Intitulé du thème193.194.80.11/jspui/bitstream/123456789/1576/1/Mémoire... · 2017. 7. 4. ·...

الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية

République Algérienne Démocratique et Populaire

وزارة التعليم العالي والبحث العلمي

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Intitulé du thème

MéMoire pour l’obtention du diplôMe de Master

Faculté : Sciences de la Nature et de la Vie et des Sciences de la Terre

Département : Biologie

Spécialité : Analyses Biologiques et Biochimiques

Soutenu le : 15/06/2017

Par

Nom :- Hennine Prénom :- Yassine

- Serièr - Houcine

Devant le

Jury

Président : Mr. AIT OUAZZOU A. MCA, UDB-Khemis Miliana

Promotrice : Mme. GUETARNI H. MCB, UDB-Khemis Miliana

Examinateurs :

1- Mme. Ghomari F-N. MAA, UDB-Khemis Miliana

2- Mr. Cheurfa M. MAB, UDB-khemis Miliana

Année universitaire : 2016/2017

Isolement et caractérisation des bactéries

lactiques dans le smen traditionnel algérien

Dédicaces

J’ai l’honneur de dédier ce modeste travail réalisé

grâce à l’aide d’Allah le tout puissant

A mes chers parents et surtout ma chère mère qui a

autant sacrifié et patienté pour mon succès.

A mes chers frères et mes chères sœurs

A tout ma grande famille

Et à tous mes amis surtout :

Mustapha, Mohamed, Khaled et Abdelmalek

A tous les étudiants du 2emanné master spécialité

ABB

promotion 2016 /2017.

HENNINE Y.

Dédicaces

Je dédie ce travail à ma très chère

mère

Qu’allah la protège et la garde à moi

pour toujours

SERIER H.

REMERCIEMENT

Avant toutes choses, nous tenant à exprimer notre grand remerciement

et notre profonde gratitude et reconnaissance à Allah notre créateur, qui

nous a donné force pour réaliser ce travail et qui était avec nous par sa

miséricorde dans chaque moment et chaque instant jusqu’à l’accomplir.

Nous désirons à exprimer notre sincère reconnaissance et

remerciement à notre encadreur, Dr. Guetarni Hassina, pour avoir accepté

de nous encadrer et consacré autant de temps pour nous, pour son suivi

régulier, sa bienveillance, ses conseils et ses orientations.

Nous remercions les membres du jury qui ont bien voulu accepter de

juger notre modeste travail et de nous honorer : Président : Dr. Ait Ouazzou

Abdenour (Université de Khemis Miliana) et Examinateurs : Mme. Ghomari

Faiza Nawel (Université de khemis Miliana), Dr. Cheurfa Mohammed

(Université de Khemis Miliana).

Nous remercions également tous les membres des laboratoires

pédagogiques de l’université de Khemis Miliana, qui nous ont bien aidés pour

réaliser notre étude dans des bonnes conditions.

Nous remercions tous ceux qui nous ont rendu service et qui nous ont

soutenus de près ou de loin pour réaliser de ce travail.

TABLE DES MATIERES

Résumé

Abstract

الملخص

LISTE DES ABREVIATION

LISTE DES TABLEAUX

LISTE DES FIGURES

Introduction ........................................................................................ 1

Première partie : Revue Bibliographique

Chapitre 1 : LE LAIT ET LES PRODUITS ARTISANAUX ..... 3

1. Le lait : .................................................................................................................................. 3

1.1. Définition : .................................................................................................................... 3

1.2. Composition du lait : .................................................................................................... 3

1.2.1. Eau : ....................................................................................................................... 3

1.2.2. Glucides : ............................................................................................................... 3

1.2.3. Matière grasse : .................................................................................................... 4

1.2.4. Protéines :.............................................................................................................. 5

1.2.5. Sels minéraux : ..................................................................................................... 5

1.2.6. Vitamines : ............................................................................................................ 6

1.2.7. Enzymes : .............................................................................................................. 7

1.2. Caractéristiques physico-chimiques du lait : ............................................................. 8

1.3. Caractéristiques organoleptiques du lait : ................................................................. 8

1.3.1. Couleur :................................................................................................................ 8

1.3.2. Saveur :.................................................................................................................. 8

1.3.3. Odeur : .................................................................................................................. 8

1.3.4. Viscosité : .............................................................................................................. 9

1.4. La microflore du lait cru : ........................................................................................... 9

1.4.1. Les bactéries : ....................................................................................................... 9

1.4.2. Les champignons microscopiques : ..................................................................... 9

1.4.3. Autres micro-organismes : ................................................................................ 10

2. Produits laitiers traditionnelles Algériennes : ................................................................. 11

2.1. Leben : ......................................................................................................................... 12

2.2. Raïb : ........................................................................................................................... 12

2.3. Jben : ........................................................................................................................... 12

2.4. Klila : ........................................................................................................................... 12

2.5. Bouhezza : ................................................................................................................... 13

2.6. Beurre ou Zebda : ...................................................................................................... 13

2.7. Smen : .......................................................................................................................... 13

2.7.1. Définition : .......................................................................................................... 13

2.7.2. Procédé de préparation du Smen : ................................................................... 13

Chapitre 2 : LES BACTERIES LACTIQUES .......................... 15

1. Généralités : ........................................................................................................................ 15

2. Découverte des bactéries lactiques : ................................................................................. 15

3. Habitat : .............................................................................................................................. 15

4. Classification des bactéries lactiques : .............................................................................. 16

5. Caractérisation des principaux genres des bactéries lactiques : .................................... 18

5.1. Lactobacillus : ............................................................................................................. 18

5.2. Les streptocoques, entérocoques, Lactocoques : ..................................................... 19

5.3. Pediococcus : ............................................................................................................... 19

5.4. Leuconostoc : ............................................................................................................... 20

5.5. Bifidobacterium : ......................................................................................................... 20

6. Métabolisme des bactéries lactiques : ............................................................................... 21

6.1. Métabolisme des sucres : ........................................................................................... 21

6.2. Activité protéolytique : .............................................................................................. 23

6.3. Activité lipolytique : ................................................................................................... 23

6.4. Métabolisme du citrate : ............................................................................................ 24

7. Besoins nutritionnels : ........................................................................................................ 25

7.1. Besoins azotées : ......................................................................................................... 25

7.2. Vitamines : .................................................................................................................. 25

7.3. Ions : ............................................................................................................................ 25

8. Quelques effets bénéfiques des bactéries lactiques : ....................................................... 25

8.1. Dans le domaine alimentaire : ................................................................................... 25

8.2. Dans le domaine thérapeutique : .............................................................................. 26

Deuxième partie : Etude Expérimentale

Chapitre I : MATERIEL ET METHODES ................................ 27

1. Lieu de stage : ..................................................................................................................... 27

2. Matériel utilisé : .................................................................................................................. 27

2.1. Echantillons de smen: ................................................................................................ 27

2.2. Materiel et milieux de culture utilisés : .................................................................... 28

3. Méthodologie : .................................................................................................................... 28

3.1. Isolement des bactéries lactiques : ............................................................................ 28

3.1.1. Préparation de la solution mère et des dilutions décimales : .......................... 28

3.1.2. Ensemencement et isolement des souches lactiques : ...................................... 28

3.1.2.1. Analyse macroscopique : ............................................................................... 31

3.1.2.2. Test de catalase : ............................................................................................. 31

3.1.2.3. Coloration de Gram : ..................................................................................... 31

3.1.3. Purification des isolats : ..................................................................................... 31

3.2. Identification biochimique et physiologique des bactéries lactiques : ................... 31

3.2.1. Test d’oxydase : .................................................................................................. 31

3.2.2. Mannitol mobilité ............................................................................................... 32

3.2.3. Type fermentaire : .............................................................................................. 32

3.2.4. Résistance au téllurite : ...................................................................................... 32

3.2.5. Culture en différentes températures : .............................................................. 32

3.2.6. Croissance dans des conditions hostiles : ......................................................... 32

3.2.6.1. En présence de NaCl : .................................................................................... 32

3.2.6.2. En pH 4.5, 6.5 et 9.5 : ..................................................................................... 33

3.2.6.3. Thermorésistante : ......................................................................................... 33

3.2.7. Utilisation de la galerie Api 20E : ..................................................................... 33

3.2.8. Test d’hémolyse : ................................................................................................ 34

3.2.9. Profil fermentaire : ............................................................................................. 34

3.3. Etude de quelques propriétés technologiques des bactéries lactiques : ................. 37

3.3.1. Pouvoir acidifiant : ............................................................................................. 37

3.3.2. Pouvoir lipolytique : ........................................................................................... 37

Chapitre II :RESULTATS ET INTERPRETATION ................ 38

1. Isolement des bactéries lactiques : .................................................................................... 38

1.1. Analyse macroscopique : ........................................................................................... 38

1.2. Analyse microscopique (coloration de Gram) : ....................................................... 39

1.3. Test de Catalase : ........................................................................................................ 42

2. Identification biochimiques et physiologiques des bactéries lactiques : ........................ 42

2.1. Test d’oxydase : .......................................................................................................... 45

2.2. Mannitol Mobilité : .................................................................................................... 45

2.3. Type fermentaire : ...................................................................................................... 46

2.4. Croissance à différentes températures : ................................................................... 46

2.5. Thermorésistance : ..................................................................................................... 47

2.6. Croissance à différentes pH et à différentes concentration de NaCl : ................... 47

2.7. Résistance au téllurite : .............................................................................................. 48

2.8. Test d’hémolyse : ........................................................................................................ 49

2.9. La galerie Api 20 E : .................................................................................................. 50

2.10. Le profil fermentaire : ............................................................................................... 50

3. Etude de quelques propriétés technologiques : ............................................................... 53

3.1. Etude du pouvoir acidifiant : .................................................................................... 53

3.2. Etude du pouvoir lipolytique : .................................................................................. 56

Chapitre III :DISCUSSION GENERALE .................................. 57

Conclusion et perspectives……………………………………………………60

Références Bibliographiques………………………………………………...62

Annexes

Résumé

Résumé :

Comme tous les produits laitiers fermentés, le smen représente un habitat naturel pour les bactéries

lactiques. Pour cette raison, cette étude a été réalisée afin d’isoler et d’identifier les bactéries lactiques

trouvées dans le smen algérien préparé traditionnellement. Trois échantillons de smen sont collectés des trois

régions de la wilaya de Ain Defla. A partir de ces trois échantillons, les analyses microbiologiques

(phénotypiques, biochimiques et physiologiques) ont permet d’isoler et d’identifier 20 souches de bactéries

lactiques dont elles appartiennent à trois genres différents qui sont : Enterococcus, Pediococcus et

Lactococcus. De ces derniers, le genre Enterococcus est le plus dominant avec un pourcentage de 60%, du

fait de son adaptation au procédé de préparation de smen qui inclut différentes conditions hostiles pour le

développement bactérien : cuisson, salage, condition anaérobique,… etc.

Les espèces identifiées du smen sont : Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus

malodoratus, Enterococcus dispar, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis

subsp lactis et Lactococcus garvieae. L’étude des caractères technologiques des souches isolées a été potée

sur le pouvoir acidifiant et le pouvoir lipolytique.

Mots clés : Lait, smen, bactéries lactiques, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus.

Abstract:

Like all fermented dairy products, smen is a natural habitat for lactic acid bacteria. For this reason,

this study was carried out in order to isolate and identify the lactic acid bacteria found in the traditionally

prepared algerian smen. Three samples of smen are collected from the three regions of Ain Defla. From these

three samples, microbiological analyzes (phenotypic, biochemical and physiological) made it possible to

isolate and identify 20 strains of lactic acid bacteria of which they belong to three different genera:

Enterococcus, Pediococcus and Lactococcus. Of these, the genus Enterococcus is the most dominant with a

percentage of 60%, due to its adaptation to the process of preparation of smen which includes various hostile

conditions for bacterial development: cooking, salting, anaerobic condition, etc.

The identified species of smen are: Enterococcus faecalis, Enterococcus faecalis, Enterococcus malodoratus,

Enterococcus dispar, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp lactis and

Lactococcus garvieae. The study of the technological characteristics of the strains isolated was potted on the

acidifying power and the lipolytic power.

Key words: Milk, smen, lactic acid bacteria, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus.

ملّخص

، يعتبر السمن أحد المواطن الطبيعية الّتي تتواجد فيها البكتيريا اللّبنية. ولهذا الغرض، أُجريت مثل جميع منتجات األلبان المخمرة

ث عّيناتالهذه الدّراسة من أجل عزل والتّعرف على البكتيريا اللّبنية المتواجدة في السمن الجزائري المحّضر تقليدياً.وقد أجريت التحاليل على ث

من مناطق مختلفة من والية عين الدّفلى، والّتي قد ُحّضرت كلّها بنفس الّطريقة لكن تختلف فيما بينها من حيث مدّة التّخمير. ُجلبت

سمحت التحاليل المكروبيولوجية )المظهرية، الكيميائية والفيسيولوجية( اّلتي نُفّذت على عيّنات السمن الثاّل ث بعزل والتّعرف على

من هذه األخيرة، يمثّل . Lactococcus و Enterococcus ،Pediococcus ساللة من البكتيريا اللبنية تنتمي إلى ثال ث أنواع مختلفة: 20

(، وهذا يعود لتكيّفه وتحّمله الّطريقة المستعملة لتحضير السمن الّتي تتضّمن مختلف الّظروف %60النّسبة الغالبة ) Enterococcusنوع

ة لنمو البكتيريا: غليان، تمليح، ظروف الهوائية، ...إلخ. المعادي

، Enterococcus faecium ،Enterococcus faecalisالسالالت الُمتعّرف عليها والمعزولة من عيّنات السمن الثال ث هي: Enterococcus malodoratus، Enterococcus dispar، Pediococcus acidilactici، Pediococcus pentosaceus،

Lactococcus lactis subsp lactisو Lactococcus garvieae .

تّمت دراسة الخصائص التكنولوجية للسالالت المعزولة حول خاصية الحموضة وخاصية تفكيك الدّهون.

.Enterococcus ،Pediococcus ،Lactococcusالسمن، البكتيريا اللبنية، الكلمات الرئيسية:

LISTE DES ABREVIATIONS

AA : acide aminé.

