Intérêt de la cytogénétique conventionnelle et moléculaire · - pronostique, - thérapeutique...
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Intérêt de la cytogénétique
conventionnelle et moléculaire
dans les hémopathies malignes
Dr C. Lefebvre
Laboratoire de Génétique Onco-Hématologique
EC Génétique _ janvier 2011
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Généralités
Rappel des techniques utilisées : Caryotype et FISH
Impact des données cytogénétiques dans les hémopathies :
- diagnostique,
- pronostique,
- thérapeutique
Modèles :
- la leucémie aiguë promyélocytaire,
- la leucémie myéloïde chronique,
- le lymphome à cellules du manteau,
- la LLC
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L’Hématopoïèse normale
Autorenouvellement Colonies, Progéniteurs
Divisions, puis Différenciation / Maturation
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Transformation maligne -> lymphoma
Transformation
maligne
->leucémie
Origine cellulaire des hémopathies malignes
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2%
Diagnostic pluridisciplinaire d’une hémopathie
Histologie
Immunohistochimie
Cytologie
Phénotypage
Caryotype
FISH
Biologie moléculaire
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Objectifs Technique complémentaire
Intérêt dans les hémopathies
Cytologie Aspect détaillés des cellules tumorales
Cytochimie : lignée (enzyme), fer
Diagnostic+++,
Suivi++
Histologie Aspect tissulaire, environnt, et cellulaires
Immunohistochimie : lignée, index de prolifération, classification
Diagnostic+++
Phénotypage (suspension)
Marqueurs de surface ou intracytopl.
Marquage multicouleur, IF sur lame,
Diagnostic+++,
Suivi++ (maladie résiduelle ou MRD),
Cytogénétique Caryotype
Génome tumoral Anomalies Iaires et IIaires
FISH : précisions ou détection d’anomalies cryptiques
Diagnostic+++,
Suivi+, pronostic+++
Biologie moléculaire
Recherche et quantification de transcrit pathologiques, clonalité T/B, mutations acquises oncogéniques
PCR nichée, Séquençage…
Diagnostic,
Suivi+++ (MRD)
Pronostic++,
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Hémopathies malignes : diagnostic biologique
- Cytologie : aspect des cellules / coloration Giemsa : diagnostic, suivi
- Histologie : aspects tissulaire et cellulaire, environnement, extension,
marquages complémentaires par immunohistochimie : diagnostic
- Phénotypage : en cytométrie de flux (suspension) : Marqueurs /Ag de
surface, intracytoplasmique, intensité d’expression : identification d’un
clone, lignée d’origine, suivi de la maladie résiduelle (MRD)
- Cytogénétique conventionnelle : caryotype : anomalies qui corroborent le
diagnostic -> cytogénétique moléculaire : FISH pour explorations
complémentaires, dictées par le type d’hémopathie, l’intérêt diagnostique
ou pronostique ou thérapeutique ++++
- Biologie Moléculaire : identification d’un transcrit anormal : RT-PCR,
clonalité (lymphocytes B/T), quantification du taux d’expression d’un gène
(non remanié ou hybride): RT-Q-PCR, …
Diagnostic pluridisciplinaire
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Caryotype
• Définition et objectifs
• Indications
• Matériel
• Étapes
• Apports et limites
• Exemples
• Intérêt
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Caryotype
Obtention et interprétation
des chromosomes en
métaphase
Analyse morphologique
Diagnostic des anomalies
chromosomiques
• Objectif technique
Cytogénétique conventionnelle
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Le cycle cellulaire
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• Indications
Caryotype constitutionnel pré-natal (signes,atcd…)
liquide amniotique (16è-19è SA), villosités choriales (10è SA)
Caryotype constitutionnel post-natal (phénotype d’un enfant, retard mental, anomalies cardiaques…)
lymphocytes du sang périphérique, fibroblastes
Anomalies constitutionnelles vs acquises
Caryotype de cellules/tissus tumoraux : leucémie, lymphomes… = recherche d’anomalies chromosomiques acquises et présentes uniquement ds le(s) tissu(s) tumoral(aux) : sang : si cellules leucémiques > 20% moelle osseuse ganglions/rate et tumeurs solides: fragment tissulaire
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• Matériel
Prélèvements
- tube hépariné… identifié !
sang (7 ml)
moelle osseuse (1 ml)
fragment tissulaire
- ou tube sec stérile ( pour liquide pleural, d’ascite…)
- renseignements cliniques et pathologie suspectée ++++
Stérilité +++, acheminement rapide à t
ambiante
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• Étapes
Culture cellulaire
Capacité proliférative des cellules in vitro : selon l’hémopathie !
