ISH IN SITU HYBRIDISERING (ISH) Definisjon Metode og ...
Transcript of ISH IN SITU HYBRIDISERING (ISH) Definisjon Metode og ...
1
IN SITU HYBRIDISERING (ISH) Metode og analyse i diagnostikk
Kurs i Molekylærpatologi
Oslo Kongressenter
8. Juni 2017
Klaus Beiske
Avd. for patologi, KLM
Oslo Universitetssykehus Radiumhospitalet
ISH Definisjon
ISH • identifiserer nukleotidsekvenser (DNA, RNA)
- av endogen (human) eller eksogen (infeksiøs) opprinnelse
- vha hybridisering av en probe til komplementære målsekvenser
• korrelerer deres lokalisasjon til cellens/vevets morfologi
ISH Anvendelsesområder
Formalinfiksert
parafininnstøpt vev
Benmargsaspirat
Blodprøver
ISH Anvendelsesområder
Parafinsnitt Cytospin
Imprint
Utstryk
ISH Anvendelsesområder
Deteksjon av
* endogene gensekvenser
DNA: - hele kromosomer: antall per kjerne (aneuploidi)
- enkelte gener:
- amplifikasjon
- delesjon
- translokasjon
RNA: - genekspresjon (mRNA)
* eksogene gensekvenser
f. eks. virus (DNA, RNA), bakterier, sopp
ISH Agenda
Prosedyre – fiksering av vev/celler
– forbehandling av vev/celler
– prober
• typer
• merking
– hybridisering
– deteksjon
– kontroller
2
ISH Prosedyre
Fiksering av vev/celler * formål: kombinere maksimal preservasjon av
målsekvensene med optimal morfologi
* typer: best egnet: 4% bufret paraformaldehyd
pH 7.4 i 3-24 timer
mindre egnet: di-aldehyder
- krever mer demaskering
uegnet: syre/tungmetall-holdige fiksativer - kan ødelegge nukleotid- sekvenser * tidspunkt: så raskt som mulig etter prøvetaking
ISH Agenda
Prosedyre – fiksering av vev/celler
– forbehandling av vev/celler
– prober
• typer
• merking
– hybridisering
– deteksjon
– kontroller
ISH Prosedyre
Forbehandling av vev/celler
* montering på poly-L-lysin dekkete objektglass
* demaskering av målsekvenser:
- proteolytiske enzymer (proteinase K, pepsin, trypsin)
- non-ioniske detergenter (Triton X-100, saponin)
- mikrobølgeovn, damptrykk-koking
* postfiksering (paraformaldehyd)
ISH
Prosedyre – fiksering av vev/celler
– forbehandling av vev/celler
– prober • typer
• merking
– hybridisering
– deteksjon
– kontroller
ISH Prosedyre
Merking av prober 1. Radioaktiv (brukes ikke lenger i diagnostikk)
2. Ikke-radioaktiv
Signalmolekyler: • Fluorokromer: FISH (Fluorescens-ISH)
• Organiske kromogener: CISH (Kromogen-ISH)
• Metaller: Metallografisk ISH (Met-ISH) nanogold (1-30 nm) - forsølves/forgulles etter hybridisering (GOLDFISH = gold-facilitated ISH) - gir lysmikroskopisk sortfarging
FISH
3
FISH CISH
© Klaus Beiske, RH
ISH - Prosedyre • Indirekt merking av prober
Målsekvens
Probe
Biotin Digoxigenin FITC
Streptavidin antistoffer
FITC
Enzymer: HRP, AP Gold partikler
FISH
Substrat+chromogen Gold/silver coating
CISH Metallografisk ISH
binds to
ISH
Fordeler/ulemper ved ulike merkeprosedyrer
Fluorokromer Enzym/substrat
Sensitivitet (DNA) 1-5 kb 10 kb
Optisk oppløsning meget god begrenset
