Introdução ao laboratório de Micro de alimentos E metodos para contagem de microrganismos em...

Introdução ao laboratório e Métodos de contagem de microrganismos

em alimentos

Uelinton M. Pinto

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Avaliações

• Conteúdo programático das aulas práticas – ainda em preparação

• 2 provas práticas no horário da aula (15% cada)

• Relatórios (5% extra, 5% a menos para quem não entregar) – cada relatório deverá ser entregue no prazo máximo de uma semana após a aula.

Normas de segurança no laboratório

• Não comer, beber ou fumar dentro do laboratório;

• Usar sempre o jaleco;

• Não pipetar material tóxico ou infeccioso com a boca. Usar

pipetadores;

• As placas de contagem de bactérias não podem ser

consideradas inofensivas. Muitos patogênicos

desenvolvem-se bem nos meios de cultura comumente

utilizados no laboratório.

• Não cheirar os meios de cultura inoculados

Normas de segurança

• As lâminas e lamínulas usadas devem ser

colocadas em recipiente com desinfetante;

• Lavar as mãos com freqüência, usando solução desinfetante, com água corrente e sabão,

especialmente antes e após o trabalho laboratorial;

• Limpar a mesa de trabalho, antes e depois de

cada sessão de trabalho, usando desinfetante;

Normas para coleta de amostras

• As amostras para exame microbiológico deverão ser enviadas separadamente das destinadas aos exames físico-químicos;

• As amostras devem estar em sua embalagem original. Quando não for possível, aceita-se o fracionamento em condições assépticas;

• As amostras deverão ser acondicionadas em recipientes limpos, estéreis e sem perfurações, rachaduras, etc. Quantidade mínima de 500 g de amostra ou colher várias amostras para atingir o mínimo. Cuidados especiais com respeito ao lote, data de fabricação. Enlatados - ~mínimode duas latas.

Normas para armazenamento e transporte de amostras

• Alguns produtos podem ser transportados a temperatura ambiente outros devem ser refrigerados (recipientes isotérmicos com gelo). Cuidado para não haver contato entre a amostra e a água de degelo.

• Produtos congelados – não podem descongelar até a chegada ao laboratório.

• Tempo entre coleta e chegada ao laboratório deve ser o menor possível. Ex.: leite pasteurizado menos que 24 horas, respeitando-se o prazo de validade do produto.

• Amostras em embalagens lacradas. Necessário para evitar a substituição ou adulteração da amostra entre o ponto de colheita e o laboratório.

Normas para armazenamento e transporte de amostras

• Após o recebimento: • Amostras refrigeradas perecíveis deverão ser

analisadas em um período máximo de 12 horas; • amostras congeladas deverão ser mantidas a no

mínimo -18°C, por período máximo de 7 dias.• Amostras não perecíveis deverão ser estocadas em

lugar fresco e protegidas da umidade, e analisadas em um prazo máximo de 3 dias.

• Manter registros de recebimento, números de protocolo, datas de liberação e outros registros que se fizerem necessários.

O cotidiano no laboratório• Organização! • Tempo máximo entre diluição e

inoculação – 20 min• Limpar e desinfetar a superfície de

trabalho antes e depois do trabalho diário;

• Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado, antes de iniciar a análise.

• O material utilizado deve receber a seguinte seqüência de tratamento: � esterilização, lavagem, secagem, embalagem; esterilização e armazenamento ;

• Os cultivos após a leitura devem ser esterilizados;

O cotidiano no laboratório O cotidiano no laboratórioNormas de higiene e ordem pessoais

• Manter no laboratório exclusivamente os materiais

necessários aos trabalhos de análise;

• Se for portador de algum ferimento nas mãos, não

participar dos trabalhos de análise. No caso de

necessidade extrema, utilizar luvas, procedendo

também a sanificação das mesmas;

• Lavar e usar sanificantes nas mãos ao entrar, sempre

que for necessário e ao sair do laboratório;

O cotidiano no laboratório

Normas de higiene e ordem pessoais

• Evitar tocar o corpo e especialmente os olhos, boca,

nariz com as mãos durante os trabalhos no laboratório;

• Não umedecer etiquetas ou outro material do

laboratório com a língua;

• Em casos de acidente com ferimentos e cortes, proceder

imediatamente a lavagem e a desinfecção;

O cotidiano no laboratório

Resumo das condições de esterilização:

a) Via seca: 170 °C por 2 a 3 horas (estufa de esterilização): placas de Petri, pipetas, vidraria em geral.

b) Via úmida: 121 °C por 15 min. (autoclave): solução de diluição, meios de cultura, etc.

c) Antibióticos, vitaminas: filtração

Qual a importância de se determinar o número de microrganismos em um

alimento?

1. Qualidade e segurança alimentar2. Avaliação dos processos de produção

3. Alimentos funcionais (probióticos)

Métodos de contagem e detecção de microrganismos em alimentos Que tipos de organismos são

comumente enumerados em alimentos?

Bactérias “totais aeróbias”

Bactérias psicrotróficas

Bactérias anaeróbiasStaphylococcus aureus

Fungos e leverduras

Coliformes totais e termotolerantes

Como estes microrganismos sãoenumerados?

Métodos convencionais (culturais, clássicos)

Métodos rápidos

Atividade metabólica

Métodos turbidimétricos

Uma outra maneira de classificar estes métodos

Métodos de contagem de

bactérias

Totais

Viáveis

Diretos

Indiretos

Diretos

Indiretos

Contagens Microscópicas

Contagens eletrônicas

Determinação de biomassa

Determinação de impedância

Radiometria

Luminescência dos genes lux

Contagem em placas

Determinação do NMP

Cont. em membrana filtrante





Radiometria




Contagem em placas



Contagem emplacas

Como recuperar microrganismosdos alimentos?

