Insulin Dimers

8/8/2019 Insulin Dimers

1/8


2/8

E . R . M o r t e n s e n , J . G . D r a c h m a n a n d G . G u i d o t t iM e t h u e n , MA, U . S . A . T u r k e y e r y t h r o c y t e p l a s m a m e m b r a n e sw e r e p r e p a r e d b y t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d b y G i n s b e r g e t a l .( 1 9 7 6 ) . T r i t o n X - 1 0 0 ( f i n a l c o n c n . 1 - 3 % , v / v ) was a d d e d t om e m b r a n e s ( p r o t e i n c o n c n . 1 2 - 1 5 m g / m l ) , i n H e p e s b u f f e r a t3 ' C . T h e s u s p e n s i o n w a s u l t r a c e n t r i f u g e d a t 1 3 0 0 0 0 g f o r 4 5 m i n ,a t 3 ' C , t o y i e l d a s u p e r n a t a n t s o l u t i o n c o n t a i n i n g d e t e r g e n t -s o l u b i l i z e d m e m b r a n e p r o t e i n s .R a t a d i p o c y t e p l a s m a m e m b r a n e s

R a t a d i p o c y t e m e m b r a n e s w e r e p r e p a r e d b y d i f f e r e n t i a lc e n t r i f u g a t i o n , b y u s i n g t h e m e t h o d o f M c K e e l & J a r r e t t ( 1 9 7 0 )w i t h m o d i f i c a t i o n s b y C u s h m a n & W a r d z a l a ( 1 9 8 0 ) . M e m b r a n e sw e r e s t o r e d i n 5 0 m M - H e p e s , pH 7 . 8 , a t -70 ' C b e f o r ee x p e r i m e n t s . A d i p o c y t e m e m b r a n e s w e r e s o l u b i l i z e d w i t h T r i t o nX - 1 0 0 a s d e s c r i b e d a b o v e ; i n s u l i n r e c e p t o r s w e r e f u r t h e r e n r i c h e db y W G A - a g a r o s e p u r i f i c a t i o n ( F u j i t a - Y a m a g u c h i e t a l . , 1 9 8 3 ) .P r e p a r a t i o n o f ' 2 5 I - i n s u l i n - l a b e l l e d d e t e r g e n t e x t r a c t o fm e m b r a n e s

M e m b r a n e s w e r e l a b e l l e d a n d v e l o c i t y s e d i m e n t a t i o n w a sc o n d u c t e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( A i y e r , 1 9 8 3 a , b ) . F o r v e l o c i t ys e d i m e n t a t i o n , m a r k e r p r o t e i n s w e r e i d e n t i f i e d b y SDS/PAGE.P h o s p h o r y l a t i o n

T r i t o n - X - 1 0 0 - s o l u b i l i z e d t u r k e y e r y t h r o c y t e a n d r a t a d i p o c y t em e m b r a n e s w e r e d i l u t e d , w h e n n e c e s s a r y , t o a f i n a l T r i t o nc o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 0 0 a n d i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r1 h w i t h r o c k i n g i n t h e a b s e n c e o r p r e s e n c e o f 1 0 0 n M - i n s u l i n i n5 0 m M - H e p e s , pH 7 . 8 . G r a d i e n t f r a c t i o n s w e r e u s e d d i r e c t l yw i t h o u t d i l u t i o n . H i s t o n e 2 B w a s a d d e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o no f 0 . 1 m g / m l . P h o s p h o r y l a t i o n w a s t h e n i n i t i a t e d b y a d d i t i o n o fM g C l 2 , M n C l 2 a n d Na2ATP t o f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 m M ,2 mm a n d 5 mm r e s p e c t i v e l y . [ y - 3 2 P ] A T P ( 7 0 0 0 mCi/mmol) w a sa d d e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f a p p r o x . 1 . 5 m C i / m l . R e a c t i o n sw e r e t e r m i n a t e d b y a d d i t i o n o f g e l s a m p l e b u f f e r i n p r e p a r a t i o nf o r e l e c t r o p h o r e s i s , o r I r e a c t i o n v o l . o f 2 5 0 m M - N a F , 5 0 mM-N a 2 P 2 0 7 a n d 2 5 mM-Na2EDTA ( S t o p p i n g S o l u t i o n ) i n o r d e r t oi n h i b i t p h o s p h a t a s e a c t i v i t y , b e f o r e s u c r o s e - d e n s i t y - g r a d i e n ts e d i m e n t a t i o n .I n s u l i n - a g a r o s e - s t i m u l a t e d p h o s p h o r y l a t i o n

S o l u b i l i z e d r e c e p t o r ( 1 0 0 l l ) i n 0 . 1 0 % T r i t o n X - 1 0 0 w a si n c u b a t e d w i t h 1 0 , 1 o f i n s u l i n - a g a r o s e f o r 2 h i n 5 0 m M - H e p e s( p H 7 . 8 ) / I mM-EDTA a t 3 ' C . I n s u l i n - a g a r o s e - b o u n d r e c e p t o rw a s t h e n q u i c k l y p e l l e t e d a n d r e s u s p e n d e d t w i c e t o r e m o v eu n b o u n d r e c e p t o r . P h o s p h o r y l a t i o n w a s t h e n e f f e c t e d a t 2 2 ' Cw i t h s t a n d a r d p h o s p h o r y l a t i o n c o c k t a i l i n 5 0 / 1 l v o l u m e f o r3 m i n . P h o sp h o r y l a t i o n w a s t e r m i n a t e d b y a d d i t i o n o f 5 0 m M - N -e t h y l m a l e i m i d e a n d g e l s a m p l e b u f f e r .S u c r o s e - d e n s i t y - g r a d i e n t s e d i m e n t a t i o n

T h i s w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d b y A i y e r ( 1 9 8 3 a ) . To i n h i b i tt h e a c t i o n o f p h o s p h o p r o t e i n p h o s p h a t a s e s o r i s o t o p i c e x c h a n g ed u r i n g t h e s e d i m e n t a t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d r e c e p t o r , g r a d i e n ts o l u t i o n s c o n t a i n e d 5 0 m M - N a F , 1 0 m M - N a 2 P 2 0 7 a n d 5 mM-Na2EDTA i n a d d i t i o n t o b u f f e r .SDS/PAGE a n d a u t o r a d i o g r a p h ySDS/PAGE a n a l y s i s w a s c a r r i e d o u t i n t h e L a e m m l i ( 1 9 7 0 )s y s t e m o n g e l s w i t h a n a c r y l a m i d e g r a d i e n t ( 4 - 8 % f o r r e c e p t o ra l o n e a n d 4 - 2 0 % f o r r e c e p t o r a n d h i s t o n e s ) . To p r e v e n ta r t i f a c t u a l r e d u c t i o n o f r e c e p t o r i n n o n - r e d u c i n g g e l s , e i t h e r1 0 m M - N - e t h y l m a l e i m i d e w a s a d d e d d i r e c t l y t o s o l u b i l i z e d r e -c e p t o r b e f o r e a d d i t i o n o f g e l s a m p l e b u f f e r , o r 5 - f o l d -c o n c e n t r a t e d g e l s a m p l e b u f f e r w a s m a d e 1 0 mm w i t h N -e t h y l m a l e i m i d e i m m e d i a t e l y b e f o r e i t s a d d i t i o n t o s o l u b i l i z e d

r e c e p t o r s a m p l e s . Kodak XAR 5 f i l m w a s u s e d i n c o n j u n c t i o nw i t h C r o n e x L i g h t n i n g P l u s i n t e n s i f y i n g s c r e e n s t o o b t a i na u t o r a d i o g r a p h s o f t h e d r i e d g e l s . G e l s l i c e s w e r e t h e n c u t , a d d e dt o a minimum v o l u m e o f 3 0 % ( v / v ) H 2 0 2 , i n c u b a t e d a t 8 5 C f o r1 5 - 2 0 h , a n d t h e i r r a d i o a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d b y s p e c t r o -p h o t o m e t r y i n A q u a s o l .RESULTSP r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y o f t u r k e y e r y t h r o c y t e r e c e p t o r sT u r k e y e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s c o n t a i n i n s u l i n - r e c e p t o rd i m e r s ( M r 3 5 0 0 0 0 ) a n d m o n o m e r s ( M , 2 2 0 0 0 0 ) , w i t h s e d i -m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t s o f 1 0 . 2 S a n d 6 . 6 S r e s p e c t i v e l y , a s d e -t e r m i n e d b y s u c r o s e - d e n s i t y - g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n ( A i y e r ,1 9 8 3 a , b ) .To d e t e r m i n e w h e t h e r o r n o t n a t i v e i n s u l i n - r e c e p t o r m o n o m e r sh a v e k i n a s e a c t i v i t y , r e c e p t o r d i m e r s a n d m o n o m e r s w e r e i s o l a t e db y d e n s i t y - g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n a n d t h e s e p a r a t e d p e a k s w e r ea s s a y e d f o r p r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y o n e n d o g e n o u s a n d e x o g e n o u ss u b s t r a t e s . T h e r e s u l t s ( F i g . l a ) s h o w t h a t t h e p r i n c i p a la u t o p h o s p h o r y l a t i n g a n d h i s t o n e - p h o s p h o r y l a t i n g a c t i v i t i e s a r ei n t h e d i m e r p e a k w i t h a s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t o f 1 0 . 2 S . Ont h i s n o n - r e d u c i n g g e l t h e d o m i n a n t p h o s p h o r y l a t e d r e c e p t o rb a n d i s s e e n a t Mr 3 5 0 0 0 0 . F i g . 1 ( b ) s h o w s t h a t t h ep h o s p h o r y l a t i n g a c t i v i t y o f t h e d i m e r i s i n s u l i n - d e p e n d e n t . F i g .l ( c ) , w h i c h r e p r e s e n t s a much l o n g e r f i l m e x p o s u r e , s h o w s t h a tt h e r e i s v e r y s l i g h t p h o s p h o r y l a t i n g a c t i v i t y i n t h e monomer p e a k ,w h i c h i s a l s o i n s u l i n - d e p e n d e n t . T h e a c t i v i t y o f t h e monomerp e a k i s 4 0 t i m e s s m a l l e r t h a n t h a t o f t h e d i m e r p e a k p e r i n s u l i n -b i n d i n g u n i t .

