Interpretación crítica de ANA - SORCOM · 2020. 10. 8. · Jolien Claessens, Thibaut Belmondo,...
Transcript of Interpretación crítica de ANA - SORCOM · 2020. 10. 8. · Jolien Claessens, Thibaut Belmondo,...
Interpretacióncrítica de ANAMª José Martínez Becerra
Inmunólogo Adjunto
Sección Autoinmunidad y Alergia
HU Fundación Jiménez Díaz
EAI: VARIABILIDAD
Your Date Here Your Footer Here 2
Distintas interacciones entre genes y medio ambiente condicionan fenotipos variables de una misma EAI
En cada individuo se da una combinación única de anticuerpos
3
¿ANA?
EASI/IUIS (2014)
Anti-celulares
ICAP
Ensayo de IFI en Hep2 (Hep2 IIFA)
4
IFI
Línea Celular Hep2
Patrón de fluorescencia
Título: mayor dilución* que mantiene fluorescencia
Variabilidad: subjetividad, limitaciones para anticuerpos (Ro/Jo1), etc.
¿SOSPECHA DE ENFERMEDAD AUTOINMUNE SISTÉMICA?
Identificar especificidad de ANA
Your Date Here Your Footer Here 7
Didier K, Bolko L, Giusti D, Toquet S, Robbins A, Antonicelli F and Servettaz A (2018) Autoantibodies Associated With Connective Tissue Diseases: What Meaning for Clinicians? Front. Immunol. 9:541
CRITERIOS DE CLASIFICACIÓN
8
PL Meroni et al. Nat Rev Rheum 2014
2013 ACR:Scl70
RNA Pol IIICentrómero
2019 EULAR/ACR:ANA
dsDNACL/B2GPI/AL
Sm
2016 ACR/EULAR:Ro
ANTICUERPOS VALOR PRONÓSTICO: SSc
Mecoli CA, Casciola-Rosen L. An update on autoantibodies in scleroderma. Curr Opin Rheumatol. 2018 Nov;30(6):548-553.
Your Date Here Your Footer Here 10
Journal of Internal Medicine, Volume: 280, Issue: 1, Pages: 8-23, First published: 25 November 2015, DOI: (10.1111/joim.12451)
Betteridge Z, McHugh N. Myositis-specific autoantibodies: an important tool to support diagnosis of myositis. J Intern Med. 2016 Jul; 280(1):8-23
ANTICUERPOS VALOR PRONÓSTICO: MII
Jiří Vencovský
Institute of Rheumatology, Prague, Czech Republic
MSA EXCLUYENTES
Betteridge et al. Frequency, mutual exclusivity and clinical associations of myositis autoantibodies in a combined European cohort of idiopathic inflammatory myopathy patients .J Autoimmun. 2019 Jul; 101: 48–55.
Positivo/NegativoValor numérico
Negativo por una mezcla de antígenos
/ Positivo por mezcla
Positivo, Título y Patrón
Positivo, Título y Patrón (AC-X)
+Estudio de especificidades
ANA: INFORMES AL DIAGNÓSTICO
¿IMPORTANCIA DE PATRÓN Y
TÍTULO?
Lupus 2019
ControlEAI
¿IMPORTANCIA DE PATRÓN Y
TÍTULO?
Lupus 2019
SOLICITUDES ANA
17
Fritzler M. (2019) Perspective: Widening Spectrum and Gaps in
Autoantibody Testing for SystemicAutoimmune Diseases.
J Rheumatol Res, 1(1): 10-18.
Mahler et al.Journal of Immunology Research 2014
INTERPRETACIÓN EN CONTEXTO.PROBABILIDAD PRE Y POST-TEST
ANA: MÉTODO DE ESTUDIO
ACR: IFI gold standard
EASI/IUIS: Especificar método
2009
2014
Ej. FJD: Negativo por una técnica multiparamétrica que incluye Ro,
La, dsDNA, Cromatina, U1RNP, Sm, Jo1, Scl70, CENPB, Ribosomal P.
• Variabilidad en las combinaciones comercializadas
CRIBADO CRIBADO
ANA: MÉTODO DE ESTUDIO
ACR: IFI gold standard
EASI/IUIS: Especificar método
EULAR Task force
2009
2014
2019
ANA EN CONTEXTO
Bossuyt X, Fieuws S. Ann Rheum Dis 2014;73:e10.
