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Einführung in dieElektronenmikroskopie
Instrumentation
ZMB / Uni Zürich 2007
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:-)• Auflösung makromolekularer
Strukturen
• Darstellung feinstrukturellerZusammenhänge
• Lokalisation von Einzelmole-külen im Kontext (Korrelationvon Struktur & Funktion )
Vor-& Nachteile derElektronenmikroskopie
:-(
• Teuer
• Platzbedarf
• Zusatzgeräte
• aufwändige Präparation
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LM - Darstellung auf Zellebene
Das CytosklettnachFluoreszenz-markierung.
-> DasFilament-geflecht ist guterkennbar imLichtmikroskop.
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EM: Darstellung auf makromolekularer Ebene
Extracted, CPD, Pt, SEM FD, Pt, SEM
Cytosklett nachExtraktion.
-> Die Cytosklett-Filamente sindeinzeln in ihrerFeinstrukturerkennbar (hierSEM).
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EM-Lokalisation von Proteinen
TEM Replica Sample of Actin Leading Edge.
Immunogold-Lokalisationvon Aktin-ver-netzendenProteinen.
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Auflösungsvermögen im Vergleich
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Wellenlängen im Vergleich
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Vergleich Licht- & Elektronenmikroskopie
ELEKTRONEN
° ! = 0,04-0,004 nm (1-100 kV)
• Auflösung bis 0,1 nm
• Vergrösserung bis 1 000 000 x
• TEM & SEM
• Hochvakuum
LICHT
• ! = 400-700 nm
• Auflösung bis 200 nm
• Vergrösserung bis 1 000 x
• Durchlicht & Auflicht-LM
• Proben sind wasserhaltig
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Vergleich der StrahlengängeTEM REM
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Elektronenoptik
• Hochvakuum (~10-7 torr)
• Elektronenquelle (Wolfram-Draht, Feldemission)
• Elektromagnetische Linsen (stromdurchflossene Drahtspulen)
• Blenden
• Detektoren (Szintillator, div.)
gemeinsame Elemente von TEM & REM
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Elektronenstrahlerzeugung
Thermische Kathode Feldemmisionskathode
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Elektromagnetische Linsen
Elektromagnetische Linsen verhalten sich weitgehend wie licht-optische
Linsen. Sie bestehen aus stromdurchflossenen Spulen. In Abhängigkeit
von Linsenstrom und Zahl der Windungen entsteht ein Magnetfeld, das
die Flugbahn der Elektronen beeinflusst -> Beschleunigung tangential
zur Spulenwindung. Das Magnetfeld bestimmt die Brechkraft der Linse.
Elektromagnetische Linsen sind in ihrer Brechkraft variabel.
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Axialer Astigmatismus
Der axiale Astigmatismus ist der bestimmendeLinsenfehler in der biologisch/medizinischen EM.
Aufgrund von leichten Unsymmetrien oder Material-inhomogenitäten im Linsenaufbau sowie aufgrund vonKontaminationen optischer Elemente kommt es zurelliptischen Verformung des Magnetfeldes der Linse.
Kompensation durch Stigmatoren-Paar, das ein vari-ables elliptisches Kompensationsfeld erzeugt.
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WechselwirkungElektron Materie
ungestreute Elektronen
elastische Streuung - geänderte Bewegungsrichtung, gleichbleibende Energie (E°)
inelastische Streuung - geändere Bewegungsrichtung, verminderte Energie (E°- ! E)
ungestreute Elektronen bleiben in Richtung und Energie unverändert (E°)
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Elektronen in der Probe
K
L
M
N
Schalenmodell des Atoms.
Elektronen aus einer Schale könnenin die nächste übertreten. Dabei wirdStrahlung frei.
Beim inelastischen Zusammen-stoss von Strahlelektron undProbenatom wird Energie !Eauf das Probenelektron übertrag-en und dieses aus seiner Schaleherausgeschleudert. Innerhalb desAtoms kann es daraufhin zu Scha-lenwechseln kommen.
1
2
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StrahlenschadenDurch den Energieeintrag bei inelast-ischen Streuungen kommt es zu Ver-änderungen intra-& intermokekularerBindungen, Ionisationen, Masseverlustund Objekterhitzung.