I n o r d e r t o q u a n t i f y t h e k i n a s e a c t i v i t y o f r e c e p t o r d i m e r s a n dm o n o m e r s , i n s u l i n b i n d i n g a n d p h o s p h o r y l a t i o n a c t i v i t y w e r em e a s u r e d o n s e p a r a t e d r e c e p t o r d i m e r s a n d m o n o m e r s . F i g . 2s h o w s t h e p r o f i l e f o r h o r m o n e b i n d i n g a n d p h o s p h o r y l a t i o na c r o s s t h e g r a d i e n t . R e c e p t o r d i m e r s a r e t h e p r e d o m i n a n tp h o s p h o r y l a t e d a n d p h o s p h o r y l a t i n g s p e c i e s ; s m a l l a m o u n t s o fb o t h e n d o g e n o u s a n d e x o g e n o u s s u b s t r a t e k i n a s e a c t i v i t y c a na l s o b e o b s e r v e d a t t h e p o s i t i o n a n d Mr o f t h e r e c e p t o r m o n o m e r s .M e a s u r e m e n t o f t h e a m o u n t ( m o l ) o f p h o s p h a t e i n c o r p o r a t e dp e r m o l o f i n s u l i n b o u n d g a v e a r a t i o o f 0 . 6 7 f o r d i m e r s a n d0 . 0 1 2 f o r m o n o m e r s .T h e c o n c l u s i o n i s t h a t i n t h e t u r k e y e r y t h r o c y t e m e m b r a n e st h e i n s u l i n - r e c e p t o r d i m e r i s t h e p r i n c i p a l t y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y .I t i s i n t e r e s t i n g t h a t i n r a t l i v e r m e m b r a n e s , w h i c h a l s o h a v ei n s u l i n - r e c e p t o r d i m e r s a n d m o n o m e r s ( A i y e r , 1 9 8 3 a ) , o n l y t h ed i m e r s h a v e t y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y ( G . V e l i c e l e b i , p e r s o n a lc o m m u n i c a t i o n ) .P r ot e i n k i n a s e a c t i v i t y o f r e d u c e d i n s u l i n r e c e p t o r s

T h e c e n t r a l q u e s t i o n i n t h i s w o r k i s w h e t h e r i n s u l i n - r e c e p t o rm o n o m e r s h a v e p r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y . S i n c e t h e monomersp r e s e n t i n n a t i v e m e m b r a n e s o f t u r k e y e r y t h r o c y t e s a r e i n a c t i v e ,we a s k e d w h e t h e r o r n o t t h e monomers o b t a i n e d b y r e d u c t i o n o fa c t i v e d i m e r s m i g h t r e t a i n t h e k i n a s e a c t i v i t y .S i n c e r e d u c t i o n c o u l d a c t i v a t e t h e k i n a s e a c t i v i t y o f t h e r e s i d e n tr e c e p t o r monomers i n t h e m e m b r a n e , we d e t e r m i n e d t h e e f f e c to f r e d u c t i o n o n t h e p r o p e r t i e s o f t h e i s o l a t e d d i m e r s a n dmonomers ( F i g . 3 ) . T h e r e c e p t o r d i m e r e x h i b i t e d i n s u l i n -s t i m u l a t e d [ 3 2 P ] p h o s p h a t e i n c o r p o r a t i o n w h i c h was i n h i b i t e db y d i t h i o t h r e i t o l ( D T T ) i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r .A u t o p h o s p h o r y l a t i o n was n o t s i g n i f i c a n t l y a f f e c t e d b y l e s s t h a n0 . 5 m M - D T T , b u t was m a r k e d l y i n h i b i t e d a t h i g h e r c o n c e n -t r a t i o n s . T h e b i n d i n g o f i n s u l i n t o t h e d i m e r s was i n c r e a s e d u p t o2 - f o l d b y r e d u c t i o n w i t h c o n c e n t r a t i o n s o f DTT u p t o 1 0 m M( r e s u l t s n o t s h o w n ) . M o n o m e r s , h o w e v e r , w e r e n e v e r a u t o -p h o s p h o r y l a t e d , e i t h e r w i t h o r w i t h o u t r e d u c i n g a g e n t s . T h i s

1 9 9 1

5 0


3/8

T y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r a , monomer

( a ) :

1 0 3 !x Mr

350-

. . . : : . . . . . . . .! 1 0 . 2 S ~. . . . . . . . . . . ..

. : : : : ( b ) | ! : ( c ) ... ........

. . . . : - - . . . . . . ..

6 . 6 S ;. . . . . . . . . . : . . . :. 1 0 3 ;:.. . Z W W X i ' !

. . . . . : . ._ : , : : : .

. . . . . . W .

10 -5 1 5 1 9 :

F r a c t i o n n o .

F i g . 1 . P h o s p h o r y l a t i o n o f i n s u l i n r e c e p t o r s a f t e r d e n s i t y - g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o nA 2 0 0 e l l p o r t i o n o f 1 % ( w / v ) - T r i t o n X - 1 0 0 - s o l u b i l i z e d t u r k e y e r y t h r o c y t e p l a s m a m e m b r a n e s w a s l a y e r e d o n t o 5 - 2 0 % ( w / v ) s u c r o s e g r a d i e n t sa n d s u b j e c t e d t o u l t r a c e n t r i f u g a t i o n . S a m p l e s ( 4 5 4 1 l ) o f g r a d i e n t f r a c t i o n s s p a n n i n g t h e r e g i o n c o n t a i n i n g r e c e p t o r w e r e i n c ub a t e d w i t h 1 0 0 n M -i n s u l i n ( f i n a l c o n c n . ) f o r 1 h a t room t e m p e r a t u r e . A f t e r a d d i t i o n o f 5 m g o f h i s t o n e 2 B , p h o s p h o r y l a t i o n w a s i n i t i a t e d a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l sa n d m e t h o ds s e c t i o n a n d t e r m i n a t e d a f t e r 2 0 m i n b y a d d i t i o n o f g e l s a m p l e b u f f e r . N o n - r e d u c i n g SDS/PAGE was d o n e o n 4 - 2 0 % l i n e a r g r a d i e n ta c r y l a m i d e g e l s . P a n e l ( a ) i s t h e a u t o r a d i o g r a m o f t h e g e l s h o w i n g p h o s p h o r y l a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f i n s u l i n . L a n e s a r e s h o w n l e f t t o r i g h t i n o r d e ro f d e c r e a s i n g s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t . P a n e l s ( b ) a n d ( c ) s h o w p h o s p h o r y l a t i o n o f g r a d i e n t f r a c t i o n s a t 1 0 . 2 S a n d 6 . 6 S r e s p e c t i v e l y , + a n d -i n s u l i n . T h e s e s a m p l e s w e r e r e d u c e d t o s h o w p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e f l - s u b u n i t i n b o t h d i m e r a n d m o n o mer s p e c i e s . A u t o r a d i o g r a p h i c e x p o s u r ew a s s e l e c t e d t o s h o w t h e r e l a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n o f r e c e p t o r a n d h i s t o n e . T h e e x p o s u r e t i m e f o r p a n e l ( c ) i s r o u g h l y 1 0 t i m e s t h a t f o r ( b ) .

