Intéractions Moléculaires Puces ACTivités - … Le réseau Biogenouest 4 domaines d'activité :...
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Intéractions Moléculaires Puces ACTivités
Jeudi 29 mars 2012 à Lorient
Pierre Weigel & Cathy Charlier
http://www.impact-plateforme.com
5 axes technologiques, 20 plates-formes technologiques
Mer
Agro
Santé
Bio-informatique
Le réseau Biogenouest
4 domaines d'activité : plus de 50 unités de recherche
• Réseau de 20 plates-formes en sciences du vivant du Grand Ouest Régions Bretagne et Pays de la Loire - regroupées en 5 axes :
Génomique (Séquençage/Génotypage, Transcriptome)
Protéome Exploration fonctionnelle
Bio-informatique Analyse structurale et métabolome • Soutiens Régions Bretagne et Pays de la Loire, du Ministère de la Recherche et de l'Union Européenne
• Partenariats
Grands organismes de recherche : Afssa, CNRS, Ifremer, Inra, Inria, Inserm 5 universités de l’Ouest Pôles de compétitivité bretons et ligériens : Atlantic Biotherapies, Pôle Mer Bretagne, Valorial et
Végépolys Organismes associés (CHU, grandes écoles...)
50 unités de recherche (2000 personnes) 800 chercheurs et enseignants-chercheurs
Biogenouest (anciennement OUEST-genopole/OGP)
Nantes
Angers
Rennes
Axe Protéomique
Animateur : Charles Pineau
Identification–Caractérisation à haut débit Charles Pineau
Développement d’anticorps monoclonaux (PADAM)
Hugues Gascan
Interactions moléculaires puces activités (IMPACT)
Yannick Jacques et Pierre Weigel
Intéractions Moléculaires Puces ACTivités
Etude de la fonctionnalité des protéines dans la cellule Modulation/régulation des réseaux d'interactions protéiques Technologies de pointe complémentaires
Etude globale des interactions moléculaires Du criblage à haut débit jusqu'à leur caractérisation Analyse structure-fonction des interactions Par un ensemble d'approches biophysiques
Interactomique
Recherche de profils d’interaction, de motifs de signalisation, d’activité fonctionnelle.
Recherche de cibles
Recherche de modulateurs
Interactomique
Positionnement / expertise de la plateforme
Caractérisation des interactions moléculaires/mécanismes
Analyse des réseaux d'interactions
Protéom
ique
Valider Moduler
Positionnement / expertise de la plateforme
Découvrir
Interactions moléculaires
Découvrir
de nouvelles interactions protéiques
Profiling et screening haut débit: In vitro, extraits cellulaires procaryote/eucaryote,
tissus animaux et végétaux.
Puces à protéines et à petites molécules HTRF-BRET, SPR-i
Valider Moduler
Positionnement / expertise de la plateforme
Découvrir
Valider
de nouvelles interactions protéiques
Caractérisation des paramètres thermodynamiques, stoëchiométriques, conformationnels, fonctionnels.
SPR, microcalorimétrie, dichroïsme circulaire,
fluorescence et anisotropie de fluorescence
Moduler
Positionnement / expertise de la plateforme
Valider
Moduler des interactions protéiques et leur fonctionnalité
Identification de nouveaux outils de recherche,
pharmacologiques et thérapeutiques.
Screening à haut débit : puces à petites molécules chimiques antagonistes, SPR-i, HTRF-BRET
Découvrir
Positionnement / expertise de la plateforme
1.L’étude des interactions protéine-protéine, antigène-anticorps, protéine-acide nucléique, protéine-glycosides, protéine-ligand chimique…
2.L’étude des modifications post traductionnelles (phosphorylation, acétylation…).
3.La dérégulation des voies de signalisation.
4.L’étude du profil d’expression de protéines, de leurs activités.
5.La recherche de biomarqueurs et de cibles d’intérêt.
6.Le développement de tests de spécificité et d’outils diagnostiques.
7.Le criblage de biomolécules d’intérêt pharmacologique, thérapeutique, agroalimentaire, etc.
Champs d’application de la plateforme
38 projets en cours 50% dédiés à des programmes de
recherche sur le cancer . - 20% projets internes - 60% collaborations - 20 % R&D 14 publications, 6 brevets (4
européens, 1 USA ,1 France).