(Spatial resolution) 1 kb (linear DNA) ? 20-50 kb (interfase) 1-3 Mb (metafase)
Signalkombinasjon 2 - 12 2
Kvantifisering meget god semikvantitativ
Histologisk korrelasjon begrenset meget god
Holdbarhet begrenset ubegrenset
gain/amplifikasjon amplifikasjon
Best egnet for delesjon
påvisning av translokasjon
av gener
EnzMet (Enzym Metallografisk) ISH
HRP katalyserer
omvandlingen av
Ag+ ioner
til non-ionisk Ag
som deponeres
ved proben
SISH (Silver ISH)
Fordeler: meget sensitiv, god oppløsning, semikvantitativ
Ulemper: foreløpig kun én farge tilgjengelig (sorte partikler)
Metallografisk ISH: amplifisert HER2 i parafinsnitt av mammakarsinom
GOLDFISH konfluerende signaler
EnzMet ISH distinkte signaler
Powell et al, Hum Pathol 2007
4
ISH Agenda
Prosedyre – fiksering av vev/celler
– forbehandling av vev/celler
– prober
• typer
• merking
– hybridisering
– deteksjon
– kontroller
ISH Prosedyre
Hybridisering (1) forbehandlet (demaskert/etterfiksert) vev
* inkuberes med hybridiseringsmiks
(= probe(r), formamid, blokkerende DNA, buffer)
- evtl. prehybridisering med miks uten probe -
* dekkes med dekkglass og forsegles
* DNA målsekvenser (og evtl. proben) denatureres 5-10 min
ved 65-95 C
ISH Prosedyre
ISH Prosedyre
Hybridisering (2) * hybridiseres over natt ved 37-42 C
hybridiseringstemp. vanligvis 12-17 C lavere enn Tm
Tm: temperatur der 50% av probe/målsekvens er dissosiert
avh. av - formamidkons.
- saltkons. i buffer
- % andel C-G sekvenser
- lengde av DNA/RNA tråd
* vaskes med formamid-holdig buffer
alle konsentrasjoner, temperaturer og tider må tilpasses den individuelle proben, målsekvens og vevstype.
ISH Agenda
Prosedyre – fiksering av vev/celler
– forbehandling av vev/celler
– prober
• typer
• merking
– hybridisering
– deteksjon
– kontroller
ISH Prosedyre
Deteksjon avhengig av hvordan proben er merket
* radioaktive prober: autoradiografi (filmemulsion)
* fluorokrom-merkete prober:
fluorescensmikroskop
flow cytometri
* enzym-substrat/gull/sølv-merkete prober:
lysmikroskopi
elektronmikroskopi
5
FISH Deteksjon av fluorokrom-merkete prober
FISH Zeiss Axio Imager.Z2
ISIS analyse software (Metasystems)
ISH
Eksempler
1. Påvisning av eksogene (f. eks. virale) gensekvenser
2. Genekspresjonsanalyse
3. Cytogenetikk
- interfasekjerner
- metafasekromosomer
ISH Eksempler
1. Påvisning av eksogene, virale gensekvenser (1)
* Epstein Barr virus (EBV)
virus-spesifikk mRNA (EBER) påvises
i lymfeknutesvulst hos immunsupprimert individ
(=post-transplantasjons-lymfoproliferativ sykdom)
ISH for viral RNA er mer sensitiv enn
immunhistologi for viralt protein LMP
EBER ISH
6
anti-LMP-1
antistoff
Kombinasjon
av ISH (EBER)
og IHC (CD20)
PTLD monomorf type (lymfom)
ISH Eksempler
1. Påvisning av eksogene, virale gensekvenser (2)
* Human Papilloma Virus (HPV)
eks. på ulik oppløsning av signalene ved - merking med FITC - merking med enzym-substrat (peroksidase-DAB)