Milieux synthétiques de culture:
éléments nutritifs+ maintien des constantes physico-chimiques
Reproduction la plus fidèle des conditions in vivo
Dilacération des tissus (peau, villosités, tumeurs): scalpel
-> suspension cellulaire,
Concentration cellulaire de culture variable
1 à 2x106 cellules / ml: sang, moelle, fibroblastes…
1 à 4x106 cellules / ml: ggl, rate, tumeur
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• Étapes
Culture cellulaire
Hématologie : Culture de durée variable
- courte (24h) sans agents mitogènes pour les hémopathies
myéloïdes (aiguës, chroniques), Sd myéloprolifératifs,
- longue (72h) avec mitogènes pour les leucémies lymphoïdes
chroniques, les lymphomes à petites cellules : issus de cellules plus
« matures » avec capacité naturelle de division limitée
(Oligo-CpG et Interleukine-2)
Mise en culture à l’étuve à 37
C
Constitutionnel Post-natal
Sang : Agent mitogène PHA (Phytohémagglutinine)
72h : lymphocytes T
Peau : cellules adhérentes, fibroblastes
cultures + longues, surveillance +++ microscope
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• Étapes
Blocage des mitoses
- Colchicine: bloque la cellule au stade de métaphase
Interrompt la formation des fibres du fuseau
Libère les chromosomes de la plaque équatoriale
Mais induit une contraction des chromosomes
Concentration et temps d’exposition +++
Exposition Colchicine :
Variable : 30 min à 17 H, avec
concentration adaptée
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• Étapes
Choc hypotonique
Solution pauvre en sels KCl 0.075 M : pénétration par osmose
Gonflement de la cellule, étirement de la membrane cytoplasmique
Lyse des hématies 37
C (10 ml) sur vortex, 20 min 37
Fixation
Préserve la morphologie de la cellule
Stoppe les fonctions cellulaires
Perte d’une partie des protéines +++
Fixateur Méthanol / Acide acétique 3:1 (4
C) sur vortex x3
Culot cellulaire fixé conservé qqs jours à 4
C
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• Étapes
Étalement
Qualité de l’étalement +++
t
et degré d’humidité évaporation du fixateur
Contrôle au microscope : mitoses, densité, amas
Dénaturation
Marquage en bandes
Bandes chromosomiques non visible dans l’ADN isolé
replis résultants de l’interaction entre ADN et protéines
Marquages en bandes G, R, C, NORs:
G: digestion enzymatique /protéolytique, coloration au Giemsa
R: trt thermique en milieu salin puis coloration par Giemsa
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Caryotype • Étapes
Dénaturation
Technique de marquage en bandes R (Dutrillaux et Lejeune, 1971)
Solution saline Earle (tampon phosphaté, pH4,2) 87
C, BM
pdt 12 à 17 min, ajustement nécessaire
Coloration Giemsa 4%
Alternance bandes sombres « riches en gènes »
G-C: 3H
A-T: 2H
Lecture au microscope optique
Acquisition et classement
Interprétation
Culot cellulaire conservé à –20
C
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• Caryotype en bande R 46,XY
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• Caryotype en bande G 46,XY
R
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• gain d’un chromosome
-> trisomie
• perte d’un chromosome
-> monosomie
• Anomalie de la ploidie (normal = diploïde à 46 chrs)
hypodiploidie : 35-45
hyperdiploidie : 47-57
triploidie : # 69
tétraploidie : # 92
haploidie : # 23
/ (lot de 23)
Anomalies du caryotype
Anomalies de structure Anomalies de nombre
équilibrées
déséquilibrées
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Anomalies de structure
équilibrées déséquilibrées
inversion
délétion duplication
translocation
réciproque isochromosome
E
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Effets oncogéniques des translocations
Ex : effets pathologiques induits par la protéine de fusion BCR/ABL
Ex : effets pathologiques induits par la dérégulation du gène c-Myc par la t(8;14) IGH/cMyc
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Les mécanismes « oncogéniques » sont beaucoup moins clairs et moins précisés concernant les anomalies de nombre (gains, pertes)
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• Apports et limites
Approche pangénomique : visualisation du génome ds sa totalité
détection des anomalies numériques & structurales
détection de clone(s) apparentés ou non
détections de cassures « figures » ex: Fanconi
Apports
Echecs de culture: peu ou pas de mitoses,
Qualité du prélèvement et de la préparation,
Caryotype normal: nature des cellules en mitose ?