r e s u l t s u g g e s t s t h a t e x p o s u r e o f n a t i v e m o n o m e r s t o DTT w i l ln o t a c t i v a t e t h e k i n a s e a c t i v i t y . T h e s e r e s u l t s a r e q u a n t i f i e d i nT a b l e 1 .F i g . 4 s h o w s t h e e f f e c t s o f r e d u c t i o n o n s o l u b i l i z e d r e c e p t o r s .R e d u c t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d r e c e p t o r s b y DTT r e s u l t s i n t h ec o m p l e t e c o n v e r s i o n o f d i m e r s i n t o m o n o m e r s ( l a n e s 1 - 9 ) ; w i t h1 . 5 mM-DTT, h a l f t h e d i m e r s a r e c o n v e r t e d i n t o m o n o m e r s( l a n e 6 ) . R e d u c t i o n o f s o l u b i l i z e d r e c e p t o r s w i t h 0 . 5 m m - ,1 . 0 m m - , 1 . 5 m m - , 2 mM- a n d 5 mM-DTT ( l a n e s A - E ) b e f o r ea u t o p h o s p h o r y l a t i o n c a u s e s a d e c r e a s e i n t h e e x t e n t o fp h o s p h o r y l a t i o n , e v e n a t t h e l o w e s t c o n c e n t r a t i o n o f DTT( l a n e A ) . A t 5 . 0 mM-DTT ( l a n e E ) , t h e r e i s n o d e t e c t a b l ea u t o p h o s p h o r y l a t i o n . On t h e o t h e r h a n d , t h e monomer a p p e a r st o i n c o r p o r a t e l o w , b u t d e t e c t a b l e , l e v e l s o f [ 3 2 P ] p h o s p h a t e a t t h ef o u r l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f DTT. T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t t h em o n o mer c a n f u n c t i o n a s a p r o t e i n k i n a s e .I n o r d e r t o d e m o n s t r a t e t h i s p o i n t c l e a r l y , we e x a m i n e d t h ek i n a s e a c t i v i t y o f i n s u l i n - r e c e p t o r m o n o m e r s o b t a i n e d b y r e -d uc t i o n o f d i m e r s i n t h e m e m b r a n e . T h i s p r o c e d u r e w a s u s e d t om i n i m i z e t h e d e l e t e r i o u s e f f e c t s o f r e d u c t i o n s h o w n i n F i g . 4 . F i g .5 s h o w s t h a t t h e t y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y o f i n s u l i n r e c e p t o r s o ft u r k e y e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s , a s j u d g e d b y a u t o p h o s p h o r y l a t i o n ,i s a l l p r e s e n t a t t h e p o s i t i o n o f t h e i n s u l i n - r e c e p t o r d i m e r . A f t e rr e d u c t i o n , h o w e v e r , t h e r e i s n o a c t i v i t y a t t h e d i m e r p o s i t i o n , b u ta s u b s t a n t i a l amount o f k i n a s e a c t i v i t y i s p r e s e n t a t t h e p o s i t i o no f t h e i n s u l i n - r e c e p t o r m o n o mer ( 6 . 6 S ) . C o i n c i d e n t w i t h t h e l o s so f k i n a s e a c t i v i t y a t t h e d i m e r p o s i t i o n i s a l o s s o f i n s u l i n - b i n d i n ga c t i v i t y a t t h e d i m e r p o s i t i o n ( 1 0 . 2 S ) ( r e s u l t s n o t s h o w n ) . T h eq u a n t i f i c a t i o n o f t h i s r e s u l t i s s h o w n i n T a b l e 2 ; t h e r e i s t r a n s f e r

o f o n e h a l f o f t h e a u t o p h o s p h o r y l a t i n g a c t i v i t y a n d o f a l m o s t a l lt h e h i s t o n e p h o s p h o r y l a t i n g a c t i v i t y , f r o m t h e 1 0 . 2 S t o t h e 6 . 6 Sp o s i t i o n .T h e i n s u l i n c o n c e n t r a ti o n - d ep e n d e nc e o f t h e k i n a s e a c t i v i t i e so f r e c e p t o r d i m e r s a n d monomer w a s c o m p a r e d t o e s t i m a t e t h ee f f e c t s o f r e d u c t i o n o n t h e p r o p e r t i e s o f t h e r e c e p t o r m o n o m e r .T h e r e s u l t s o f t h e s e e x p e r i m e n t s , s h o w n i n F i g . 6 , i n d i c a t e t h a tb o t h t h e a u t o p h o s p h o r y l a t i o n a c t i v i t y a n d t h e e x o g e n o u s k i n a s ea c t i v i t y o f r e c e p t o r d i m e r s a n d monomers h a v e a s i m i l a r d e -p e n d e n c e o n t h e i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n w i t h a n a p p a r e n t K d f o ri n s u l i n o f 1 5 n m . T h i s v a l u e i s c o m p a r a b l e w i t h t h o s e o b t a i n e df o r t h e i n s u l i n r e c e p t o r s o f 3 T 3 - L 1 a d i p o c y t e s ( K d = 8 n M ) ( R o s e ne t a l . , 1 9 8 3 ; K o h a n s k i e t a l . , 1 9 8 6 ) .T h e e f f e c t o f r e d u c t i o n o n t h e p r o p e r t i e s o f i n s u l i n r e c e p t o r s o ft h e r a t a d i p o c y t e m e m b r a n e was a l s o s t u d i e d . I n t h i s s y s t e m , a l lt h e i n s u l i n r e c e p t o r s a r e p r e s e n t a s d i m e r s . T h e r e s u l t s s h o w n i nF i g . 7 i n d i c a t e t h a t b o t h a u t o p h o s p h o r y l a t i n g ( p a n e l a ) a n dh i s t o n e - p h o s p h o r y l a t i n g ( p a n e l b ) a c t i v i t i e s a r e p r e s e n t o n l y a tt h e p o s i t i o n o f t h e i n s u l i n - r e c e p t o r d i m e r b e f o r e r e d u c t i o n . A f t e rr e d u c t i o n w i t h FT T ( p a n e l c ) , i n s u l i n - d e p e n d e n t h i s t o n e -p h o s p h o r y l a t i o n a c t i v i t y i s f o u n d a t t h e m o n o m e r p o s i t i o n .T h e s e r e s u l t s a r e q u a n t i f i e d i n T a b l e 3 . I t i s e v i d e n t t h a t r e d u c t i o no f t h e a d i p o c y t e r e c e p t o r i s a c c o m p a n i e d b y s u b s t a n t i a l l o s s( 9 0 - 9 5 %) o f k i n a s e a c t i v i t i e s , s u g g e s t i n g a g r e a t e r s e n s i t i v i t y o ft h i s r e c e p t o r t o r e d u c t i o n a s c o m p a r e d w i t h t h e t u r k e y e r y t h -r o c y t e r e c e p t o r . A l t h o u g h n o t f u r t h e r i n v e s t i g a t e d , t h i s o b -s e r v a t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h t h e much g r e a t e r s e n s i t i v i t y o f t h i sr e c e p t o r k i n a s e t o b i v a l e n t - m e t a l i n a c t i v a t i o n ( E . R . M o r t e n s e n ,u n p u b l i s h e d w o r k ) .

V o l . 2 7 3

5 1


4/8

E . R . M o r t e n s e n , J . G . D r a c h m a n a n d G . G u i d o t t i

2 .E6 .1 -U;x0

05

- 4Ea .c ; 3o . 2x0

1 6F r a c t i o n n o .F i g . 2 . I n s u l i n b i n d i n g a n d k i n a s e a c t i v i t y o f i n s u l i n - r e c e p t o r m o n o m e r sa n d d i m e r s

S o l u b i l i z e d t u r k e y e r y t h r o c y t e p l a s m a m e m b r a n e i n 0 . 5 % ( w / v )T r i t o n X - 1 0 0 w a s i n c u b a t e d w i t h ' 2 5 I - i n s u l i n ( 5 0 n M ) a t r o o mt e m p e r a t u r e f o r 1 h . A 2 0 0 s l s a m p l e w a s l a y e r e d o n t o 5 - 2 0 %s u c r o s e d e n s i t y g r a d i e n t s a n d s e d i m e n t e d a s d e s c r i b e d i n t h eM a t e r i a l s a n d m e t h o d s s e c t i o n . S a m p l e s o f f r a c t i o n s w e r e c o u n t e df o r r a d i o a c t i v i t y w i t h a B e c k m a n 4 0 0 0 y - c o u n t e r . S a m p l e s ( 4 5 , l l ) o ff r a c t i o n s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 0 0 n M - i n s u l i n . H i s t o n e a d d i t i o n ,p h o s p h o r y l a t i o n , S D S / P A G E , a u t o r a d i o g r a p h y a n d q u a n t i f i c a t i o no f i n c o r p o r a t e d p h o s p h a t e w e r e a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d i n t h eM a t e r i a l s a n d m e t h o d s s e c t i o n . T o t a l r a d i o a c t i v i t y ( c . p . m . ) i np h o s p h o r y l a t e d b a n d s a t a p p a r e n t Mr v a l u e s o f 3 5 0 0 0 0 ( O , 0 ) ,2 2 0 0 0 0 ( A , . A) a n d 1 0 0 0 0 ( 5 , *) i s i n d i c a t e d ( w i t h o u t a n d w i t hi n s u l i n r e s p e c t i v e l y ) .