Jolien Claessens, Thibaut Belmondo, Ellen De Langhe, ReneWesthovens, Koen Poesen, Sophie Hüe, Daniel Blockmans, Michael Mahler, Marvin J. Fritzler, Xavier Bossuyt , Solid phase
assays versus automated indirect immunofluorescence for detection of antinuclear antibodies. Autrev(2018)
ANA EN CONTEXTO
Adaptar la técnica a la sospecha clínica
Informar al laboratorio del contexto clínico
EIA ANA
POSITIVO
IFI
+ -
NEGATIVO
Especificidades
ANA SIN DATOS CLÍNICOS / BAJA SOSPECHA
Negativo por una técnica que incluye: dsDNA, Ro, La, Scl70,
Jo1, U1RNP, RibP, CENPB, Cromatina, y Sm.
OsteopeniaDepresiónLumbalgiaArtralgias…
Informar Ej. Anti-Ro52 / Hep2 NEG
Sm
Sm/RNP
Scl70
CENPB
Jo1
SSA
SSB
DNA
Rib P
Cromatina
EIA ANA
POSITIVO
IFI
+ -
NEGATIVO
Informar
LESSm
Sm/RNP
Scl70
CENPB
Jo1
SSA
SSB
DNA
Rib P
Cromatina
ANA sin especificidad?
Ku??PCNA??
Informar Ej. Anti-Ro60 / Hep2 NEG
EIA ANA
POSITIVO
IFI
+ -
NEGATIVO
La baja sensibilidad de Hep2 para anti-Ro determina que los EIA mejoren lasensibilidad del estudio de ANA en SS.
ANA en dx SS
Negativo por una técnica que incluye:
dsDNA, Ro, La, Scl70, Jo1, U1RNP, RibP,
CENPB, Sm y Cromatina.
Informar Ej. Anti-Ro60 / Hep2 NEG
Informar
Sm
Sm/RNP
Scl70
CENPB
Jo1
SSA
SSB
DNA
Rib P
Cromatina
Especificidades*
EIA ANA
POSITIVO
IFI
+ -
NEGATIVO
ANA en dx SSc
RNA Pol III?ThTo?
Fibrilarina?PmScl 100/75?
Ku?CENPA?
RNA Pol III?
Sm
Sm/RNPScl70
CENPB
Jo1SSA
SSB
DNA
Rib P
Cromatina
Free creative templates, charts, diagrams and maps
for your outstanding presentations
SSc: PROBLEMAS TÉCNICAS ESPECÍFICAS
• Fibrilarina
• ThTo
Koenig M et al. Rheumatology 2019;58:1784-1793
EIA ANA
POSITIVO
IFI
+ -
NEGATIVO
Especificidades*
ANA en dxMiopatías AI
MDA5?Mi2?
NXP2/MJ?SAE1/2?
TIF1Gamma?HMGCoAr?
PL7, PL12, EJ? OJ, Ks, Ha, Zo?
MDA5?NXP2/MJ?SAE1/2?
HMGCoAr?? HALIPOJ, Ks, Ha, Zo?
Sm
Sm/RNP
Scl70
CENPB
Jo1
SSA
SSB
DNA
Rib P
Cromatina
La combinación de técnicas es la mejor herramienta. Ninguna técnica englobatodas las posibilidades diagnósticas con adecuada sensibilidad y especificidad
IFI Hep2
+
Nuclear
Moteado fino / grueso
Mi2* SAE TIF-1γ*
Citoplasmática
Moteado fino / difuso
SRP* PL-7 PL-12 EJ Jo1 HMGCoAr
-
Jo1 MDA5* TIF-1γ* HMGCoAr SRP*
*Variabilidad inter-fabricanteCuando para un mismo antígeno existen dos opciones, en cursiva se recoge la segunda opción, de menor probabilidad
Propuesta de algoritmo diagnóstico para Miopatías Autoinmunes basado en los resultados obtenidos en el Taller SEI 2015
Sospecha Miopatía Autoinmune
Taller AI SEI 2015. Mª José Martínez Becerra
¿Ha, Zo, Ks, OJ?
