INTRODUÇÃO - teses.usp.br

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INTRODUÇÃO

O mundo de hoje exige formação profissional bem diferente da que até

então era necessária. O profissional precisa ter visão globalizada dos problemas e

de suas soluções, iniciativa de pesquisa e procura de informações, análise crítica

do avanço tecnológico, criatividade nas decisões e relacionamento

multidisciplinar cooperativo no seu ambiente de trabalho (FRANÇA, 2001;

HÉRCULES, 1997a; KIELY, 2003; NORDBY, 2003).

A integração de seu conhecimento com outras áreas do saber é muito

importante. É preciso que o profissional seja capaz de encontrar soluções de

integração do técnico com o conjunto problemático (HAGLUND; SORG, 1997).

A Medicina Legal tem, necessariamente, de estar nesse contexto atual. É

uma ciência que nasceu das exigências da justiça, tendo de se adaptar aos avanços

científicos do momento histórico, como também às necessidades sociais e ao

ordenamento jurídico vigente (FRANÇA, 2001; KIELY, 2003). Ela está em

contínua adaptação e expansão. Seus conteúdos e sua metodologia se modificam,

não apenas pelos avanços tecnológicos e conhecimentos biomédicos, como

também pelas mudanças que acontecem no mundo do Direito (CAÑADAS, 2005;

FRANÇA, 2001). A Medicina Legal tem um leque de atividades que a envolve, o

que contribui, fundamentalmente, para o funcionamento da justiça e para resolver

inúmeras questões materiais e morais a ela relacionada (KNIGHT, 1997;

NORDBY, 2003).

Devido à contribuição multiprofissional, a Medicina Legal foi invadida por

uma enorme quantidade de informações e acontecimentos, principalmente, no que

diz respeito aos avanços das ciências biológicas (NORDBY, 2003; SORG, 2003).

Com o passar dos dias, mais se têm alargado os horizontes dessa curiosa e

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apaixonante matéria e sua contribuição para o meio jurídico tem sido de grande

valia. Onde houver a necessidade do saber técnico e científico, não pode ser

dispensada a contribuição dos peritos. Segundo França (2001):

Não há vocação maior que a inclinação às perícias médico-forenses, em que a rocha, muitas vezes, é cavada com as mãos e o seu trabalho se perde no anonimato e no silêncio, pois que dele tomam conhecimento apenas as autoridades policial-judiciárias.

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ESTIMATIVA DO TEMPO DE MORTE COMO UM DESAFIO MÉDICO – LEGAL

A determinação da data da morte é um dos problemas mais complicados e

difíceis que se pode apresentar ao médico legista (COE, 1989; GOFF; FLYNN,

1991; GRELLNER; GLENEWINKEL, 1997; HÉRCULES, 1997b). Os autores

clássicos como Orfila, Thoinot e Corin (apud CAÑADAS, 2005) acreditavam ver

na solução desse problema um propósito superior às forças do homem e são

muitos os trabalhos consagrados a esse tema (NOKES et al., 1992; QUERIDO,

1998; QUERIDO; PILLAY, 1988; SPARKS et al., 1989; STHEPHENS;

RICHARDS, 1987; WEHNER et al., 1999; WEHNER; WEHNER; SUBKE,

2001; WILLEY; HEILMAN, 1987).

O fator cronológico está tão intimamente ligado à Medicina Legal que é

uma de suas características mais peculiares (JAAFAR; NOKES, 1994; KNIGHT,

1991; LANGE; SWEARER; STURNER, 1994; MUÑOZ et al., 2001). A

determinação do tempo, às vezes, está acima de todas as atuações periciais e é

sempre uma questão médico-legal a resolver (DI MAIO; DI MAIO, 1993;

GRELLNER; GLENEWINKEL, 1997). Assim, desde a data da fecundação,

tempo de gestação, parto, tempo de sobrevivência do recém-nascido, idade do

sujeito vivo, cronologia das lesões até os problemas cronológicos que surgem

depois da morte, quando sobram restos mortais ou fragmentos de ossos, esse

problema está, continuamente, presente no trabalho médico-legal (BREITMEIER

et al., 2005; FRANÇA, 2001; GALLOWAY, 1997; HÉRCULES, 1997b;

YOSHINO; KIMIJIMA, 1991).

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França (2001) conceitua Tanatocronodiagnose ou Cronotanatognose ou

Diagnóstico Cronológico da Morte o espaço de tempo verificado entre diversas

fases do processo de decomposição do cadáver e o momento em que se verificou a

morte. Quanto maior é esse espaço, tanto mais difícil será a perícia.

Os fenômenos cadavéricos estudados ainda se apresentam insuficientes

para determinar o tempo da morte, pois, como se sabe, ela se constitui num

processo e não num momento exato (CAÑADAS, 2005; GILL-KING, 1997).

Quanto maior o intervalo postmortem, tanto mais difícil se torna determinar o

tempo de morte (KAHANA et al., 1999). Vários são os fatores internos e externos

que influenciam a evolução da morte (CAMPOBASSO; DI VELLA; INTRONA,

2001; RODRIGUEZ, 1997; ROTHSCHILD; SCHMIDT; SCHNEIDER, 1996) e

por isso sua cronologia varia de caso para caso (HENSSGE; MADEA;

GALLENKEMPER, 1988; SCHOENLY; GRIEST; RHINE, 1991; SMIALEK;

LEVINE, 1998). As exumações têm mostrado como são diversificados esses

resultados (GRELLNER; GLENEWINKEL, 1997).

Estabelecer com maior aproximação possível o momento da morte tem

grande importância. Isto pode interessar isoladamente, indicar com precisão

quando um determinado indivíduo morreu ou estabelecer a ocorrência da morte

em tempos muitos próximos (KNIGHT, 1991). No campo do Direito Penal,

afirmar o momento da morte pode representar o êxito ou o fracasso da

investigação policial no esclarecimento de um crime (KIELY, 2003). Começar

uma pesquisa com o erro de situar mal o momento de uma agressão mortal pode

presumir culpar um inocente ou inocentar o verdadeiro culpado (HÉRCULES,

1997b).

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Estabelecer o tempo de morte pode ser de extraordinária ajuda na

investigação criminal e o seu insucesso pode tornar impossível a reconstrução dos

fatos (HAGLUND; REAY, 1993).

O problema de se determinar o momento da morte é, essencialmente,

médico-legal e não apenas anatômico (CAÑADAS, 2005). Para o bom

desempenho da perícia é preciso recorrer a todas as evidências (HAGLUND;

REAY; SNOW, 1987), havendo ocasiões em que elementos estranhos ao processo

de decomposição do cadáver proporcionarão informações de grande valor na

cronotanatognose (SMITH, 1993).

Na realidade, não há lei que regule a evolução da putrefação, a qual pode

ser rápida em certas condições e de uma lentidão surpreendente em outras

(CAÑADAS, 2005; GONZALO, 2005). Além disso, as transformações

conservadoras dos cadáveres podem modificar seus prazos de destruição, embora

em alguns casos, sejam capazes de proporcionar, por si mesmas, indícios

cronológicos (COTTON; AUFDERHEIDE; GOLDSCHMIDT, 1987;

GALLOWAY, 1997; GALLOWAY et al., 1989; HAGLUND, 1993).

Nem sempre a putrefação destrói o cadáver num prazo relativamente curto

de tempo. Em determinadas circunstâncias, o processo putrefativo se detém uma

vez já iniciado e, outras vezes, atuam agentes físicos e biológicos que impedem o

progresso dos fenômenos destrutivos cadavéricos. Como conseqüência de ambas

as possibilidades, o cadáver pode permanecer conservado (CABIROL et al., 1998;

CLARK; WORREL; PLESS, 1997).

As circunstâncias que detêm a putrefação, uma vez iniciada, estão

representadas pelos processos naturais conservadores dos cadáveres, que são a

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mumificação, a saponificação ou adipocera, a calcificação e a corificação

(FRANÇA, 2001; GONZALO, 2005; HÉRCULES, 1997b). A investigação para

confirmar a formação de adipocera mereceu nosso interesse na presente

investigação dando continuidade a uma linha de pesquisa desenvolvida no Centro

de Medicina Legal (CEMEL) do Departamento de Patologia da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP).

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SAPONIFICAÇÃO E ADIPOCERA

A saponificação é um processo transformativo do cadáver, que consiste em

mudança química da gordura corporal convertida, por hidrólise, em composto

ceroso similar aos sabões (FORBES et al., 2004). Isso leva à formação de uma

armadura gordurosa, untosa, viscosa num estado úmido, mas que depois de seca

ao ar, adquire consistência dura, granulosa e de cor cinza-esbranquiçada. Ocorre

de fora para dentro, envolvendo o tronco e o esqueleto em suas extremidades.