Sélection d’un clone possible (culture),
Pouvoir de résolution de détection des anomalies : 5-10 Mb
(1 bande = 107 pb)
Limites
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• Intérêt du caryotype
- diagnostic : Lymphomes, leucémies…
concordance avec anapath, cytologie, immunophénotypage
- pronostic : LAM : t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q21), inv(16)(p13q22)
LAM à caryotype complexe
LAL: hyperdiploïdie, t(9;22)
MDS: -5/5q, -7/7q, complexité
-suivi cytogénétique:
LMC sous traitement et suivi du contingent avec t(9;22)
Greffe de moelle osseuse allogénique : sexe, clone
Hémopathies +++
Tumeurs solides
- diagnostic: Sarcome d’Ewing – t(11;22)
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FISH: Hybridation Fluorescente in situ
• Définition et objectifs
• Principe
• Matériel
• Apports et limites
• Indications
• Exemples
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FISH • Définition
Cytogénétique moléculaire
Détection in situ de séquences d’acides nucléiques sur
métaphases
noyaux interphasiques
Ré-association moléculaire spécifique ADN-ADN :
cible = ADN chromosomique
sonde = ADN complémentaire
Hybridation moléculaire
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Sonde Préparation chromosomes cellules…
marquage
dénaturation dénaturation
HYBRIDATION
détection directe détection
indirecte
FISH • Principe
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• Matériel
Sondes: types de sonde
Séquences répétitives : centromère (séq alphoïde)
dénombrement des chrs
Séquences uniques -> vecteur
sondes spécifiques / locus
translocation, gène de fusion
délétion, amplification
ADN de tout ou partie d’un chromosome
microdissection -> banques
peinture chromosomique
Plasmide 0-10 Kb
Phage 10-25 Kb
Cosmide 20-50 Kb
PAC 130-150 Kb
BAC 150-300 Kb
YAC 200-2000 Kb
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• Matériel
Cible
Préparations cytogénétiques
noyaux : interphase
métaphases
Préparations cytologiques (pas de culture)
frottis, cytospins
appositions
Préparations histologiques
coupes congelées
coupes en paraffine
+/- extraction des noyaux
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FISH • Apports et limites
Apports
Etude in situ rapide, sensible, spécifique (locus)
Faible quantité de matériel biologique
Pouvoir de résolution // taille de sonde
Détection directe, sondes double-couleur
Détection des réarrangements géniques, délétion, amplification,
aneuploïdies…en interphase si échec du caryotype,
Nombre de fluorochromes (5)
Limites
Travail à l’échelle du gène -> informations partielles
Interprétation des résultats -> caryotype !