• El estudio de ANA y especificidades tiene un gran valor diagnóstico y pronóstico
• Los ANA carecen de valor en la monitorización
• Pocas especificidades tienen utilidad en el seguimiento:
– dsDNA en LES (Nucleosomas*)
– Ro en Lupus neonatal
– MDA5**
– HMGCoAr**
2014 ACR/ARHP Annual MeetingDidier K, Bolko L, Giusti D, Toquet S, Robbins A, Antonicelli F and Servettaz A (2018) Autoantibodies Associated With Connective Tissue Diseases: What Meaning for Clinicians? Front. Immunol. 9:541.
¿ANA EN EL SEGUIMIENTO?
TAKE-HOME MESSAGES
GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN
• IFl gold standard para estudio de ANA
InconvenientesVentajas
Subjetiva
Falta estandarización
50% Antígenos no disponibles: Baja sensibilidad para algunos Antígenos (Ro, La y Jo1)
Larga retraso
NO específica de
Antígeno Estudios en positivos
Aumento demanda
¿viable?
Múltiples antígenos, estado nativo
Informativa (Patrón, Otros Ac.)
Sencilla
Reproducible
ANA: MÉTODO DE ESTUDIO
*Variabilidad en los ensayos comercializados
Informar al laboratorio del contexto clínico
Free creative templates, charts, diagrams and maps
for your outstanding presentations
Abeles et al. The clinical utility of a positive antinuclear antibody test result. The American Journal of Medicine, Vol 126, No 4, April 2013
Free creative templates, charts, diagrams and maps
for your outstanding presentations
¿IMPORTANCIA
DE PATRÓN Y
TÍTULO?
La frecuencia de títulos bajos de ANA (≤1/320) essignificativamente mayor en NAD (70%) y en Sanos (67%) que enEAI sistémicas.
Moteado fino es el patrón de IFI más frecuente en todos losgrupos (32% EAIS, 35% NAD, 49% Sanos)
EAIS: Moteado grueso y Homogéneo
Sanos y Control enfermo: Moteado fino denso DFS
Lupus 2019
DESAFÍOS IFI
Estandarización:
Armonización:Nomenclatura
FABRICANTES
Fijadores
Cultivo
Conservantes
USUARIO
Conjugados
Dilución partida
Titulaciones
Microscopio
Criterio observador
EIA ANA
POSITIVO
IFI
+ -
NEGATIVO
Especificidades
ANA SIN DATOS CLÍNICOS / BAJA SOSPECHA
Negativo por una técnica que incluye: dsDNA, Ro, La, Scl70,
Jo1, U1RNP, RibP, CENPB, Cromatina, y Sm.
OsteopeniaDepresiónLumbalgiaArtralgias…
Informar Ej. Anti-Ro52 / Hep2 NEG
Sm
Sm/RNP
Scl70
CENPB
Jo1
SSA
SSB
DNA
Rib P
Cromatina
ANTICUERPOS ≠ GLUCOSA
MUESTRAS HETEROGÉNEAS
• Los sueros de pacientes con EAI presentan anticuerpos policlonales
• Reconocen diferentes epítopos
• De diferentes isotipos (IgG 1, 2, 3, 4, IgM, IgA)
• Variedad en punto isoeléctrico
• Variabilidad en región Fc
• Diferente avidez
¿¿ESTANDARIZACIÓN??
Mahler M et al. Clin Immunol 2003
a) ANA CON ESPECIFICIDAD b) ANA SIN ESPECIFICIDAD0
Negativo para especificidades
Anti-CENPB +
Colangitis Biliar Primaria (CBP)
Esclerosis Sistémica (SSc)
FUENTE ANTIGÉNICA
• Vector Modificaciones post-traduccionales, importantes en la respuesta autoinmune
– Generación de neoepítopos
– Modula afinidad por HLA y/ó TCR
Nativo
• Fuente: mamíferos
• Autenticidad (modificaciones post-traduccionales, plegamiento)
• Falta de Pureza (purificación)
• Problemas de Reproducibilidad
Recombinante
• 1980
• Identificación de dianas antigénicas
• Reproducible
• Mejora la pureza
• Importancia de vector
ANTICUERPO – VALOR DIAGNÓSTICO
Mahler et al.Journal of Immunology Research 2014
Damoiseaux J, Andrade LEC, Carballo OG, et al. Ann Rheum Dis. 2019;78:879–889.
• Paso previo a IFI: Enzimoinmunoensayos (ELISA, Quimioluminiscencia, Luminex, etc.) basados en mezclas de antígenos celulares para CRIBADO de ANA
• Tipos:
Cualitativo: POSITIVO /NEGATIVO para la mezcla.