Pode ocorrer de forma parcial ou geral (MELLEN; LOWRY; MICOZZI, 1993).

Fourcroy (1789 apud GONZALO, 2005) descreveu, pela primeira vez, o

processo de saponificação em alguns cadáveres exumados no Cemitério dos

Inocentes em Paris e, devido às características de uma substância que possuía

propriedades intermediárias entre a gordura e a cera, foi-lhe dada o nome

adipocera. Depois da Segunda Guerra Mundial, os estudos sobre o tema foram

intensificados (MAC LEOD, 1946; MANT, 1950; EVANS, 1963 apud

GONZALO, 2005), pois a inumação massiva de combatentes falecidos nas

grandes batalhas gerou facilidade na obtenção de grande quantidade de

exumações (MANT, 1987 apud VASS et al., 1992).

O processo de saponificação começa nas partes do corpo que contêm

maior quantidade de gordura, as primeiras a se transformarem em adipocera. Aos

poucos, vai-se estendendo pelo corpo, de modo que, em condições favoráveis,

toda gordura subcutânea pode ser envolvida no processo (MELLEN; LOWRY;

MICOZZI, 1993).

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Segundo Dix (1987), França (2001) e Gonzalo (2005), para que haja a

formação da adipocera se requer que ocorram certas condições ambientais e

individuais. Tal processo ocorre nas seguintes circunstâncias quando:

1. O cadáver está submergido em água parada ou de pouca corrente.

2. O cadáver está inumado em solo argiloso ou úmido.

3. Numerosos cadáveres estão enterrados uns em contato com os outros.

Determinadas condições individuais também desempenham um papel

importante na formação da adipocera. São elas:

1) Idade: a adipocera é freqüente nas crianças, pois a quantidade de

gordura subcutânea é proporcionalmente maior que nos adultos.

2) Sexo: o organismo feminino contém mais gordura do que o do homem.

3) Obesidade: ocorre muito raramente nos cadáveres de sujeitos magros e

caquéticos.

4) Condições patológicas: alcoolismo e outras intoxicações podem

originar uma alteração gordurosa.

Quando o processo de formação de adipocera abrange grandes partes do

corpo, o cadáver pode se conservar durante muito tempo e, aí surge um grande

interesse médico-legal pela possível comprovação, mesmo depois de um longo

tempo após a morte, de eventuais lesões nela presentes.

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HORMÔNIOS SEXUAIS

Os esteróides gonodais, em altas concentrações, são responsáveis pelo

desenvolvimento das características sexuais primárias e secundárias (OLSEN;

KOVACS, 1996).

Essas características sexuais secundárias, além dos próprios órgãos

sexuais, distinguem o sexo masculino do sexo feminino nos seguintes aspectos: 1)

distribuição dos pêlos corporais; 2) calvície; 3) voz; 4) pele e desenvolvimento de

acne; 5) desenvolvimento muscular; 6) crescimento; 7) metabolismo basal; 8)

equilíbrio hidroeletrolítico, entre outros (BYDLOWSKI, 2002a; GUYTON;

HALL, 2002).

Douglas (2002) afirma que antes da puberdade, tanto o esqueleto quanto a

massa corporal magra e o conteúdo de gordura são iguais nos dois sexos. Porém,

após a puberdade, a massa corporal magra e o esqueleto cresceram 1,5 vezes mais

no homem do que no sexo feminino, enquanto o conteúdo de gordura cresceu

duas vezes mais na mulher.

Os testículos secretam diversos hormônios sexuais masculinos, que são

coletivamente denominados androgênios. A testosterona, que é o mais abundante,

é considerado o hormônio testicular fundamental (GUYTON; HALL, 2002;

OLSEN; KOVACS, 1996).

A testosterona age desenvolvendo e logo mantendo uma função elevada de

tecidos e órgãos sexuais masculinos, como também de outros tecidos sensíveis,

que sob sua influência adquirem características masculinas (DOUGLAS, 2002).

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A partir do desenvolvimento testicular, o crescimento do esqueleto se

acelera, verificando-se aumento da espessura e densidade dos ossos, que se

tornam mais fortes e resistentes. Há maior desenvolvimento do tórax tornando-se

o diâmetro biacromial (entre os ombros) maior que o diâmetro bitrocantéreo

(pelve), ao contrário do que ocorre no sexo feminino sob a ação estrogênica

(HANDELSMAN, 2001).

Os músculos esqueléticos também aumentam de tamanho por hipertrofia,

manifestando-se mais salientes e fortes, assim, somaticamente o individuo do sexo

masculino torna-se mais resistente e apto para suportar melhor o trabalho físico e

a fadiga muscular (CATLIN, 2001). A testosterona aumenta a taxa metabólica

corporal, determinando maior consumo de oxigênio e tornando mais elevados os

requerimentos energéticos alimentares no sexo masculino, em relação ao sexo

feminino da mesma característica física (BAGATELL; BREMNER, 1996).

Os dois tipos de hormônios sexuais ovarianos são os estrogênios e as

progestinas. O mais importante dos estrogênios é o hormônio estradiol enquanto a

progestina mais importante é a progesterona (GUYTON; HALL, 2002)

Os estrógenos atuam como um hormônio estimulante nos tecidos dos

órgãos sexuais, e em outros ligados à reprodução. Causam deposição de gorduras

nas mamas, o desenvolvimento de seu estroma e o crescimento do sistema

canalicular. No tecido ósseo, os estrógenos estimulam a atividade osteoblástica,

provocando maior crescimento durante a fase puberal. Por outro lado, estimulam a

fusão das epífises ósseas por ossificação da cartilagem epifisária, cessando

precocemente o crescimento estatural (WEIGEL; ROWAN, 2001; BYDLOWSKI,

2002b).

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Os estrógenos acentuam o depósito de gordura no tecido subcutâneo e nas

mamas, além de fazê-lo também especialmente em outras partes específicas, como

nádegas e nas coxas por acentuação do número de células adiposas. O estradiol

tem ação mineralocorticóide, aumentando a reabsorção de sódio e água,

provocando retenção hidroeletrolítica (BYDLOWSKI, 2002b; GUYTON; HALL,

2002).

A ação da progesterona aumenta acentuadamente o conteúdo de glicogênio

das células. Nas mamas, a progesterona promove desenvolvimento dos lóbulos e

alvéolos mamários, que adquirem aspecto secretor. Pode também aumentar a

reabsorção renal de eletrólitos e de água (WEIGEL; ROWAN, 2001;

BYDLOWSKI, 2002b).

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HIPÓTESE DE TRABALHO

Estudos têm documentado como é variável a decomposição corporal, uma

vez que muitos fatores ambientais estão envolvidos. O processo pelo quais os

restos mortais se modificam depende da região, meio ambiente, das circunstâncias

em que eles são deixados, temperatura, umidade, condições aeróbicas e

anaeróbicas, além da presença de microrganismos e condições do solo (FORBES;

DENTB; STUART, 2005; SLEDZIK; MICOZZI, 1997; UBELAKER, 1997;

YAN et al., 2001). A transição entre a hora da morte de um corpo e a sua

esqueletização considerando as mudanças postmortem dos restos mortais onde são

encontrados é denominada Tafonomia (BEHRENSMEYER, 1984; HAGLUND,

2003; HAGLUND; SORG, 1997). Esses fatores são amplamente considerados

como interferentes na totalidade do processo que envolve a preservação ou não do

cadáver (BOYLE; GALLOWAY; MASON, 1997; HANZLICK, 1994; MICOZZI,

1986).

Devido às dificuldades de isolar fatores específicos que interferem na

decomposição do corpo humano ou de animais no meio ambiente, observações

experimentais têm contribuído para o entendimento dos mecanismos biológicos

envolvidos na tafonomia, principalmente aqueles relacionados a fenômenos de

preservação de tecidos (TAKATORI, 1996; TAKATORI, 2001).

Muito do que é cientificamente conhecido sobre a decomposição de corpos

foi e continua sendo pesquisado na “fazenda de corpos” da Universidade do

Tennessee – Knoxville (BASS, 1979; BASS; DRISCOLL, 1983; BASS;

BENNETT, 2000). Neste grande laboratório ao ar livre, cientistas forenses

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estudam o que acontece com os corpos humanos após a morte. Estes corpos, que

foram doados ou não reclamados, são colocados em ambientes que reproduzem as

condições da cena do crime como, por exemplo, corpos encontrados dentro de

carros, submersos em água, enterrados ou deixados expostos no meio ambiente.