bestemmelse (høy-/lav risiko) av virus-stamme
HPV ISH
low risk
7
HPV ISH
low risk
Påvisning av eksogene gensekvenser
Eksempel: HPV
Lavgradig SIL:
mange episomale viruskopier
Cervixcancer:
få integrerte kopier
ISH
Forbedring av sensitivitet • Sensitivitet:
– Konvensjonell ISH: - minst 25 kopier/celle - probelengde 50-100 bp
– In situ PCR: 1 kopi/celle
• In situ (RT) PCR Målsekvens (DNA/RNA) amplifiseres in situ med PCR
PCR produktene påvises vha inkorporering av merkete nukleotider eller vha ISH med merket probe
Fordel: betydelig signalamplifikasjon
Ulemper: teknisk krevende risiko for amplifikasjon av uønskede sekvenser
• Deteksjonsrate for HPV ved cervixcancer – Konvensjonell ISH: 75%
– In situ PCR: >95%
RT in situ PCR
Eksempel: HIV-1 Latent infeksjon: 1 virusgenom/celle integrert i cellens DNA
krever in situ PCR
Aktiv infeksjon: varierende antall RNA transkripter/celle
krever RT in situ PCR
HIV-1 infiserte lymfocytter RT in situ PCR for HIV-1 RNA
Nuovo GJ, Hum Pathol 2007
Påvisning av eksogene gensekvenser
Eksempel: Polyomavirus Nyrebiopsi/urinprøve fra nyre-transplantert pas.
Påvisning av eksogene gensekvenser
Eksempel: Salmonellabakterier
FITC merket EUB338, universal 16s rRNA Bacteria probe
Utstryk Colonslimhinne
8
Påvisning av eksogene gensekvenser
Eksempel: blandet bakterieflora
Materiale fra periapikalt granulom i munnhule
FITC-EUB338 probe
universal 16s rRNA
Cy3-genus-spes.
Streptococcus probe
Simultan deteksjon
Sunde et al, Microbiology 2003
ISH
Eksempler
2. Genekspresjonsanalyse
* malignt lymfom med morfologi som plasmocytom
* ingen immunhistologisk påvisning av immunglobulin
* ekspresjon av kappa- eller lambda mRNA
Kappa mRNA
Lambda mRNA
ISH
Eksempler
3. Interfase cytogenetikk (analyse av cellekjerner)
- kromosomer: antall kopier per kjerne
- enkelte gener: - amplifikasjon - delesjon - translokasjon
9
+12
Kronisk lymfatisk leukemi CEP12/13q14/13q34
Trisomi 12
N
L
CEP12
© Klaus Beiske, RH
Økt kopitall av enkeltgener
© Klaus Beiske, RH
Økt kopitall av enkeltgener
Eksempel: HER2
KREATECH
© Klaus Beiske, RH
Økt kopitall av enkeltgener
Eksempel: HER2
KREATECH
© Klaus Beiske, RH
Brystkreft prognostisk status av HER2 med konvensjonell FISH på parafinsnitt
HER2/CEN17=0,7 HER2/CEN17=2,6 © Klaus Beiske, RH
Brystkreft prognostisk status av HER2 med konvensjonell FISH på utstryk
FNAC fra
metastatisk
intercostal
lesjon på
dorsal
thorax vegg
10
© Klaus Beiske, RH
Brystkreft prognostisk status av HER2 med DuoCISH
© Klaus Beiske, RH
Brystkreft prognostisk status av HER2 med HER2 SISH
HER2
HER2
HER2
CEN17
CEN17
CEN17
Ventana-Roche
© Klaus Beiske, RH
Brystkreft prognostisk status av HER2 med HER2 Dual Colour SISH
Ventana-Roche
© Klaus Beiske, RH
Brystkreft prognostisk status av HER2 med HER2 Dual Colour SISH
Ventana-Roche
A: normal
B: HER2 ampl.
