A Promising Tool for Bone Regeneration. Stem Cell Rev., 2008. DAVILA, C.J.; et al. Use and applications of Stem Cells in Toxicology. J. Toxicol. Sci., v. 79, 214-223, 2004. DE UGARTE, D.A.; et al. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow. Cells Tissues Organs, v. 174, p.101-109, 2003. DENNIS, J.E., CHARBORD, P. Origin and differentiation of human murine stroma. Stem Cells, v. 20, p. 205-214, 2000. DEVINE, S.M., HOFFMAN, R. Role of mesenchymal stem cell in hematopoietic stem cell transplantation. Curr. Opin. Hematol., v. 7, p. 358-363, 2000. DIWAN, S.B., STEVENS, L.C. Development of teratomas from ectoderm of mouse egg cylinders. J. Natl. Cancer Inst., v. 57, 937-942, 1976. DOCHEVA, D.; et al. Human mesenchymal stem cells in contact with their environment: surface characteristics and the integrin system. J. Cell Mol. Med., v. 11, n. 1, 21-38, 2007. DOMINICI, M.; et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, v. 8, p. 315-317, 2006. FIBBE, W.E., NOORT, W.A. Mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells transplantation . Ann NY Acad Sci. v. 996, p. 235-244, 2003. FRIEDENSTEIN, A.J., CHAILAKHJAN, R.K., LALYKINA, K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet., v. 3, n. 4, p. 393-403, 1970. GREGORY, C.A.; et al. Wnt signalling inhibitor Dkk-1 is required for re-entry into the cell cycle of human adult stem cells from bone marrow stroma (hMSCs). J Biol Chem, v. 278, 28067-28078, 2003.

65

GRONTHOS, S.; et al. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J. Cell Physiol., v. 189, n. 1, 54-63, 2001. GRONTHOS, S.; et al. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., v. 97, n. 25, p. 13625-13630, 2000. GRONTHOS, S.; et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J. Dent. Res., v. 81, n. 8, p. 531-535, 2002. GROVE, J.E., BRUSCIA, E., KRAUSE, D.S. Plasticity of bone marrow-derived stem cells. Stem Cells., v. 22, n. 4, p. 487-500, 2004. GU, Y.Q.; et al. Transplantation of autologous bone marrow mononuclear cells for patients with lower limb ischemia. Chin. Med. J., v. 121, n.11, p.963-967, 2008. HORWITZ, E.M.; et al. Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of bone. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, v. 99, n. 13, p. 8932-8937, 2002. IN´T ANKER, P.S.; et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells, v. 22, p. 1338-1345, 2004. JACKSON, K.A., MI, T., GOODELL, M.A. Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, v. 96, p.14482-14486, 1999. JIANG, Y.; et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature, v. 418, 41-49, 2002. JONES, E.A; et al. Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells. Arthritis Rheum., v. 46, n. 12, p. 3349-3360, 2002. KERKIS, I.; et al. Isolation and Characterization of a Population of Immature Dental Pulp Stem Cells Expressing OCT-4 and Other Embryonic Stem Cell Markers. Cells Tissues Organs, v. 184, p. 105-116, 2006. KERMANI, A.J., FATHI, F., MOWLA, S.J. Characterization and genetic manipulation of human umbilical cord vein mesenchymal stem cells: potential application in cell-based gene therapy. Rejuvenation Res., v. 11, n. 2, p. 379-386, 2008. KHARAZIHA, P.; et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. Eur J Gastroenterol Hepatol., 2009. KOYAMA, N.; et al. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 67, n. 3, p. 501-506. 2009. KUO, T. K.; et al. Stem cell therapy for liver disease: parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells. Gastroenterology, v. 134, n. 7, p. 2111-2121, 2008.

66

KURTZ, A. Mesenchymal stem cell delivery routes and fate. Int. J. Stem Cells, v. 1, n. 1, 2008. LAINO, G.; et al. An approachable human adult stem cell source for hard-tissue engineering. J. Cell Physiol., v. 206, n. 3, p. 693-701, 2006. LEE, J.; et al., The human Oct-4 isoforms differ in their ability to confer self-renewal. J Biol. Chem., 2006. LEE, R.H.; et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol. Biochem., v. 14, n. 4-6, p. 311-324, 2004. LIE, D.C.; et al. Wnt signalling regulates adult hippocampal neurogenesis. Nature, v. 437, n. 7063, p. 1370–1375, 2005. LYRA, A.C.; et al. Feasibility and safety of autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients with advanced chronic liver disease. World J Gastroenterol., v. 13, n. 7, p. 1067-1073, 2007. MANNELLO, F., TONTI, G.A. Concise review: no breakthroughs for human mesenchymal and embryonic stem cell culture: conditioned medium, feeder layer, or feeder-free; medium with fetal calf serum, human serum, or enriched plasma; serum-free, serum replacement nonconditioned medium, or ad hoc formula? All that glitters is not gold! Stem Cells, v. 25, n. 7, p. 1603-1609, 2007. MARTIN, G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl. Acad. Sci.USA, v. 78, p. 7634-7638, 1981. MEZA-ZEPEDA, L.A.; et al. High-resolution analysis of genetic stability of human adipose tissue stem cells cultured to senescence. J. Cell Mol Med., v. 12, n. 2, p. 553-563, 2008. MIKI, T.; et al. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells, v. 23, n. 10, p. 1549-1559, 2005. MINGUELL, J.J., ERICES, A., CONGET, P. Mesenchymal stem cells. Exp. Biol. Med., v. 226, n. 6, p. 507-520, 2001. MITALIPOVA, M.M.; et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol., v. 23, n.1, p. 19-20, 2005. MITCHELL, J.B.; et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells, v. 24, n. 2, p. 376-385, 2006. MITSUI, K.; et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell, v. 113, n. 5, p. 631-642, 2003. MORIGI, M.; et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells accelerate recovery of acute renal injury and prolong survival in mice. Stem Cells, v. 26, n. 8, p. 2075-2082, 2008.