Todas essas pesquisas têm auxiliado a esclarecer o processo de decomposição

cadavérica com o tempo de morte transcorrido (MANN; BASS; MEADOWS,

1990; VASS et al., 1992).

Contudo, a maioria dos estudos preocupa-se com fatores ambientais

relacionados ao processo de decomposição corporal (FORBES; DENTB;

STUART, 2005; O’BRIEN, 1997; RODRIGUEZ; BASS, 1985) enquanto pouco

se investigam os fatores relacionados às características biológicas do corpo, tais

como sexo, idade e proporção de gordura corporal. Porém, há pouca informação

na literatura sobre o papel específico do gênero na decomposição de corpos.

Em trabalho preliminar desenvolvido no CEMEL do Departamento de

Patologia da FMRP-USP, Rocha, Guimarães e Martin (2000) determinaram o

tempo de esqueletização completa de ratos Wistar (machos e fêmeas) em

diferentes tipos de sepulturas. Foi observado que o tempo de esqueletização de

ratos em sepultura de cimento é significativamente menor que o tempo de animais

sepultados diretamente na terra, o que orientou o uso do primeiro tipo de

sepultamento em estudos experimentais.

Outro dado observado, que chamou a atenção, foi a decomposição

cadavérica das fêmeas apresentar-se de modo diferente do observado nos machos.

Aparentemente, o processo de decomposição ocorreu de maneira mais lenta nas

fêmeas, uma vez que essas apresentavam resíduos de tecidos em decomposição

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em maior quantidade que os machos, que se encontravam totalmente

esqueletizados (ROCHA; GUIMARÃES; MARTIN, 2000).

Em estudo posterior Guimarães et al. (2004) descreveram o

desenvolvimento de um modelo experimental para verificar a relação entre

decomposição corpórea e sexo em ratos Wistar. Os dois grupos de animais

(machos e fêmeas) foram sepultados no mesmo local, sob as mesmas condições

ambientais, durante o mesmo intervalo de tempo. Os resultados confirmaram a

diferença da decomposição corporal entre machos e fêmeas observada,

inicialmente, no estudo de Rocha, Guimarães e Martin (2000, 2002).

Partindo do fato de que os hormônios sexuais são os responsáveis pela

diferenciação e manutenção das características sexuais (FODOR; VAN

LEEUWEN; SWAAB, 2002; SEALE et al., 2005; TRUDEAU et al., 2001), foi

decidido investigar a relação entre esses hormônios e a decomposição corpórea.

Para tal finalidade, esses dois grupos de animais foram divididos de acordo

com a fase hormonal predominante em que se encontravam até o momento da

morte, para investigar se os hormônios sexuais são um dos fatores responsáveis

pela diferença observada na decomposição corpórea.

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OBJETIVOS

Os objetivos propostos para o trabalho foram:

1) Registrar e comparar as variáveis ambientais temperatura, umidade

relativa do ar, chuvas e as variáveis corporais peso e teor de gordura

dos animais.

2) Descrever, macroscopicamente, a esqueletização comparando-se os

grupos segundo sexo e fase hormonal.

3) Identificar a composição da massa cadavérica proveniente dos restos

da decomposição corpórea através do método da cromatografia gasosa.

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MATERIAL e MÉTODOS

ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA

O protocolo de pesquisa com o número 05.1.441.53.4 foi submetido a

revisão ética e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) do

Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (USP).

ANIMAIS

Foram utilizados ratos da linhagem Wistar, sendo 30 machos e 60 fêmeas

provenientes do Biotério Geral do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de

São Paulo (USP), com idade aproximada de 20 dias e pesando entre 45 e 60g.

Esses foram alojados no Biotério do Departamento de Patologia da FMRP-USP e

mantidos em caixas de polipropileno forradas com maravalha, contendo cinco

animais em cada uma, tendo livre acesso à alimentação (ração comercial para

roedores) e água, sob estrito ciclo claro/escuro de 12/12h (luzes tubulares

fluorescentes acesas das 7h às 19h) mantidas por controlador digital e temperatura

de 23±2ºC.

FORMAÇÃO DOS GRUPOS

Machos: o grupo dos machos foi dividido em três subgrupos nomeados da

seguinte maneira:

10 Machos castrados sem reposição de testosterona (MCST)

10 Machos castrados com reposição de testosterona (MCCT)

10 Machos controles da testosterona (MCoT)

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Fêmeas: o grupo das fêmeas foi dividido em seis subgrupos nomeados da seguinte

maneira:

10 Fêmeas controles na fase diestro (FCoD)

10 Fêmeas controles na fase estro (FCoE)

10 Fêmeas controles na fase proestro (FCoP)

10 Fêmeas castradas sem reposição de hormônio (FCSH)

10 Fêmeas castradas com reposição de estrógeno (FCCE)

10 Fêmeas castradas com reposição de progesterona (FCCP)

GRUPO DOS MACHOS

O experimento foi iniciado por esse grupo e os animais foram pesados

semanalmente, por três meses, quando atingiram o peso corporal entre 350 e

450g.

Cirurgia

Dentre os 30 ratos utilizados, 10 deles foram submetidos a cirurgia de

castração entre o 21º e o 25º dia de vida.

Os mesmos foram anestesiados com tribromoetanol (Acros Oragnics, New

Jersey, USA) a 2,5% diluído em solução salina 0,9%, sendo 1mL de solução para

cada 100g de peso corpóreo e então submetidos a cirurgia para retirada dos

testículos por técnica padrão através de incisão na bolsa escrotal.

Reposição hormonal

A reposição hormonal foi feita utilizando DURATESTON® (Decanoato de

testosterona, Fenilpropianato de testosterona, Isocaproato de testosterona,

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Propionato de testosterona) com concentração de 0,6µg/mL de óleo para injeção

subcutânea, sendo 0,1mL de solução para cada 100g de peso corpóreo.

Duas semanas após a cirurgia, com aproximadamente trinta dias de vida, o

subgrupo MCCT recebeu a primeira dose de reposição hormonal e após 21 dias o

subgrupo recebeu a segunda e última dose de hormônio. A morte dos animais foi

feita com aproximadamente 80 dias de vida quando esses atingiram o peso

corporal entre 350 e 450g.

GRUPO DAS FÊMEAS

Após o término do experimento com o grupo dos machos foram iniciados

os trabalhos com esse grupo onde os animais foram pesados semanalmente, por

cinco meses, quando atingiram o peso corporal entre 350 e 450g.

Ciclo Estral

Diariamente, foi observado quando ocorreria a abertura do orifício vaginal.

Confirmada a abertura, foi realizada, sempre no período da manhã (7-9h), a coleta

de lavado de secreção vaginal com pipeta romba e solução salina 0,9%. O lavado

foi gotejado em lâminas de vidro para microscopia e analisado a fresco por

observação em microscópio óptico (Figura 1). Segundo Freeman (1994), as fases

do ciclo estral foram consideradas como:

− Proestro: caracterizada pela predominância de células epiteliais nucleadas.

Essas células são esféricas, visivelmente nucleadas e aparecem agrupadas

no pico dessa fase. O hormônio predominante é o estradiol.

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− Estro: predominância de células epiteliais escamosas cornificadas. Sua

forma é irregular, o citoplasma é granulado e não se observa o núcleo.

Essas células aparecem, também, em grande quantidade. Nessa fase estão

atuando os hormônios estradiol e progesterona.

− Diestro: a célula dominante nessa fase é o leucócito podendo estar

presentes células epiteliais cornificadas. O hormônio predominante é

estradiol.

O ciclo estral tem duração de 4-5 dias. O período de cada fase é variável,

sendo, a duração do proestro de 12-14h, do estro de 25-27h e diestro de 55-57h.

Os animais que apresentaram ciclo estral irregular foram selecionados para

ooforectomia bilateral. No momento da morte, foram formados os subgrupos de

acordo com a fase do ciclo em que se encontravam.

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Figura 1. Tipos celulares presentes no lavado de secreção vaginal das ratas durante as fases do ciclo estral (X 100). (A) Proestro caracterizada pela predominância de células epiteliais visivelmente nucleadas. (B) Estro distintamente caracterizada pela predominância de células epiteliais escamosas cornificadas com forma irregular, citoplasma granulado e ausência de núcleo. (C) Diestro é caracterizada pela predominância de leucócitos

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A

C

B

Cirurgia

Dentre as 60 fêmeas utilizadas, 30 foram selecionadas e submetidas a

ooforectomia bilateral com aproximadamente 50 dias de vida.

Os animais foram anestesiados com tribromoetanol (Acros Oragnics, New

Jersey, USA) à 2,5% diluído em solução salina 0,9%, sendo 1mL de solução para

cada 100g de peso corpóreo e então submetidos a cirurgia.