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FISH • Indications
Cytogénétique Constitutionnelle
Anomalie de nombre (couples de sondes): aneuploïdie
Syndromes microdélétionnels
Cytogénétique oncohématologique
Diagnostic: - anomalie cryptique -> 11q23 / MLL; CBFB / inv(16)
- précision du point de cassure: LMC / t(9;22)
- détection d’une anomalie récurrente essentielle au
diagnostic (échec
caryotype)
Pronostic: - inv(16) / CBFB; 11q22 / ATM; 11q23 / MLL
Suivi: maladie résiduelle, allogreffe de moelle (sexe)
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Caryotype et FISH
- Leucémies aiguës:
• Doit corroborer avec les données cytologiques et phénotypiques,
• Peut entraîner la modification du diagnostic cytologique de myélodysplasie en leucémie aiguë (ex t(8;21)),
- Lymphomes :
- profil cytogénétique ou signature cytogénétique ou anomalies « spécifiques » pour chaque grand sous-type de lymphome, donc
- aide à la précision du sous-type histologique
- LLC (leucémie lymphoïde chronique) : impact thérapeutique :
- délétion 17p13/TP53 : Résistance à la Fludarabine
- délétion 11q22 / ATM : intérêt d’une immunochimiothérapie
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Caryotype : FISH : exemples de l’intérêt dans le cadre du diagnostic et du traitement des leucémies aiguës myéloïdes
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L’hématopoïèse normale
myéloblaste promyélocyte métamyélocyte
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Définition
Les leucémies aiguës (LA) sont des proliférations clonales malignes de progéniteurs ou précurseurs médullaires des cellules sanguines associées à un blocage de maturation à un stade immature :
- de la lignée myéloïde : LAM - de la lignée lymphoïde : LAL - rarement : M et L : biphénotypique Il en résulte une accumulation de ces cellules immatures
(bloquées à un stade donné), ou blastes, dans la moelle osseuse, +/- le sang, et parfois dans d'autres organes.
La prolifération des blastes engendre une insuffisance
médullaire avec déficit de production des cellules sanguines matures.
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LAM avec t(15;17) :
obligatoirement LAM3 = promyélocytaire
5 à 8% des LAM, CIVD ++++
cytologie caractéristique / formes variantes
de très bon pronostic
pas d’allogreffe !
si échec caryotype ou mitoses normales : FISH
PML/RARA double couleur ; RARA dc
car insertions cryptiques, autres t 17q22 :
t(5;17)(q35;q21) : NPM ;
t(11;17)(q13;q21) : PLZF
anomalie isolée (si autres anomalies : tjs bon pronostic)
traitement spécifique
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Corps d’Auer en fagots
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46,XY,t(15;17)(q22;q21) PML/RARA
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46,XY,t(15;17)(q22;q21) PML/RARA
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Peu de modèles de cancer génétiquement simples
• Leucémie aiguë : promyélocytaire :
Translocation t(15;17) gène de fusion protéine de fusion
PML/RARA : blocage de la cellule à un stade précoce (promyélocyte)
Chimiothérapie classique (trop) efficace : libération de facteurs activant la coagulation +++
Traitement ciblé : ATRA : levée du blocage de la cellule
80% de guérison
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Facteurs pronostiques des LAM de novo
• Age (>60 ans) (+état général & comorbidités)
• Caryotype et/ou biologie moléculaire (<60ans)
• Leucocytose initiale
• Réponse au traitement
(immédiat et/ou MRD : minimal residual disease)
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Altérations génétiques sans anomalies CG
mutations ponctuelles Microdélétions Amplification
activation d’oncogènes inactivation FT essentiel différenciation
Mutations de gènes
Transduction du signal : FLT3, c-KIT (rec TK), RAS
Facteurs de transcription : AML1, CEBPα, EVI1,
Suppresseur de tumeur : p53
NPM1 ++++
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Facteurs pronostiques des LAM de novo
Caryotype / biologie moléculaire = facteur prédictif le plus fort de la réponse initiale au traitement (rémission complète 1 : RC1) et du risque de rechute.
Les anomalies cytogénétiques et moléculaires sont classées en 3 catégories.