67

MULLER, M.; et al. Selection of ventricular like cardiomyocytes from ES cell in vitro. FASEB J. v. 14, p. 2540-2548, 2002. NAGY A.; et al. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., v. 90, n. 18, p. 8424-8428, 1993. NAGY, A., GOCZA, E., DIAZ, E.M. Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse. Development, v. 110, p. 815-821, 1990. NIWA, H., MIYAZAKI, J., SMITH, A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet., v. 24, n. 4, p. 372-376, 2000. NOGUEIRA, R.C.; et al. Early toxicity screening and selection of lead compounds for parasitic diseases. Curr. Drug Targets, v. 10, n. 3, p. 291-298, 2009. PAROLINI, O.; et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells, v. 2, p. 300-311, 2008. PITTENGER, M.F.; et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, v. 284, p. 143-147, 1999. REBELATTO, C.K.; et al. Dissimilar differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, and adipose tissue. Exp. Biol. Med., v. 233, n. 7, p. 901-913, 2008. RODDA, D.J.; et al.Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J Biol Chem., v. 280, n. 26, p. 24731-24737, 2005. ROMANOV, Y.A., SVINTSSISKAYA, V.A, SMIRNOV, V.N. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from human umbilical cord blood. Stem Cells, v. 21, p. 105-110, 2003. SANCHEZ, O., ESCOBAR, J.I., YUNIS, J.J. A simple G-banding technique. LANCET, v. 2, n. 7823, p. 269, 1973. SEKIYA, I.; et al. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality. Stem Cells, v. 20, n. 6, p. 530-541, 2002. SHAHDADFAR, A.; et al. In vitro expansion of human mesenchymal stem cells: choice of serum is a determinant of cell proliferation, differentiation, gene expression, and transcriptome stability. Stem Cells, v. 23, n. 9, p. 1357-1366, 2005. SHI, S., GRONTHOS, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone. Miner. Res., v. 18, n. 4, p. 696-704, 2003. SHOCKLEY, K.R.; et al. PPARgamma2 Regulates a Molecular Signature of Marrow Mesenchymal Stem Cells. Res., p. 81219, 2007.

68

SNYKERS, S.; et al. Chromatin remodeling agent trichostatin A: a key-factor in the hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells derived of adult bone marrow. BMC Dev. Biol., v, 2, p. 7-24, 2007. SNYKERS, S.; et al. In vitro differentiation of embryonic and adult stem cells into hepatocytes: state of the art. Stem Cells, v. 27, n. 3, p. 577-605, 2009. SOLTER, D. From teratocarcinomas to embryonic stem cells and beyond: a history of embryonic stem cell research. Nat. Rev. Genet., v. 7, n. 4, p. 319-327, 2006. STENDERUP, K.; et al. Aging is associated with decreased maximal life span and accelerated senescence of bone marrow stromal cells. Bone, v. 33, n. 6, p. 919-926, 2003. STREM, B.M.; et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med, v. 54, n. 3, p. 132-141, 2005. TALÉNS-VISCONTI, R.; et al. Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. World J. Gastroenterol., v. 12, n. 36, p. 5834-5845, 2006. THEISE, N.D., Krause, D.S. Toward a new paradigm of cell plasticity. Leukemia, v. 16, p. 542-548, 2002. THOMSON, J.A.; et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, v. 282, p. 1145-1147, 1998. TOMA, J.G. ; et al. Isolation of multipotent adult stem cells from dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol., v. 3, p. 778-784, 2001. VARMA, M.J.; et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev., v. 16, n. 1, p. 91-104, 2007. VILAS-BOAS, F.; et al. Early results of bone marrow cell transplantation to the myocardium of patients with heart failure due to Chagas disease. Arq. Bras. Cardiol., v. 87, n. 2, p. 159-166, 2006. WADDINGTON, R.J.; et al. Isolation of distinct progenitor stem cell populations from dental pulp. Cells Tissues Organs., v. 189, n. 1-4, p. 268-274, 2009. XU, R.H.; et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophlobast. Nat. Biotechnol., v. 201, p. 1261-1264, 2002. YANG, L; et al. In vivo trans-differentiation of adult hepatic stem cells into pancreatic endocrine hormone-producing cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, v. 99, p. 8078-8083, 2002. YAO, K.; et al. Administration of intracoronary bone marrow mononuclear cells on chronic myocardial infarction improves diastolic function. Heart, v. 94, n. 9, p. 1147-1153, 2008.

69

ZHAO, Y., GLESNE, D., HUBERMAN, E. A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. Proc Natl. Acad. Sci. U S A, v. 100, p. 2426-2431, 2003. ZHU, Y.; et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC. Cell. Biochem. Funct., v. 26, n. 6, p. 664-675, 2008. ZUK, P.A.; et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng., v. 7, p. 211-228, 2001.

70

9 ANEXOS

____________________________________________________________________