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Resolución de Problemas de Laboratorio en Biología Molecular (4 julio 2013) EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON ÁCIDOS GRASOS SOBRE EL PESO Y LA MICROBIOTA INTESTINAL DE RATONES OBESOS Jorge R. Mujico 1 , Gyselle C. Baccan 2 , Alina Gheorghe 1 , Ligia E. Díaz 1 & Ascensión Marcos 1 1 Grupo de Inmunonutrición (http://www.inmunonutricion-csic.com) Departamento de Metabolismo y Nutrición Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC) Madrid, Spain 2 Instituto de Ciencias de la Salud Universidad Federal de Bahía Salvador, Brasil 1
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Resolución de Problemas de Laboratorio
en Biología Molecular (4 julio 2013)
EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN
CON ÁCIDOS GRASOS SOBRE EL PESO
Y LA MICROBIOTA INTESTINAL DE
RATONES OBESOS Jorge R. Mujico1, Gyselle C. Baccan2, Alina Gheorghe1,
Ligia E. Díaz1 & Ascensión Marcos1
1 Grupo de Inmunonutrición
(http://www.inmunonutricion-csic.com)
Departamento de Metabolismo y Nutrición
Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición
(ICTAN-CSIC)
Madrid, Spain
2 Instituto de Ciencias de la
Salud
Universidad Federal de Bahía
Salvador, Brasil
1
• Prevalencia mundial del sobrepeso y la obesidad
• Obesidad: trastornos metabólicos y
cardiovasculares, tales como diabetes tipo 2,
aterosclerosis, hipertensión e infartos
• Nuevas sustancias que podrían ser utilizadas para
controlar el peso corporal y mejorar la salud de los
pacientes obesos
Introducción
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• Estudios en modelos experimentales y humanos:
• La composición de la microbiota intestinal de las
personas obesas es diferente respecto de las
delgadas
• Los cambios en la dieta o la pérdida de peso pueden
conducir a alteraciones de la microbiota intestinal (Ley
et al., 2006; Santacruz et al., 2009; Delzenne et al.,
2011; Jumpertz et al., 2011)
• La microbiota intestinal desempeña un papel importante
en la regulación del almacenamiento y metabolismo de las
grasas (Bäckhed et al., 2004; Cani and Delzenne, 2009)
Introducción
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La composición de la microbiota puede dar lugar a una respuesta
inmune saludable o predisponer a la enfermedad:
Alteraciones en el desarrollo normal de la microbiota podrían
afectar al desarrollo inmunológico y potencialmente predisponer a
los individuos a desarrollar diversas enfermedades inflamatorias
Introducción
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Introducción
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El consumo de una dieta alta en
grasas (DAG) está asociado a una
inflamación crónica y sistémica "de
bajo grado", que puede alterar la
composición de la microbiota
intestinal y ésta, a su vez, afectar al
proceso de desarrollo de la obesidad
Hipótesis de partida
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El objetivo del presente estudio ha sido
investigar la capacidad de ciertos ácidos
grasos para modular tanto el peso corporal
como la microbiota intestinal en un modelo
in vivo de obesidad inducida por DAG
Objectivo
S1: Compuesto derivado del ácido oleico
(1.500 mg/kg/día)
S2: Combinación de ácidos grasos omega-3
(ácidos eicosapentaenoico y docosahexaenoico,
3.000 mg/kg/día)
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Ochenta ratonas hembra ICR (CD-1®) de
8 semanas de edad fueron alimentadas con:
• Dieta Control (DC, )
• DAG no suplementada (DAG, )
• DAG suplementada con S1 (DAG-S1, )
• DAG suplementada con S2 (DAG-S2, )
Tres jaulas por cada grupo experimental
(jaula A, n 8; jaulas B y C, n 6)
Materiales & Métodos
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Composición de las dietas
Dieta Control (DC)
% (p/p)
Carbohidratos
Proteínas
Grasa Saturada
Grasa Mono-insaturada
Grasa Poli-insaturada
Fibra Soluble
Fibra Insoluble
50
Dieta Alta en Grasas (DAG)
50
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Análisis de la microbiota fecal
Los DNAs fueron extraídos de las muestras de heces (jaulas B y C) utilizando las QIAamp® DNA Stool Mini Kit (Qiagen)
Las concentraciones fueron determinadas mediante fluorimetría (Fluorescent DNA Quantification Kit, Bio-Rad)
La cuantificación de los distintos grupos de bacterias se realizó mediante PCR cuantitativa y SYBR Green I (Agilent)
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Cebadores o primers
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Para la PCR cuantitativa en tiempo-real se utilizaron los siguientes
primers* (específicos de distintos grupos de bacterias):