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Impact pronostique des anomalies chromosomiques Consensus international du risque pronostic selon le caryotype :
1) Groupe favorable : - t(15;17) des APL,
- t(8;21) AML1/ETO et inv(16) des LAM CBF,
- Caryotypes normaux/intermédiaires avec profil moléculaire FLT3wt, NPM1wt, CEBPa muté,
2) Groupe intermédiaire : redéfini selon le statut mutationnel de 3 gènes (NPM1, FLT3 +/- CEBPa)
- NPM1 wt, FLT3 wt, CEBPa wt
- NPM1 muté, FLT3 wt
3) Groupe défavorable : - Caryotypes du groupe 2 avec FLT3 muté type ITD
- caryotypes complexes (> 3 anomalies),
- anomalies 5/7,
- anomalies 3q,
- anomalies 11q23/MLL sauf t(9;11),
- t(6;9) DEK/NUP214
Normal (50% des cas)
t(9;11)
+8
Autres (2 anomalies)
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Byrd et al, Blood 2002
CALGB 8461
17%
61%
22%
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FLT3
C-Kit
N-Ras
K-Ras
H-Ras
CEBP
MLL
EVI1
NPM
Anomalies moléculaires des LAM
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• Exemples
LAM4 - Leucémie aiguë myélomonocytaire
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• Exemples
FISH MLL
der(11)
11
der(19)
-> 46,XX,t(11;19)(q23;p13)
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Cytogénétique conventionnelle :
Intérêt diagnostique et pour le suivi :
Modèle de la LMC
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LMC : Introduction
• syndrome myéloprolifératif chronique
• prolifération prédominante de la lignée granuleuse
• évolution clinique en 3 phases:
- chronique
- accélération
- acutisation
• présence d ’une anomalie chromosomique typique:
chromosome Philadelphie (Ph) par t(9;22)
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L’Hématopoïèse normale
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LMC : Historique
• 1960 : découverte d ’un marqueur spécifique de la LMC :
le chromosome Philadelphie : 22q-
• 1983 : équivalent moléculaire BCR-ABL
transcrit BCR-ABL protéine de fusion BCR-ABL
échange de matériel génétique entre les bras longs
des chrs 9 et 22
• 1973 : translocation réciproque t(9;22)(q34;q11), présent chez 95%
des patients
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Clinique
• Signes d ’appels : asthénie, pesanteur abdominale
• Signes cliniques : splénomégalie +++
• Découverte fortuite (40 à 50% des cas)
• Complications inaugurales : rares
crise de goutte,
thrombose,
infarctus splénique
Épidémiologie
• incidence : 10 cas /an / 1.106 habitants
• âge moyen : 35-55 ans ; prédominance masculine
• facteurs favorisants : radiations ionisantes, benzène
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Diagnostic : arguments cytologiques
sang Moelle +++
Phase : chronique,
transformation, ou
accélération
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9q+
Ph
22
• Moelle
• Présence d ’un Ph
dans 95% des cas
• t(9;22)(q34;q11) « classique »
dans 95% des cas
• Translocation variante :
t(?;9;22) peu fréquente
• Banding R ou G
Diagnostic formel : caryotype
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LMC : cytogénétique
• t(9;22)(q34.1;q11.2) : translocation réciproque
22
Ph
(22q-) BCR/ABL
Gène de fusion
Protéine de fusion
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Caryotype 46,XY,t(9;22)(q34;q11)
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Caryotype 47,XY,t(6;9;22)(p24;q34;q11),+21
![Page 63: Intérêt de la cytogénétique conventionnelle et moléculaire · - pronostique, - thérapeutique Modèles : - la leucémie aiguë promyélocytaire, - la leucémie myéloïde chronique,](https://reader031.fdocuments.net/reader031/viewer/2022021712/5b9a9f8609d3f2aa588baccd/html5/thumbnails/63.jpg)
FISH
• bi-couleur
• sondes spécifiques bcr et abl
• visualisation directe de la fusion bcr-abl dans les
cellules interphasiques
bcr
abl
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FISH
• Précision du point de cassure, outil diagnostique :