ADH : Arginine dihydrolase.

ADN : acide désoxyribonucléique.

ADNr : acide désoxyribonucléique

ribosomique.

ADP : Adénosine diphosphate.

AMY : Amygdaline.

ARA : Arabinose.

ARN : Acide ribonucléique

ATP : Adénosine triphosphate.

BCP : Bromocresol purple.

BCP+L : Bromocresol purple + Lactose.

CIT : Citrate.

CO2 : Dioxyde de carbone.

COA : Coenzyme A.

CUD : Coefficient d'utilisation digestive

ESD : Extrait Sec Dégraissé.

g : Gramme.

G : guanine.

G+C : Guanine + cytosine.

GEL : Gélatine.

GLU : Glucose.

h : Heure.

H+ : Ion d’hydrogène.

H2O : Dioxyde d'hydrogène.

H2O2 : Peroxyde d’hydrogène.

HCL : Acide chlorhydrique.

INO : Inositol.

LB : Lactobacillus.

LC : Lactococcus.

MAN : Mannitol.

MEL : Melibiose.

meq : Miliéquivalent.

Mg++ : Ion de magnesium.

min : Minute.

Mn++ : ion magnèse.

mol : mole.

MRS : Man, Rogosa et Sharpe.

NaCl : chlorure de sodium.

NAD+ : Nicotinamide adénine

dinucléotide.

NADH : Nicotinamide adénine

dinucléotide réduit.

Nit : Nitrate réductase.

Ox : oxydase.

P : phosphate.

PCR : Polymerase Chain reaction.

PFGE : Pulsed-field Gel Electrophoresis.

pH : Potentiel d’hydrogène.

RHA : Rhamnose.

RMT : Réseau Mixte Technologique

s : Seconde.

S : Souche.

Su : Sucre de mannitol

SAC : Saccharose.

SOR : Sorbitol.

TPP : Thiamine pyrophosphate.

Vit : vitamine.

VP : Vogues Proskaeur.

% : pourcentage.

°C : degré Celsius.

µm : Micromètre.

LISTE DES TABLEAUX

Page

Tableau 1 : Matière grasse du lait contenu dans du globule gras en émulsion ………. 04

dans la phase aqueuse

Tableau 2 : Composition minéral du lait……………………………………………… 05

Tableau 3 : Concentration en vitamines du lait de vache…………………………….. 06

Tableau 4 : Quelques une des enzymes du lait……………………………………….. 07

Tableau 5 : Caractéristique physico-chimique du lait………………………………… 08

Tableau 6 : Physico-chimie du smen traditionnel algérien avec comparaison au…….. 14

beurre traditionnel algérien et au smen traditionnel marocain

Tableau 7 : Provenance et durée de fermentation des trois échantillons analysés …….27

Tableau 8 : Tests phénotypiques biochimiques et physiologiques utilisés dans …..…. 34

l’isolement et l’identification des bactéries lactiques

Tableau 9 : Résultats de l’observation microscopique après coloration de Gram ……..41

des souches isolées des trois échantillons de smen

Tableau 10 : Résultats des tests phénotypiques, biochimiques et physiologique des ….43

souches lactiques isolées des trois échantillons de smen

Tableau 11 : Résultats du profil fermentaire des souches isolées à partir des trois ……52

échantillons

Tableau 12 : Résultats d’identification des souches de bactéries lactiques isolées……..53

LISTE DES FIGURES

Page

Fig. 1 : Spores et filaments myélien de Geotrichum cnadidum……………………………. 10

Fig. 2 : Production laitiers- Fromagère Algériennes……………………………………..11

Fig. 3 : Distance phylogénétique entre les principaux genres constituant les bactéries …17

lactiques basé sur la séquence des ARNr 16S

Fig. 4 : Lactobacilles représentatifs. a) L. bulgaricus, contraste de phase (x600). b) ……18

L. lactis, coloration de Gram (x500). c) L. acidophilus (x1.000)

Fig. 5 : Leuconostoc mesenteroides, image au microscope à contraste de phase…………20

Fig. 6 : Les principales voies fermentaires des hexoses chez les bactéries lactiques …….22

Fig. 7 : Principaux voies lipolytiques des bactéries lactiques …………………………….23

Fig. 8 : Métabolisme du citrate chez les bactéries lactiques……………………………... 24

Fig. 9 : localisation des trois régions où les échantillons de smen sont provenus……….. 27

Fig. 10 : Schéma montrant la préparation et l’ensemencement des dilutions décimales….29

Fig. 11 : Schéma sur l’isolement et la purification des bactéries lactiques……………… 30

Fig. 12 : Aspect des colonies de bactéries lactiques sur milieu MRS après 48h………….38

d’incubation à 37°C

Fig. 13 : Aspect des colonies de bactéries lactiques sur milieu M17 après……………….39

48h d’incubation à 37°C

Fig. 14 : Observation des bactéries lactiques du genre Enterococcus sous microscope…..39

optique (10x100) après coloration de Gram.

Fig. 15 : Observation des bactéries lactiques du genre Lactococcus sous microscope…...40

optique (10x100) après coloration de Gram

Fig. 16 : Observation des bactéries lactiques du genre Pediococcus sous microscope …..40

optique (10x100) après coloration de Gram

Fig. 17 : Test de catalase......................................................................................................42

Fig. 18 : Le pourcentage des genres obtenus et isolés à partir des trois échantillons …….42

de smen

Fig. 19 : Répartition des trois genres de Bactéries lactiques isolées dans chaque...............43

échantillon de smen analysé

Fig. 20 : Test d'oxydase par les disques OX…………………............................................45

Fig. 21 : Test de Mannitol mobilité……………………………………………………….45

Fig. 22 : Test du type fermentaire des bactéries lactiques…………………………….......46

Fig. 23 : Résultats du test de croissance à 45 °C pour les isolats de l'échantillon 2………47

Fig. 24 : Résultats du test de croissance à 4% de NaCl pour les souches isolées de ……..48

l'échantillon 3

Fig. 25 : Résultats du test de croissance à un pH = 6.5 pour les souches isolées de ……..48

l'échantillon 1

Fig. 26 : Test de résistance au téllurite……………………………………………............49

Fig. 27 : Résultats du test d'hémolyse……………………………………………………. 49

Fig. 28 : Résultats des tests de la galerie Api 20E ………………………………………. 50

Fig. 29 : Résultats de la fermentation des deux sucres "saccharose et fructose" par les … 51

bactéries lactiques isolées (galerie classique)

Fig. 30 : Résultats de la fermentation des sucres de la galerie Api 20 E…………………. 51

Fig. 31 : Résultats de l’évolution du pH et de l'acidité en fonction du temps pour les….. 54

bactéries lactiques isolées appartenant au genre Lactococcus

Fig. 32 : Résultats de l’évolution du pH et de l'acidité en fonction du temps pour les ….. 54

bactéries lactiques isolées appartenant au genre Pediococcus

Fig. 33 : Résultats de l’évolution du pH et de l'acidité en fonction du temps pour les….. 55

bactéries lactiques isolées appartenant au genre Enterococcus

Fig. 34 : Résultat de l'activité lipolytique sur milieu MRS additionné de 30% de ……… 56

Tween 80

Introduction

Introduction

1

Introduction Le lait est un produit fragile fortement altérable par voie microbienne en raison de

sa forte teneur en eau, de son pH voisin de la neutralité et de sa richesse en composants

biodégradables (lactose, protéines et lipides). Pour augmenter sa durée de conservation,

l’homme depuis l’antiquité jusqu’à ce jour travail sur sa fermentation et sa transformation

en d’autres produits laitiers mieux conservés.

La fermentation du lait est utilisée depuis très longtemps pour prolonger sa

conservation. En effet, toutes les populations humaines pratiquant l'élevage ont su

développer des modes traditionnels de fermentation du lait de leurs troupeaux (vaches ou

autres) pour élaborer des produits laitiers fermentés, dont certains sont maintenant aussi

fabriqués industriellement (Yantyati et Andi, 2014).

En Algérie, comme dans les différent autres pays du monde, on retrouve des

produits laitiers indigènes, dont le mode de fabrication découle de l’héritage culturel de la

population transmit de génération en génération. On note parmi ces produits : lbene, raibe,

smen, jben, bouhezza, klila, …etc (Lahsaoui, 2009). En plus d'être plus faciles à

conserver, ces produits sont également plus digestes que le lait d'origine et leurs qualités

organoleptiques sont très appréciés.

Le smen est un produit laitier fermenté traditionnel et un ingrédient essentiel dans

la cuisine algérienne, et largement connu aussi dans d’autres pays nord-africaines et du

Moyen-Orient. C’est un agrégat de matière grasse d’origine animale (beurre fermier) dont

il a subi par la suite un lavage, salage et malaxage, puis conditionné dans des pots

hermétiquement fermés et entreposés dans un endroit frais et obscur à température

ambiante (El Marrakchi et al, 1986 ; Sakili et Issouel, 2003). Ce produit très apprécié par

le consommateur algérien pour ses qualités gustatives et diététiques, est utilisé comme

additif pour les produits alimentaires afin de remonter le goût et l'arôme de certaines

recettes traditionnelles algériennes (couscous, tajine, rfisse, assida …). Sa propriété

d'aliment de forte énergie est exploitée en médecine traditionnelle pour atténuer les

douleurs de la sensation du froid qui accompagne la toux, le rhumatisme et le traumatisme

osseux (voie orale et massage) (Sakili et Issouel, 2003).

Introduction

2

Malgré sa grande consommation dans notre pays, sa disponibilité reste faible. Cela

est du à l’absence des industries dédiées à l’élaboration de ce produit et à cause de

l’insuffisance de production laitière due au manque d’élevage. En effet, L’Algérie se place

au deuxième rang mondial en matière d’importation de laits et produits laitiers après le

Mexique, et le lait représente 20% de ses importations alimentaires totales (Souki, 2009).

Ce qui amène à la population algérienne de consommer des produits d’origine végétale

(smen végétale et margarine).

Parmi tous les micro-organismes, les bactéries lactiques jouent un rôle majeur dans

la fermentation du lait, et contribuent à l’affinage et la maturation de plusieurs produits

laitiers fermentés. De ce fait, elles ont aussi un grand intérêt dans les industries

alimentaires dont elles sont largement utilisées dans la fermentation de plusieurs matières

premières animales et végétales. Comme elles sont aussi connues pour leurs effets

bénéfiques sur la santé. Leur utilisation comme probiotique contribue dans l’amélioration

des fonctions digestives et la guérison du déséquilibre de la microflore gastro-intestinale, et

aident dans la maturation du système immunitaire. Les genres de bactéries lactiques les

plus connues et utilisées dans les industries alimentaire sont : Lactococcus, Streptococcus,

Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus et Bifidobacterium (Leveau et Bouix, 1993).

Du fait de la place importante qu’occupent les bactéries lactiques dans la

fermentation et la production des produits laitiers fermentés et leur affinage, nous avons

pensé à déterminer les agents principaux de la transformation et la maturation du beurre

fermier en smen, et l’amélioration de ses caractères gustatives et organoleptiques. Pour

cela, le but de cette étude est l’isolement et l’identification des bactéries lactiques dans le

smen traditionnel algérien et leur caractérisation biochimique, physiologique et

technologique.

Les objectifs de ce travail sont :

Isolement des bactéries lactiques qui se trouvent dans le smen algérien traditionnel.

Caractérisation phénotypique, biochimique et physiologique de ces bactéries

lactiques.

Etude de quelques caractéristiques technologiques des bactéries lactiques isolées :

pouvoir acidifiant et pouvoir lipolytique.

Première partie :

Revue

Bibliographique

Revue Bibliographique

3

Chapitre 1 : LE LAIT ET LES PRODUITS ARTISANAUX

1. Le lait :

1.1. Définition :

Selon le congrès international de la répression des fraudes de 1909, le lait est le produit

intégral de la traite totale ininterrompue d’une femelle laitière bien portante, bien nourrie et

non surmenée. Il doit être recueilli proprement et ne pas contenir de colostrum (Debry,

2001).

Le lait est un liquide alimentaire opaque, blanc mat légèrement bleuté ou plus ou

moins jaunâtre, à odeur peu marqué et au goût douceâtre, sécrété après parturition, par la

glande mammaire des animaux mammifères femelles pour nourrir leur nouveau-né

(Larousse agricole, 2002).

1.2. Composition du lait :

Les principaux constituants du lait sont par ordre décroissant :

- de l’eau très majoritairement ;

- des glucides principalement représentés par le lactose ;

- des lipides essentiellement des triglycérides rassemblés en globules gras ;

- des protéines : caséines rassemblées en micelles, albumines et globulines solubles ;

- des sels et minéraux à l’état ionique et moléculaire ;

- des éléments à l’état de traces mais au rôle biologique important : enzymes,

vitamines, oligo-éléments …

1.2.1. Eau :

L’eau est l’élément quantitativement le plus important : 900 à 910 g par litre. En

elles, sont dispersés tous les autres constituants du lait, tous ceux de la matière sèche

(Mathieu, 1998).

1.2.2. Glucides :

Essentiellement représentés par le lactose, puisqu’il constitue environ 40% des

solides totaux. D’autres glucides peuvent être présents en faible quantité, comme le

glucose et le galactose qui proviendraient de l’hydrolyse du lactose ; en outre, certains

glucides peuvent se combiner aux protéines. Ainsi, le lait contient près de 4.8% de lactose,

tandis que la poudre du lait écrémé en contient 52% et la poudre de lactosérum, près de 70

% (Mentreuil, 1971).


4

1.2.3. Matière grasse :

Elle se présente sous forme de globules gras, immergés dans l’eau : petites

gouttelettes de triglycérides enveloppées d’une membrane de substances diverses. Pour le

lait de vache, elle est composée essentiellement de triglycérides et secondairement de

diglycérides, de lipides complexes et de substances liposolubles insaponifiables. Les acides

gras entre dans la composition de tous les lipides et constituent 90 % de leur masse. Leur

nature est variée ; on en compte plusieurs centaine mais une dizaine seulement sont

importants par leur quantité (tableau 1) dont deux en particulier, l’oléique et le palmitique

(Mathieu, 1998).