A g g r e g a t i o n s t a t e o f m o n o m e r s d u r i n g t h e k i n a s e r e a c t i o nT h e s i m p l e s t e x p l a n a t i o n o f t h e s e r e s u l t s i s t h a t i n s u l i n - r e c e p t o r

m o n o m e r s h a v e t y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y . To r u l e o u t t h e p o s s i -b i l i t y t h a t t h e monomers m i g h t h a v e f o r m e d c o v a l e n t l y a s s o c i a t e dd i m e r s i n t h e p r e s e n c e o f i n s u l i n , t h e s e d i m e n t a t i o n p r o p e r t i e s o fr e c e p t o r monomers f r o m r a t a d i p o c y t e m e m b r a n e s w e r e d e -t e r m i n e d a f t e r a u t o p h o s p h o r y l a t i o n , a n d a f t e r i n c u b a t i o n w i t ha n d w i t h o u t i n s u l i n . F i g . 8 s h o w s t h e a n a l y s e s o f t h e s u c r o s ed e n s i t y g r a d i e n t s : p a n e l A i s t h e p a t t e r n o b t a i n e d w i t ha u t o p h o s p h o r y l a t e d m o n o m e r s ; p a n e l s B a n d C s h o w t h ep a t t e r n s o b t a i n e d w i t h t h e m o n o me r p e a k a f t e r i n c u b a t i o nw i t h o u t a n d w i t h i n s u l i n r e s p e c t i v e l y . I n a l l t h r e e c a s e s , t h e o n l yp h o s p h o r y l a t e d r e c e p t o r i s p r e s e n t a t t h e p o s i t i o n o f t h e x , / Lmonomer ( 6 . 6 S ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e r e i s n o c o v a l e n t d i m e rf o r m e d u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s .

DTT ( m M ) . . . 0 0 . 5I - - D i m e r M o n o m e r - *

1 . 5 1 0 0 1,= - + - I I I .. Tn s u l i n . - -. - +r

F i g . 3 . P h o s p b o r y l a t i o n o f m o n o m e r s a n d d i m e r sI s o l a t e d f r a c t i o n s o f m o n o m e r s a n d d i m e r s w e r e o b t a i n e d f r o mT r i t o n X - 1 0 0 - s o l u b i l i z e d t u r k e y e r y t h r o c y t e s b y s u c r o s e - g r a d i e n tv e l o c i t y s e d i m e n t a t i o n ( a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d m e t h o d ss e c t i o n ) . S a m p l e s ( 4 5 u l ) o f p o o l e d d i m e r a n d m o n o m e r f r a c t i o n sw e r e p h o sp h o ry l a t ed w i t h o r w i t h o u t 1 0 0 n M - i n s u l i n f o r 2 0 m i n i nt h e p r e s e n c e o f t h e i n d i c a t e d c o n c e n t r a t i o n s o f r e d u c i n g a g e n t , a n da n a l y s e d a s d e s c r i b e d b y r e d u c i n g SDS/PAGE o n 7 . 5 % - a c r y l a m i d eg e l s .

T a b l e 1 . E f f e c t o f r e d u c t i o n o n m o n o m e r a n d d im e r p h o s p h o r y l a t i o nT h e g e l b a n d s i d e n t i f i e d b y a u t o r a d i o g r a p h y p r e s e n t a t t h e p o s i t i o no f monomer a n d d i m e r i n F i g . 3 w e r e e x c i s e d , d i g e s t e d a n d c o u n t e df o r r a d i o a c t i v i t y a s d e s c r i b e d . R e s u l t s s h o w n a r e t h e i n c o r p o r a t e d[ 3 2 P ] P i c . p . m . f o r m i n u s - a n d p l u s - i n s u l i n l a n e s a s a f u n c t i o n o f[ D T r ] . A l s o s h o w n i s t h e i n s u l i n - d e p e n d e n t c . p . m . [ s p e c i f i c =( + i n s u l i n ) - ( - i n s u l i n ) ] .

3 2 p i n c o r p o r a t i o n ( c . p . m . )[ D TT ] ( m M) - I n s u l i n + I n s u l i n S p e c i f i c

D i m e r 00 . 51 . 01 . 51 0 . 0Monomer 01 . 0

8 7 3 5 01 6 9 4 0 91 4 0 3 1 21 7 3 2 2 11 1 8 1 5 71 2 7 1 2 61 2 0 1 4 0

2 6 32 4 01 7 24 83 92 0

T h e r e r e m a i n s t h e p o s s i b i l i t y t h a t o n l y n o n - c o v a l e n t r e c e p t o rd i m e r s a r e a c t i v e i n t h e k i n a s e r e a c t i o n . T h i s p o s s i b i l i t y w a se x a m i n e d b y m e a s u r i n g t h e e x t e n t o f p h o s p h o r y l a t i o n o f r e c e p t o rd i m e r s a n d m o n o m e r s o f r a t a d i p o c y t e m e m b r a n e s a s a f u n c t i o no f r e c e p t o r c o n c e n t r a t i o n . I n F i g . 9 , l a n e s A a n d B , a r e s h o w nt h e r e s u l t s o f t h e c o n t r o l a n d i n s u l i n - s t i m u l a t e d p h o s p h o r y l a t i o n so f t h e p a r t i a l l y r e d u c e d u n d i l u t e d r e c e p t o r p r e p a r a t i o n . T h er a d i o a c t i v i t i e s o f t h e r e c e p t o r monomer a n d d i m e r b a n d s a r er e p o r t e d i n T a b l e 4 . A 1 0 - f o l d d i l u t i o n o f t h e r e c e p t o r m i x t u r ed o e s n o t a f f e c t t h e f r a c t i o n o f r a d i o a c t i v i t y i n r e c e p t o r monomera n d d i m e r b a n d s u n d e r s u b - m a x i m a l l y p h o s p h o r y l a t i n g c o n -d i t i o n s . T h i s r e s u l t i n d i c a t e s t h a t t h e k i n a s e a c t i v i t y o f t h er e c e p t o r monomer i s n o t a f f e c t e d b y monomer c o n c e n t r a t i o n ,s u g g e s t i n g t h a t t h e m o n o mer a n d n o t a n o n - c o v a l e n t d i m e r i s t h ea c t i v e s p e c i e s .R e c e p t o r m o n o m e r s a n d d i m e r s o b t a i n e d f r o m r a t a d i p o c y t e sa f t e r r e d u c t i o n w i t h DTT a n d i s o l a t i o n b y s u c r o s e - d e n s i t y -g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n w e r e i n c u b a t e d w i t h i n s u l i n - a g a r o s e i n

1 9 9 1

5 2

- - v


5/8

T y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r a , 8 m o n o me r3 2 P DTT D T T , 3 2 P112 3 4 5 6 7 8 9 1 A B CDE