• Pronostic : non
• Elucidation des translocations complexes
P190 , P210 ou P230
LMC LCN LAL Ph+
M-bcr m-bcr µ-bcr
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FISH - sonde BCR-ABL
M-bcr
normal
m-bcr
Ph
22
9q+
9
22
Ph
9q+
9
22 22
9 9 M-bcr
m-bcr
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Cassure M-bcr FISH - métaphase
1F 1V 2R
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Cassure m-bcr FISH - métaphase
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LMC, maladie de « la » cellule souche
Ph+
Ph+
Ph+
Ph+
Ph+
Ph+
Ph+
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LMC : P210BCR/ABL, protéine hybride
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BCR-ABL 3 points de cassure
P210
P190
LMC
LAL Ph+, LMC
P230
Leucémie
neutrophile
chronique
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c-ABL : protéine nucléaire, expression ubiquitaire / régulation fine
= tyrosine kinase (régulation +++) , bloque le cycle cellulaire
BCR-ABL : tyrosine kinase constitutivement active, de localisation cytoplasmique,
avec propriétés « transformantes » (modèles animaux BCR/ABL+ LMC)
Sujets sains BCR/ABL+ (sang)
• Sujet normal :
• LMC:
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Augmente la
prolifération
Réduit
l’adhérence
Inhibe
l’apoptose
Propriétés « oncogéniques » de la protéine P210BCR/ABL
Instabilité génétique +++
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La LMC, un modèle pour l’évaluation de la maladie résiduelle
Baccarani,
Blood, 2006
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Evolution naturelle de la LMC
+Ph, +8,
iso(17)(q10)
+19, +21
10 ans
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Caryotype 45,XY,-2,+8, t(9;22)(q34;q11),i(17)(q10),-21
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Phase chronique crise blastique
Précédée parfois d’une phase d’accélération
Apparition d’anomalies additionnelles dans 75 à 85% des cas
parfois avant toute manifestation cytologique ou clinique
p16
p53
+8
i(17)q
+Ph
+19
LMC acutisée
La phase acutisée de la LMC est marquée par une anomalie moléculaire (90% cas)
qui concerne le gène Ikaros/7p12 :
- délétion Ikaros (cryptique ou non, -7), totale ou partielle
- mutation Ikaros
protéine Ikaros aberrante…qui serait rfesponsable du blocage de la cellule à un
stade précoce de maturation (progéniteurs) d’où …leucémie aiguë
Mullighan et al. Nature Genetics, 2008
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Fuxa & Skok, Curr Opin Immunol, 2007
Rôle clé de régulateurs/facteurs de transcription dans la lymphopoièse B
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15 LMC acutisées
(3 LAL, 12 LAM)
4 del IKZF1
CML-7 : mutation
non-sens exon 7
La délétion de IKZF1 (Ikaros) constitue un évènement fréquent
dans le processus de transformation des LMC en LAL
Chrs 7
Mullighan et al., Nature, 2008
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Caryotype 48,XY,del(7)(p12p1?5),+8,t(9;22)(q34;q11),+15
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Traitement / Suivi
• Imitanib (GLIVEC*): inhibiteur de tyrosine kinase en 1ère intention (400 mg/j)
• ITK de 2è génération (Dasatinib: Sprycel* ; Nilotinb : Tasigna*) ou
Intérêt du suivi du caryotype +++
jusqu’à l’obtention de la réponse cytogénétique complète (RCyC)
RéponseCytogénétique
% de cellules médullairesPh+
Complète 0
Partielle 1 à 34%
Mineure 35 à 95%
Absence 100%
En parallèle suivi quantitatif par RT-Q-PCR
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Autre modèle : le lymphome à cellules du manteau
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Ontogénie B et Lymphomes
1 sous-type de lymphome = corolaire pathologique d’un compartiment physiologique
Moelle osseuse
ganglion Moelle osseuse, sang
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Ontogénie B
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D’après (Küppers 2005).