Tableau 1 : Matière grasse du lait contenu dans du globule gras en émulsion dans la phase

aqueuse (Jenson et Newburg, 1995)

% lipidique strict

Goutte lipidique non polaire (# 95% du GG)

*Tri-; 1-2 Di-; Mono-Glycérides : 95,80; 2,25; 0,08

*Cholestérol (majoritairement dans la membrane)

*Acides gras libres

*Cholestérides

*Esters de rétinol

* Composés liposolubles : Vit A,D,E,K; squalène,

caroténoïdes°

98.13

0,28

0,02

traces

traces

Membrane lipidoprotéique externe polaire (#5% du GG)

*Triglycérides

*Phospholipides (lipides complexes)

*Cholestérol total

*Protéines (butyrophiline et xanthine oxydase : 0,3 à 0,4 g/l)

*Enzymes (traces)

*Glycanes divers (traces)

comptabilisés dans les

glycérides

1,11

0,46

non lipidique

non lipidique

non lipidique


5

1.2.4. Protéines :

Les protéines constituent une part importante du lait et des produits laitiers. Ils représentent

95 % de la quantité totale d’azote dont la concentration moyenne est de 3.2%. Les composés

azotés non protéiques sont principalement des protéases, des peptones et de l’urée (Cayot et

Lorient, 1998).

On classe les protéines en deux catégories d’après leur solubilité dans l’eau et leur stabilité,

d’une part, les différentes caséines qui sont en suspension colloïdale, qui se regroupent sous

forme de micelles et qui précipitent sous l’action de la présure ou lors de l’acidification à un

pH d’environ 4.6. D’autre part, les protéines du sérum qui sont en solution colloïdale et qui

précipitent sous l’action de la chaleur (Whitney et al, 1976).

1.2.5. Sels minéraux :

Le lait et les produits laitiers sont les principales sources alimentaires du calcium et

du phosphore. Pour lequel ils couvrent la moitié de nos besoins journalière. Ce sont les

éléments plastiques intéressant dans l’ossification, et leur apport est crucial pour les sujets

jeunes et âgés (Brulé, 1987).

Les minéraux contenus dans le lait prennent plusieurs formes ; sont les plus souvent

des sels, des bases et des acides. A cette liste s’ajoutent certains éléments comme le soufre

présents dans les protéines et les oligo-éléments suivants qui sont présent à de faibles

concentrations à l’état de trace : manganèse, bore, fluor, silicium, brome, molybdène,

cobalt, baryum, titane, lithium et probablement certains autres (Brulé, 1987).

Tableau 2 : Composition minéral du lait (Veisseyre, 1975)

Constituants Teneurs moyennes g/l

Potassium 1.5

Calcium 1.25

Sodium 0.5

Magnésium 0.13

Chlore 1.0

Phosphore totale 0.95

Acide citrique 1.75


6

1.2.6. Vitamines :

Les vitamines sont nécessaires au fonctionnement normal des processus vitaux,

mais l’organisme humain est incapable de les synthétiser. L’organisme humain doit donc

puiser ces sources dans l’alimentation. Les vitamines sont des molécules plutôt complexes

mais de taille beaucoup plus faible que les protéines. Les structures des vitamines sont très

variées ayant un rapport étroit avec les enzymes. Elles jouent un rôle de coenzyme associée

à une apoenzyme protéique (Adrian, 1987). On classe les vitamines en deux grandes

catégories :

- Les vitamines hydrosolubles (vitamines du groupe B et vitamine C) de la phase aqueuse.

- Les vitamines liposolubles (vitamines A, D, E et K) associées à la matière grasse.

Certaines sont au centre du globule gras et d’autres à sa périphérie (Renner, 1983).

Tableau 3 : Concentration en vitamines du lait de vache (Renner, 1983).

Vitamines Moyennes (mg/l)

Vitamines hydrosolubles

B (thiamine) 0.42

B2 (riboblavine) 1.72

B6 (pyridoxine) 0.48

B12 (cobalamine) 0.0045

B3 (acide nicotinique) 0.92

B9 (acide folique) 0.053

B5 (acide pentothénique) 3.6

B7 (inositol) 1.6

B8 (biotine) 0.036

B4 (choline) 1.70

C (acide ascorbique) 8

Vitamines liposolubles

A (rétinol) 0.37

D (cholécalciphérol) 0.0008

E (tocophérol) 1.1

β-carotène 0.21

K 0.03


7

1.2.7. Enzymes :

Dans les conditions normales, le lait contient une grande variété d’enzymes

(Tableau 4). Il y’a plus de 100 ans, on mentionnera pour la première fois la présence de

lactopéroxydase, probablement la première enzyme découverte dans le lait de vache par

Arnold en 1881 (Debry, 2001).

Depuis plus de 60 enzymes ont été répertoriées, mais toutes ne proviennent pas de

cellules lactogènes ou de leucocytes et ne sont pas des constituants natifs. De nombreuses

enzymes sont produites par les micro-organismes du lait. On distingue :

Les enzymes natives dites encore naturelles ou intrinsèque.

Les enzymes d’origine externe, celle des micro-organismes, ou extrinsèques

Tableau 4 : Quelques une des enzymes du lait (Dabry, 2001)

Nom Répartition pH optimum Masse molaire

en g/mol

Teneur en

mg/l

1.

Oxydoréductase :

Lactopéroxydase

Xanthine oxydase

Catalase

- Lactosérum

- Membrane

globulaire

- Membrane

glublaire

6.5 – 6.8

7

6.8 – 7.00

Environ 80 000

600 000

240 000

10 – 70

120 - 160

2. Hydrolase :

Phosphatase

alcaline

Lysozyme

Lipase naturelle

Protéase alcaline

Protéase acide

- Membrane

globulaire

- Lactosérum

- Caséine

- Caséine

- Caséine

7 – 10

8

7 – 9

7.5 – 8

4

170 000

14 000 –

18 000

50 000

48 000

36 000

1.1 – 0.18

1 - 2


8

1.2. Caractéristiques physico-chimiques du lait :

Tableau 5 : Caractéristique physico-chimique du lait (Veisseyre, 1975)

Caractéristiques Valeur

Densité à 15°C 1.030 – 1.034

Chaleur spécifique 0.93

Point de congélation -0.55°C

pH 6.6 à 6.8

Acidité exprimé en degré Dornic 16 à 18

Indice de réfraction à 20°C 1.35

Point d’ébullition 100.16°C

1.3. Caractéristiques organoleptiques du lait :

1.3.1. Couleur :

Le lait est un liquide blanc mat, opaque à cause des micelles de caséinates ou parfois

bleuté ou jaunâtre du fait de la β carotène ou de la lactoflavine contenus dans la matière

grasse (Aby, 2008).

1.3.2. Saveur :

Elle est douceâtre faiblement sucrée (agréable variable en fonction des espèces

animales) (Aby, 2008).

1.3.3. Odeur :

Selon Vierling, (2003), l’odeur du lait est caractéristique du fait de la matière grasse

qu’il contient fixe des odeurs animales. Elles sont liées à l’ambiance de la traite, à

l’alimentation (les fourrages à base d’ensilage favorisent la flore butyrique, le lait prend

alors une forte odeur), à la conservation (l’acidification du lait à l’aide de l’acide lactique

lui donne une odeur aigrelette).


9

1.3.4. Viscosité :

La viscosité est fonction de l’espèce, c’est ainsi que l’on distingue :

- Un lait visqueux chez les monogastriques (jument, ânesse, carnivores, et femme etc.)

- Un lait moins visqueux chez les herbivores (lait de brebis plus visqueux que celui de la

vache) (Seydi, 2004).

1.4. La microflore du lait cru :

Selon RMT, (2011), les grandes catégories de micro-organismes rencontrées dans

les laits sont :

1.4.1. Les bactéries :

Elles prédominent parmi les micro-organismes rencontrés dans le lait. Leurs formes

les plus courantes sont des cellules sphériques (coques) ou des bâtonnets (bacilles), plus ou

moins réguliers ou incurvés. Placées dans des conditions d’environnement défavorables,

certaines bactéries sont capables de donner naissance à des structures très résistantes, les

spores, qui vont leur permettre de survivre pendant des durées qui peuvent être

extrêmement longues. C’est le cas par exemple des « butyriques » (Clostridium

tyrobutyricum).

1.4.2. Les champignons microscopiques :

Ce sont des organismes unicellulaires ou pluricellulaires, porteurs de spores qui

assurent leur multiplication et/ou leur dissémination. Ils sont habituellement divisés en

deux types de microorganismes :

les levures :

Ce sont des champignons pour lesquels l’état unicellulaire prédomine. La forme la

plus fréquente est ovalaire ou sphérique, avec des tailles allant de 2 à 3 μm jusqu’à 20 à 50

μm de long pour 1 à 10 μm de large. Parmi elles figurent notamment Geotrichum

candidum ou Debaryomyces hansenii.


10

Moisissures :

Les moisissures sont des champignons filamenteux pluricellulaires. Leur

dissémination se fait par l’émission de spores qui peuvent être véhiculées par

l’environnement (air, eau) et se retrouver dans le lait et dans le fromage. La taille des

spores varie de 4 à 10 μm de large et jusqu’à 500 μm de long (si pluricellulaires). Les

filaments, de 2 à 5 μm de large, sont de longueur très variable.

1.4.3. Autres micro-organismes :

Les laits peuvent renfermer divers virus (ex : entérovirus), dont certains sont des

bactériophages (parasites obligatoires des bactéries). Comme ils peuvent aussi renfermer

des protozoaires (ex : Toxoplasma gondii, agent de la toxoplasmose) potentiellement

pathogènes pour l’homme.

Figure 1 : Spores et filaments myélien de Geotrichum cnadidum (RMT, 2011)


11

2. Produits laitiers traditionnels algériens :

Le lait, abondant durant certains moments de l’année, il est difficile de le conserver

et facilement périssable, surtout dans les zones à climat très chaud. Dans n’importe quelle

culture, il a toujours été traité pour augmenter la durabilité et la valeur nutritive, et en

même temps permettre sa commercialisation. Les femmes algériennes, comme toutes les

cultures pastorales, ont toujours été les principaux protagonistes auteurs de la

transformation du lait (Lahsaoui, 2009).

Figure 2 : Production laitière- Fromagère algérienne (Lahsaoui, 2009).


12

On peut noter parmi les principaux produits laitiers traditionnels algériens :

2.1. Leben :

L'origine de ce produit remonte à des temps immémoriaux, probablement à

l'époque où l'homme a commencé à domestiquer les espèces laitières et à utiliser leurs laits.

Sa fermentation lactique lui donne son arôme naturel et sa saveur inimitable. Sa

préparation artisanale est simple, le lait est abandonné à lui-même jusqu'à sa coagulation.

Celle-ci se fait à température ambiante et dure 24 à 48 h selon la saison. Le barattage qui

lui succède dure 30 à 40 minutes. A la fin du barattage, on ajoute généralement un certain

volume d'eau (environ 10 % du volume du lait), chaude ou froide, suivant la température

ambiante, de façon à ramener la température de l'ensemble à un niveau convenable au

rassemblement des grains de beurre (Benkerroum et Tamime, 2004 ; Ouadghiri, 2009).

2.2. Raïb :

Le Raïb, comme le leben, fait aussi partie des produits laitiers fermentés populaires

en Algérie. Mais contrairement à lui, il ne subit pas une opération de barattage et

d’écrémage, il s’agit d’un lait fermenté entier. Il est fabriqué à partir du lait cru de vache

ou de chèvre. La fermentation du lait, comme de nombreux procédés traditionnels de

fermentation, est spontanée et incontrôlée et pourrait être une source précieuse des

bactéries lactiques autochtones (Mechai et Kirane, 2008).

2.3. Jben :

Le jben est le fromage frais le plus connu et consommé depuis longtemps aussi bien

en milieu rural qu’en milieu urbain (Benkerroum et Tamime, 2004). D’une manière

générale, il est fabriqué soit à partir du lait de vache ou du lait de chèvre et le processus de

fabrication nécessite trois grandes étapes essentielles : la maturation, la coagulation et

l’égouttage (Randazo et al, 2002).

2.4. Klila :

La klila est préparée à partir du leben chauffé sur feu doux pendant 12 minutes

environ pour favoriser la séparation du caillé et du lactosérum et accélérer le processus

d'égouttage. Le lait caillé est égoutté dans un tissu fin. La klila peut être consommée à l'état

frais ou additionnée à certains plats traditionnels après avoir été coupé en petits cubes et

séchés au soleil (Touati, 1990).


13

2.5. Bouhezza :

C’est un fromage affiné traditionnel, à pâte molle, des régions de l’Est Algérien

(Oum el Bouaghi, Khenchella, Batna, Biskra, etc). Il est obtenu après transformation du

Leben dans une outre, la Chekoua, faite de peau de chèvre préalablement traitée avec du

sel et du genièvre. L’égouttage, le salage et l’affinage du Bouhezza sont réalisés

simultanément dans la Chekoua pendant une durée de 2 à 3 mois. Au cours de la période

d’affinage, du leben et du lait sont rajoutés au contenu de la Chekoua. Au stade de la

consommation le fromage est pétri avec incorporation de poudre de piment rouge, ce qui

lui donne une caractéristique particulière (Aissaoui et al, 2006).

2.6. Beurre ou Zebda :

Le beurre frais (Zebda) est obtenu après barattage du Rayeb. Ce dernier est

occasionnellement augmenté d’une quantité d’eau tiède (40-50 °C) à la fin du barattage

pour favoriser l’agglomération des globules lipidiques et accroître le rendement en beurre.

Les globules gras apparaissant en surface, à la suite du barattage, sont séparés par une

cuillère perforée. Le beurre frais obtenu présente une consistance molle du fait de la forte

concentration en eau (Benkerroum et Tamine, 2004).

2.7. Smen :

2.7.1. Définition :

Le Smen est du beurre rance salé obtenu après transformation du beurre frais par

lavage, saumurage et salage à sec (Benkerroum et Tamine, 2004).

2.7.2. Procédé de préparation du Smen :

Le terme « smen » désigne généralement des produits préparés de façon artisanale à

partir du beurre fermier par lavage et salage, puis conditionnement dans des pots en terre et

conservation à l'abri de l'air et de la lumière pour une durée variable d'au moins 6 mois.