Stomacher

Contagem em placas

Análises MicrobiológicasPreparo da amostra

Amostra

+

Diluente

Homogenato

25g : 225mLDiluente

DiluiDilui çção seriadaão seriada

Contagem em placas

PlaqueamentoPlaqueamento PlaqueamentoPlaqueamento

Contagem das colônias após incubação

10-2

10-3

10-4

UFC= Num. colonias X (1/dil)Alíquota

Entre 30 e 300

MMéétodos de todos de plaqueamentoplaqueamento

Contagem em placasModificações para fazer o processo

mais rápido

Spiral plater

Spiral plater

UFC/mL

Técnica de microcotas

UFC/mL

20 µl

Petrifilm (3M)

1 ml de diluente contendo a amostra

Reidratação

Incubação Atividade metabólica




Radiometria




Contagem em placas



Método do númeromais provável (NMP)

– metodologia:• teste presuntivo• teste confirmativo• teste completo

10 ml por tubo

0,1 ml por tubo

1 ml por tubo

incubação a 35ºC/24-48 h:formação de gás: NMP

Amostra dealimento

Teste Presuntivo – Caldo Lactosado LST

Tubo contendo caldo lactosado

resultado negativo

Tubo contendo caldo lactosado

resultado positivo

TESTE PRESUNTIVO PARA A PRESENÇA DE COLIFORMES

Análises MicrobiológicasNúmero Mais Provável

Coliformes Caldo LST 35.5

oC/48 h

Presuntivo Confirmativo

Coliformes Totais Caldo BVB35.5

oC/48 h

• Confirmativo de Coliforme Termotolerante

Número Mais Provável

Coliformes Caldo EC45

oC/48 h





Radiometria




Contagem em placas



Amostra a ser filtrada

Membrana filtrante que retém células

Saída para vácuo

Membrana transferida para meio de cultura

Incubação Colônias

Filtração para concentrar a amostra

Contagem em membrana filtrante

Contagem de colônias em placas –Filtração (concentração da amostra)

Colônias coliformes em uma membrana filtrante





Radiometria




Contagem em placas



Contagem do nContagem do n úúmero de cmero de c éélulas totaislulas totais

Detalhe da região central da lâmina

Câmara de Neubauer: lâmina escavada


Contagem do nContagem do n úúmero de cmero de c éélulas totaislulas totais MMéétodo rtodo r áápido que permite detectar baixas populapido que permite detectar baixas popula ççõesões

Alimento

Membrana

Contagens Microscópicas – com membrana

Homogenato FiltraçãoTritonX,Tripsina

Laranja de acridinaSecagem

Contagem em microscópio de

epi-fluorescência

No células/g= No médio X No de campos X fator do microscópio





Radiometria




Contagem em placas



Contagens eletrônica – CITOMETRIA DE MASSA

Contagens eletrônica – CITOMETRIA DE MASSA





Radiometria




Contagem em placas



IMPEDÂNCIA – método rápido, porém envolvecultivo

Impedância= atual resistência elétrica à corrente di reta

Meio de cultura estéril – produtos de baixa condutib ilidade

Crescimento microbiano

Inocula alíquota de amostra de alimento (diluição apropriada)

Produtos de alta condutibilidade

Impedância diminui –detecção

automática


Quanto mais rápido for a detecção de mudanças de impedância do meio, maior a contaminação do produto .

Maior contaminação – detecção rápidaMenor contaminação – detecção lenta

A detecção acontece quando há 10 7 células/g

Vários sistemas comerciais disponíveis – detecção de diversos tipos de microrganismos


Rapid Automated Bacterial lmpedanceTechnique (RABIT)

BacTrac 4300 RAPID MICROBIOLOGICAL ANALYZER

Ribeiro et al., 2003

Detecção indireta do crescimento microbiano porimpedância

Ribeiro et al., 2003





Radiometria




Contagem em placas



Método indireto –detecção de CO2

radioativo por exemplo.

Luminescência dos genes lux de Vibrio fisheri

lux genes

Infecta o fago no homogenado (alimento) para detecta r a bactéria de interesse

Engenharia genética do fago específico

Fago multiplica �� LUZLUZAtividade metabólica




Radiometria




Contagem em placas




Redução de corante - Azul de metileno/resazurina em leite

Método muito simples – quanto mais rápido a reduçãodos corantes, maior a contaminação do produto

Não é um método preciso, mas determina de forma muito rápida, simples e barata a qualidademicrobiológica de um produto

Nossas futuras aulas práticas

• Determinar o efeito de diversos fatores, encontrados pelos

micro-organismos nos alimentos, no crescimento

microbiano.

• Contagem de microrganismos em alimentos.

• Contagem total de aeróbios em placa (spread plate e

microgotas);

• Contagem de psicrotróficos;

• Determinação de coliformes totais e termotolerantes;

• Isolamento de patógenos de alimentos

Avaliação

Responder às seguintes perguntas para a próxima aul a:

1 – Por que enumerar micro-organismos em alimentos?

2 – Que tipo de micro-organismos seriam enumerados d e

um alimento refrigerado?

3 – Qual a principal desvantagem de se enumerar micr o-

organismos pelos métodos tradicionais?

4 – Qual é o objetivo de se utilizar membranas para a s

contagens de micro-organismos em microscópio?

Material para consulta

1. Jay, J.M. Microbiologia de Alimentos/ James M. Jay ; trad. Eduardo Cesar Tondo [et al.] 6.ed. – Porto Alegre: Artmed, 2005.

2. FRANCO, B.D.G.M.; LANDGRAF, M. Microbiologia de Alimentos. São Paulo, Atheneu, 2008.

3. APHA. Compendium of Methods for theMicrobiologica Examination of Foods. 2001.

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