LMNH et Translocations Chromosomiques
t(14;18) IGH/BCL2
t(3;14) IGH/BCL6
t(8;14) IGH/cMYC
t(1;14)
IGH/BCL10
t(3;14)
IGH/BCL6
t(11;14)
IGH/CCND1
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Lymphome à cellules du manteau
Particularités cliniques :
- formes disséminées (>90% st III ou IV)
- fréquentes atteintes muqueuses (intestin, ORL),
- lymphome à petites cellules « agressif »
Hétérogénéité clinique, morphologique,
Phénotype immunologique
IgS (ML), CD19+, CD5+, CD10-, CD23-
t(11;14)(q13;q32) : anomalie cytogénétique caractéristique
caryo/FISH (# 100%)
PCR (50-60%)
Conséquences : Hyperexpression cycline D1 (CCND1)
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LM du Manteau : pronostic péjoratif
0
10
20
30
40
50
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80
90
100
0 6
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96
102
108
114
120
Survie en mois
Pro
bab
ilit
é d
e s
urv
ie
Folliculaire
Lymphocytique
Manteau
Zone marginale (SLVL)
Facteurs pronostiques : Ki67
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Architecture diffuse Petites cellules
Lymphomes à cellules du manteau 7% des lymphomes
Immunophénotype
IgM++, CD19+, CD5+, CD10-, CD23-, CCND1+
•Forme blastoïde : cellules plus grandes,
•Forme pleiomorphe,
•Forme classique
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la t(11;14)(q13;q32)
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La t(11;14)(q13;q32)
cen tel
Major
Translocation
Cluster
Cassures 11q13 éparpillées
dans région de #1Mb en 5’ et 3’
de CCND1,
un hot spot : MTC, 120 kb en 5’
de CCND1
Gène IGH
Hyperexpression de
la cycline D1
der(14)
IGH : Points de cassure
entre les segments D et J
Dérégulation de la transcription d’un seul gène (non tronqué) sous l’effet d’un activateur hétérologue
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The translocation t(11;14)(q13;q32) in MCL. (A) Schematic representation of the germline immunoglobulin heavy
chain (IgH) locus (IGH@) on chromosome 14q32 displaying the genomic organization of the variable (V), diversity
(D), joining (J) and the constant region (only the Cl gene is shown). The breakpoint in IGH seems to occur
between the diversity and joining regions during the early steps of the V(D)J recombination. (B) Genomic
organization of the BCL-1 (B-cell lymphoma/leukaemia 1) locus on chromosome 11q13. The majority of
breakpoints (30–50%) happen at the major translocation cluster (MTC), however there is some variability and 10–
20% of the breaks occurs outside the MTC closer to CCND1. (C) The translocation leads to a 5¢-5¢ fusion of the
bcl-1 locus with sequences from the IGH@ locus and brought under the control of the IgH enhancer, CCND1.
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cyclineD1
Rate - Immunohistochimie
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11 14 14q+11q-
CCND1
IGH
La t(11;14)(q13;q32) détection par FISH
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Sonde LSI IGH / CCND1 dual color Vysis
FISH
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Le caryotype d’un lymphome du manteau est souvent complexe…
G01 210 – HU G g1314
Caryotype : mitoses anormales 4/15
FISH 87 % noyaux avec t(11;14)
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Cytogénétique conventionnelle et FISH dans les LLC
Impact pronostic et thérapeutique
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Cytogénétique des LLC : impact thérapeutique
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Cytogénétique des LLC
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Cytogénétique des LLC
S06-079
CEP17
FISH p53/CEP17
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Cytogénétique des LLC
Délétion 17p 45,X,-Y,+12,-16,add(17)(p11)
S07-785
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Stilgenbauer ASH, 2004
Impact pronostique péjoratif de la délétion p53
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Losanski et al., Blood, 2004
Délétion 17p des LLC : Impact clinique thérapeutique
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CONCLUSIONS
Intérêt de l’étude cytogénétique des hémopathies malignes
1. Impact clinique : 4 : diagnostic, pronostic, suivi, thérapeutique
2. Signification de ces anomalies pour la compréhension des mécanismes de leucémogénèse,
3. Et de ce fait mieux orienter la recherche sur le versant thérapeutique : thérapie ciblée,
4. Avancée sur le plan fondamental : mécanismes intracellulaires, ou lien avec l’environnement tumoral…
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CONCLUSIONS
Identification des gènes concernés Conséquences des anomalies de structure: Translocations, inversions, délétions: DÉRÉGULATIONTRANSCRIPTIONNELLE, GENES de FUSION (quelle fusion?) Troncation génique Délétions: gènes suppresseurs de tumeurs haplo-insuffisance Isodisomie parentale acquise (puce) Amplifications: dmin, HSR contenu des amplicons, expression des gènes amplifiés