Cette préparation fait ressortir les caractéristiques suivantes :

Absence de tout traitement thermique,

Le salage constituant le seul élément de conservation.


14

Les conditions de stockage sont également originales (anaérobiose et température

ambiante) (El Marrakchi et al, 1986 ; Sakili et Issouel, 2003).

Avant le salage, le beurre peut exceptionnellement subir une cuisson de 1 h à 1 h et 30

min pour favoriser une certaine évaporation d’eau. De plus, le smen, après salage et avant

son conditionnement, peut être aromatisé de thym sous forme de fragments (El Marrakchi

et al, 1986).

2.7.3. Quelques propriétés physico-chimiques du smen :

Tableau 6 : Physico-chimie du smen traditionnel algérien avec comparaison au beurre

traditionnel algérien et au smen traditionnel marocain (Lahsaoui, 2009 ; Latreche, 2016

et El Marrakchi et al, 1986).

Paramètres Smen

traditionnel

algérien

Beurre

traditionnel

algérien

Smen

traditionnel

marocain

Humidité (%) 14 16 13.7

NaCl (g/100g) 1.5 0.93+/- 0.006 1.5

Lactose (par rapport au poids

sec)

1.2 0.1 1.22

Matière grasse (g/100g) 81 82 81.34

Protéines (g/100g) 3.2 0.9 3.25

Lipides insaponifiables (par

rapport aux lipides totaux)

0.3 _ 0.33

Indice d’acide (mg KOH/g

lipide)

52 _ 52.34

Indice peroxyde (meq/g

lipide)

3.7 _ 3.67

ESD (%) _ 2.58+/-0.01 4.96


15

Chapitre 2 : LES BACTERIES LACTIQUES

1. Généralités :

Les bactéries lactiques sont décrites pour la première fois par Orla Jenson au début du

vingtième siècle. Elles sont des microorganismes utiles à l’homme lui participant à

l’élaboration de nombreux produits alimentaires fermentés. Elles jouent plusieurs rôles

relatifs aux caractéristiques organoleptiques, nutritionnelles et sanitaires de l’aliment (Pilet

et al, 1998). Elles produisent de l’acide lactique et éventuellement d’autres produits de

fermentation. L’acidité produite permet la conservation de l’aliment en inhibant la culture

de très nombreuses bactéries. Elles sont considérées comme non pathogènes et voient

attribuer le qualificatif anglo-saxon d’organisme GRAS (GENERALLY REGARDED AS

SAFE) (Guetarni, 2013).

Les bactéries lactiques sont un groupe de bacille ou coccobacille à Gram-positif qui ont

moins de 55 % de contenu G+C dans leur ADN (à l’exception des Bifidobacterium). Elles

sont asporulées, généralement non mobiles, anaérobies mais aéro-tolérantes (Dellaglio et

al 1994, Ganzalez et al, 2000). Elles ne possèdent pas de catalase (certaines souches

possèdent une pseudocatalase), ni de nitrate réductase, ni de cytochrome oxydase. Elles ont

des exigences nutritionnelles nombreuses (acides aminé, peptides, sels, acides gras et

glucides) (Holzapfel et al, 2001 ; Gevers, 2002).

2. Découverte des bactéries lactiques :

Le terme bactéries lactiques est intimement associé aux bactéries impliquées dans la

fermentation des aliments pour l’homme et l’animal. La première culture pure était des

Bacterium lactis probablement des Lactococcus lactis, obtenu par Lister en 1873.

Historiquement, les premiers genres à être décrits sont : Lactobacillus, Leuconostoc,

Pediococcus et Streptococcus ; les genres ci-après : Aerococcus, Carnobacterium,

Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus,

Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella sont considérés comme les

principaux bactéries lactiques du point de vue technologique (Guiraud, 2003 ; Limsowtin

et al, 2004).

3. Habitat :

Les bactéries lactiques sont ubiquistes, elles ont pour habitat de nombreux milieux

naturels. Elles se trouvent généralement associées à des aliments riches en sucres simples.


16

Elles peuvent être isolées du lait, du fromage, de la viande et des végétaux (plantes et

fruits) (König et Fröhlish, 2009). Elles se développent avec la levure dans le vin, la bière

et le pain. Quelques espèces colonisent le tube digestif et on peut les trouver aussi dans les

cavités buccales, vaginales et dans les fèces (Leveau et Bouix, 1993 ; Hassen et Frank,

2001).

4. Classification des bactéries lactiques :

Traditionnellement, les bactéries lactiques ont été classées sur la base des caractères

phénotypiques : la morphologie, le type de fermentation du glucose, la croissance à

différentes températures, l‘isomère de l'acide lactique produit et la fermentation des

différents hydrates de carbone (De Roissart et Luquet, 1994 ; Holzapfel et al, 2001). La

première classification des bactéries lactiques a été établie en 1919 par Orla-Jensen sur

divers critères morphologiques et physiologiques (activités catalase et nitrite réductase,

type de fermentation) (Stiles et Holzapfel, 1997). Cependant, les études basées sur la

comparaison des séquences de l'ARN ribosomal 16S ont montré que certains taxons

générés sur la base de la caractérisation phénotypique ne concordent pas avec les relations

phylogénétiques suggérées. Ainsi, certaines espèces ne sont pas faciles à distinguer par des

caractéristiques phénotypiques (Gevers, 2002). Par conséquent, Les méthodes de typage

moléculaire telles que l'électrophorèse en champ pulsé (PFGE), la réaction de

polymérisation en chaine utilisant des éléments répétés (rep-PCR), ainsi que les Restriction

Fragment Length Polymorphism (RFLP) sont extrêmement précieux pour la caractérisation

et la détection des bactéries lactiques (Holzapfel et al., 2001).

Sur la base des données de séquençage de 16S et 23S de l‘ADNr, les bactéries Gram

positives forment deux embranchements (figure 3). Un embranchement composé de

bactéries Gram positives avec un pourcentage G + C inférieur à 50% (Clostridium) et un

autre formé de bactéries ayant une teneur en G + C supérieure à 50% (Actinomycétes)

(Holzapfel et al., 2001 ; Gevers, 2002). Les bactéries lactiques typiques ont une teneur en

G + C inférieure à 50% alors que le genre Bifidobacterium qui, d'un point de vue

physiologique, fait partie des bactéries lactiques, appartient à la branche des

Actinomycètes qui comprend aussi Propionibacterium et Brevibacterium (Vandamme et

al., 1996). Il y a peu de corrélation entre la classification traditionnelle et la parenté

phylogénétique des bactéries lactiques. Des genres morphologiquement distincts,


17

Lactobacillus, Leuconostoc et Pediococcus sont phylogénétiquement entremêlés (Schleifer

et Ludwig, 1995 ; Gevers, 2002).

Figure 3 : Distance phylogénétique entre les principaux genres constituant les bactéries

lactiques basé sur la séquence des ARNr 16S (Schleifer et Ludwig, 1995).

Actuellement, les bactéries lactiques regroupent treize genres bactériens différèrent

; Lactobacillus, Bifidobacterium Leuconostoc, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus,

Pediococcus, Carnobacterium, Oenococcus Weissella, Aerococcus, Tetragenococcus,

Vagococcus. (Carine et Thonart, 2009). Les principaux genres des bactéries lactiques

sont classés dans le même phylum, classe et ordre :


18

Phylum BXIII : Firmicutes

Classe I : Bacilli

Ordre II : Lactobacillales

5. Caractérisation des principaux genres des bactéries lactiques :

Les caractéristiques des principaux genres des bactéries lactiques Selon Guiraud,

(2003) :

5.1. Lactobacillus :

Lactobacillus est le genre principal de la famille des Lactobacillaceae. Il contient de

nombreuses espèces qui sont des agents de fermentation lactiques intervenant dans de

nombreuses industries ou qui sont rencontrées comme contaminants. Il s’agit de bacilles

souvent allongés, Gram +, asporulés, parfois groupés en paires ou en chaînes,

généralement immobiles. Ils sont catalase – (certains ont une pseudo-catalase, mais comme

les pédiocoques sont benzidine -), microaérophiles ou anaérobies. Ils ont un métabolisme

fermentaire produisant de l’acide lactique. Certaines espèces sont homolactiques, d’autres

hétérolactiques produisant des acides volatils, de l’éthanol et du CO2 à côté de l’acide

lactique.

Le genre Lactobacillus a été subdivisé par Orla Jensen en trois groupes et cette

classification est encore utilisée en milieu industriel :

Figure 4 : Lactobacilles représentatifs. a) L. bulgaricus, contraste de phase (x600). b) L. lactis, coloration de Gram (x500). c) L. acidophilus (x1.000)

(Guiraud, 2003)


19

- Groupe « thermobactérium » :

Il comprend les lactobacilles homofermentaires thermophiles qui se développent à

45 °C mais pas à 15 °C. Les espèces les plus fréquentes dans l’alimentation (lait, yaourts,

fromages) sont L. helveticus, L. jugurti, L. bulgaricus, L.lactis, L. acidophilus, L.

leichamnii, L. derbrueckii, L. kefirofaciens, L. mali, etc.

- Groupe « streptobactérium » :

Il regroupe les lactobacilles homofermentaires mésophiles qui se développent à 15

°C (ils peuvent être occasionnellement hétérofermentaires en fonction du substrat). Il

comporte les espèces L. casei qui est les lactobacilles prédominant du lait, L. plantarum

rencontré dans la choucroute, L. curvatus, L. sake, L. acetotolerans, L. graminis, L.

rhamnosus, etc.

- Groupe « bétabactérium » :

Il comprend les lactobacilles hétérofermentaires. Les espèces les plus fréquents

dans l’alimentation sont : L. fermentum, L. fructivorans, L. hilgardii, L. snafrancisco, etc.

5.2. Les streptocoques, entérocoques, Lactocoques :

Ils étaient anciennement groupés en un seul genre Streptococcus. Ils sont très fréquents

dans l’industrie alimentaire comme contaminant et surtout comme agents de fermentation

homolactique (avec production d’acide lactique de type dextrogyre). Ils sont très exigeants

sur le plan nutritionnel et se développent bien à 37 °C. Parmi le genre Streptococcus, le

groupe viridans comprend les agents d’acidification fréquents dans certains fromages et

yaourts comme le cas de l’espèce Sc. thermophilus . Les Enterococcus composés de

streptocoques fécaux (Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium).

Le genre Lactococcus est représenté par les espèces suivantes : Lactococcus Lactis

subsp. cremoris, Lc. Lactis subsp. Lactis et Lc. Lactis subsp diacetylactis.

5.3. Pediococcus :

Les pediococcus sont des germes micro-aérophiles à besoins nutritifs complexes. Leur

développement nécessite la présence de divers facteurs de croissance. De nombreuse

espèces sont acidophiles et osmophiles. Leur fermentation homolactique donne parfois de

l’acide lactique racémique, mais fréquemment la forme L prédomine. Ils sont utilisés


20

parfois comme levains lactiques pour les charcuteries. Les Aerococcus sont proches des

Pediococcus.

5.4. Leuconostoc :

Les leuconostoques sont également anaérobies, facultative et exigeant en point de

vue nutritionnel. Ils se développent entre 20 et 30 °C. Ils sont généralement capsulés : cette

propriété entraîne fréquemment l’apparition d’une viscosité dans le milieu. Leur

fermentation hétérolactique donne de l’acide L-lactique. Ils sont responsable de

fermentation malolactique des vins (L. oenos) et ils sont utiles dans certains fromages

(bleus) où ils facilitent l’ouverture par la production de CO2. Ils interviennent aussi dans

les ensilages (L. mesenteroides), et les végétaux fermentés : olives, choucroute, …etc.,

mais aussi cacao et café.

5.5. Bifidobacterium :

Bifidobacterium (anciennement Lactobacillus bifidus) est un bacille présent dans la

flore intestinale du nouveau-né. Il est utilisé dans certains yaourts (probiotiques). Sa

présence entraînerait un effet anti-infectieux au niveau intestinal à cause de la présence

d’un facteur bifidogène. Bifidobacterium est phylogéniquement proche des Actinomycètes

alors que les autres bactéries sont proches des clostridies.

Figure 5 : Leuconostoc mesenteroides, image au microscope à contraste de phase. La barre = 10 µm

(Guiraud, 2003).


21

6. Métabolisme des bactéries lactiques :

6.1. Métabolisme des sucres :

Les bactéries lactiques utilisent la fermentation lactique pour dégrader les glucides et

synthétiser de l’énergie sous forme d’ATP. Il existe deux voix principales type de

fermentation lactique :

L’homofermentation regroupe la voie de la glycolyse, aussi connu sous le nom

d’Embden-Mayerhof (Pernas) (Figure 6. 2a), suivie de la conversion de 2 molécules de

pyruvate en 2 molécules de lactate. Elle est surtout utilisée par les bactéries appartenant au

genre Streptococcus et à certaines espèces de Lactobacillus comme Lactobacillus

bulgaricus (Lb. bulgaricus), Lactobacillus casei (Lb. casei), Lactobacillus caucasicus,

Lactobacillus lactis (Lb. lactis) et Lb. plantarum et de Thermobacterium comme

Thermobacterium yoghurti. Au cours de cette voie de fermentation, ces bactéries dégradent

le glucose, le fructose, le mannose, le galactose, le saccharose ou le lactose.

L’hétérofermentation (Figure 6. 2b), communément appelée voie des pentoses

phosphate (transcétolases) (Kandler, 1983) se produit chez des espèces appartenant à

Lactobacillus, telles que Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermenti et à Leuconostoc,

telles que Leuconostoc mesenteroides (Ln. mesenteroides) et Leuconostoc pentosaceus. Au

cours de l’hétérofermentation, les bactéries dégradent les hexoses avec formation quasi

stoechiométrique d’une molécule d’acide lactique, d’une molécule de CO2 et d’une

molécule d’éthanol (Kandler, 1983).


22

Figure 6 : Les principales voies fermentaires des hexoses chez les bactéries lactiques (Makhloufi, 2012).


23

6.2. Activité protéolytique :

Le système protéolytique des bactéries lactiques est composé de protéases associées à

la paroi cellulaire, qui catalysent l’hydrolyse de protéines en peptides contenant de 7 à 16

résidus aminés (Kamaly et Marth, 1989). Ces peptides sont ensuite dégradés par des

endopeptidases ou exopeptidases en unités transportables d’acides aminés et de petits

peptides (Lane et Fox, 1996 ; Lynch et al, 1997).