Reposição hormonal

Segundo Moorthy et al. (2004) a reposição hormonal deve ser feita por

quatro dias consecutivos. Essa reposição foi feita quatro dias antes da morte

desses animais, quando eles estavam com aproximadamente 150 dias de vida e

pesando entre 350-450g. Dos seis subgrupos, dois receberam reposição hormonal,

da seguinte maneira:

a) O subgrupo FCCE recebeu doses de cipionato de estradiol (17β-

cipionato de estradiol – Sigma, St. Louis, MO, USA) de 0,1μg/g p.c., ou seja, 10µ

g/100µl de veículo oleoso para cada 100g de peso corpóreo, por via subcutânea.

b) O subgrupo FCCP recebeu doses de progesterona (Sigma, St. Louis,

MO, USA) de 2,5μg/g p.c., ou seja, 250µg/100µl de veículo oleoso para cada

100g de peso corpóreo, por via subcutânea.

MORTE E SEPULTAMENTO

Machos e fêmeas foram observados até atingirem o peso entre 350 e 450g,

como realizado em Rocha, Guimarães e Martin (2000, 2002) e Guimarães et al.

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(2004), quando foram mortos em câmara de CO2 (ANDERSEN et al., 2004). A

morte dos animais foi feita em datas diferentes. Primeiramente, em fevereiro, foi

feita a morte apenas do grupo dos machos e em janeiro do ano seguinte a morte

das fêmeas.

Confirmada a morte dos animais, foram eles envolvidos individualmente

em gaze e algodão e colocados em caixas de madeira, representando uma urna,

medindo 47 x 23 x 9 cm, divididas em cinco compartimentos de 20,2 x 8 x 7,8

cm, para conter um animal em cada, sendo então fechadas com tampa de madeira.

O fundo de cada compartimento foi forrado com uma camada de folha de

alumínio e uma camada de papel filtro sobre essa (Figura 2A), para evitar o

contato direto dos corpos com a madeira, seguindo o procedimento de Guimarães

et al. (2004).

As urnas foram identificadas de acordo com o grupo e colocadas num

recipiente de cimento (caixa d’água) adquirido no comércio, medindo 65 x 49 x

44 cm, colocado em buraco cavado no solo para servir como sepultura (Figura

2B), nas dependências do Biotério Geral do Campus de Ribeirão Preto da USP.

Dentro dessa sepultura as urnas foram colocadas sobre tijolos mantendo uma

distância de 18 cm do fundo (Figura 2C), para evitar seu contato com líquidos que

pudessem se acumular no fundo, evitando exposição diferenciada à água.

Cada subgrupo foi dividido em duas urnas, sendo que uma foi colocada em

contato com tijolo e a outra sobre a primeira (Figura 2D). A sepultura foi tampada

para evitar o acesso de predadores. Desse modo, todos os animais foram mantidos

sob as mesmas condições ambientais (Figuras 2E e 2F). Após 120 dias de

sepultamento, com base em dados prévios descritos por Rocha, Guimarães e

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Martin (2000, 2002) e Guimarães et al. (2004), a exumação dos animais foi

realizada.

Os restos mortais foram levados ao Laboratório de Antropologia Forense

do Centro de Medicina Legal (CEMEL) da FMRP-USP para realização das

análises e registro fotográfico. Ao término das análises o descarte do material

restante foi eliminado como lixo hospitalar, segundo a normatização vigente

(ANDERSEN et al., 2004).

26

Figura 2. Etapas da morte e sepultamento dos animais. A) urna com divisórias forrada com papel alumínio e filtro contendo animais envolvidos em gaze e algodão; B) recipiente de cimento enterrado no solo representando a sepultura; C) sepultura com tijolos colocados no fundo da sepultura; D) urnas dentro da sepultura sobre os tijolos; E) sepultura utilizada para inumação dos machos e F) sepulturas utilizadas para inumação das fêmeas

27

3

A B

C D

E F

VARIÁVEIS

Temperatura

O experimento procedeu-se sob as condições ambientais do local. Em

intervalos de 24 horas, foram apenas registradas as temperaturas máxima e

mínima durante os dois diferentes períodos de inumação.

Umidade Relativa do Ar e Chuvas

O registro diário da umidade relativa do ar durante os períodos de

inumação foi obtido através do Centro de Cana-de-açúcar do Instituto

Agronômico de Campinas (IAC) – Unidade de Ribeirão Preto.

Em relação às chuvas foi observado se a água da chuva invadiu ou não a

sepultura deixando os corpos imersos em água e assim interferindo no

experimento.

Pesos

O peso dos animais foi registrado semanalmente. Entretanto, o peso foi

verificado em quatro momentos especiais:

1) inicial: quando os animais foram recebidos no biotério;

2) antemortem: foi o período antes e após a administração dos hormônios.

Foi observada a variação de peso principalmente para os subgrupos FCSH,

FCCE e FCCP porque esses dois últimos subgrupos receberam

doses de reposição hormonal por quatro dias consecutivos.

Não foi feito o acompanhamento diário da medida de peso do

28

subgrupo MCCT porque esse recebeu doses de reposição

hormonal a cada vinte e um dias.

3) no momento da morte;

4) no momento da exumação.

Gordura

No momento da morte dos animais foi feita a medida de gordura no dorso

de cada um utilizando-se um paquímetro.

ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os resultados foram organizados em uma base de dados

utilizando o software Statistical Package for Social Sciences (SPSS),

versão 10.1 para o Windows e os dados tratados, estatisticamente,

através da análise descritiva e inferencial. O nível de significância

utilizado foi α=0,05.

Foram feitas análises para as seguintes situações:

1) Temperatura e Umidade Relativa do Ar: foi verificado se houve

diferenças estatisticamente significativa entre as médias das

temperaturas e da umidade relativa do ar em que os grupos

ficaram expostos, sendo utilizado o Teste t de Student. Esse é

um teste paramétrico, por se tratar de uma amostragem

superior a 30 que compara duas amostras independentes.

29

2) Normalidade dos valores: por se tratar de subgrupos com uma

amostragem pequena (n=10), para verificar a Normalidade na

distribuição dos pesos (inicial, antemortem, no momento da

morte e na exumação) e na medida de gordura no dorso do

animal, inicialmente, foi utilizado o teste não-paramétrico de

Kolmogorov-Smirnov.

3) Pesos: para avaliar, entre os nove subgrupos, se houve diferenças

estatisticamente significativa na média dos pesos, foi realizado o teste da

Análise de Variância (ANOVA). Esse é um teste paramétrico, que

compara mais que duas amostras independentes. Quando

necessário, o teste Post Hoc de Tukey foi aplicado para

identificar os subgrupos diferentes.

4) Peso antemortem: essa análise foi realizada somente para os subgrupos FCSH,

FCCE e FCCP através do teste paramétrico t pareado que compara

duas amostras dependentes.

5) Gordura: para avaliar, entre os nove subgrupos, se houve diferenças

estatisticamente significativa na média da medida de gordura, foi realizado o

teste da Análise de Variância (ANOVA). Esse é um teste

paramétrico, que compara mais que duas amostras

independentes. Quando necessário, o teste Post Hoc de Tukey

foi utilizado para identificar os subgrupos diferentes.

Todas as médias foram apresentadas com seu desvio padrão.

30

ANÁLISE CROMATOGRÁFICA

Para a pesquisa de ácidos graxos foram colhidas amostras da massa

cadavérica proveniente dos restos da decomposição corpórea, que foram

encaminhadas ao Laboratório de Nutrição do Hospital das Clínicas da FMRP-

USP.

A extração dos ácidos graxos foi feita a 80ºC com clorofórmio-metanol,

segundo o método de Folch, Lees e Stanely (1956) modificado. Para a

identificação do composto, foi utilizado o cromatógrafo gás-líquido HP5890 Série

II utilizando a coluna Techonology IMC cat. 19091N-213 da Agilent.

A pressão de nitrogênio e hidrogênio foi mantida a 30mL/min e a pressão

do ar sintético a 300mL/min. Foi feita análise programada com temperatura inicial

da coluna a 180ºC e com temperatura final a 250ºC. A temperatura de injeção era

de 220ºC e a do detector era de 260ºC.

CRITÉRIOS PARA AVALIAR OS GRAUS DE ESQUELETIZAÇÃO

Foi criado um padrão para descrever a decomposição corpórea tendo como

referência o próprio esqueleto do animal, sendo chamado de grau de

esqueletização. Apenas três graus foram estabelecidos para a esqueletização: a

completa, a parcial e a mínima. Também foram descritas a presença de pele ou

pêlos.