- 2 0 0

~~~~~1~~ ~ ~ ~ 1..:: .: . . : . : . . . 9..

F i g . 4 . A n a l y s i s o f t h e e f f e c t o f DTT o n r e c e p t o r k i n a s e b e f o r e a n d a f t e rp h o s p h o r y l a t i o nI n t h e l e f t - h a n d p a n e l , 4 5 , l s a m p l e s o f s o l u b i l i z e d t u r k e y e r y t h r o -c y t e m e m b r a n e , c o n t a i n i n g b o t h m o n o m e r s a n d d i m e r s , w e r ep h o s p h o r y l a t e d b y t h e s t a n d a r d p r o t o c o l , w i t h a n d w i t h o u t 1 0 0 n M -i n s u l i n ( l a n e s 1 a n d 2 ) . T h i s l a b e l l e d m a t e r i a l w a s s u b s e q u e n t l yr e d u c e d t o m o n o m e r b y a 3 0 m i n i n c u b a t i o n w i t h 0 . 1 m M - , 0 . 5 m M - ,1 m M - , 1 . 5 m m - , 2 m m - , 5 m m - o r 1 0 mM-DTT ( l a n e s 3 - 9 ) . I n t h er i g h t - h a n d p a n e l , s o l u b i l i z e d r e c e p t o r w a s i n c u b a t e d f i r s t w i t h DTTf o r 3 0 m i n a n d t h e n p h o s p h o r y l a t e d b y t h e s t a n d a r d p r o t o c o l , w i t h1 0 0 n M - i n s u l i n . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f DTT w e r e 0 . 5 m M , 1 m M ,1 . 5 m M , 2 m m a n d 5 mm ( l a n e s A - E ) . E x c e s s N - e t h y l m a l e i m i d e w a sa d d e d , a n d s a m p l e s w e r e s u b s e q u e n t l y a n a l y s e d a s d e s c r i b e d i n t h eM a t e r i a l s a n d m e t h o d s s e c t i o n b y n o n - r e d u c i n g SDS/PAGE o n4 %- a c r y l a m i d e g e l s .

[ D T T ]1 0 gXM

1 0 . 2 SI

5 3T a b l e 2 . E f f e c t o f r e d u c t i o n o n t h e s e d i m e n t a t i o n p r o p e r t i e s o f t u r k e ye r y t h r o c y t e r e c e p t o r k i n a s e a c t i v i t y

A s d e s c r i b e d i n F i g . 5 , t u r k e y e r y t h r o c y t e p l a s m a m e m b r a n e w a si n c u b a t e d f o r 3 0 m i n a t room t e m p e r a t u r e w i t h o r w i t h o u t 1 0 mM-D T - T . A f t e r r e m o v a l o f r e d u c t a n t , m e m b r a n e s w e r e s o l u b i l i z e d a n dv e l o c i t y - s e d i m e n t e d , a n d t h e g r a d i e n t f r a c t i o n s w e r e p h o s p h o r y l a t e da n d e l e c t r o p h o r e s e d i n a c c o r d a n c e w i t h s t a nd ar d p r o c e d u r e s . A u t o -r a d i o g r a p h i c a l l y i d e n t i f i e d p h o s p h o r y l a t e d b a n d s w e r e e x c i s e d a n dc o u n t e d f o r r a d i o a c t i v i t y t o a f i n a l c o u n t i n g e r r o r o f 1 % . I n c o r -p o r a t i o n o f [ 3 2 P ] P i i n t o r e c e p t o r m o n o m e r s a n d d i m e r s a n d i n t oh i s t o n e 2 B i s s h o w n a s a f u n c t i o n o f t h e p o s i t i o n s o f t h e p e a k s . A l s os h o w n i s t h e r a t i o o f i n s u l i n - d e p e n d e n t p h o s p h a t e i n c o r p o r a t i o ni n t o h i s t o n e r e l a t i v e t o t h a t i n t o r e c e p t o r f l - s u b u n i t . N u m b e r s s h o w na r e q u a n t i t a t i v e r e s u l t s o f o n e o f f o u r r e p r e s e n t a t i v e e x p e r i m e n t s .3 2 p i n c o r p o r a t i o n( c . p . m . )

DTT - I n s u l i n + I n s u l i n S p e c i f i c R a t i o0 MonomerH i s t o n eD i m e rH i s t o n e1 0 m M Monomer

H i s t o n eD i m e rH i s t o n e0 mM

2 61 6 71 7 98 4 03 2 17 0 12 11 6 0

1 3 63 2 11 0 8 02 0 5 07 6 8

1 9 1 12 38 6

1 1 01 5 49 0 11 2 1 04 4 7

1 2 1 0

1 . 41 . 32 . 7

10mM

6 . 6 SI 1 0 . 2 SI 6 . 6 SI350_

2 2 0 -

10-

F i g . 5 . E f f e c t o f m e m b r a n e r e d u c t i o n o n t h e s e d i m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e h o r m o n e - d e p e n d e n t k i n a s e a c t i v i t y o f t u r k e y e r y t h r o c y t e m e m b r a n e sT u r k e y e r y t h r o c y t e p l a s m a m e m b r a n e w a s i n c u b a t e d w i t h o r w i t h o u t 1 0 mM-DTT f o r 3 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e . M e m b r a n e s w e r e w a s h e d ,s o l u b i l i z e d a n d v e l o c i t y - s e d i m e n t e d a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d m e t h o d s s e c t i o n . S a m p l e s o f f r a c t i o n s w e r e i n c u ba t e d w it h i n s u l i n ,p h o s p h o r y l a t e d , e l e c t r o p h o r e s e d a n d a n a l y s e d f o r i n c o r p o r a t e d p h o s p h a t e a s d e s c r i b e d i n F i g . 1 .

V o l . 2 7 3

A &


6/8

E . R . M o r t e n s e n , J . G . D r a c h m a n a n d G . G u i d o t t i1 0 0

E~~~~~~~~~~~~~Ex~~~~~~~~~~~~E 60l0

. 4 0 .00 . rC , 2 0 - 2 /0.~~~~~~~~~~

X 12 1 1 10 9 8 7 6- l o g { [ l n s u l i n ] ( M ) }

F i g . 6 . D e p e n d e n c e o f monomer a n d d i m e r a u t o p h o s p h o r y l a t i o n a n dp h o s p h o r y l a t i o n o f h i s t o n e 2B o n t h e i n s u l i n c o n c e n t r a t i o nI s o l a t e d f r a c t i o n s o f r e c e p t o r monomer a n d d i m e r , o b t a i n e d as i nF i g . 5 , were i n c u b a t e d w i t h t h e i n d i c a t e d c o n c e n t r a t i o n s o f i n s u l i na n d p h o s p h o r y l a t e d as d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n d m e t h o d ss e c t i o n f o r 2 0 m i n . P h o s ph o r y l a t i o n w as t e r m i n a t e d b y a d d i t i o n o fexcess N - e t h y l m a l e i m i d e a n d s a m p l e b u f f e r . R e c e p t o r b a n d s w e r es e p a r a t e d b y n o n - r e d u c i n g SDS/PAGE on 4 % - a c r y l a m i d e g e l s ,i d e n t i f i e d b y a u t o r a d i o g r a p h y , e x c i s e d a n d q u a n t i f i e d . P e r c e n t a g e o fm a x i m a l h o r m o n e - d e p e n d e n t p h o s p h a t e i n c o r p o r a t i o n i s d i s p l a y e df o r a u t o p h o s p h o r y l a t i o n a n d h i s t o n e 2B p h o s p h o r y l a t i o n f o r d i m e r( 0 , * ) an d monomer ( A i , ) r e s p e c t i v e l y .

o r d e r t o i m m o b i l i z e t h e r e c e p t o r s b e f o r e exposure t o t h ep h o s p h o r y l a t i o n c o n d i t i o n s . L a n e s C a n d D o f F i g . 9 s h o w t h a tt h e i s o l a t e d r e c e p t o r d i m e r s a n d monomers, r e s p e c t i v e l y , ar ec a p a b l e o f a u t o p h o s p h o r y l a t i o n u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . L a n e Es h o w s t h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h a p a r t i a l l y r e d u c e d p r e p a r a t i o no f i n s u l i n r e c e p t o r s a d s o r b e d t o i n s u l i n - a g a r o s e . I n t h i s case t h ef r a c t i o n o f r a d i o a c t i v i t y i n r e c e p t o r monomer a n d d i m e r b a n d si s t h e same as t h a t f o r t h e r e a c t i o n i n s o l u t i o n , as i s d e m o n s t r a t e di n T a b l e 4 .We c o n c l u d e t h a t t h e i n s u l i n - r e c e p t o r monomer i s a c t i v e as ak i n a s e as t h e m o n o m e r i c s p e c i e s .DISCUSSION