Ensayo PCR Secuencia (5'–3') Tamaño
amplicón (pb) Reference
Bacterias totales F: 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' R: 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'
200 Fierer 2005
Filo Firmicutes F: 5'-GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA-3' R: 5'-AGCTGACGACAACCATGCAC-3'
126 Guo 2008
Cluster Clostridial XIVa F: 5'-GCGGTRCGGCAAGTCTGA-3' R: 5'-CCTCCGACACTCTAGTMCGAC-3'
81 Ramírez-
Farias 2009
Grupo Lactobacillus F: 5'-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3' R: 5'-CACCGCTACACATGGAG-3'
341 Rinttila 2004
Orden Enterobacteriales F: 5'-ATGGCTGTCGTCAGCTCGT-3' R: 5'-CCTACTTCTTTTGCAACCCACTC-3'
177 Castillo 2006
Filo Bacteroidetes F: 5'-GGARCATGTGGTTTAATTCGATGAT-3' R: 5'-AGCTGACGACAACCATGCAG-3'
126 Guo 2008
Bifidobacterium spp. F: 5'-TCGCGTCYGGTGTGAAAG-3' R: 5'-RCCACATCCAGCRTCCAC-3'
243 Rinttila 2004
*Estos primers fueron comercialmente sintetizados por Isogen
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La DAG indujo un aumento del
peso corporal, que disminuyó tras
suplementar la dieta con S1
Resultados & Discusión (I)
0
60
7 0 Semanas
Peso
Co
rpo
ral
(g)
DAG-S1
DC
DAG / DAG-S2
DC DAG DAG-S1 DAG-S2 0
3500
* * * *
Áre
a B
ajo
Cu
rva
*P<0,05 (Kruskal-Wallis)
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Resultados & Discusión (I)
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DC DAG DAG-S1 DAG-S2
0
2
4
6
** *
** P
es
o G
ras
a V
isc
era
l (g
)
DC DAG DAG-S1 DAG-S2
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Resultados & Discusión (II)
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Ensayo PCR Pendiente Eficiencia
PCR (%)
Coeficiente
correlación
Bacterias totales -3,288 101,4 0,999
Filo Firmicutes -3,382 97,6 0,999
Cluster Clostridial XIVa -3,439 95,3 0,999
Grupo Lactobacillus -3,709 86,0 0,999
Orden Enterobacteriales -3,379 97,7 0,990
Filo Bacteroidetes -3,401 96,9 0,999
Bifidobacterium spp. -3,613 90,2 0,997
• Las curvas estándar tuvieron coeficientes de
correlación entre 0,990-0,999
• Usando la fórmula E = [10(-1/pendiente) - 1], las
eficiencias para cada ensayo individual
estuvieron entre 86,0-101,4%
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Resultados & Discusión (II)
Filo Firmicutes
DC DAG DAG-S1 DAG-S2
100
0
Un
ida
de
s R
ela
tiva
s
Grupo Lactobacillus
DC DAG DAG-S1 DAG-S2
100
0
Un
ida
de
s R
ela
tiva
s
Cluster Clostridial XIVa
DC DAG DAG-S1 DAG-S2
100
0
Un
ida
de
s R
ela
tiva
s
Orden Enterobacteriales
DC DAG DAG-S1 DAG-S2
* *
100
0
Un
ida
de
s R
ela
tiva
s *
*P<0,1 vs. CD (Kruskal-Wallis)
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El análisis de
correlaciones (Test de
Spearman) reveló que
el peso corporal
correlacionaba
positivamente con el
Filo Firmicutes
(P=0,0154) y el Cluster
Clostridial XIVa
(P=0,0022)
Resultados & Discusión (II)
Filo Firmicutes
0
80
0 100 Unidades Relativas
Peso
Co
rpo
ral
(g)
Cluster Clostridial XIVa
0
80
0 100 Unidades Relativas
Peso
Co
rpo
ral
(g)
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La suplementación con S1 restauró la proporción de
bacterias que habían disminuido con la DAG (por
ejemplo, Bifidobacterium spp.)
Resultados & Discusión (III)
Bifidobacterium spp.
DC DAG DAG-S1 DAG-S2
100
0
Un
ida
de
s R
ela
tivas
Filo Bacteroidetes
DC DAG DAG-S1 DAG-S2
100
0
Un
ida
de
s R
ela
tivas
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La suplementación con S1 restauró la proporción de
bacterias que habían disminuido con la DAG (por
ejemplo, Bifidobacterium spp.)
El análisis de correlaciones (Test de Spearman) reveló
que el peso corporal correlacionaba negativamente con
el Filo Bacteroidetes (P=0,0279)
Resultados & Discusión (III)
Bacteroidetes Phylum
0
80
0 100 Unidades Relativas
Peso
Co
rpo
ral
(g)
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El consumo de una DAG produjo cambios en la
microbiota fecal, que estaban asociados con la
aparición del fenotipo obeso
La suplementación de DAG con S1 contrarrestó la
disbiosis intestinal inducida por DAG, además de
disminuir el peso corporal
Estos resultados apoyan el papel de ciertos ácidos
grasos como nutrientes interesantes relacionados
con la prevención de la obesidad
Conclusiones
DAG-S1
DAG
Del-
gado Obeso
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Los resultados aquí presentados son parte del
estudio PRONAOS
Los autores agradecen el apoyo financiero de:
o El Programa CENIT (Consorcios Estratégicos
Nacionales en Investigación Técnica)
o BTSA-Biotecnologías Aplicadas (la compañía
que proporcionó los ácidos grasos)
Agradecimientos
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