Positionnement et projets en cours
Projets européens, nationaux et régionaux: Labex IRON et Labex IGO, INCA, ARC, 4 ANR, CIMATH2 “Ciblage moléculaire
et applications thérapeutiques”, AFM, TARCC project, SIRIC project (Integrated Cancer Research Center)
Partenaires industriels: Jasco, Polyintell, TLC Pharma, Cytune Pharma, Atlantic bone Screen Etroite collaboration avec Protneteomix et Affilogic, Financement de 2 programmes majeurs par Servier et Chemveda Life Sciences :
criblage d’agents thérapeutiques potentiels pour le traitement du cancer. Membre du “VWR national tour” en 2011 et 2012 Membre de réseaux : GDR CNRS 3260 ACCITH “Anticorps et Ciblage thérapeutique”, GDR CNRS 3056 “Criblage de petites molécules” Sharebiotech En voie d’intégrer le réseau national « chemical biology » et le réseau européen
ESFRI EU-OPENSCREEN.
Positionnement et projets en cours
Équipements de la PF
Puces à Protéines et technologie de criblage
Équipements d'analyses biophysiques
Spotteurs Scanners
BioRobot (Qiagen) Station Agilent
(Electrophorèse Microcapillaires)
Microcalorimètre Dichroisme circulaire
Fluorescence, spectroscopie UV-Vis Anisotropie de Fluorescence
Plateau HTRF, BRET, FRET
BIACORE (2000, 3000, SPR-i)
Synthétiseur de peptides
Répartitions des équipements - 1,5 M€ - sur les deux sites….
Technologie des puces à protéines
Détection :
Fluorescence (visible ou proche
infrarouge)
Sondes marquées Protéine, ADN, Anticorps…
Interaction
Protéines
• Systèmes de dépôt manuels ou automatiques des échantillons (Spotteurs)
MicroCaster Microarrayer
System (WHATMAN)
GMS 417 Arrayer
(Aviso) sciFLEXARRAYER S3
(Scienion)
• Détection des interactions par fluorescence, deux types de scanners
ScanArray GX
(Perkinelmer) LI-COR d’Odyssey
(Infrared Imaging System)
• 2 types d’expérimentations
– Conception & Fabrication de puces à façon de puces à protéines, à anticorps,
à antigènes, à peptides, en phase directe ou reverse – Utilisation de puces commerciales (Invitrogen, Sigma, R&D, Protneteomix…)
Approches biophysiques pour l’étude
des interactions biomoléculaires
• Détermination structurale de macromolécules: protéines,
peptides, ADN
• Stabilité et Analyses de la dénaturation Thermique et
chimique
• Evaluation de la pureté de substances optiquement active
• Détermination de l’affinité ligand/protéin peptide/protéine,
ADN/Protéine
• Données thermodynamiques (Kd, enthalpie, entropie)
• Criblage haut débit
Spectropolarimètre J-810 Dichroïsme Circulaire et linéaire
Spectrofluorimètre FP-6500 Fluorescence
Spectromètre UV-530 Absorbance UV-Vis
Photomètre de polarisation de fluorescence FP-715
Microcalorimètre ITC
Mithras LB940 HTRF / BRET / FRET / AF Biacore 3000 & 2000
Résonance plasmmonique de surface (SPR) et SPRI
La PF dispose également d’un synthétiseur de peptides (INTAVIS)
1. Rendez-vous de faisabilité • Définition avec l’équipe demandeuse de la stratégie et des objectifs du projet
Initiation d’une prestation collaborative
2. Partie expérimentale • Disponibilité des biomolécules cibles ou des extraits
• Définition des tampons d’interactions et de lavages
• Disponibilité des sondes marquées pour la détection (AC, protéines, ligands…)
• Critères de détection
• Analyse résultats
• Système d’exploitation des résultats
3. Définition de la prestation
Approche à haut débit par la technologie des puces à protéines et plateau MITHRAS
Approches biophysiques pour l’étude des interactions biomoléculaires