31

A esqueletização foi considerada completa quando o esqueleto era visível,

com os ossos soltos, secos e sem resíduos, sem aderência de ligamentos, tendões e

restos musculares e completa ausência de tecidos moles.

A esqueletização foi considerada parcial quando partes do esqueleto eram

visíveis, apresentando restos musculares ou aderência de ligamentos, tendões e

massa cadavérica recobrindo algumas partes do esqueleto.

Já a esqueletização mínima foi quando os corpos estavam completamente

recobertos pela massa cadavérica ou até com presença de órgãos e vísceras,

apresentando muita umidade, onde não era possível visualizar o esqueleto.

32

33

RESULTADOS

TEMPERATURA

Externamente à sepultura, foram registradas as temperaturas máxima e

mínima para cada grupo em seu respectivo intervalo de 120 dias de inumação.

Para o grupo dos machos foi registrada a temperatura máxima de 42 ºC e a

temperatura mínima de 5ºC, obtendo-se uma média geral de 25,2±11,1 ºC

(Gráfico 1). A média da temperatura máxima foi de 35,3±4,9 ºC (Gráfico 2) e a

média da temperatura mínima foi de 15,1±4,3 ºC (Gráfico 3).

Para o grupo das fêmeas foi registrada a temperatura máxima de 46 ºC e a

temperatura mínima de 13ºC, obtendo-se uma média geral de 29,6±11,6 ºC

(Gráfico 1). A média da temperatura máxima foi de 40,7±3,5 ºC (Gráfico 2) e a

média da temperatura mínima foi de 18,5±2,4 ºC (Gráfico 3).

Na comparação entre as médias gerais das temperaturas dos dois grupos

foi observada diferença estatisticamente significativa (p=0,014).

34

Gráfico 1. Média geral(± DP) das temperaturas para cada grupo de animais em 120 dias de inumação

Gráfico 2. Média (± DP) das temperaturas máximas para cada grupo de animais em 120 dias de inumação

Gráfico 3. Média (± DP) das temperaturas mínimas para cada grupo de animais em 120 dias de inumação

35

GRUPOS

FêmeaMacho

95%

CI T

EMP

4442

40

38

36

3432

30

28

26

2422

20

18

16

1412

GRUPOS

FêmeaMacho

95%

CI T

EMP_

MAX

4442

40

38

36

3432

30

28

26

2422

20

18

16

1412

GRUPOS

FêmeaMacho

95%

CI T

EMP_

MIN

4442

40

38

36

3432

30

28

26

2422

20

18

16

1412

ºC

ºC

ºC

p=0,014

UMIDADE RELATIVA DO AR E CHUVAS

A umidade relativa do ar para o grupo dos machos variou entre 65 – 98%

obtendo-se uma média de 88,7±7,0 % (Gráfico 4).

Para o grupo das fêmeas a umidade relativa do ar variou entre 67 – 98%

obtendo-se uma média de 87,7±7,8 % (Gráfico 4).

Na comparação entre as médias não foi observada diferença

estatisticamente significativa (p=0,240).

Em relação às chuvas não foi observado o acúmulo de água da dentro da

sepultura.

Gráfico 4. Média (± DP) da umidade relativa do ar para cada grupo de animais em 120 dias de inumação

36

Umidade Relativa do Ar

75

80

85

90

95

100

Porc

enta

gen

Machos Fêmeas

p=0,240

NORMALIDADE DOS VALORES

O teste de Kolmogorov-Smirnov mostrou que houve

Normalidade na distribuição dos pesos inicial, antemortem, no

momento da morte e na exumação. A Tabela 1 mostra os valores

(em g) das médias dos pesos de acordo com cada fase do

experimento para seu respectivo subgrupo e o valor da

probabilidade (p) associada ao teste estatístico.

Tabela 1 – valores (em g) das médias (±DP) dos pesos de acordo com cada fase do experimento para seu respectivo subgrupo e o valor da probabilidade (p) associada ao teste estatístico.

Início Antemortem Morte ExumaçãoMédia±

DPp Média±

DPp Média±

DPp Média±

DPp

MCST 53,4±4,0 0,602

377,0±49,0 0,979

97,8±19,9 1,00

MCCT

52,9±3,4 0,800

370,0±38,3 0,804

98,6±27,4 0,349

MCoT 55,5±2,9 0,798

382,0±41,6 0,699

66,1±28,1 0,673

FCoD 53,5±5,3 0,582

347,0±33,0 0,834

60,1±20,5 0,705

FCoE 59,5±11,6 0,359

371,0±41,7 0,882

78,8±33,4 0,869

FCoP 61,5±7,5 0,904

370,0±45,0 0,451

79,5±25,2 0,990

FCSH 53,5±6,3 0,793

370,0±36,5 0,819

389,5±34,2 0,916

59,0±13,3 0,880

FCCE 54,5±8,3 0,431

373,0±32,7 0,592

380,0±33,7 0,752

57,0±9,8 0,999

FCCP 55,0±9,1 0,780

369,0±38,1 0,865

386,0±38,1 0,954

57,2±15,3 0,999

A Tabela 2 mostra os valores (em mm) das médias

encontradas na distribuição das medidas de gordura feitas no

dorso dos animais no momento da morte, para seu respectivo

subgrupo e o valor da probabilidade (p) associada ao teste

estatístico.

37

Tabela 2 – valores (em mm) das médias (±DP) encontradas na distribuição das medidas de gordura e o valor da probabilidade (p) associada ao teste estatístico.

Subgrupo Média±DP pMCST 4,3±0,7 0,452MCCT 3,8±0,8 0,587MCoT 3,7±0,7 0,452FCoD 3,9±0,7 0,539FCoE 3,6±0,5 0,110FCoP 3,9±0,6 0,130FCSH 3,8±0,8 0,587FCCE 4,6±0,7 0,312FCCP 4,4±0,7 0,062

PESOS

Peso Inicial

Analisando as médias dos pesos dos diferentes subgrupos

considerados (Gráfico 5), o teste ANOVA mostrou não haver

diferenças estatisticamente significativa (p=0,085).

Gráfico 5. Média (±DP) dos pesos dos subgrupos na fase inicial do experimento

38

GRUPOS

FCCPFCCEFCSHFCoPFCoEFCoDMCoTMCCTMCST

95%

CI I

NIC

IO

120

105

90

75

60

45

30

p=0,085

Peso

em

(g)

Subgrupos

Peso antemortem

Quando foram comparados os pesos antes e depois da

administração dos hormônios, o teste t pareado mostrou diferenças

estatisticamente significativa para os subgrupos FCCE (p=0,045) e

FCCP (p=0,0001). Também foi feito o mesmo teste para o subgrupo

FCSH, no mesmo intervalo de tempo, mostrando diferença estatisticamente

significativa (p=0,0004).

Peso no momento da morte


(Gráfico 6), o teste ANOVA mostrou não haver diferenças


39

GRUPOS


95%

CI M

OR

TE

1200

1050

900

750

600

450

300

Peso

em

(g)

Gráfico 6. Média (±DP) dos pesos dos subgrupos no momento da morte dos animais

Peso no momento da exumação


(Gráfico 7), o teste ANOVA mostrou haver diferenças

estatisticamente significativa (p<0,0001).

Gráfico 7. Média (±DP) dos pesos dos subgrupos no momento da exumação dos animais

O teste de Tukey mostrou que alguns subgrupos diferiram

entre si e essas diferenças, em relação às médias dos pesos no

momento da exumação, se apresentaram da seguinte maneira:

MCCT ≥ [MCST ≥ (FCoP=FCoE) ≥ MCoT ≥

(FCoD=FCSH=FCCP=FCCE)]

40

GRUPOS


95%

CI E

XUM

A

120

105

90

75

60

45

30

p=0,445

Subgrupos

Subgrupos

Peso

em

(g)

p<0,0001

O Gráfico 8 apresenta todos os valores das médias dos pesos

(em g) para seu respectivo subgrupo para cada fase do

experimento.

Gráfico 8. Valores das médias dos pesos (em g) para seu respectivo subgrupo para cada fase do experimento.

41

p=0,085

p<0,0001

p=0,445

p=0,0001p=0,0004p=0,045

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

MCST MCCT MCoT FCoD FCoE FCoP FCSH FCCE FCCP

Subgrupos

Peso

(g)

Início Antemortem Morte Exumação

MEDIDA DE GORDURA

Analisando as médias das medidas de gordura nos diferentes

subgrupos (Gráfico 9), o teste ANOVA mostrou haver diferenças


Gráfico 9. Média (±DP) das medidas de gordura nos diferentes subgrupos no momento da morte dos animais

O teste de Tukey mostrou que apenas dois grupos diferiram

entre si e esta diferença, em relação às médias das medidas de

gordura, se apresentou da seguinte maneira:

FCoE < FCCE

EXUMAÇÃO DOS ANIMAIS

Após 120 dias de inumação, as urnas foram retiradas da sepultura e todas

elas se apresentavam íntegras, com o mesmo aspecto externo (Figura 3A). No

42

GRUPOS


95%

CI G

OR

DU

RA

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

Subgrupos

Milí

met

ros

p=0,016

interior da sepultura não havia acúmulo de líquidos ou presença de fauna

cadavérica (Figura 3B).