Le catabolisme des acides aminés est une voie majeure dans la formation de molécules

aromatiques (alcools, aldéhydes, acides organiques, …), comme il peut être une source

d’énergie pour certaines bactéries lactiques en cas de limitation en nutriments (Williams et

al, 2001).

6.3. Activité lipolytique :

L’activité lipolytique des bactéries lactiques est moins importante que leurs activités

protéolytiques. Il paraît, au travers des publications scientifiques, que les connaissances sur

l’activité lipolytique des bactéries lactiques soient encore fragmentaires. Néanmoins, les

voies métaboliques liées à la lipolyse génèrent des acides gras libres et des précurseurs

d'arômes qui entrent dans la saveur globale des produits alimentaires (Bigret, 1994).

Figure 7 : Principales voies de lipolyse chez les bactéries lactiques (Mc

Sweeny et Sousa, 2000)


24

6.4. Métabolisme du citrate :

Malgré sa concentration relativement faible dans le lait (8-9 mM), le citrate est un

constituant clef pour la formation du diacétyle, un composant volatil à l’arôme de beurre

important dans les laits fermentais et les fromages frais. Environ 90% du citrate du lait est

soluble et majoritairement perdu dans le lactosérum (Aamikunnas, 2006)

Figure 8 : Métabolisme du citrate chez les bactéries lactiques (Cogan, 1981).


25

7. Besoins nutritionnels :

Les bactéries lactique ont une faible aptitude biosynthétique et sont en principe

incapable d’assimiler directement non seulement des substrats complexes carbonés, azotés

mais aussi de facteurs de croissance comme les vitamines et les oligoéléments dont le rôle

des coenzymes est plus important (Lenoir et al .1992).

7.1. Besoins azotées :

En général, les bactéries lactiques sont incapables d’effectuer la synthèse des acides

aminés à partir d’une source d’azote, et doit faire appel à des sources exogènes pour

assurer le métabolisme. Six acides aminés sont essentiels à la croissance des bactéries

lactiques soient : l’acide glutamique, la valine, la méthionine, l’isoleucine, leucine,

l’histidine (Cocaign-Bousquet et al, 1995).

7.2. Vitamines :

Elles jouent un rôle primordial dans le métabolisme cellulaire. Les bactéries lactiques

sont incapables de synthétiser de vitamines d’où l’importance d’un apport exogène en

vitamines au milieu de culture (Desmazaud et De Roissart, 1994).

7.3. Ions :

Ils ont une fonction de cofacteur pour de nombreuses enzymes, en effet le fer est un

élément important puisqu’il y a des affinités pour un grand nombre de molécules

chelatrices. Il augmente la croissance et la production d’acide lactique pour les

Lactococcus ainsi le calcium et magnésium exercent un effet crucial dans le métabolisme

énergétique, le sodium exerce un effet sélectif sur différentes espèces des bactéries lactique

(Boyaval, 1989).

8. Quelques effets bénéfiques des bactéries lactiques :

8.1. Dans le domaine alimentaire :

Les bactéries lactiques sont impliquées dans la fermentation et la bioconservation

de différents aliments. Ils sont utilisées pour améliorer les caractéristiques organoleptiques

des produits fermentés : Différentes actions enzymatiques (protéolyse, réduction des

nitrites, activité péroxydasique, dégradation des lipides) permettent l’apparition de flaveur,

texture et couleur, intéressante pour le consommateur. Comme ils sont aussi utilisées pour

augmenter la durée de conservation des aliments sans l’utilisation de conservateurs

chimiques grâce aux substances antimicrobiennes qu’elles secrètent, et par leur


26

développement rapide qui permet d’assurer une maitrise de la contamination par des

organismes indésirables (Garry et Le Gherne, 1999 ; Dortu et Thonart, 2009).

8.2. Dans le domaine thérapeutique :

Dans le domaine de la santé, certaines bactéries lactiques spécifiques sont utilisées

comme probiotiques c’est-à-dire des micro-organismes vivants dont l’application à

l’homme ou à l’animal exercent un effet bénéfique sur la santé de ce dernier par

amélioration des propriétés de la flore intestinale. Les espèces couramment utilisées sont

Lb. acidophilus, Lb casei, Lb johnsonii, Lb reuteri, Lb derbruecki, subsp bulgaricus

(Salminen et al, 2004).

Différentes études ont démontré le rôle préventif aussi bien que curatif de ces

bactéries sur plusieurs types de diarrhées (Mkrtchyan et al, 2010). D’autres ont cité leur

capacité de diminuer les allergies liées aux aliments grâce à leur activité protéolytique (El-

Ghaish et al, 2011).

Deuxième partie :

Etude

Expérimentale

Etude Expérimentale

27

Chapitre I : MATERIEL ET METHODES

1. Lieu de stage :

La réalisation de cette étude a été faite au niveau du laboratoire pédagogique du

l’université Djilali Bounaama de Khemis Miliana pendant 3 mois.

2. Matériel utilisé :

2.1. Echantillons de smen:

Trois échantillons de smen ont été utilisés dans cette étude. Ils ont été pris à partir des

régions différentes de la wilaya de Ain defla, et ils ont tous été préparés à partir du lait de

vache.

Figure 9 : localisation des trois régions où les échantillons de smen sont provenus (Google

maps, 2017)

Tableau 7 : Provenance et durée de fermentation des trois échantillons analysés

Echantillons Provenance Durée de fermentation

1 Bourached + 4 mois

2 Ain Lechiakh + 10 ans

3 Ben Allal + 6 mois


28

2.2. Matériel et milieux de culture utilisés :

Voir annexe

3. Méthodologie :

3.1. Isolement des bactéries lactiques :

3.1.1. Préparation de la solution mère et des dilutions décimales :

Afin de préparer la solution mère, 2.6 g d’échantillon de smen contenu dans un tube

stérile est additionné de 2 ml d’eau physiologique, puis est incubé à 37 °C jusqu’à

fusionnement et obtention de deux phases. Ensuite, pour assurer la répartition des

bactéries, une agitation pendant 3 à 5 minutes par un vortex a été réalisée (Sakili et

Issouel, 2003).

Des dilutions décimales jusqu’à 10-6 ont été préparées à partir de la solution mère :

par une pipette Pasteur stérile, un volume de 1 ml de la phase aqueuse est pris et additionné

aseptiquement à 9 ml d’eau physiologique pour l’obtention de la dilution 10-1. Ensuite, 1

ml de cette dernière est pris et additionné à 9 ml d’eau physiologique pour réaliser la

dilution 10-2, et le processus a été continu ainsi jusqu’à l’obtention de la dernière dilution.

3.1.2. Ensemencement et isolement des souches lactiques :

L’ensemencement a été réalisé à partir de trois dilutions décimales: 10-3, 10-4 et 10-5

par la technique d’étalement en râteau en utilisant une pipette Pasteur. Chaque dilution a

été ensemencé sur deux milieux gélosés MRS et M17, préalablement coulés dans des

boites de Pétri stériles.

Ces boites ont été bien fermées pour assurer l’anaérobiose qui est favorable pour le

développement des bactéries lactiques. Ensuite, elles ont été incubées à 37 °C pendant 48h

à 72 h.

Après incubation, les colonies obtenues ont été sélectionnées après analyse

macroscopique, coloration de Gram et test de catalase. Seules ceux qui présentent un

aspect typique des colonies de bactéries lactiques, et qui ont Gram + et catalase -, ont été

présumées comme étant des bactéries lactiques, et ont été pris et mis isolément dans des

tubes contenant le bouillon MRS pour leur enrichissement.


29

Figure 10 : Schéma montrant la préparation et l’ensemencement des dilutions

décimales

Incubation à 37oC pendant 48 à 72h

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Solution

mère

MRS

M17

1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL

0.1mL 0.1mL

0.1mL 0.1mL 0.1mL

0.1mL 0.1mL

0.1mL


30

Figure 11 : Schéma représentant les étapes de l’isolement et la purification des bactéries

lactiques

Ensemencement par technique des quadrants

MRS OU M17

Rep

iqu

ag

e successive ju

squ

’à p

urifica

tion

Incubation à 37°C pendant 48h à 72h

MRS ou M17

5 mL Bouillon

MRS

Après incubation

Incubation à 37°C pendant 48h à 72h

- Test de

catalase

- Coloration de

Gram

- Observation

macroscopique

Une colonie

Identification biochimique et

physiologique


31

3.1.2.1. Analyse macroscopique :

C’est une observation visuelle des colonies sur la surface des milieux MRS et M17

solides, pour caractériser leurs formes, leurs tailles, leurs contours et leurs couleurs (Badis

et al, 2005).

3.1.2.2. Test de catalase :

Il consiste à mettre dans une lame stérile une goutte d’eau oxygénée, dans laquelle

sera dissociée une colonie d’une souche définie. Cette dernière est dite catalase positive

(possède l’enzyme de catalase) s’il y’a formation des bulles d’air, alors que le contraire

indique qu’elle est catalase négative (Marchal et al, 1991).

3.1.2.3. Coloration de Gram :

Elle permet de différencier les bactéries à Gram + de celle à Gram -, et de nous

renseigner sur leur formes et le mode de leur association.

Sur chacune des lames dont les souches sont fixées, quelques gouttes de violet de

gentiane a été déposées et laissé agir pendant 1 min. Après rinçage avec de l’eau de

robinet, du lugol est redéposé pendant 1min pour le mordançage. Ensuite, la décoloration a

été faite par l’alcool à 95° pendant 30s puis un autre rinçage est effectué. Enfin, un

deuxième colorant (fuschine de Ziehl) est déposé pendant 30s (Larpent et Larpent,

1990).

Après le dernier lavage et séchage des lames, l’observation a été réalisée au

microscope optique (10 x 100) avec l’utilisation de l’huile d’immersion.

3.1.3. Purification des isolats :

Plusieurs repiquages ont été réalisés pour chaque souche isolée jusqu’à obtention

des colonies de même taille, même forme et même couleur.

3.2. Identification biochimique et physiologique des bactéries

lactiques :

3.2.1. Test d’oxydase :

Il consiste à prendre une partie d’une colonie pure du milieu MRS ou M17 gélosé et

la mettre en contact avec un disque « Ox ». Le développement d‘une couleur violette


32

signifie que le test est positif et que l‘isolat possède l‘enzyme cytochrome oxydase

(Kovacs et al, 1995).

3.2.2. Mannitol mobilité

Ce test permet d’étudier la fermentation du mannitol et la mobilité des bactéries.

L’ensemencement des souches a été réalisé par piqûre centrale jusqu’au fond de la gélose à

l’aide d’une pipette Pasteur.

La fermentation du mannitol se traduit par virage de la couleur du milieu du rouge

au jaune. Les bactéries mobiles se déplacent à partir de la ligne d’ensemencement en créant

un trouble dans le milieu, alors que les bactéries immobiles poussent uniquement le long

de la strie d’ensemencement (Gerhardt et al, 1994).

3.2.3. Type fermentaire :

Ce test permet de différencier entre les bactéries lactiques homofermentaires et

hétérofermentaires (production du gaz CO2). Les souches ont été ensemencées dans des

tubes contenant chacune 10 ml du milieu BCP+L et une cloche de Durham.

Après incubation à 37°C pendant 24h à 48h, le CO2 produit par les bactéries

hétérofermentaires s’accumule dans les cloches de Durham (Copolla et al, 1997).

3.2.4. Résistance au téllurite :

La résistance au téllurite a été recherchée en utilisant la gélose MRS additionné à

0.4 % de téllurite. Les souches ont été ensemencées par strie sur la surface du milieu,

ensuite elles ont été incubées à 37 °C pendant 24 h. Celles qui donnent des colonies noires

après l’incubation sont considérées résistantes aux téllurite (Facklam, 1972).

3.2.5. Culture en différentes températures :

Cette culture permet de distinguer entre les bactéries lactiques mésophiles et

thermophiles. Après inoculation dans du bouillon MRS, les souches isolées ont été incubé

à 15 °C et à 45 °C pendant 24h à 48h (Guiraud, 1998).

3.2.6. Croissance dans des conditions hostiles :

3.2.6.1. En présence de NaCl :

Le bouillon MRS est additionné de 2%, 4% et 6.5% de NaCl, puis il est réparti en

tubes et ensemencé par les souches lactiques isolées. Le résultat obtenu après incubation à


33

37 °C pendant 24h à 48h est considéré comme positif s’il y’a apparition de trouble (Badis

et al, 2005).

3.2.6.2. En pH 4.5, 6.5 et 9.5 :

Le pH du milieu MRS est ajusté à 4.5, 6.5 et 9.5 à l’aide d’une solution de HCl,

puis il est ensemencé par les différentes souches isolées et incubé à 37°C pendant 2 à 3

jours. La présence de trouble indique une croissance bactérienne (Badis et al, 2005).

3.2.6.3. Thermorésistante :

Les tubes contenant le milieu MRS et ensemencés par les isolats ont été incubés à

65 °C pendant 30 minutes, après ils ont été refroidis et incubés à 37°C pendant 24h. La

présence de trouble indique une croissance bactérienne et que la souche est

thermorésistante (Guiraud, 2003).

3.2.7. Utilisation de la galerie Api 20E :

Cette galerie comporte 20 microtubes contenant des substrats sous forme

déshydraté, et dont seront inoculés par la suspension bactérienne de la souche à tester.

Bien que ce type de galerie soit recommandé pour l’identification des entérobactéries,

elle a été employée pour profiter de certains tests biochimiques qu’elle contient, et

compléter l’identification des souches isolées. Ces tests sont :

l’arginine dihydrolase (ADH) ;

l’utilisation du citrate (CIT) ;

réaction de Voges-Proskauer (VP) ;

liquéfaction de la gélatine (GEL) ;

réduction du nitrate (GLU) après l’ajoute des deux réactifs : Nitrite 1 et Nitrite2 ;

la dégradation des sucres : Glucose (GLU), Mannose (MAN), Inositol (INO),

Sorbitol (SOR), Rhamnose (RHA), Saccharose (SAC), Melibiose (MEL),

Amygladine (AMY), Arabinose (ARA).