T h e d a t a p r e s e n t e d h e r e s h o w t h a t , i n b o t h t u r k e y e r y t h r o c y t e sa n d r a t a d i p o c y t e s , t h e n a t i v e i n s u l i n r e c e p t o r w i t h p r o t e i nk i n a s e a c t i v i t y i s t h e ( a 4 ) 2 d i m e r . A f t e r r e d uc t i o n o f t h e d i s u l p h i d eb o n d s b e t w e e n a , 8 m o n o m e r s , t h e r e c e p t o r monomers f r o mt u r k e y e r y t h r o c y t e ( F i g . 5 a n d T a b l e 2 ) a n d r a t a d i p o c y t e ( F i g .7 - 9 a n d T a b l e 3 ) m e m b r a n e s r e t a i n most o r p a r t o f t h e k i n a s ea c t i v i t y , r e s p e c t i v e l y .T h e s i m p l e s t e x p l a n a t i o n o f t h e d a t a i s t h a t t h e a f l monomerd o e s h a v e p r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y a n d i s c o m p e t e n t f o ra u t o p h o s p h o r y l a t i o n a n d f o r p h o s p h o r y l a t i o n o f h i s t o n e s .I t h a s b e e n a r g u e d t h a t t h e a , B monomer d i m e r i z e s u n d e r t h ec o n d i t i o n s o f t h e assay f o r k i n a s e a c t i v i t y , so t h a t i n f a c t t h e( a f l ) 2 d i m e r i s t h e o n l y s p e c i e s w i t h k i n a s e a c t i v i t y ( B o n i -S c h n e t z l e r e t a l . , 1 9 8 6 ; S w e e t e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h i s s u p p o s i t i o n i su n l i k e l y f o r two reasons. I n t h e f i r s t p l a c e , t h e r e s u l t s shown i nF i g . 5 i n d i c a t e t h a t t h e m a t e r i a l a t t h e monomer p o s i t i o n on t h eg r a d i e n t h a s t h e s i z e o f t h e a 4 monomer b y SDS/PAGE( M r 2 2 0 0 0 0 ) . T h u s , i f t h e d i m e r h ad formed d u r i n g t h e p h o s -

X L 1 0 0 0 .

0m

* 1 0 0 .0

F r a c t i o n n o . .F i g . 7 . E f f e c t o f m e m b r a n e r e d u c t i o n o n t h e s e d i m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c so f r a t a d i p o c y t e p l a s m a - m e m b r a n e i n s u l i n - d e p e n d e n t k i n a s e a c t i v i t y

R a t a d i p o c y t e p l a s m a m e m b r a n e w a s i n c u b a t e d w i t h o r w i t h o u t1 0 mm-DTT f o r 3 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e . M e m b r a n e s w e r ew a s h e d , s o l u b i l i z e d , a n d v e l o c i t y - s e d i m e n t e d ; g r a d i e n t f r a c t i o n sw e r e p h o s p h o r y l a t e d , e l e c t r o p h o r e s e d a n d a n a l y s e d f o r i n c o r p o r a t e dp h o s p h a t e a s i n F i g . 3 . P a n e l ( a ) s h o w s r e c e p t o r a u t o p h o s p h o r y l a t i o nw i t h o r w i t h o u t i n s u l i n i n g r a d i e n t f r a c t i o n s a r o u n d 1 0 . 2 S ( 3 5 0 kDad i m e r ) i n t h e a bs e n c e o f r e d u c t i o n a n d 6 . 6 S ( 2 2 0 kDa m o n o m e r )a f t e r m e m b r a n e r e d u c t i o n . P a n e l s ( b ) a n d ( c ) s h o w h i s t o n e 2 Bk i n a s e a c t i v i t y a c r o s s t h e g r a d i e n t w i t h u n r e d u c e d a n d r e d u c e dm e m b r a n e s r e s p e c t i v e l y . P a n e l ( a ) s h o w s c o u n t s i n c o r p o r a t e d b ya u t o p h o s p h o r y l a t i o n i n t o r e c e p t o r b a n d s i d e n t i f i e d a u t o r a d i o -g r a p h i c a l l y a f t e r SDS/PAGE. B a n d s c o r r e s p o n d i n g t o t h e Mr o f t h er e c e p t o r d i m e r w e r e s e e n o n l y i n t h e a b s e n c e o f DTT a n d e x h i b i t e da n a p p a r e n t s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t o f 1 0 . 2 S . L i k e w i s e , t h o s eb a n d s i d e n t i f i e d a t t h e Mr o f t h e m o n o mer w e r e s e e n o n l y w h e nm e m b r a n e w a s t r e a t e d w i t h 1 0 mM-DTT a n d o n l y a t t h e p o s i t i o n o f6 . 6 S w i t h i n t h e g r a d i e n t . S h o w n a r e c o u n t s i n c o r p o r a t e d i n t o d i m e r( 0 , 0 ) a n d monomer ( A , A ) b a n d s i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f1 0 0 n M - i n s u l i n r e s p e c t i v e l y . P a n e l ( b ) s h o w s t h e a b i l i t y o f g r a d i e n tf r a c t i o n s f r o m u n r e d u c e d m e m b r a n e t o p h o s p h o r y l a t e h i s t o n e 2 B i nt h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 0 0 n M - i n s u l i n ( E l , * ) . P a n e l ( c ) s h o w st h e h i s t o n e k i n a s e a c t i v i t y o f g r a d i e n t f r a c t i o n s o f v e l o c i t y -s e d i m e n t e d s o l u b i l i z e d m e m b r a n e , p r e v i o u s l y r e d u c e d b y 1 0 m M-D T T , i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f 1 0 0 n M - i n s u l i n ( V , V ) .p h o r y l a t i o n r e a c t i o n , t h e a s s o c i a t i o n b y n o n - c o v a l e n t i n t e r -a c t i o n s was n o t f o l l o w e d b y f o r m a t i o n o f d i s u l p h i d e b o n d s a n ds t a b i l i z a t i o n o f t h e d i m e r . F u r t h e r m o r e , t h e r e s u l t s shown i n F i g .

1 9 9 1

5 4


7/8

T y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y o f t h e i n s u l i n r e c e p t o r a , m o n o merT a b l e 3 . E f f e c t o f r e d u c t i o n o n t h e s e d i m e n t a t i o n p r o p e r t i e s o f r a ta d i p o c y t e r e c e p t o r k i n a s e a c t i v i t y

A s d e s c r i b e d i n F i g . 7 , r a t a d i p o c y t e p l a s m a m e m b r a n e s w e r ei n c u b a t e d f o r 3 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h o r w i t h o u t 1 0 m m -D T T . A f t e r r e m o v a l o f r e d u c t a n t , m e m b r a n e s w e r e s o l u b i l i z e d a n dv e l o c i t y - s e d i m e n t e d , a n d t h e g r a d i e n t f r a c t i o n s w e r e p h o s p h o r y l a t e da n d e l e c t r o p h o r e s e d i n a c c o r d a n c e w i th s t a nd a rd p r o c e d u r e s . I d e n t i -f i c a t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d r e c e p t o r a n d h i s t o n e b a n d s a n dq u a n t i f i c a t i o n o f i n c o r p o r a t e d r a d i o a c t i v e p h o s p h a t e w e r e a c c o m -p l i s h e d a s i n T a b l e 2 . A l s o s h o w n i s t h e r a t i o o f i n s u l i n - d e p e n d e n tp h o s p h a t e i n c o r p o r a t i o n i n t o h i s t o n e r e l a t i v e t o t h a t i n t o r e c e p t o rf l - s u b u n i t , f o r a r e p r e s e n t a t i v e r e s u l t o f t r i p l i c a t e e x p e r i m e n t s .

R a d i o a c t i v i t y ( c . p . m . / p e a k )DTT - I n s u l i n + I n s u l i n S p e c i f i c R a t i o0 R e c e p t o r d i m e rR e c e p t o rH i s t o n e1 0 m m R e c e p t o r m o n o merR e c e p t o rH i s t o n e

6 7 3 7 6 3 0 97 2 5 1 0 2 0 1 9 4 7 65 9 8 0 2 18 2 6 1 3 2 8 5 0 2

3 0 . 7

A BX 2 1 ) , 2 AR

. . a . .X 2 P k w

C D E0 4 X

. _ ' _

F i g . 9 . E f f e c t o f d i l u t i o n o n p h o s p h o r y l a t i o n o f p a r t i a l l y r e d u c e d s o l u b i l i z e dr e c e p t o r sR a t a d i p o c y t e p l a s m a - m e m b r a n e r e c e p t o r s i s o l a t e d b y e l u t i o nf r o m WGA w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 mM-DTT f o r 2 0 m i n a n d s u b -s e q u e n t l y i n cu ba t e d w it h o r w i t h o u t 1 0 0 n M - i n s u l i n f o r 2 0 m i n .P h o s p h o r y l a t i o n w a s i n i t i a t e d a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n dm e t h o d s s e c t i o n a n d e f f e c t e d f o r 3 m i n a t w h i c h t i m e i t w a st e r m i n a t e d b y a d d i t i o n o f N - e t h y l m a l e i m i d e a n d s a m p l e b u f f e r .L a n e s A a n d B s h o w c o n t r o l a n d i n s u l i n - s t i m u l a t e d p h o s p h o r y l a t i o nr e s p e c t i v e l y . L a n e s C , D a n d E r e p r e s e n t 3 m i n p h o sp h o r y la t i o ns o fr a t a d i p o c y t e i n s u l i n - r e c e p t o r d i m e r s a n d m o n o m e r s ( p r e p a r e d a s i nF i g . 3 f o r t u r k e y e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s ) a n d p a r t i a l l y r e d u c e d( 1 m M - D T T ) W G A - p u r i f i e d r a t a d i p o c y t e i n s u l i n r e c e p t o r ( p r e p a r e da s i n l a n e s A a n d B ) r e s p e c t i v e l y . S a m p l e s w e r e b o u n d t o i m m o b i l i z e di n s u l i n a n d p h o s p h o r y l a t e d a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l s a n dm e t h o d s s e c t i o n .