No interior das caixas havia a presença de fauna cadavérica recobrindo o

algodão que envolvia os corpos (Figura 3C). Esse algodão foi cortado com tesoura

para evitar mudanças na posição dos restos dos corpos. Não foi observado o

contato dessa fauna com os corpos dos animais.

43

Figura 3. Aspecto interno da sepultura e urnas após a exumação dos animais. (A) Urnas íntegras na sepultura. (B) Sepultura após a remoção das urnas com ausência de líquidos e fauna. (C) Fauna encontrada no interior das urnas recobrindo o algodão e a gaze dos animais

44

A

B

C

GRAUS DE ESQUELETIZAÇÃO

Aplicando-se os critérios estabelecidos, o padrão definido para os

subgrupos de acordo com o grau de esqueletização apresentado, foi o seguinte:

− O subgrupo MCoT foi o único que apresentou um padrão de

esqueletização completa (Figuras 4A e 4B) mostrando 80% dos animais

nessa condição.

− Os subgrupos FCCP, FCoE, FCoD, FCoP, FCSH e FCCE apresentaram-se

com um padrão de esqueletização parcial (Figuras 5A e 5B). Cada grupo

apresentou, respectivamente, 70%, 70%, 80%, 80%, 90% e 100% dos

animais com massa cadavérica.

− Os subgrupos MCST e MCCT apresentaram um padrão de esqueletização

mínima (Figuras 6A e 6B). Nesses dois subgrupos 100% dos animais

continham massa cadavérica, sendo que ambos apresentaram 80% dos

animais totalmente recobertos por essa massa.

45

Figura 4. Animais após a exumação com grau de esqueletização completa. (A) e (B) animais com presença de pele, esqueleto visível, ossos soltos, secos e sem resíduos, sem aderência de ligamentos, tendões e restos musculares e completa ausência de tecidos moles

46

B

A

47

A

13

B

Figura 5. Animais após a exumação com grau de esqueletização parcial. (A) e (B) animais com partes do esqueleto visível, restos musculares, aderência de ligamentos, tendões e massa cadavérica recobrindo algumas partes do esqueleto

48

49

A

B

Figura 6. Animais após a exumação com grau de esqueletização mínima apresentando muita umidade e não visualização do esqueleto. (A) animal completamente recoberto pela massa cadavérica. (B) animal com presença de órgãos e vísceras

O gráfico 10 mostra a porcentagem dos graus de esqueletização entre as

diferentes fases hormonais em que os animais se encontravam.

Gráfico 10. Percentual dos graus de esqueletização entre os subgrupos.

A partir do subgrupo mais esqueletizado (MCoT) até o subgrupo menos

esqueletizado (MCCT) foi observado, aproximadamente, o seguinte:

MCoT > (FCCP=FCoE) ≥ (FCoD=FCoP) ≥ (FCSH=FCCE) > (MCST=MCCT)

MASSA CADAVÉRICA

Todas as massas cadavéricas analisadas, por cromatografia gasosa,

revelaram a presença dos ácidos palmítico, esteárico, oléico e linolêico com maior

percentual na mistura. A Tabela 3 mostra esses valores com apenas dois animais

50

Esqueletização

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

MCST MCCT MCoT FCoD FCoE FCoP FCSH FCCE FCCP

Subgrupos

Mínima Parcial Completa

representando o grupo. Esses resultados confirmaram que a massa cadavérica

tratava ser adipocera.

Tabela 3

51

A adipocera encontrada nos restos dos corpos de alguns animais se

apresentou em aspectos diferentes. Primeiro, em relação à quantidade, podendo

estar ausente ou até mesmo em grande abundância. Segundo, em relação ao seu

estado físico, sendo encontrada na forma pastosa, seca e em pó.

A forma pastosa apresentava coloração variada entre o marrom, amarelo,

verde e rosa. A adipocera tinha um aspecto gorduroso e viscoso e era fácil de

cortar e modelar (Figura 7A). O odor era forte e muito semelhante ao amoníaco.

Os pêlos estavam úmidos e a pele era, facilmente, aberta sem precisar de incisões.

A coloração da adipocera seca se apresentava em tons escuros entre o

preto e o marrom (Figura 7B). Embora o odor de amoníaco persistisse, era numa

intensidade bem menor. Os pêlos estavam secos e a pele parecia estar corificada e

era de difícil abertura sendo necessária a utilização de instrumento cortante para

rompê-la.

Somente alguns animais do grupo das fêmeas apresentaram a adipocera na

forma de pó semelhante a terra (Figura 8A). O odor era quase inexistente

comparativamente às outras formas apresentadas. Os pêlos se apresentavam secos

e a pele lembrava uma folha seca sendo, facilmente, rasgada com as mãos.

Também foi observada, em alguns animais que apresentaram adipocera

seca ou em pó, a presença de uma adipocera branca, com aspecto seroso e

quebradiço (Figura 8B).

52

Figura 7. Animais após a exumação com diferentes formas de adipocera. (A) Animal apresentando adipocera pastosa, com um aspecto gorduroso e viscoso, coloração entre o marrom, amarelo, verde e rosa. (B) Animal apresentando adipocera seca com tons escuros entre o preto e o marrom

53

B

A

Figura 8. Animais após a exumação com diferentes formas de adipocera. (A) Animal apresentando adipocera em pó, com um aspecto semelhante a terra (seta). (B) Animal apresentando adipocera branca, com aspecto seroso e quebradiço

54

A

B

55

DISCUSSÃO

Usando a metodologia proposta, uma das dificuldades encontradas

foi comparar a literatura com este trabalho. Rocha, Guimarães e Martin (2000,

2002) concluíram que a esqueletização acontecia mais rapidamente quando os

ratos eram colocados em caixas de madeira e sepultados em caixa de cimento.

Guimarães et al. (2004) observaram que havia diferenças na decomposição

corpórea apresentada entre os grupos de animais machos e fêmeas.

Sabendo-se que a variável sexo é apontada como fator de diferenciação na

decomposição corpórea (CAÑADAS, 2005; FRANÇA, 2001; GONZALO, 2005)

e que os hormônios sexuais são os responsáveis pela diferenciação e manutenção

das características sexuais (FODOR; SEALE et al., 2005; TRUDEAU et al., 2001;

VAN LEEUWEN; SWAAB, 2002), a relação entre esses hormônios e a

decomposição corpórea foi investigada.

Estimar o tempo de morte baseado em apenas uma única variável, seria

muito improvável (MANN; BASS; MEADOWS, 1990), o que leva à realização

de experimentos com informações controladas e conhecidas.

Na tentativa de apontar a variável hormônio como única diferença entre os

subgrupos foi feita a verificação das condições ambientais, como temperatura,

umidade, chuva e local de sepultamento. O local de sepultamento foi o mesmo

utilizado para todos os grupos. Mesmo a inumação sendo feita, aproximadamente,

com um ano de diferença, o experimento foi realizado na mesma estação, o verão.

A temperatura à qual os animais ficaram expostos, em datas diferentes, foi

apenas registrada e comparada posteriormente. Foi observado que houve diferença

significativa (p=0,014) entre a temperatura a que o grupo dos machos ficou

56

exposto (25,2±11,1ºC) e a temperatura do grupo das fêmeas (29,6±11,6ºC). A

temperatura média a que o grupo das fêmeas ficou exposto foi maior em 4,4ºC.

Mesmo assim, nenhum subgrupo apresentou o padrão de esqueletização completa

como aconteceu com o subgrupo MCoT que ficou exposto a temperatura menor.

Esse acontecimento difere das considerações feitas por Mann, Bass e Meadows

(1990), que observaram que no tempo frio a decomposição corpórea era mais

lenta ou até mesmo inibida e que a maior dificuldade em se estimar o tempo de

morte de um corpo era na época do ano em que a temperatura oscilava entre

morna e fria.