Procédé d’utilisation :

Préparation de la galerie :

Elle consiste à remplir avec de l’eau distillée stérile les alvéoles de la boite

d’incubation afin de créer une atmosphère humide, ensuite y déposer stérilement la galerie.

Préparation de l’inoculum :


34

2 à 3 colonies de chaque souche ont été dissociées dans un tube contenant 5 ml

d’eau physiologique pour créer une suspension bactérienne très dense.

Ensemencement de la galerie :

Pour chaque souche, la suspension bactérienne a été introduite dans les microtubes

de la galerie par une pipette Pasteur stérile en évitant la formation des bulles d’air, et

suivant les instructions suivantes :

Remplir avec la suspension le tube et la cupule pour les trois tests CIT, VP, GEL.

Et remplir uniquement le tube pour les autres tests.

Recouvrir la suspension avec l’huile de paraffine pour le test d’ADH,

Incubation de la galerie :

La galerie a été incubée pendant 24h à 37°C.

Lecture des résultats :

La lecture des résultats a été faite par observation du virage de couleur pour chaque

test directement après incubation, ou indirectement révélée après 10 min d’ajout du réactif

pour les 2 tests suivants :

Test VP : ajout d’une goutte de VP1 et de VP2.

Test GLUC : ajout d’une goutte de Nitrite 1 et de Nitrite 2.

3.2.8. Test d’hémolyse :

Les souches ont été ensemencées sur milieu MRS et M17 additionnés au sang

humain puis ils ont été incubées à 37°C pendant 24h.

Ce test permet de connaitre le caractère hémolytique des bactéries isolées (Idoui et

al, 2009):

Couleur verte autour des colonies (hémolyse partielle) : α hémolytique.

Eclaircissement autour des colonies (hémolyse totale) : β hémolytique.

Le milieu n’est pas modifié (absence d’hémolyse) : γ hémolytique

3.2.9. Profil fermentaire :

Ce test a été réalisé afin de déterminer la capacité des souches à fermenter quelques

sucres, qui sont : lactose, fructose, maltose, galactose, et les sucres présents dans la galerie


35

Api E 20. Pour cela, le milieu BCP a été additionné chaque fois d’un sucre à 1%, puis il a

été ensemencé par les souches à étudier et incubé à 37°C pendant 24h à 48h. Une couche

de vaseline a été ajoutée avant l’incubation dans chaque tube pour créer des conditions

d’anaérobiose. L’apparition de trouble, et le virage de la couleur du milieu du violet au

jaune affirme que la souche est capable de fermenter le sucre testé.

Tableau 8 : Tests phénotypiques biochimiques et physiologiques utilisés dans l’isolement

et l’identification des bactéries lactiques

Test Milieu ou réactif Réaction + Réaction -

Catalase H2O2 Dégagement de

bulles de gaz

Absence

Coloration de

Gram

Violet de gentiane +

Lugol + Alcool à

95°+ Fuschine

Gram + : Bactéries

de couleur violette

Gram - : Bactéries

de couleur rose

Oxydase Disques OX Coloration violette Absence

Mannitol

Mobilité

Milieu de Mannitol

Mobilité

Mannitol + : virage

au jaune

Mannitol - : couleur

reste rouge

Mobilité + :

envahissement du

milieu

Mobilité - : Pas

d’envahissement du

milieu

Type fermentaire Milieu BCP+L Gaz + :

hétérofermentaire

Gaz - :

homofermentaire

Résistance au

téllurite 0.4%

Gélose MRS + 0.4%

de téllurite de

potassium

Colonies noires Absence

Résistance à

différente

température

Bouillon MRS Trouble Absence


36

Croissance à

différente pH

Bouillon MRS ajusté

à différente pH (4.5,

6.5 et 9.5)

Trouble Absence

Croissance à

différentes

concentration de

NaCl

Bouillon MRS salé

(2%, 4% et 6.5 % de

NaCl)

Trouble Absence

Thermorésistance Bouillon MRS Trouble Absence

Dégradation de

l’arginine (ADH)

Galerie Api 20 E Virage au rouge Couleur jaune

Production

d’acétoïne (VP)

Galerie Api 20 E Virage au rose foncé Couleur reste

transparente

Utilisation du

citrate (CIT)

Galerie Api 20 E Virage au vert bleuté

ou au bleu

Couleur jaune ou

verte

Liquéfaction de la

gélatine (GEL)

Galerie Api 20 E Virage au noir Couleur

transparente

Réduction du

nitrate (NIT)

Galerie Api 20 E Virage au rouge

foncé

Couleur reste bleu

au jaune

Hémolyse Gélose au sang α hémolyse : Couleur

verte autour des

colonies

β hémolyse :

Eclaircissement

autour des colonies

γ hémolyse : Le

milieu n’est pas

modifié

Profil

fermentaire

Bouillon BCP +

Sucre à 1%

Virage au jaune

Milieu reste violet

Galerie Api 20 E Virage au jaune Couleur reste bleu


37

3.3. Etude de quelques propriétés technologiques des bactéries

lactiques :

3.3.1. Pouvoir acidifiant :

Il consiste à étudier d’une part l’évolution du pH au coure de temps des différentes

cultures de lait écrémé où les souches sont cultivées. Et d’étudier simultanément l’acidité

dornique par dosage à la soude, et en utilisant l’indicateur coloré Phénolphtaléine qui passe

de l’incolore au rose. L’analyse de ces deux paramètres a été faite pour chacune des

souches lactiques isolées à différents intervalles de temps : 0h, 2h, 4h, 6h, 8h et 24h

(Larpent, 1997).

3.3.2. Pouvoir lipolytique :

L’activité lipolytique a été recherchée sur milieu MRS tamponné à pH = 7 et

additionné à 30% de Tween 80 (Guiraud et Galzy, 1980).

Chaque souche d’une culture jeune a été chargée dans un disque de Wattman

(6mm) ensuite déposé sur la surface du milieu. L’incubation a duré pendant 7 jours à 37°C.

L’activité lipolytique se traduit par apparition d’un halo opaque au tour des colonies

(Guiraud et Galzy, 1980).


38

Chapitre II : RESULTATS ET INTERPRETATION

1. Isolement des bactéries lactiques :

Plusieurs souches ont été sélectionnées à partir des trois échantillons de smen par les

tests préliminaires décrits ci-dessous :

Echantillon 1 : 08 souches.



Nous avons attribué aux isolats un code de E (échantillon) avec un numéro de

l’échantillon d’origine suivi par S (souche) et le numéro de la souche isolée.

1.1. Analyse macroscopique :

Des colonies rondes blanchâtres et de contour régulier apparaissent sur la surface des

géloses MRS et M17 ont été retenues et sélectionné parmi les autres micro-organismes

trouvés (champignons). Ces colonies ont subi une coloration de Gram et un test de

catalase.

Les souches sélectionnées ont conservé le même aspect après plusieurs repiquages :

forme ronde, couleur blanchâtre ou peu transparente, contour régulier, lisses et légèrement

bombé (Figure 12 et 13).

Figure 12 : Aspect des colonies de bactéries lactiques sur milieu MRS après 48h d’incubation à 37°C


39

1.2. Analyse microscopique (coloration de Gram) :

Seules les bactéries qui présentent un Gram positive sont retenues, quelques soit leurs

formes et leur mode d’association. Dans notre étude, les souches isolées sont 100% des

coques avec différents modes d’association (Tableau 9).

Figure 13 : Aspect des colonies de bactéries lactiques sur milieu M17 après 48h d’incubation à 37°C

Figure 14 : Observation des bactéries lactiques du genre Enterococcus sous microscope optique (10x100) après coloration

de Gram.


40

Figure 15 : Observation des bactéries lactiques du genre Lactococcus sous microscope optique (10x100) après

coloration de Gram

Figure 16 : Observation des bactéries lactiques du genre Pediococcus sous microscope optique (10x100) après

coloration de Gram


41

Tableau 9 : Résultats de l’observation microscopique après coloration de Gram des

souches isolées des trois échantillons de smen

Echantillon Souches Forme Mode d’association

01

S01 Coque Isolé + diplocoque + petites

chaînettes.

S02 Coque Diplocoque et tétrade.

S03 Coque Petites chaînettes.

S04 Coque Diplocoque + tétrade.

S05 Coque Tétrade.

S06 Coque Isolé + petites chaînettes.

S07 Coque Diplocoque +petites chaînette.

S08 Coque Diplocoque + petites chaînette.

02


chaînettes.

S10 Coque Tétrades.


chaînettes.


chaînettes.


chaînettes.


chaînettes.

03


chaînettes + association en amas.

S16 Coque Diplocoque + tétrades.

S17 Coque Association en amas.

S18 Coque Diplocoque + petites chaînettes.


chaînettes.


chaînettes.


42

1.3. Test de Catalase :

Les souches qui ont produit un dégagement gazeux après la mise en contact de leur

colonie avec l’eau oxygéné ont été écartées et considérées comme étant non bactérie

lactique puisqu’elles sont catalase + (Figure 17).

2. Identification biochimiques et physiologiques des bactéries lactiques :

Les tests préliminaires décrits avant, et les tests biochimiques et physiologiques

réalisées montrent que les souches isolées appartiennent à trois genres de bactéries

lactiques qui sont selon leur prédominance : Enterococcus (60%), Pediococcus (25%)

et Lactococcus (15%).

Figure 18 : Le pourcentage des genres obtenus et isolés à partir des trois échantillons de smen

Figure 17 : Test de catalase


43

L’identification des espèces isolées de bactéries lactiques a été effectuée selon les

manuels de Bergey, (2009), Leyral et Joffin, (1998) et Facklam et Elliott, (1995).

Les résultats de l’identification phénotypiques, biochimiques et physiologiques sont

résumés dans le tableau 10.

Figure 19 : Répartition des trois genres de Bactéries lactiques isolées dans chaque échantillon de smen analysé


Tableau 10 : Résultats des tests phénotypiques, biochimiques et physiologique des souches lactiques isolées des trois échantillons de smen S

ou

ches

Ca

tala

se

Gra

m

Ox

yd

ase

Ty

pe

ferm

enta

ire

Croissance à

différentes

concentration de

NaCl

Croissance à

différentes

température

s

Croissance à

différents pH

Th

erm

oré

si-

sta

ntc

e

Tes

t

d’h

émo

lyse

Ma

n

Mo

b

Rés

ista

nce

a

u

tell

u.

de

p

Nit

rate

Réd

uct

ase

AD

H

CIT

VP

GE

L

2% 4% 6.5

%

15°C 45°C pH

4.5

pH

6.5

pH

9.5

M Su

Echantillon 1 1 - + - Hom + + - - + - + + + ɣ - + + - + - - -

2 - + - Hom + + + - + + + + + ɣ - + - - + - +/- -

3 - + - Hom + + + - - - + + + ɣ - + - - + - + -

4 - + - Hom + + + - + + + + + ɣ - + + - + - + -

5 - + - Hom + + - - - + + + + ɣ - + - - + - + -

6 - + - Hom + + + - + +/- + + + ɣ - + - - + - +/- -

7 - + - Hom + + + + + +/- + + + ɣ - + - - + - + -

8 - + - Hom + + + + + +/- + + + ɣ - + - - + - + -

Echantillon 2 9 - + - Hom + + + - + - + + + ɣ - + + - + - + -

10 - + - Hom + - - - + - + + + ɣ - + - - + - - -

11 - + - Hom + + + - + + + + + ɣ - + - - + - + -

12 - + - Hom + + + - + +/- + + + ɣ - + + - + - - -

13 - + - Hom + + - - + + + + + ɣ - + - - + - + -

14 - + - Hom + + + - + - + + + ɣ - + + - + - - -

Echantillon 3 15 - + - Hom + + + - + + + + + ɣ - + + - + - + -

16 - + - Hom + + + - - + + + + ɣ - + + - + - - -

17 - + - Hom + + - - + - + + + ɣ - + - - + - - -

18 - + - Hom + + + - + + + + + ɣ - + + - + - + -

19 - + - Hom + + + - + + + + + ɣ - + - - + - - -

20 - + - Hom + + + - + + + + + ɣ - + + - + - + -

Man Mob : Mannitol Mobilité ; M : Mobilité ; Su: Sucre de mannitol ; ADH : Arginine dihydrolase ; CIT : Citrate ; VP : Voges-Proskauer ; GEL :Gélatine.


45

2.1. Test d’oxydase :

Toutes les souches étudié n’ont pas réagi avec les disques OX et n’ont pas produit

une couleur violette. Ce qui signifie qu’elles sont oxydase négatif.

2.2. Mannitol Mobilité :

Toutes les bactéries lactiques isolées ont fermenté le mannitol qui conduit au virage

de la couleur du milieu du rouge au jaune. En plus, leur croissance a été détectée

seulement dans la piqûre d’ensemencement, ce qui prouve qu’elles sont immobiles

(Figure 21).

Figure 20 : Test d'oxydase par les disques OX

Figure 21 : Test de Mannitol mobilité

Témoin E1 S4 E1 S3 E1 S2 E1 S1


46

2.3. Type fermentaire :

Ce test permet de séparer entre les espèces de coques lactiques Homofermentaires

(Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus et Pediococcus) et hétérofermentaire

(Leuconostoc)

Toutes les souches isolées et ensemencées dans le milieu BCP additionné au lactose

n’ont pas produit de gaz dans les cloches, donc elles sont tous homofermentaires.

Le virage de la couleur du milieu du violet au jaune a été observé chez toutes les

souches, ce qui signifie qu’elles ont fermenté le lactose (Figure 22).

2.4. Croissance à différentes températures :

Le but de ce test était de distinguer entre les bactéries lactiques dite mésophiles et

celles dites thermophiles. Les résultats obtenus montrent que la majorité d’entre elles sont

des thermophiles est peuvent pousser à 45 °C (Tableau 45).

Cloches de

Durham

Figure 22 : Test du type fermentaire des bactéries lactiques


47

2.5. Thermorésistance :

Tous les isolats sont thermorésistants et ont toléré un traitement à 65 °C pendant

30min.