Cuantitativo: Si POSITIVO identifica especificidad y concentración de anticuerpos.
Sm
Sm/RNP
CENPB
Scl70
Jo1
SSA
SSB
DNA
Rib P
Crom
ANA: Métodos de estudio
Ann Rheum Dis 2013
ADAPTAR TÉCNICA A SOSPECHA CLÍNICA
Informar al laboratorio del contexto clínico
VARIABILIDAD ANA IFILES - ENSAYOS CLÍNICOS
David S. Pisetsky, Dana Kathryn Thompson, Joseph Wajdula, Annette Diehl, and Sudhakar Sridharan. Variability in Antinuclear Antibody Testing to Assess Patient Eligibility for Clinical Trials of Novel Treatments for Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis & Rheumatology Vol. 71, No.
9, September 2019, pp 1534–1538DOI 10.1002/art.40910
TALLER SEI 2015: S4 (TIF1γ)N=8
0 1 2 3 4 5 6
POSITIVO
NEGATIVO
TIF1 EN LABORATORIOS CON REACTIVO (N=8)
D-tek PMS12D24 Euroimmun DL 1530-1601-4 G
PROVEEDOR FUENTE ANTIGENICA
EUROIMMUN Recombinante humano / E. coli
DTEK TRIM33 (Recombinante, humano, expresado en HEK293)
ELISA Sant Pau WB Sant Pau
D.O.: 0,4 (Positivo >0.2) +
MIOPATÍAS: OPORTUNIDAD DE MEJORA
Mahler M, Betteridge Z, Bentow C, Richards M, Seaman A, Chinoy H and McHugh N (2019) Comparison of Three Immunoassays for the Detection of Myositis Specific Antibodies. Front. Immunol.
Cavazzana I, Fredi M, Ceribelli A, Mordenti C, Ferrari F, Carabellese N, et al. Testing for myositis specific autoantibodies: comparison between line blot and immunoprecipitation assays in 57 myositis sera. J Immunol Methods. (2016)
Infantino M, Manfredi M, Bizzaro N. Ann Rheum Dis 2019
MIOPATÍAS: OPORTUNIDAD DE MEJORA
56
¿ENA?
Extractable Nuclear Antigens1959 Holman y RobinsPero…
Antígenos no extraíbles: dsDNA Antígenos no nucleares: Ribosomal P, PL7, PL12, Jo1, etc.
Nomenclatura imprecisa y confusa Anticuerpos específicos
Ejemplo MII -1Cribado especificidades Negativo
IFI Positiva Citoplasma
https://atlasautoinmunidad.org/
EJ+ por LIA (Enzimoinmunoensayo en tira)
MDA5+ por LIA (Enzimoinmunoensayo en tira)
Ejemplo MII -2Cribado especificidades Negativo
IFI Negativa
MDA5
NEGATIVO
S16: MDA5 (+Ro)N=39
0 2 4 6 8 10 12 14 16
MDA5 POSITIVO
MDA5 NEGATIVO
MDA5 EN LABORATORIOS CON REACTIVO (N=20)
DTEK EUROIMMUN
++/MODERADO++/MODERADO
SIN REACTIVO MDA5
CON REACTIVO
PROVEEDOR FUENTE ANTIGENICA
DTEK Recombinante humano, células HEK293
Euroimmun Recombinante humano, E.coli
ELISA Sant Pau WB Sant Pau
Positivo +
Ejemplo MII -1Cribado especificidades Negativo
IFI Positiva Nuclear Moteado fino (AC-4?)
Mi2+ por LIA fabricante AMi2 – por LIA fabricante B
Mi2 confirmado por ELISA
S3: Mi2N=39
Mi2MI2
DEBIL
DISCORDANTE
NEG
95% Tenían reactivo Mi2
0 5 10 15 20 25 30
b1.Patrón homogéneo con tinción nucleolar homogénea.
b2 Patrón homogéneo con nucleolos negativos.
b3.Patrón moteado grueso tipo matriz nuclear
b4 Patrón moteado grueso.
b5 Patrón moteado fino.
b7 Patrón moteado pleomórfico
PATRON NUCLEAR (N)
TÍTULO (RANGO) 160-2560
MODA 640
Sant Pau: Mi2 POSITIVO
Dra. Laporta. Hep2 Inmunoconcepts.