A temperatura do local onde está a sepultura pode ter exercido um efeito

significativo sobre a decomposição, pois a maioria das bactérias se proliferam em

uma temperatura ótima de aproximadamente 37ºC (MANHEIN, 1997; MURAD,

1997). A presença de água e bactérias nos tecidos tem-se mostrado necessária

para a formação da adipocera, pois que, experimentalmente, não se forma

adipocera em condições assépticas. Tais bactérias necessitam de um calor

moderado, pelo menos nas fases iniciais, para reprodução e metabolismo

(GOTOUDA et al., 1988; TAKATORI et al., 1986, 1987). Os ácidos graxos são

biosintetizados por enzimas de algumas variedades de bactérias aeróbicas e

anaeróbicas como, por exemplo, Bacilus subtilis, Micrococcus luteus,

Staphylococcus aureus e Clostridrium perfrigens que produzem ácido 10-

hidroxiesteárico e, somente M. luteus que produz oxiácidos graxos (GONZALO,

2005; GOTOUDA et al., 1988; PFEIFFER; MILNE; STEVENSON, 1998;

TAKATORI, 1996; TOMAS, 1972).

57

Fica uma lacuna a ser preenchida: saber se a diferença de 4,4ºC que

observamos pode ou não ter interferido no processo de decomposição dos corpos.

Como não foi observada diferença estatisticamente significativa (p=0,240)

com registro da umidade relativa do ar para os diferentes períodos de inumação, e

também não houve a interferência da água ambiental nas sepulturas, as condições

ambientais em relação à umidade em que os corpos ficaram expostos foram

consideradas iguais.

A decomposição corpórea e a formação da adipocera podem ocorrer em

alguns tipos de ambientes, mas isso depende muito das condições à sua volta

(BOYLE; GALLOWAY; MASON, 1997; COTTON; AUFDERHEIDE;

GOLDSCHMIDT, 1987; DIX, 1987; FORBES; DENT; STUART, 2005;

FORBES; STUART; DENT, 2005a, 2005b; GALLOWAY, 1997; GALLOWAY

et al., 1989). A terra usada na inumação, que fica em contato com o tecido, é um

tema bem explorado por Forbes, Dent e Stuart (2005), onde fatores relacionados

ao solo como pH, temperatura, umidade e oxigenação dentro da sepultura têm

papel importante no processo de formação da adipocera (FORBES et al., 2005;

FORBES; STUART; DENT, 2002, 2005a, 2005b). Os autores identificaram que a

temperatura do solo abaixo de 10ºC, a presença de cal na terra (pH 12,6), o solo

ácido (pH 2,4), a ausência de bactérias e as condições aeróbicas mostraram uma

redução ou inibição na formação da adipocera. Entretanto, com a temperatura

variando entre 22-40ºC, com o pH entre 5-9, com a presença de bactérias e

condições anaeróbicas, esses fatores promoveram a formação de adipocera

segundo os autores. A análise do pH do solo realizada por Mant (1957 apud

FORBES; STUART; DENT, 2005b) foi importante porque mostrou que a alta

58

acidez ou alcanilidade pode inibir o crescimento bacteriano e assim a

decomposição.

Não foram encontrados, na literatura, relatos sobre o controle dos pesos

dos animais. Foi confirmado pelo teste ANOVA que não houve diferenças

estatisticamente significativa entre os pesos iniciais (p=0,085) e os pesos no

momento da morte (p=0,445). Com esses dados podemos afirmar que todos os

animais foram inumados nas mesmas condições para a variável peso.

Comparando-se os pesos, antes e depois da administração dos hormônios,

o teste de t pareado mostrou diferenças estatisticamente significativa para os

subgrupos FCCE (p=0,045) e FCCP (p=0,0001) que receberam reposição

hormonal por quatro dias consecutivos antes de serem mortos. Para constatarmos

se essa diferença estava associada à administração do hormônio, o subgrupo

FCSH foi comparado durante o mesmo intervalo de tempo. Também foi

observada diferença estatisticamente significativa (p=0,0001), o que indica que a

variação de peso encontrada não foi devida à aplicação dos hormônios.

No momento da exumação, os pesos dos animais entre os subgrupos

apresentaram diferenças estatisticamente significativa (p<0,0001). O teste de

Tukey mostrou os subgrupos que diferiram e foi estabelecida uma relação

mostrando os subgrupos que estavam mais pesados, iguais e menos pesados.

Com o interesse de constatar se o teor de gordura subcutâneo interferiria

nas análises, no momento da morte, foi verificada a medida da espessura de

gordura no dorso dos animais. O teste ANOVA mostrou que havia diferença

estatisticamente significativa (p=0,016) na média das medidas de gordura e essa

59

diferença representava apenas qual foi a menor e a maior média encontrada entre

os subgrupos, mostrada pelo teste de Tukey.

Na exumação dos animais, tanto para o grupo dos machos quanto para o

grupo das fêmeas, não foi observado o acúmulo de líquidos no interior da

sepultura. A água ambiental que participa da formação da adipocera tem uma

grande importância, embora em sua ausência sua formação também seja possível.

Como demonstram as observações de Mant (1957 apud GONZALO,

2005), se houve formação de adipocera em tumbas não inundadas, ou seja, na

ausência de água exterior, a água necessária para a formação da adipocera, ao

menos em uma primeira fase, provém dos tecidos corporais, que se desidratam

sensivelmente após a morte.

A decomposição corpórea se apresentou de maneira variada. Graus de

esqueletização foram criados para estabelecer uma padronização da quantidade de

massa cadavérica presente nos corpos dos animais. Esses graus de esqueletização

também serviram para definir qual seria o padrão apresentado pelo grupo.

O grupo dos machos estava dividido em três fases hormonais. O padrão

estabelecido para o subgrupo MCoT foi a esqueletização completa. Foi o único

subgrupo entre machos e fêmeas que apresentou esse padrão. Os subgrupos

MCST e MCCT apresentaram entre si o mesmo padrão de esqueletização mínima.

As comparações feitas entre os subgrupos dos machos mostraram grande

diferença no processo de decomposição corpórea. Enquanto o subgrupo MCoT

apresentou a maioria dos animais com o esqueleto visível, com ossos soltos, secos

e sem resíduos (Figuras 4A e 4B), para as mesmas condições ambientais e o

60

mesmo intervalo de tempo os subgrupos MCST e MCCT apresentaram animais

que continham órgãos e vísceras, totalmente preservados (Figura 6B).

O grupo das fêmeas estava divido em seis fases hormonais. Comparando-

se o grupo dos machos com o grupo das fêmeas não houve semelhança entre os

padrões apresentados, pois todos os subgrupos das fêmeas se apresentaram com o

grau de esqueletização parcial (Figuras 5A e 5B). Quando os subgrupos das

fêmeas foram comparados entre si, foram apenas observadas diferenças, somente,

em relação aos subgrupos que apresentavam um número maior de animais com

esqueletização completa.

Uma observação intrigante surgiu quando foram comparados os graus de

esqueletização dos subgrupos com seus respectivos pesos no momento da

exumação. Não, necessariamente, o subgrupo MCoT, que foi o grupo mais

esqueletizado, era o subgrupo de menor peso na exumação assim como o

subgrupo FCCE que apresentou o menor peso na exumação foi um dos três menos

esqueletizados.

Em mamíferos, as fêmeas têm uma porcentagem mais alta de gordura

corporal em relação aos machos (TRUDEAU et al., 2001). Essa característica está

associada com o padrão hormonal feminino, ou seja, concentrações de estrógeno e

progesterona mais altas e concentrações de andrógenos mais baixas. Também é

conhecido que concentrações mais altas de andrógenos estão associadas com

porcentagem menor de gordura corporal (MUNZER et al., 2001; VERMEULEN;

GOEMAERE; KAUFMAN, 1999).

61

Na literatura considera-se que maiores porcentagens de gordura corporal

estão associadas com maior probabilidade de formação de adipocera durante o

processo de esqueletização (FRANÇA, 2001; KNIGHT, 1991).

O mecanismo de formação da adipocera tem sido extensamente estudado,

mas ainda não está totalmente claro (TAKATORI, 1996; TAKATORI, 2001).

Gonzalo (2005) descreve que um homem adulto de constituição normal contém

16% de gordura e a mulher entre 20-25%, mas nos indivíduos obesos a proporção

de gordura pode variar entre 8 e 50%. No momento da morte, a gordura do corpo

contém menos de 1% de ácidos graxos, mas na adipocera pode aumentar em 20%

em um mês e exceder em 70% em 3 meses (KNIGHT, 1991).

A adipocera é formada devido à conversão postmortem da gordura do

corpo em uma mistura lipídica (TAKATORI; YAMAOKA, 1977a, 1977b).