2.6. Croissance à différentes pH et à différentes concentration de NaCl :

Ces tests permet de caractériser certaines espèces, et de différencier entre les

Enterococcus qui peuvent tolérer différente pH et jusqu’à 6.5% de NaCl, et les

Lacococcus.

Les souches ont été ensemencées dans des milieux MRS dont le pH a été ajusté par la

solution HCl à 4.5, 6.5 et 9.5, et à différentes concentration de NaCl : 2%, 4% et 6.5%. Les

résultats obtenus sont représentés dans le tableau 10.

E2

S14

loc

hes

de

Du

rh

am

E2

S13

E2

S12

E2

S11

E2

S9

E2

S10

Figure 23 : Résultats du test de croissance à 45 °C pour les isolats de l'échantillon 2 du smen


48

2.7. Résistance au téllurite :

Les souches résistantes apparient sous forme de colonies noires sur la surface de la

gélose MRS additionné de 0.4% de téllurite de potassium. Ce test permet de sélectionner

Enterococcus faecalis (résistante au téllurite) des autres Enterococcus.

Les résultats obtenus de ce test pour les souches de bactéries lactiques isolées sont

résumé dans le tableau 10.

Figure 24 : Résultats du test de croissance à 4% de NaCl pour les souches isolées de l'échantillon 3 du smen

E3

S1

55

E3

S1

6

E3

S1

7

E3

S18

E3

S2

0

E3

S19

E1

S1

E1

S2

E1

S3

E1

S4

E1

S5

E1

S6

E1

S7

E1

S8

Figure 25 : Résultats du test de croissance à un pH = 6.5 pour les souches isolées de l'échantillon 1 du smen


49

2.8. Test d’hémolyse :

Les souches isolées ne présentent pas une activité hémolytique alors elles sont tous ɣ

hémolytiques (Figure 27).

Colonies

noires

Figure 26 : Test de résistance au téllurite

E1 S1

E1 S2

E2 S1

E2 S2

Figure 27 : Résultats du test d'hémolyse


50

2.9. La galerie Api 20 E :

Afin de compléter l’identification des bactéries lactiques isolées et de caractériser les

espèces, La galerie Api E 20 a été exploité pour certains tests qui sont : l’arginine

dihydrolase (ADH), l’utilisation du citrate (CIT), réaction de Voges-Proskauer (VP),

liquéfaction de la gélatine (GEL) et la réduction du nitrate. Comme elle a été aussi

exploitée pour établir le profil fermentaire des souches lactiques.

Les résultats obtenus après incubation des galeries montrent que tous les isolats

peuvent dégrader l’arginine (ADH +), mais ne peuvent pas utiliser la citrate (CIT -), ni

réduire la nitrate en nitrite (NIT -), ni léquifier la gélatine (GEL -). Et pour la production

d’acétoïne (VP), les résultats sont variable selon les espèces (le tableau 10).

2.10. Le profil fermentaire :

Pour établir le profil fermentaire des bactéries lactiques isolées, la fermentation de

quelques sucres a été testée par la galerie classique : Lactose, Fructose, Galactose, Maltose.

Le reste a été testé à partir de la galerie Api 20 E : Glucose, Mannose, Inositol, Sorbitol,

Rhamnose, Saccharose, Melibiose, Amygladine, Arabinose. Les résultats sont représentés

dans le tableau 11.

E1

S5

E1

S8

E3

S5

Api

20

E

Figure 28 : Résultats des tests de la galerie Api 20E


51

Galactose Fructose

Figure 29 : Résultats de la fermentation des deux sucres "galactose et fructose" par les bactéries lactiques isolées (galerie classique)

E1 S8

E3 S1

Figure 30 : Résultats de la fermentation des sucres de la galerie Api 20 E


52

Tableau 11 : Résultats du profil fermentaire des souches isolées à partir des trois

échantillons

So

uch

es

Glu

cose

Galacto

se

Fru

ctose

Sacch

arose

Malto

se

Man

nito

l

Inosito

l

Sorb

itol

Rham

nose

Melib

iose

Am

yglad

ine

Arab

inose

Lacto

se

Echantillon 1

1 + + + + + + + + + + + + +

2 + + - + + + + + + + + + +

3 + + + + + + + + + + + + +

4 + + + + + + + + + + + + +

5 + + + + + + + + + + + + +

6 + + + + + + + + + + + + +

7 + + + + + + + + + + + +/- +

8 + + + + + + + + + +/- +/- - +

Echantillon 2 9 + + + + + + + + + + + + +

10 + - + + + + + + + + + + +

11 + + + - + + + + + + + + +

12 + + + + + + + + + + + +/- +

13 + + - + + + + + + + + + +

14 + + + + + + + + + + + +/- +

Echantillon 3 15 + + + + + + + + + + + + +

16 + + + + + + + + + + + + +

17 + + + + + + + + + + + + +

18 + + + + + + + + + + + + +

19 + + + + + + + + + + + + +

20 + + + + + + + + + + + + +


53

Tableau 12 : Résultats d’identification des souches de bactéries lactiques isolées

3. Etude de quelques propriétés technologiques :

3.1. Etude du pouvoir acidifiant :

La fonction acidifiante des bactéries lactiques constitue une propriété importante

dont elle est exploitée notamment par les industries agro-alimentaires. Les résultats de

l’évolution du pH et de l’acidité pour les souches de bactéries lactiques isolées sont

illustrés dans les figures 31, 32 et 33. Et les résultats chiffrés sont représentés dans les

tableaux 13 – 18 (Annexe).

Echantillons Souches Espèce

identifiée

01

1 Lactococcus lactis subsp lactis

2 Pediococcus acidilactici

3 Enterococcus dispar

4 Pediococcus acidilactici

5 Pediococcus sp

6 Enterococcus faecium



02

9 Enterococcus faecalis

10 Pediococcus sp


12 Enterococcus malodoratus

13 Lactococcus garvieae

14 Enterococcus malodoratus

03


16 Pediococcus pentosaceus

17 Lactococcus lactis lactis


19 Enterococcus sp

20 Enterococcus faecalis


54

Figure 31 : Résultats de l’évolution du pH et de l'acidité en fonction du temps pour les bactéries lactiques isolées appartenant au genre Lactococcus

Figure 32 : Résultats de l'évolution du pH et de l'acidité en fonction du temps pour les bactéries lactiques isolées du genre Pediococcus


55

L’étude du pouvoir acidifiant des isolats de bactéries lactiques montre que ces

derniers produisent progressivement de l’acide lactique et cela est accompagné

simultanément d’un abaissement du pH du lait. Au temps T=0h, l’acidité produite varie

entre 14°D et 20°D avec des valeurs de pH qui varie entre 6,3 et 6,5. Et au bout de 24h

Figure 33 : Résultats de l'évolution du pH et de l'acidité pour les bactéries lactiques isolées du genre Enterococcus


56

Figure 34 : Résultat de l'activité lipolytique sur milieu MRS additionné de 30% de Tween 80

d’incubation, cette acidité augmente et se trouve entre 32°D et 55°D, et le PH entre 4,92 et

5,35.

L’acidité produite est différente entre les trois genres de bactéries lactiques isolés,

entre les espèces du même genre, et même entre les souches d’une même espèce. La

meilleur activité acidifiante a été remarquée chez la souche S12 « Enterococcus

malodoratus » avec une acidité égale à 55°D au bout de 24h, alors que la plus faible a été

enregistrée chez la souche S07 « Enterococcus faecium » par une valeur de 30°D au bout

de 24h.

3.2. Etude du pouvoir lipolytique :

La totalité des bactéries lactiques isolées ne représentent aucune activité lipolytique

vis à vie le tween 80 (Figure 34).


57

Chapitre III : DISCUSSION GENERALE

Les trois échantillons de smen analysés sont provenus de trois régions différentes

de la wilaya de Aïn Defla et ont subi une durée de fermentation distincte pour chacun. Par

contre, leur mode de préparation était le même : du beurre fermier obtenu après barattage

du lait fermenté a subi un lavage, ensuite une cuisson de 1h à 1h 30 min afin de vaporiser

l’eau restant et favoriser sa conservation. Après, il a été salé, malaxé puis conditionné dans

des pots hermétiquement fermés et entreposés dans un endroit frais et obscur à température

ambiante (El Marrakchi et al, 1986).

Nos résultats d’analyses des trois échantillons de smen montrent que la majorité des

bactéries lactiques isolées peuvent être cultivé à 45°C et résister à une température de 65°C

pendant 30min. Elles peuvent tolérer généralement différents pH (4.5, 6.5, et 9.5) et

différentes concentrations de NaCl (2%, 4% et 6.5%). Comme elles sont aussi toutes

homofermentaires et peuvent dégrader l’arginine. Ces bactéries appartiennent au genre

Enterococcus. Elles poussent dans le milieu M17 solide sous forme de petites colonies

rondes et blanchâtres, et apparaît sous microscope optique après coloration de Gram en

coques isolées, diplocoques et en petites chaînettes. Ces résultats sont similaires à ceux de

Guetarni, (2013).

Quatre espèces différentes ont été identifiées dans ce genre en se basant sur le

manuel de Bergey, (2009) : Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus

malodoratus et Enterococcus dispar. La distinction entre eux était basée sur le test de la

production d’acétoïne, dégradation de la gélatine, résistance aux téllurite de potassium à

0.4% et sur la capacité de fermentation de certains sucres.

Les souches d’Enterococcus faecium (S06, S07, S08, S11, S15 et S18) produisent

de l’acétoïne, fermentent plusieurs sucres (mannitol, arabinose, saccharose, sorbitol,

lactose), ne dégradent pas la gélatine et ne résistent pas aux téllurite (0.4%).

Les souches d’Enterococcus faecalis (S09 et S20) possèdent généralement les

mêmes caractéristiques biochimiques qu’ Enterococcus faecium sauf qu’elles peuvent

résister au téllurite de potasium à 0.4% (colonies noirs).

Contrairement aux autres espèces d’entérocoques, les souches S03, S12 et S14 ne

peuvent pas être cultivées à 45°C. La souche Enterococcus dispar (S03) peut produire de

l’acétoïne. Par contre les souches S12 et S14 appartenant à l’espèce Enterococcus

malodoratus ne peuvent pas le produire.

D’autres genres de bactéries lactiques ont aussi été isolés de nos échantillons de

smen analysés : Pediococcus et Lactococcus.


58

Les bactéries isolées du genre Pediococcus sont tous homofermentaires, et elles

forment des colonies arrondies peu transparentes ou grisâtres dans le milieu M17 et

blanchâtres dans le milieu MRS. Elles se présentent sous forme diplocoques ou tétrades

après observation sous microscope optique. Cinq souches identifiées dans ce genre, dont

deux appartiennent à l’espèce Pediococcus acidilactici. Ces dernières peuvent tolérer une

température de 45°C et peuvent croitre à différents pH et à différentes concentration de

NaCl. Comme elles peuvent aussi dégrader l’arginine et produire d’acétoïne. Une autre

souche de ce genre appartient à l’espèce Pediococcus pentosaceus puisque elle présente

des ressemblances dans les caractéristiques biochimiques et physiologiques avec l’espèce

précédente mais elle ne peut pas produire d’acétoïne (Facklam et Elliott, 1995). Le reste

des bactéries lactiques isolées appartiennent au genre Lactococcus. Elles sont tous

homofermentaires et peuvent se cultiver à une température de 45°C, mais ne peuvent pas

tolérer jusqu’à 6.5% de concentration de NaCl. Ces bactéries poussent dans le milieu M17

et apparaît sous microscope optique sous forme de coques isolées, diplocoques et en petites

chaînettes. Trois souches seulement sont identifiées dans ce genre dont deux d’entre eux

appartiennent à l’espèce Lactococcus lactis subsp lactis. Ces dernières peuvent dégrader

l’arginine et ne peuvent pas produire de l’acétoïne comme la souche Lactococcus garvieae

(Facklam et Elliott, 1995).

Les résultats obtenus montrent que la technique de préparation utilisée (cuisson,

salage, fermeture hermétique des pots,…) avait un impact sur le type des bactéries

lactiques qui résident sur les échantillons de smen analysés. Dont on remarque que le genre

dominant trouvé dans les trois échantillons est le genre Enterococcus, dont ces espèces

peuvent se développer à des températures élevées et tolérer jusqu’à 6.5% de NaCl et

différentes pH. Les autres espèces trouvées et qui appartiennent à d’autres genres

présentent plusieurs caractéristiques similaires aux espèces du genre Enterococcus.

Les résultats de l’isolement et de l’identification montrent que le genre

Enterococcus est nettement prédominant (60%) par rapport aux autres genres isolés. Ce qui

est similaire aux travaux de Ismaili et al, (2016) qui ont trouvé qu’il représente 53.6% de

totalité des genres isolés du lait cru analysé suivi par Lactococcus (28,6%). Contrairement

à cette étude qui démontre que le deuxième genre prédominant est Pediococcus (25%).

Cette différence est peut-être dûe à la nature des deux produits analysés.

Les résultats de notre étude montrent que les types des bactéries lactiques trouvées

dans le smen traditionnel algérien se diffèrent de celles trouvées dans le smen traditionnel


59

marocain. Dans le travail de Sakilli et Issouel, (2003), les lactobacilles mésophiles

prédominent en fin d’affinage alors que les Lactococcus et les Lactobacillus thermophiles

disparaissent progressivement. Cela peut-être est dû à la technique de préparation utilisée

pour les échantillons analysés, dont les échantillons du smen marocain n’ont pas subi une

cuisson, ce qui favorise le développement des bactéries mésophiles.

Par comparaison aux travaux de Kacem et Karam, (2006) sur le « smen » (beurre

traditionnel fabriqué à partir du lait de chamelle dans le sud algérien (sahara), on trouve

une différence au niveau des genres et espèces de bactéries lactique isolées. Dont

contrairement aux échantillons de smen analysés dans cette étude, le genre Lactobacillus

est le plus dominant dans le « smen » avec la présence également du genre Leuconostoc.

Cela est peut-être dû aux différentes origines des deux produits (différent animaux), aux

zones de prélèvement et de climat différent.

L’étude du pouvoir acidifiant des bactéries lactiques isolées démontre qu’il y’a une

progression successive au cours du temps de l’acidité dornique produite accompagné d’une

diminution simultané du pH. Par contre, une différenciation de cette production a été

remarquée entre les trois genres isolés, entre les espèces du même genre et même entre les

souches d’une même espèce. Ce résultat est en accord avec celui de Luquet et Corrien

(2005).