2 3 . 5T a b l e 4 . E f f e c t o f d i l u t i o n o n p h o s p h o r y l a t i o n o f p a r t i a l l y r e d u c e ds o l u b i l i z e d r e c e p t o r6 . 6 S

A XIl,NI"I

B

F i g . 8 . E f f e c t o f p h o s p h o r y l a t i o n , i n s u l i n a n d M g 2 " o n t h e s e d i m e n t a t i o nc o e f f i c i e n t o f i n s u l i n - r e c e p t o r - m o n o m e r k i n a s e a c t i v i t yR a t a d i p o c y t e p l a s m a m e m b r a n e s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 0 mM-DTTf o r 3 0 m i n b e f o r e s o l u b i l i z a t i o n o f r e c e p t o r s a n d s u c r o s e - g r a d i e n tv e l o c i t y s e d i m e n t a t i o n a n d f r a c t i o n a t i o n o f t h e g r a d i e n t s . F r a c t i o n ss u r r o u n d i n g t h e 6 . 6 S p e a k w e r e p o o l e d . P a n e l A s h o w s t h e r e s u l t o fp h o s p h o r y l a t i n g t h e monomer p o o l b e f o r e r e p e a t e d s u c r o s e - g r a d i e n tv e l o c i t y s e d i m e n t a t i o n . F r a c t i o n s s p a n n i n g t h e e x p e c t e d p o s i t i o n o fr e c e p t o r m o n o m e r s a n d d i m e r s w e r e s ub mi t t e d t o r e d u c i n gS D S / P A G E . P a n e l s B a n d C s h o w t h e r e s u l t o f i n c u b a t i n g p o o l e dmonomer w i t h 1 0 m M - M g C l 2 , 2 m M - M n C l 2 , w i t h o r w i t h o u t 1 5 0 n m -i n s u l i n r e s p e c t i v e l y . S a m p l e s w e r e t h e n v e l o c i t y - s e d i m e n t e d o ng r a d i e n t s c o n t a i n i n g a n e q u a l a m o u n t o f m e t a l o r m e t a l a n d h o r m o n er e s p e c t i v e l y . F r a c t i o n s s p a n n i n g t h e r e g i o n 6 . 6 - 1 0 . 2 S w e r e t h e np h o s p h o r y l a t e d b y t h e s t a n d a r d p r o t o c o l a n d e v a l u a t e d b y r e d u c i n gS D S / P A G E . I n d i c a t e d s e d i m e n t a t i o n v a l u e s a r e e s t i m a t e d f r o mm a r k e r e n z y m e p e a k p o s i t i o n s . A l l t h r e e p a n e l s s h o w t h e p o r t i o n o ft h e g e l s c o r r e s p o n d i n g t o t h e Mr o f r e d u c e d , # s u b u n i t , w h i c hr e p r e s e n t e d t h e o n l y b a n d o f i n s u l i n - s t i m u l a t e d p h o s p h o r y l a t i o n .

8 i n d i c a t e t h a t an y n o n - c o v a l e n t d i m e r i z a t i o n a s s o c i a t e d w i t he i t h e r p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e r e c e p t o r monomer o r t h e b i n d i n go f i n s u l i n t o t h e r e c e p t o r monomer i s n o t s t a b l e e n o u g h t o a l t e rt h e s e d i m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e r e c e p t o r . I n t h e s e c o n dp l a c e , t h e r e i s no e f f e c t o f d i l u t i o n o f t h e r e c e p t o r monomer ont h e k i na s e a c t i v i t y o f t h e monomer p e a k , as i s shown i n T a b l e s2 a n d 4 ; t h i s r e s u l t argues a g a i n s t t h e e x i s t e n c e o f n o n - c o v a l e n t l ya s s o c i a t e d monomers.

S a m p l e s ( 2 5 m l ) o f W G A - p u r i f i e d r e c e p t o r p a r t i a l l y r e d u c e d i n0 . 1 0 0 T r i t o n X - 1 0 0 s o l u t i o n a s i n l a n e s A a n d B o f F i g . 9 w e r e o rw e r e n o t d i l u t e d t o 1 0 t i m e s t h e i r o r i g i n a l v o l u m e , i n c ub a te d w i th1 0 0 n M - i n s u l i n a n d p h o s p h o r y l a t e d a s b e f o r e f o r 1 o r 3 m i n a si n d i c a t e d . P h o s p h o r y l a t e d r e c e p t o r b a n d s w e r e e x c i s e d a n d c o u n t e df o r r a d i o a c t i v i t y . S h o w n i n t h e f i r s t f o u r c o l u m n s a r e t h e t o t a lr a d i o a c t i v i t y ( c . p . m . , S . D . + I % ) a n d t h e r a t i o o f c o u n t s i n c o r p o r a t e di n t o m o n o m e r s a n d d i m e r s a s a f u n c t i o n o f t i me a n d d i l u t i o n .C o l u m n 5 s h o w s t h o s e c o u n t s i n c o r p o r a t e d i n t o r e c e p t o r b a n d sw h e n p a r t i a l l y r e d u c e d r e c e p t o r w a s p r e - b o u n d t o i n s u l i n - a g a r o s ea n d t h e n p h o s p h o r y l a t e d o n t h e i m m o b i l i z i n g s u p p o r t f o r 3 m i n .S h o w n i s a r e p r e s e n t a t i v e s e t o f r e s u l t s f r o m t h r e e e x p e r i m e n t s .R a d i o a c t i v i t y ( c . p . m . / b a n d )

3 m i n ,1 m i n , 3 m i n , i n s u l i n -1 m i n d i l u t e 3 m i n d i l u t e a g a r o s eMonomer 4 4 1 2 9 1 4 3 2 4 2 2 8D i m e r 1 2 6 3 0 2 3 3 8 5 7 2 6 1R a t i o 0 . 3 4 7 0 . 4 2 6 0 . 4 2 5 0 . 4 2 5 0 . 4 7 5

T h e e v i d e n c e t h a t t h e monomers, a t t h e c o n c e n t r a t i o n s u s e di n t h e s e e x p e r i m e n t s , d o n o t f o r m d i m e r s t h a t ar e d e t e c t a b l e b ys u c r o s e - d e n s i t y - g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n a n d ar e n o t a f f e c t e d b yd i l u t i o n i n t h e i r k i n a s e a c t i v i t y i s a s t r o n g argument t h a t t h emonomers t h e m s e l v e s possess p r ot e in k i n as e a c t i v i t y .T h e r e s u l t t h a t c o v a l e n t a s s o c i a t i o n o f monomers b y C l a s s Id i s u l p h i d e s i s n o t necessary f o r i n s u l i n s t i m u l a t i o n o f t h e k i n a s ea c t i v i t y h a s b e e n d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( S h i a e t a l . , 1 9 8 3 ; F u j i t a -Y a m a g u c h i & K a t h u r i a , 1 9 8 5 ; P i k e e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e p r e s e n tw o r k s h o ws , h o we v e r , t h a t t h e monomer b y i t s e l f h a s t h ec a p a c i t y t o b i n d i n s u l i n on t h e a c h a i n a n d t r a n s d u c e t h e e f f e c tt o t h e k i n a s e on t h e c h a i n , p r e s u m a b l y t h r o u g h t h e s i n g l et r a n s - m e m b r a n e s t r a n d ( U l l r i c h e t a l . , 1 9 8 5 ) .T h e s e r e s u l t s ar e i n a g r e e m e n t w i t h t h o s e o b t a i n e d b y t h eR o s e n group ( H e r r e r a e t a l . , 1 9 8 8 ; V i l l a l b a e t a l . , 1 9 8 9 ) w i t h t h ec y t o p l a s m i c domain o f t h e human i n s u l i n - r e c e p t o r s u b u n i t ; t h el a t t e r p r o t e i n i s a monomer, a n d i t s a u t o p h o s p h o r y l a t i o n i si n d e p e n d e n t o f p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n .

V o l . 2 7 3

1 0 . 2 S

5 5


8/8

E . R . M o r t e n s e n , J . G . D r a c h m a n a n d G . G u i d o t t iT h e r e r e m a i n s t h e q u e s t i o n o f t h e l a c k o f t y r o s i n e k i n a s ea c t i v i t y o f t h e monomers p r e s e n t i n t u r k e y e r y t h r o c y t em e m b r a n e s b e f o r e r e d u c t i o n . O b v i o u s l y , t h e s e s p e c i e s a r ed i f f e r e n t f r o m t h e monomers p r o d uc e d b y r e d u c t i o n o f d i m e r s ,b e c a u s e t h e y l a c k k i n a s e a c t i v i t y . T h e r e a r e s e v e r a l i n t e r p r e t a t i o n so f t h i s f i n d i n g . One i s t h a t n a t i v e monomers d o l a c k k i n a s ea c t i v i t y ; t h e m o n o m e r s d e sc r i b ed h e r e w i t h k i n a s e a c t i v i t y w o u l dr e p r e s e n t p a r t i a l l y d e n a t u r e d ( m a n i p u l a t e d ) s p e c i e s w h o s ep r o p e r t i e s a r e u n r e l a t e d t o t h o s e o f n a t i v e r e c e p t o r m o n o m e r s .A n o t h e r p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e n a t u r a l l y o c c u r r i n g a , / monomersh a v e b e e n a l t e r e d e i t h e r b y p r o t e o l y s i s ( R o t h e t a l . , 1 9 8 3 ;M a s s a g u e e t a l . , 1 9 8 1 ) o r b y d i s u l p h i d e - b o n d r e a r r a n g e m e n t( S h i a e t a l . , 1 9 8 3 ) a n d h a v e l o s t k i n a s e a c t i v i t y ; t h e monomersw i t h k i n a s e a c t i v i t y d e s c r i b e d i n t h e p r e s e n t work w o u l d t h e nr e p r e s e n t t h e t r u e s t a t e o f n a t i v e r e c e p t o r m o n o m e r s . On e c a n n o td i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e s e p o s s i b i l i t i e s .I n a n y e v e n t , t h e a , 4 m o n o m e r , o b t a i n e d b y r e d u c t i o n o fd i m e r s i n t h e m e m b r a n e , i s a c t i v e i n i n s u l i n b i n d i n g a n d i n s u l i n -d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y .We t h a n k G o n u l V e l i c e l e b i a n d Ken C h i a c c h i a f o r g e n e r o u s l yc o m m u n i c a t i n g d a t a on t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f r a t l i v e r p l a s m a -m e m b r a n e r e c e p t o r a n d on t h e b i n d i n g o f i n s u l i n t o s o l u b i l i z e d r e c e p t o r