C: mono17
D: poly17
© Klaus Beiske, RH
Brystkreft Sammenligning av HER2 FISH og HER2 Dual Colour SISH
HER2/CEN17=9,0 © Klaus Beiske, RH
Brystkreft Sammenligning av HER2 FISH og HER2 Dual Colour
ISH
HER2/CEN17=2,7
11
© Klaus Beiske, RH
Brystkreft Sammenligning av HER2 FISH og HER2 Dual Colour ISH
HER2/CEN17=0,9 © Klaus Beiske, RH
EGFR
CEN7
EGFR prognostisk status med Dual Colour ISH
Ventana-Roche
Delesjon av enkeltgener
Delesjon av enkeltgener
Eksempel: 1p36.3
Delesjon av enkeltgener prognostisk status av 1p36.3 i neuroblastom
Normal lymfocytt Neuroblastom med del1p36.3 © Klaus Beiske, RH
del11q22-q23 del17p13
17p13/11q22 17p13/11q22
N N
L
L
Delesjon av enkeltgener Eksempel: prognostisk status av 11q22-11q23 og 17p13 i KLL
12
© Klaus Beiske, RH
Halling et al, Hum Pathol 2007
Translokasjonsanalyser: split/break-off prober
Translokasjonsanalyser: split/break-off prober
Probene
• hybridiserer til
områder på hver side
av mål-genet
• segregerer ved
translokasjon
Klaus Beiske, Rikshospitalet
Ewing Sarkom
PNET/Ewing sarkom analyse med EWS/22q12 split/break-off probe
Normale lymfocytter PNET/EWS
cen22q12
tel22q12
cen22q12
tel22q12
22q12 (EWS)-assosierte translokasjoner
Rearrangering av EWS på 22q12
er ikke diagnostisk for ES/PNET!
EWS er bl.a. involvert i translokasjoner ved 4 andre tumores:
► Desmoplastisk rundcellet tumor (DRCT)
t(11;22)(p13;q12) EWS-WT1 95%
► Ekstraskeletalt myksoid chondrosarkom
t(9;22)(q22;q12) EWS-CHN 75%
► Myksoid liposarkom
t(12;22)(q13;q12) EWS-CHOP 5%
► Klarcellet sarkom (mal. melanoma of soft tissue)
t(12;22)(q13;q12) EWS-ATF1 ukjent
Alveolært rhabdomyosarkom
13
Rhabdomyosarkom Analyse med 13q14 Split/Break-off probe
embryonalt alveolært 8q24: positiv 14q32.3: positiv
N
Burkitt lymfom Analyse av begge translokasjonspartnere
i t(8;14)(q24;q32) med splitprober
© Klaus Beiske, RH
DuoCISH split probes
DAKO
Superposed signals
may mask each other
Translokasjonsanalyser: fusjonsprober
Translokasjonsanalyser: fusjonsprober
Klaus Beiske, Rikshospitalet
Probene
• hybridiserer til
hvert av
partnergenene
• fusjonerer ved
translokasjon
Mantelcellelymfom t(11;14)(q13;q32)
14
Mantelcellelymfom analyse av t(11;14)(q13;q32) med BCL1/IgH –spesifikke fusjonsprober
Imprint fra lymfeknute Parafinsnitt av imprintet flate
N
FISH analyser ved OUS
ISH
Oppsummering
• ISH er en undersøkelse av feil ved et enkelt gen (amplifikasjoner, delesjoner,
translokasjoner). Bruken av ISH må vurderes opp mot bruken av PCR
• Fordeler med FISH ift PCR:
– Histologisk kontroll sikrer at prøvematerialet er representativt
– I blandete populasjoner kan enkeltceller (subpopulasjoner) analyseres vha morfologisk
kontroll
– Høyere sensitivitet ved påvisning av translokasjoner med variable bruddpunkter
• Ulemper med FISH ift PCR:
– Avlesning krever tid og morfologisk erfaring
– Egner seg derfor ikke til rask analyse av store prøvemengder
• Fordeler med bruk av FISH i forh. Til CISH/SISH:
– bedre optisk oppløsning (små signalmolekyler)
– eksakt kvantifisering mulig
– samtidig anvendelse av multiple prober