1. Prestation R&D – projet collaboratif
2. Activité d’expertise
3. Prestation « libre service »
Protocole d’accès
Fiche projet
Protocoles
Réservation
Tarification
18
Approches biophysiques pour l’étude des interactions moléculaires Site UFR ST
Fluorescence
Anisotropie de fluorescence
Dichroïsme Linéaire et Circulaire
Microcalorimètrie
Etude des différentes étapes de la recombinaison homologue Régulation transcriptionnelle/Promoteur fort
Inhibition d’une activité enzymatique
1. Dénaturation d’une protéine 2. Détermination des sites d’interaction monomère-monomère dans le filament Rad51 3. Sondes des surfaces des protéines 4. Etude de l’inhibition de rad 51 5. Transfert d’énergie de fluorescence (FRET)
Approches biophysiques pour l’étude des interactions moléculaires Application de la fluorescence
Marqueurs fluorescents intrinsèques des protéines
CH2
CHH2N COOH
Phenylalanine
Tryptophane
Tyrosine
CH2
CHH2N COOH
OH
N
COOHH2N CH
CH2
H
280 295
Fluorescence de trp = 90% fluorescence des protéines
Réparation des CDBs de l’ADN par Recombinaison Homologue
apparition CBD
digestion nucléolytique
Formation du nucléofilament = autoassociation de Rad51 sur ADNsb
échange de brin
réparation fidèle de l’ADN
Rad51 Co-facteurs (BRCA2)
Localisation des sites d’interaction
Monomère - monomère
HsRad 51
M A M Q M Q L E A N A D T S V E E E S F G P Q P I S R L E Q C G I N A N
D V K K L E E A G F H T V E A V A Y A P K K E L I N I K G I S E A K A D
K I L A E A A K L V P M G F T T A T E F H Q R R S E I I Q I T T G S K E
L D K L L Q G G I E T G S I T E M F G E F R T G K T Q I C H T L A V T C
Q L P I D R G G G E G K A M Y I D T E G T F R P E R L L A V A E R Y G L
S G S D V L D N V A Y A R A F N T D H Q T Q L L Y Q A S A M M V E S R Y
A L L I V D S A T A L Y R T D Y S G R G E L S A R Q M H L A R F L R M L
L R L A D E F G V A V V I T N Q V V A Q V D G A A M F A A D P K K P I G
G N I I A H A S T T R L Y L R K G R G E T R I C Q I Y D S P C L P E A E
A M F A I N A D G V G D A K D
Séquence primaire de Rad51 humaine (Hs Rad51)
Longueur d’onde (nm)
IF
1.0 -
0.5 -
0 - 350 400 300
Trp enfoui Trp exposé
Dissociation
Polymérisation
Analyses de Mutants
Rad51 ne contient pas de tryptophane
Identification des interfaces impliqués
dans l’auto-association de Rad51
Insertion Trp = sonde fluorescente
Conilleau S., et al, J. Mol. Biol., 2004, 339, 797-804.
Selmane T. et al. J. Mol. Biol., 2004, 335, 895-904.
Etude de la dissociation du filament Rad51- ADN par des inhibiteurs
(Ex. 320nm – Emission 400nm)
PolydεA + Rad51 [ polydεA- Rad51] Fluorescence
PolydεA + Rad51 + inhibiteur
[inhibiteur- Rad51] + polydεA Fluorescence
Un inhibiteur nucléique : aptamères « ADNsb »
Un inhibiteur peptidique : peptide BRC4 Etude de 2 inhibiteurs
Spectre d’émission
[polydεA- Rad51]
+ aptamère
24
Dissociation du filament Rad51-ADN en présence d’aptamères
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Co
mp
lexe H
sR
ad
51/A
DN
(%
)
BRC4-28 (µM)
Mesure de la fluorescence du poly(deA) Dissociation du filament Rad51-ADN en présence du peptide BRC4
Nomme et al. Genes to Cells (2008) 13, 471-481
IC50 = 2,2 µM
HsRad51: 1,5 µM / poly(deA) : 3,0 µM / 1 mM ATP
Co
mp
lexe
Ra
d5
1-A
DN
(%
)
1. Suivi de cinétique de l’hélicase
2. Interaction Rad51/peptide BRC4 3. De la fonctionnalité sous unité alpha de l’ARN Polymérase 4. De l’effet d’inhibiteurs potentiels 5. Transfert d’énergie de fluorescence (FRET)
Anisotropie de fluorescence