m o n o m e r s a n d d i m e r s , r e s p e c t i v e l y , a n d t h e r e s t o f t h e G u i d o t t i a n dC a n t l e y g r o u p s f o r t h e i r u s e f u l c r i t i c i s m . I n a d d i t i o n w e s i n c e r e l y t h a n kt h e o w n e r s a n d s t a f f o f R a y m o n d ' s T u r k e y F ar m , M e t h u e n , MA,U . S . A . , f o r t h e i r c o - o p e r a t i o n a n d a s s i s t a n c e i n o b t a i n i n g m a t e r i a l s . T h i sw o r k w a s s u p p o r t e d b y G r a n t AM 2 7 6 2 6 f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e so f H e a l t h t o G . G . , H a r v a r d U n i v e r s i t y . E . R . M. w a s p a r t i a l l y s u p p o r t e db y a t r a i n i n g g r a n t f r o m t h e M r s . M a r i l y n P . S i m p s o n T r u s t o f t h eR o c k e f e l l e r F o u n d a t i o n .

REFERENCESA i y e r , R . A . ( 1 9 8 3 a ) J . B i o l . C h e m . 2 5 8 , 1 4 9 9 2 - 1 4 9 9 9A i y e r , R . A . ( 1 9 8 3 b ) J . B i o l . C h e m . 2 5 8 , 1 5 0 0 0 - 1 5 0 0 3B o n i - S c h n e t z l e r , M . , R u b i n , J . B . & P i l c h , P . F . ( 1 9 8 6 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 1 ,1 5 2 8 1 - 1 5 2 8 7B o n i - S c h n e t z l e r , M . , K a l i j i a n , A . , D e l V e c c h i o , R . & P i l c h P . F . ( 1 9 8 8 )

J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 6 8 2 2 - 6 8 2 8C u s h m a n , S . W. & W a r d z a l a , L . J . ( 1 9 8 0 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 5 , 4 7 5 8 - 4 7 6 2C z e c h , M. P . , M a s s a g u e , J . & P i l c h , P . F . ( 1 9 8 1 ) T r e n d s B i o c h e m . S c i . 6 ,2 2 2 - 2 2 5F u j i t a - Y a m a g u c h i , Y . & K a t h u r i a , S . ( 1 9 8 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .U . S . A . 8 2 , 6 0 9 5 - 6 0 9 9

F u j i t a - Y a m a g u c h i , Y . , C h o i , S . , S a k a m o t o , Y . & I t a k u z a , K . ( 1 9 8 3 )J . B i o l . C h e m . 2 5 8 , 5 0 4 5 - 5 0 4 9G i n s b e r g , B . H . , K a h n , C . R . & R o t h , J . ( 1 9 7 6 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a4 4 3 , 2 2 7 - 2 4 2H e d o , J . A . , K a h n , C . R . , H ay a sh i , M . , Y a m a d a , K . K . M. & K a s u g a ,M. ( 1 9 8 3 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 8 , 1 0 0 2 0 - 1 0 0 2 6H e r r e r a , R . , L e b w o h l , D . , G a r c i a d e H e r r e r o s , A . , K a l l e n , R . G . &R o s e n , 0 . M. ( 1 9 8 8 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 5 5 6 0 - 5 5 6 8J a c o b s , S . , S a h y o u n , N . E . , S a l t i e l , A . R . & C u a t r e c a s a s , P . ( 1 9 8 3 ) P r o c .N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 0 , 6 2 1 1 - 6 2 1 3K a s u g a , M . , K a r l s s o n , F . A . & K a h n , C . R . ( 1 9 8 2 a ) S c i e n c e 2 1 5 , 1 8 5 - 1 8 7K a s u g a , M . , Z i c k , Y . , B l i t h e , D . L . , K a r l s s o n , F . A . , H a r i n g , H . U . &K a h n , C . R . ( 1 9 8 2 b ) J . B i o l . C h e m . 2 5 6 , 9 8 9 1 - 9 8 9 4K a s u g a , M . , F u j i t a - Y a m a g u c h i , Y . , B l i t h e , D . L . & K a h n , C . R . ( 1 9 8 3 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 0 , 2 1 3 7 - 2 1 4 1K o h a n s k i , R . A . , F r o s t , S . C . & L a n e , M. D . ( 1 9 8 6 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 1 ,1 2 2 7 2 - 1 2 2 8 1L a e m m l i , U . K . ( 1 9 7 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 2 7 , 6 8 0 - 6 8 5M a s s a g u e , J . & C z e c h , M . P . ( 1 9 8 2 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 7 , 6 7 2 9 - 6 7 3 8M a s s a g u e , J . , P i l c h , P . F . & C z e c h , M. P . ( 1 9 8 1 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 6 ,3 1 8 2 - 3 1 9 0M c K e e l , D . W. & J a r r e t t , L . ( 1 9 7 0 ) J . C e l l B i o l . 4 4 , 4 1 7 - 4 3 2M o r r i s o n , B . D . , S w a n s o n , M . L . , S w e e t , L . J . & P e s s i n , J . E . ( 1 9 8 8 )J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 7 8 0 6 - 7 8 1 3P i k e , L . J . , E a k e s , A . T . & K r e b s , E . G . ( 1 9 8 6 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 1 ,3 7 8 2 - 3 7 8 9P i l c h , P . F . & C z e c h , M . P . ( 1 9 7 9 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 4 , 3 3 7 5 - 3 3 8 1R o s e n , 0 . M . , H e r r e r a , R . , O l o w e , Y . , P e t r u z e l l i , L . M. & C o b b , M. H .( 1 9 8 3 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 0 , 3 2 3 7 - 3 2 4 0R o t h , R . A . & C a s s e l l , D . J . ( 1 9 8 3 ) S c i e n c e 2 1 9 , 2 9 9 - 3 0 1R o t h , R . A . , M e s i r o w , M. L . & C a s s e l l , D . J . ( 1 9 8 3 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 8 ,1 4 4 5 6 - 1 4 4 6 0S c h l e s s i n g e r , J . ( 1 9 8 8 ) T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 3 , 4 4 3 - 4 4 7S h i a , M. A . & P i l c h , P . F . ( 1 9 8 3 ) B i o c h e m i s t r y 2 2 , 7 1 7 - 7 2 1S h i a , M. A . , R u b i n , J . B . & P i l c h , P . F . ( 1 9 8 3 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 8 ,1 4 4 5 0 - 1 4 4 5 5S w e e t , L . J . , W i l d e n , P . A . & P e s s i n , J . E . ( 1 9 8 6 ) B i o c h e m i s t r y 2 5 ,7 0 6 8 - 7 0 7 4S w e e t , L . J . , M o r r i s o n , B . D . , W i l d e n , P . A . & P e s s i n , J . E . ( 1 9 8 7 ) J . B i o l .C h e m . 2 6 2 , 1 6 7 3 0 - 1 6 7 3 8U l l r i c h , A . & S c h l e s s i n g e r , J . ( 1 9 9 0 ) C e l l 6 1 , 2 0 3 - 2 1 2U l l r i c h , A . , B e l l , J . R . , C h e n , E . Y . , H e r r e r a , R . , P e t r u z e l l i , L . M . , D u l l ,T . J . , G r a y , A . , C o u s s e n s , L . , L i a o , Y . C . , T s u b o k a w a , M . , M a s o n , A . ,S e e b u r g , P . H . , G r u n f e l d , C . , R o s e n , 0 . M. & R a m a c h a n d r a n , J . ( 1 9 8 5 )

N a t u r e ( L o n d o n ) 3 1 3 , 7 5 6 - 7 6 1V i l l a l b a , M . , W e nt e , S . R . , R u s s e l , D . S . , A h n , J . , R e i c h e l d e r f e r , C . F . &R o s e n , 0 . M. ( 1 9 8 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 8 6 , 7 8 4 8 - 7 8 5 2W h i t e , M. F . , H a r i n g , H . U . , K a s u g a , M. & K a h n , C . R . ( 1 9 8 4 ) J . B i o l .C h e m . 2 5 9 , 2 5 5 - 2 6 4Y u , K . T . & C z e c h , M . P . ( 1 9 8 4 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 5 2 7 7 - 5 2 8 6R e c e i v e d 9 M a r c h 1 9 9 0 / 2 3 J u l y 1 9 90 ; a c c e pt e d 3 0 J u l y 1 9 9 0

1 9 9 1

5 6

Insulin Dimers

Documents

Transcript of Insulin Dimers