Enquanto a transformação completa da gordura do corpo pode levar anos

(TAKATORI, 2001), dependendo das condições locais, a transformação parcial

da gordura em adipocera pode ocorrer em um curto período de tempo. Há relatos

de casos onde a transformação parcial levou seis semanas (FORBES; STUART;

DENT, 2002) e até duas semanas após a morte sendo três meses o mais comum

(BARRAL apud GONZALO, 2005).

Após 120 dias de inumação, toda massa encontrada nos corpos dos

animais foi analisada por cromatografia gasosa e confirmado se tratar de

adipocera.

Os maiores constituintes da adipocera são os ácidos graxos saturados

oléico, mirístico, palmítico e esteárico (CABIROL et al., 1998; FORBES;

STUART; DENT, 2002; YAN et al., 2001; TAKATORI, 1996). Mais de 60% do

62

total de ácidos graxos do tecido adiposo consistem em ácidos graxos insaturados:

oléico, linoéico e palmitoléico. Dos ácidos graxos saturados, os formados em

maior proporção são o palmítico e o esteárico (TAKATORI et al., 1983, 1986,

1987; TOMAS, 1972). Esses dados confirmam nossos resultados.

Entretanto a natureza exata da adipocera ainda não foi determinada

(FORBES; STUART; DENT, 2002).

Quando formada na água a adipocera produz uma substância branca ou

ligeiramente amarela quando o processo se dá em terra úmida. Se estiver

manchada com sangue ou produtos da putrefação pode-se observar colorações

avermelhadas ou esverdeadas. O odor foi descrito por Evans (apud GONZALO,

2005) como “terroso, que cheira como queijo e amoníaco”. Com o tempo sofre

certa modificação, que permite distinguir uma adipocera recente de uma adipocera

antiga (FORBES et al., 2004, 2005; GONZALO, 2005).

A adipocera recente é untosa ou viscosa ao tato, se deixa modelar com os

dedos. Tem pouca homogeneidade estrutural e permite ver em sua espessura

porções de tecidos estranhos, como restos de músculos, tendões ou ligamentos,

que podem ser reconhecidos (FORBES et al., 2004, 2005; GONZALO, 2005).

A adipocera antiga é dura, seca e quebradiça e ao tentar parti-la se

desmancha como um queijo velho. Examinada ao microscópio mostra uma

estrutura muita mais homogênea, semelhante a um retículo fibroso no seio de uma

substância branca de aspecto gorduroso, sem traços de estrutura organizada

(FORBES et al., 2004, 2005; GONZALO, 2005).

63

A transformação de um tipo em outro é muito lenta e gradual sem que se

possam fixar limites cronológicos. Existem estudos experimentais que tratam de

datar a formação da adipocera mediante o estudo da formação e desintegração dos

ácidos graxos hidrolisados, hidroxiesteárico e oxiesteárico (FORBES et al., 2004,

2005).

A formação da adipocera inibe a putrefação devido à acidez crescente dos

tecidos e à desidratação causada pelo consumo de água na hidrólise, que retarda o

crescimento e a propagação das bactérias (PFEIFFER; MILNE; STEVENSON,

1998).

Segundo França (2001) e Gonzalo (2005), existe uma grande controvérsia

em assinalar quais tecidos se transformam em adipocera. Alguns autores admitem

que somente a gordura normal transforma-se e outros opinam que todos os demais

tecidos, mesmo os de natureza albuminóide, principalmente os músculos, podem

sofrer tal transformação. Os que defendem tal exclusividade das gorduras afirmam

que o desaparecimento dos músculos se deve aos fenômenos de putrefação e, se a

adipocera for um fenômeno posterior à putrefação, a musculatura já haveria

desaparecido pela decomposição, antes mesmo que surgisse a transformação

adipocerosa.

Todavia, há casos em que a adipocera compromete apenas a superfície do

cadáver, preservando integralmente os conjuntos musculares, permitindo assim

um estudo médico-legal mais consistente (FRANÇA, 2001).

Assim, segundo França (1995):

Uma ciência de vastas proporções e de extraordinária diversificação, a Medicina Legal não se preocupa apenas com o indivíduo enquanto

64

vivo, alcança-o ainda quando ovo e pode vasculhá-lo na escuridão da sepultura.

65

66

CONCLUSÕES

1) As variáveis ambientais temperatura, umidade relativa do ar, chuvas e as

variáveis corporais peso e teor de gordura dos animais foram observadas e foi

possível apontar os hormônios sexuais como variável a ser estudada. As

análises realizadas para verificar a variação de temperatura mostraram que

mesmo com a interferência da maior temperatura no grupo das fêmeas foi o

subgrupo MCoT que apresentou maior grau de esqueletização. Isso nos leva a

afirmar que a interferência hormonal foi fator determinante nas diferenças

encontradas no processo de esqueletização dos animais. Também podê-se

certificar o mesmo para as análises realizadas para as demais as variáveis.

Conclui-se, assim, que todos os animais foram submetidos às mesmas

condições ambientais e corporais.

2) Apresentou esqueletização completa apenas o grupo MCoT com o esqueleto

visível livre de quaisquer restos remanescentes. Os grupos MCST e MCCT

apresentaram esqueletização mínima com adipocera recobrindo todo o corpo e

alguns ainda apresentando órgãos e vísceras conservados. Todos os subgrupos

das fêmeas apresentaram esqueletização parcial diferindo apenas na forma

pastosa, seca e em pó, em que a adipocera se encontrava. Não houve relação

entre a forma encontrada e a fase hormonal em que o subgrupo se encontrava.

Foi observado que a testosterona teve papel de destaque em relação à

progesterona e ao estrógeno no processo de esqueletização e a ausência da

testosterona nos subgrupos MCSH e MCCT reteve mais água, por isso, os

67

corpos, em sua maioria, nesses subgrupos, foram encontrados tão pesados e

úmidos.

3) Toda a massa cadavérica analisada confirmou ser adipocera. O grupo dos

machos apresentou apenas adipocera recente e o grupo das fêmeas apresentou

tanto a adipocera com o aspecto recente quanto com o antigo.

Com os resultados obtidos foi possível concluir que os hormônios sexuais

influenciam na decomposição corporal.

68

69

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83

S U M Á R I O

Resumo

Abstract

Lista de Figuras

Lista de Gráficos

Lista de Tabelas

.............................................................................................................. 1

INTRODUÇÃO ................................................................................... 1

ESTIMATIVA DO TEMPO DE MORTE COMO UM DESAFIO MÉDICO –

LEGAL ................................................................................................................. 4

SAPONIFICAÇÃO E ADIPOCERA .................................................................. 8

HORMÔNIOS SEXUAIS .................................................................................. 10

HIPÓTESE DE TRABALHO ............................................................................ 13

............................................................................................................ 16

OBJETIVOS ...................................................................................... 16

MATERIAL E MÉTODOS .............................................................. 18

ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA .............................................................. 19

ANIMAIS ........................................................................................................... 19

FORMAÇÃO DOS GRUPOS ........................................................................... 19

GRUPO DOS MACHOS ................................................................................... 20

Cirurgia ......................................................................................................... 20 Reposição hormonal ...................................................................................... 20

GRUPO DAS FÊMEAS .................................................................................... 21

Ciclo Estral .................................................................................................... 21 Cirurgia ......................................................................................................... 24 Reposição hormonal ...................................................................................... 24

MORTE E SEPULTAMENTO ......................................................................... 24

VARIÁVEIS ...................................................................................................... 28

Temperatura ................................................................................................... 28 Umidade Relativa do Ar e Chuvas ................................................................. 28 Pesos .............................................................................................................. 28 Gordura ......................................................................................................... 29

ANÁLISES ESTATÍSTICAS ............................................................................ 29

84

ANÁLISE CROMATOGRÁFICA .................................................................... 31

CRITÉRIOS PARA AVALIAR OS GRAUS DE ESQUELETIZAÇÃO ......... 31

............................................................................................................ 33

RESULTADOS .................................................................................. 33

TEMPERATURA .............................................................................................. 34

UMIDADE RELATIVA DO AR E CHUVAS .................................................. 36

NORMALIDADE DOS VALORES ................................................................. 37

PESOS ................................................................................................................ 38

Peso Inicial .................................................................................................... 38 Peso antemortem ........................................................................................... 39 Peso no momento da morte ............................................................................ 39 Peso no momento da exumação ..................................................................... 40

MEDIDA DE GORDURA ................................................................................. 42

GRAUS DE ESQUELETIZAÇÃO ................................................................... 45

MASSA CADAVÉRICA ................................................................................... 50

........................................................................................................... 55

DISCUSSÃO ...................................................................................... 55

CONCLUSÕES ................................................................................. 66

............................................................................................................ 69

REFERÊNCIAS ................................................................................ 69

S U M Á R I O ................................................................................... 84

85

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