S3: Mi2
S3: Mi2 TOTAL
PROVEEDOR INMUNOBLOT
DTEK
ORGENTEC
PALEX
Lab 1Lab 10
Lab 36
Lab FJD
0
50
100
150
200
250
300
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
THERMOPROVEEDOR FUENTE ANTIGENICA
THERMO Recombinante humano
DTEK CHD4+Mi2b (recombinante en sf9 infectadas con baculovirus)
Orgentec Purificado
Palex* CHD4+Mi2b (recombinante en sf9 infectadas con baculovirus)
Mi2 total. Técnica.
FEIA (THERMO)
INMUNOBLOT
N=22
100% Positivo
S3: Mi2 ALFA
MI2 ALFA
NEGATIVO
DUDOSO
POSITIVO
PROVEEDOR / MODELO FUENTE ANTIGENICA
EUROIMMUN / MYOPATHIES 16 AG (1530/1601/4G) Recombinante (Baculovirus – celulas insecto)
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
8/128
6/116
Lab
. 1La
b. 2
Mi2α (% UA CONTROL POSITIVO)
N=13
100% EUROIMMUN 4G
S3: Mi2 BETA
MI2 β
DUDOSO NEGATIVO
POSITIVO
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Lab. 1 Lab. 2 Lab. 3 Lab. 4 Lab. 5 Lab. 6 Lab. 7 Lab. 87/116 12/190 12/127 10/144 7/116 8/130 16/186 12/140
% UA CONTROL POSITIVO 6% 6% 9% 7% 6% 6% 9% 9%
Mi2β (% UA CONTROL POSITIVO)
N=25
100% EUROIMMUN (G / 3G /4G)
PROVEEDOR / MODELO FUENTE ANTIGENICA
EUROIMMUN / MYOPATHIES 16 AG (1530/1601/4G) Recombinante (Baculovirus – celulas insecto)
DESAFÍOS IFI: ESTANDARIZACIÓN
Estudio LE Andrade et al. Dresden 2017• 275 EAIS• 293 Enf. No autoinmunes• 300 voluntarios sanos
Hep2: 4 fabricantes• Aesku / Bion / Inova / Hemagen
3 observadores ciegoDilución 1/80; Objetivo 400xNomenclatura ICAP
HETEROGENICIDAD TAMBIÉN EN REACTIVOS
• Pureza Especificidad (contaminantes)
• Expresa los epítopos?? Fuente antigénica (nativa, recombinante, vector Eucariota vs. Procariota, etc.)
• Capacidad para detectar anticuerpos aglutinantes / precipitantes
• Avidez de los anticuerpos detectados
FUENTE ANTIGÉNICA
VECTORES DE EXPRESIÓN
E coli (Procariota)
-Proteínas de pequeño tamaño
-Ausencia de modificaciones post-traduccionales(glicosilación, fosforilación, acilación)
-Problemas de solubilidad (cuerpos de inclusión)
Levaduras (Eucariota)
+Modificaciones post-traduccionales
+Fácil manilpulación
+Rápido crecimiento
-Extracción dificil
-Adición de carbohidratos
Baculovirus + Células de Insecto
+Proteínas de cualquier tamaño
+Rápido
+Modificaciones post-traduccionales
-Glicosilación puede saturarse
Células mamífero (hamster)
-Dificultad de generar líneas estables
-Lento crecimiento
-Bajos niveles de expresión
AC-0: NegativoAC-XX: No clasificables. Incluir
descripción
AC-29: Scl70/Topoisomerasa I
ANA IFI (Hep2) Junio 2013Negativo
Especificidades antigénicas1) ANA ELISA (QUANTA Lite®)
CENPB, Ro, La, Scl70, Sm, U1RNP, Jo1, dsDNA, M2, Histonas, PCNA y RibosomalP
Negativo2) Inmunoblot PM/DM (Dtek® Modelo PMS12)
PmScl 100 kDa, PL7, PL12, Mi2, SRP54, MDA5, TIF-γ, EJ, Scl70, Jo1, Ro52 y Ku
MDA5 (Recombinante) Positivo Moderado/++
Hospital Santa Creu i Sant Pau: Anti-MDA5ELISA y Western-blot in-house (recombinante)
PositivoELISA DO: 1.2 (Positivo >0.2)