C-ter
N-ter
Interaction Rad51-peptide
Peptide 28aa
Peptide 13aa
Peptide 15aa
Conservation de la structure tenaille du peptide 28aa
Peptides marqués par FITC
BRC4-FITC : 0,2 µM / ATP : 1 mM
Anisotropie de fluorescence
Etude de la liaison spécifique du peptide BRC4-FITC à HsRad51 A
nis
otr
op
ie (
UI)
Concentration en protéine (µM)
Nomme et al. Genes to Cells (2008) 13, 471-481
(Kd : 100 nM)
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
HsRad51
RecA
DMC1
Dichroisme circulaire
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
200 210 220 230 240 250 260
Rad51
Rad51 + aptamère T 15min
Rad51 + aptamère T 30min
Longueur d’onde (nm)
CD
(m
de
g)
Dichroïsme circulaire
Etude de la structure de Rad51 libre ou liée à l’ADNsb
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
220 240 260 280 300 320 340
CD
[m
deg
]
A79
Longueur d’onde (nm) -20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
220 240 260 280 300 320 340
CD
[m
deg
]
A30
Longueur d’onde (nm)
Structure des aptamères
20°C
80°C
Présence de structure dans les aptamères étudiés
Dichroïsme circulaire (CD)
Bande + à 275 nm et bande – à 240 nm
Présence de G-quartet?
Forte ressemblance avec des spectres CD de G-quartet
32
-10
0
10
20
CD
(m
deg
)
200 220 240 260 280
Wavelength (nm)
(a)
60
70
80
90
100
Tm
(
°C)
0 2 4 6 8 10
[Urea] (M)
(b)
Analyse du répresseur ArgR de T. neapolitana par dichroïsme circulaire
33
Microcalorimètre à Titration Isotherme - Auto ITC200
Etude des interactions entre biomolécules en solution
Protéine / Protéine
Protéine / ADN
Protéine / petites molécules
Anticorps / Antigène
Drogue / cible
Enzyme / inhibiteur
Mesure la quantité de chaleur qui est générée ou absorbée
lors de l’interaction entre 2 biomolécules
Paramètres thermodynamiques ( G, H, et S) et affinité de la réaction (Kd)
Pas d’étape de marquage
La calorimétrie pour caractériser les interactions entre 2 biomolécules
Microcalorimètre à Titration Isotherme Auto ITC200
ΔG = −RT lnKa 34
Thermogramme
= données brutes
Courbe de titration du ligand
= données intégrées
µcal/s µcal/mol ligand injecté
[Ligand]/[Biomol]
Constante d’affinité
Stoechiométrie (n) = nb site de fixation
Enthalpie H
ΔG = ΔH − TΔS
Auto ITC200 : exemple d’application
35
interaction enzyme BCA (bovine carbonic anhydrase II) + 2 types d’inhibiteurs
détermination des paramètres thermodynamiques
H1 H2
affinité
similaire
Affinité similaire pour les 2 inhibiteurs mais mécanisme d’interaction différent
E + I EI
ΔG = −RT lnKa
ΔG = ΔH − TΔS
Microcal Life Sciences, 2011
ITC : interactions entre 2 molécules en solution
Affinité et stœchiométrie de l’interaction
mécanisme de l’interaction: enthalpie et entropie de la réaction
Applications:
Protéine / Protéine
Protéine / ADN
Protéine / petites molécules
Anticorps / Antigène
Drogue / cible
Enzyme / inhibiteur
36
Microcalorimètre à Titration Isotherme Auto ITC200
Accès à la plateforme IMPACT
Contacts - Responsables techniques
Site de l’UFR Sciences et techniques
Cathy CHARLIER, IE
[email protected] UMR CNRS 6204
Faculté des Sciences et des Techniques
2, rue de la Houssinière BP 92208 - 44322 NANTES Cedex 3 FRANCE
Tél : +33 (0)2 51 12 56 21
Site du Centre de Recherche en Cancérologie (CRCNA)
Mike MAILLASSON, IE
[email protected] Institut de Recherche Thérapeutique 1
8, quai Moncousu BP 70721 - 44007 NANTES Cedex 1
Tel: (33) (0)2.28.08.03.79
(33) (0)2.28.08.03.78 (lab) http://www.impact-plateforme.com
FIN