Toutes les souches de bactéries lactiques isolées n’avaient aucune activité

lipolytique vis-à-vis le tween 80. Le même résultat est justifié par Roissart et Luquet,

(1994) qui ont trouvé que les bactéries lactiques sont faiblement lipolytique. Par

comparaison avec d’autres espèces bactériennes telles que Pseudomonas, Acinetobacter ou

Flavobacterium (Brennan et al, 2002).

Malgré le faible pouvoir lipolytique les bactéries lactiques, cette activité demeure

essentielle pour développer l’arôme et la flaveur connu chez le smen. Cela est expliqué

selon El Marrakchi et al, (1988) par la présence d’une flore caséolytique et lipolytique

autre que les bactéries lactiques, et dont elles diminuent sensiblement au cours de la

maturation du smen marocain. Dans le beurre avant salage, cette flore est représentée

essentiellement par les bactéries à Gram négatif (Aeinetobacter, Pseudomonas,

Flavobacterium, Vibrionaceae et Enterobacteriaceae), et au cours de l'élaboration du

smen, ces bactéries sont supplantées par les espèces Staphylococcus cohnii, Bacillus cereus

et Aeromonas hydrophila.

Conclusion

Conclusion et perspectives

60

Conclusion :

Le smen est un produit laitier qui appartient au patrimoine nutritionnel algérien et dont

sa consommation est encore apprécié jusqu’à ce jour par le consommateur algérien. A partir

de l’analyse microbiologique (phénotypique, biochimique et physiologique) des différents

échantillons choisis pour l’isolement et l’identification des bactéries lactiques d’origine de

smen, nous avons isolé 20 souches appartenant à trois différents genres qui sont :

Enterococcus (60%), Pediococcus (25%) et Lactococcus (15%).

Toutes les souches isolées sont des coques immobiles homofermentaires non

hémolytique et thermorésistants. Elles dégradent l’arginine, ne liquéfient pas la gélatine et

n’utilisent pas le citrate et elles sont dépourvues du catalase, de cytochrome oxydase et de

nitrate réductase. La plus part de ces isolats peuvent être cultivé à 45°C, à différent pH (4.5,

6.5 et 9.5) et à différentes concentration de NaCl (2%, 4% et 6.5%). Comme elles peuvent

aussi résister à 0.4% de téllutite de potassium et dégrader les sucres suivants : glucose,

fructose, Galactose, saccharose, maltose, mannitol, inositol, sorbitol, rhamnose, melibiose,

amygladine, arabinose et le lactose.

D’après les résultats de l’étude des caractères technologiques, tous les isolats ne

possèdent pas une activité lipolytique et possèdent une activité acidifiante qui est variable

entre les trois genres isolés, entre les espèces du même genre et même entre les souches de la

même espèce.

La souche S12 « Enterococcus malodoratus » possède la meilleur activité acidifiante,

elle secrète une quantité égale à 55°D d’acide lactique au bout de 24h, alors que la souche S07

« Enterococcus faecium » possède la plus faible activité (30°D).

.

Conclusion et perspectives

61

Perspectives :

D’après les résultats de cette étude, différentes perspectives sont suggérées :

Etude comparative sur les types de bactéries lactiques résiduelles entre dans le smen

traditionnel préparé avec cuisson et celui préparé sans cuisson.

Etude quantitative et qualitative des constituants du smen algérien traditionnel.

Déterminer la biodiversité microbiologique (bactéries, champignon, … etc) du smen

algérien.

Caractérisation technologique des bactéries lactiques isolées.

Caractérisation moléculaire des bactéries lactiques isolées (PCR, 16S, ect …).

Références

Bibliographiques

Références bibliographiques

62

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Annexes

Annexes

Annexes

1. Matériels utilisés dans cette étude :

1.1. Milieux de culture

Milieu MRS (bouillon + gélose)

Milieu M17 (gélose).

Milieu BCP.

MRS additionné de NaCl : 2%, 4% et 6.5%.

MRS additionné de HCl : 2% et 4%.

Gélose MRS au sang.

Gélose MRS + Tween 80.

Gélose au téllurite.

1.2. Produits chimiques :

Eau distillée.

Eau physiologique.

Huile d’immersion.

Huile de paraffine.

H2O2.

Disques d’oxydase.

Produit de coloration de Gram :

o Violet de gentiane.

o lugol’s iodine.

o Alcool 95°.

o Fuchsine.

Sucres :

o Fructose.

Annexes

o Maltose.

o Galactose.

o Lactose.

Réactifs de la galerie Api 20

o VP 1.

o VP 2.

o Nitrite 1.

o Nitrite 2.

1.3. Appareillage :

Etuve bactériologique (WISVEN).

Bain marie (MEMMET).

Réfrigérateur (HAIER).

Autoclave (WISCLAVE).

Vortex (VELP).

Balance de précision (KEREN).

Balance électrique (KEREN).

Microscope optique (ZEISS).

Agitateur muni d’une plaque

chauffante (VWR).

1.4. Autres matériels :

Bec-benzène.

Boites de Pétri.

Tubes à essai.

Lames.

Lamelles.

Anse de platine.

Pipettes Pasteur.

Portoirs.

Coton.

Cloches de Durham.

Flacons stériles.

Galeries Api E 20 (BIOMERIEUX).

Glacière.

Papier parafilm.

Annexes

2. Constituants de quelques milieux de cultures :

2.1. BOUILLON MRS (pH=6.2+/-0.2)

Glucose………………………20g

Peptone ……………………...10g

Extrait de viande …………….08g

Acétate de sodium……………...05g

Extrait levure ……………….04g

Phosphate di potassique ……..02g

Tween 80 ……………….01ml

Ammonium citrate ……..02g

Sulfate magnésium ……..0.2g

Sulfate de manganèse …..0.05g

2.2. M17

Peptone de soja……………….05g

Peptone de viande ……………05g

Peptone de caséine …………...05g

Extrait de viande …………….05g

Extrait de levure ……………..2.5g

Lactose ………………………05g

di-sodium βglycerophosphate …19g

Sulfate de magnesium …………0.25g

Acide ascorbique ………………0.5g

Agar……………………………11g

2.3. MANNITOL MOBILITE (pH=7.8)

Extrait de viande…………………03g

Peptone ………………………….15g

Mannitol…………………………10g

Nitrate de potassium……………..01g

Rouge de phenol…………………0.05g

Agar…………………………….. 04g

2.4. GELOSE AU TELLURITE (pH=7.1)

Extrait de viande ……………10g

Annexes

Extrait de levure ……………03g

Peptone …………………….05g

NaCl ………………………..05g

Glucose ……………………05g

Agar ………………………20g

Ajouter 50 ml de téllurite de potassium.

2.5. BCP (pH=6.8)

Peptone…………………………01g

Extrait de viande ………………01g

Nacl…………………………….05g

Pourpre de bromocresol……….15mg

Repartir en tubes 9 ml à 10 ml

Autoclave : à 121°C pendant 15min, ajouté aseptiquement 1ml de solution de sucre à 10%.

Annexes

Tableau 13 : Résultats d'évolution du PH en fonction du temps pour les souches isolées

du genre Enterococcus

Tableau 14 : Résultats d'évolution de l’acidité en fonction du temps pour les souches

isolées du genre Enterococcus

Souches Espèces T0h T2h T4h T6h T8h T24h

S03 Enterococcus dispar 6.48 6.24 6.13 5.8 5.75 5.22

S06 Enterococcus faecium 6.43 6.23 6.13 5.7 5.55 5.07



S09 Enterococcus faecalis 6.48 6.2 6.1 5.66 5.45 5.07


S12 Enterococcus

malodoratus

6.4 6.19 6.06 5.62 5.45 4.92

S14 Enterococcus

malodoratus

6.5 6.13 6.01 5.68 5.49 5.07



S19 Enterococcus sp 6.5 6.12 6.01 5.71 5.6 5.28

S20 Enterococcus faecalis 6.47 6.19 6.03 5.69 5.65 4.94


S03 Enterococcus dispar 17 20 23 25 27 42

S06 Enterococcus faecium 14 18 22 25 27 45



S09 Enterococcus faecalis 15 19 22 24 26 32


S12 Enterococcus

malodoratus

14 17 21 23 26 55

S14 Enterococcus

malodoratus

15 17 20 23 25 35


Annexes

Tableau 15 : Résultats d'évolution du PH en fonction du temps pour les souches isolées du

genre Pediococcus


isolées du genre Pediococcus


S19 Enterococcus sp 16 20 24 26 27 37

S20 Enterococcus faecalis 15 19 23 25 28 45


S02 Pediococcus acidilactici 6.45 6.22 6.12 5.8 5.75 5.3

S04 Pediococcus acidilactici 6.44 6.22 6.16 5.78 5.55 5.23

S05 Pediococcus sp 6.46 6.2 6.11 5.47 5.75 5.2

S10 Pediococcus sp 6.5 6.19 6.1 5.91 5.56 5.28

S16 Pediococcus pentosaceus 6.49 6.17 6 5.61 5.48 5.05


S02 Pediococcus acidilactici 15 20 22 24 26 35

S04 Pediococcus acidilactici 16 19 21 24 26 32

S05 Pediococcus sp 17 20 23 26 28 33

S10 Pediococcus sp 15 19 22 24 27 45

S16 Pediococcus pentosaceus 17 20 24 25 27 48

Annexes

Tableau 17 : Résultats d'évolution du pH en fonction du temps pour les souches isolées du

genre Lacotococcus


isolées du genre Lacotococcus


S01 Lactococcus lactis

lactis

6.5 6.25 6.15 5.97 5.6 5.06

S13 Lactococcus garvieae 6.46 6.19 6.07 5.67 5.54 5.13


lactis

6.5 6.2 6.05 5.73 5.62 5.35



lactis

15 20 23 25 28 40

S13 Lactococcus garvieae 17 20 23 25 27 40


lactis

16 19 22 25 28 40

Annexes

Résumé :

Comme tous les produits laitiers fermentés, le smen représente un habitat naturel pour les bactéries

lactiques. Pour cette raison, cette étude a été réalisée afin d’isoler et d’identifier les bactéries lactiques

trouvées dans le smen algérien préparé traditionnellement. Trois échantillons de smen sont collectés des trois

régions de la wilaya de Ain Defla. A partir de ces trois échantillons, les analyses microbiologiques

(phénotypiques, biochimiques et physiologiques) ont permet d’isoler et d’identifier 20 souches de bactéries

lactiques dont elles appartiennent à trois genres différents qui sont : Enterococcus, Pediococcus et

Lactococcus. De ces derniers, le genre Enterococcus est le plus dominant avec un pourcentage de 60%, du

fait de son adaptation au procédé de préparation de smen qui inclut différentes conditions hostiles pour le

développement bactérien : cuisson, salage, condition anaérobique,… etc.

Les espèces identifiées du smen sont : Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus

malodoratus, Enterococcus dispar, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis

subsp lactis et Lactococcus garvieae. L’étude des caractères technologiques des souches isolées a été potée

sur le pouvoir acidifiant et le pouvoir lipolytique.

Mots clés : Lait, smen, bactéries lactiques, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus.

Abstract:

Like all fermented dairy products, smen is a natural habitat for lactic acid bacteria. For this reason,

this study was carried out in order to isolate and identify the lactic acid bacteria found in the traditionally

prepared algerian smen. Three samples of smen are collected from the three regions of Ain Defla. From these

three samples, microbiological analyzes (phenotypic, biochemical and physiological) made it possible to

isolate and identify 20 strains of lactic acid bacteria of which they belong to three different genera:

Enterococcus, Pediococcus and Lactococcus. Of these, the genus Enterococcus is the most dominant with a

percentage of 60%, due to its adaptation to the process of preparation of smen which includes various hostile

conditions for bacterial development: cooking, salting, anaerobic condition, etc.

The identified species of smen are: Enterococcus faecalis, Enterococcus faecalis, Enterococcus malodoratus,

Enterococcus dispar, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp lactis and

Lactococcus garvieae. The study of the technological characteristics of the strains isolated was potted on the

acidifying power and the lipolytic power.

Key words: Milk, smen, lactic acid bacteria, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus.

ملّخص

، يعتبر السمن أحد المواطن الطبيعية الّتي تتواجد فيها البكتيريا اللّبنية. ولهذا الغرض، أُجريت مثل جميع منتجات األلبان المخمرة

ث عّيناتالهذه الدّراسة من أجل عزل والتّعرف على البكتيريا اللّبنية المتواجدة في السمن الجزائري المحّضر تقليدياً.وقد أجريت التحاليل على ث

من مناطق مختلفة من والية عين الدّفلى، والّتي قد ُحّضرت كلّها بنفس الّطريقة لكن تختلف فيما بينها من حيث مدّة التّخمير. ُجلبت

سمحت التحاليل المكروبيولوجية )المظهرية، الكيميائية والفيسيولوجية( اّلتي نُفّذت على عيّنات السمن الثاّل ث بعزل والتّعرف على

من هذه األخيرة، يمثّل . Lactococcus و Enterococcus ،Pediococcus ساللة من البكتيريا اللبنية تنتمي إلى ثال ث أنواع مختلفة: 20

(، وهذا يعود لتكيّفه وتحّمله الّطريقة المستعملة لتحضير السمن الّتي تتضّمن مختلف الّظروف %60النّسبة الغالبة ) Enterococcusنوع

ة لنمو البكتيريا: غليان، تمليح، ظروف الهوائية، ...إلخ. المعادي

، Enterococcus faecium ،Enterococcus faecalisالسالالت الُمتعّرف عليها والمعزولة من عيّنات السمن الثال ث هي: Enterococcus malodoratus، Enterococcus dispar، Pediococcus acidilactici، Pediococcus pentosaceus،

Lactococcus lactis subsp lactisو Lactococcus garvieae .

تّمت دراسة الخصائص التكنولوجية للسالالت المعزولة حول خاصية الحموضة وخاصية تفكيك الدّهون.

.Enterococcus ،Pediococcus ،Lactococcusالسمن، البكتيريا اللبنية، الكلمات الرئيسية:

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