Zusätzlich kann er zum Aufbacken vonKontaminationsschichten im Strahl führ-en, die das Bild verdunkeln.
-> Detailverlust !!
daher:
• Minimale Strahlendosis durch geeig- nete Beleuchtung.
• Fokussieren und korrigieren vor Bildauf- nahme an anderer Probenstelle.
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Probe Interaktionsvolumen
Primärelektronen (Strahl)Primärelektronen (Strahl)
Ungestreute ElektronenUngestreute Elektronen
Elastisch gestreute ElektronenElastisch gestreute Elektronen
Inelastisch gestreute Elektronen
TE
M
RE
M
SekundärelektronenSekundärelektronenRückstreuelektronenRückstreuelektronen
Auger-ElektronenWärme
KathodoluminisenzRöntgenstrahlen
Signale durch Elektronenbeschuss
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TEM
vacuum
vacuum specimen support
REM
vacuum
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Vergleich TEM vs. REM
pseudo
pod
plasma
membran
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Das Transmissionselektronenmikroskop
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Elektronenoptik im TEM
Strahlquelle - Elektronenwerden emittiert und be-schleunigt.
Kondensor - optimiert die„Beleuchtung“.
Objektiv - ist die eigent-liche abbildende Linse.
Projektive - bis zu 4Linsen zur mehrstufigenNachvergrösserung desZwischenbildes.
Objektivblende - ist dasKontrast-gebende Ele-ment.
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Strahlengang in LM und TEMLM - Fokussierendurch Verstellen desAbstandes zwischenObjektiv und Probe.Die optischen Eigen-schaften der Glaslinsesind fix.
TEM - Fokussierendurch Verstellen derBrennweite derelektromagnetischenObjektivlinse. Der Ab-stand zwischen Linseund Probe ist fix.
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Bildprojektion im TEM
Die durch die Probehindurch gestrahltenElektronen werd-en auf einen Leucht-schirm projiziert.-> Eine Platte istphosphoreszierendbeschichtet: trifft einElektron auf die Patte,so wird sie an dieserStelle zum leuchtenangeregt. DiesesLeuchten kann nundirekt, oder durch einVergrösserungsglas,betrachtet werden.
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TEM - Proben
3 mm
Grids aus Kupfer, Gold, Nickel mit ver-schiedener Maschenzahl und Maschenweite.Oftmals noch mit einem transluzenten Träger-film versehen. Die Netzchen dienen als Trägerder dünnen Probe z.B. Einzelpartikel, Ultra-dünnschnitte.
Ein Ultradünnschnitthat eine Fläche ~ 0,5x 0,4 mm und ist 30 -100 nm dick. 0,00001 mm3.
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Kontrastentstehung im TEM
Die im grossen Winkelgestreuten Elektronen werdendurch die Kontrastblende ausdem Strahlengang entfernt(ausgeblendet) und tragennicht mehr zum Bild bei.
Stellen in der Probe, dieaufgrund höherer Dichte oderdem Vorkommen schwererElemente (z.B. Metalle) stärk-er streuen, erscheinen daherim Bild dunkler.(Dichte/Dicke-Kontrast,Materialkontrast)Die Objektivblende als
kontrastgebendes Element.
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Beispiele für EM in Biologie/Medizin
Immunogoldmarkierung eines Peptidhormons an Herzmuskelzelle
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Beispiele für EM in Biologie/Medizin
mit Blei und Uran nachkontrastierte Probe
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BeugungsbilderZwischenlinsefokussiert aufBildebene derObjektivlinse
Zwischenlinsefokussiert auf
Brennebene derObjektivlinse
Anhand von Beugungsbildern lassen sich Aus-sagen über die kristalline Struktur von Probenmachen - z.B. über die Abstände und Orientier-ungen im Kristallgitter oder über Kristalldefekte.
Je nachdem, ob die Zwischenlinsen auf die Bild-ebene oder die Brennebene der Objektivlinsefokussiert werden, wird das Durchstrahlungsbildoder das Beugungsbild der Probe vergrössert.
Be
ug
un
gsb
ild
Ab
bild
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Elektronen Tomographie
Selbst relativdünne durch-strahlbare TEM-Proben habeneine räumlicheDimension.
TEM Bilder sind2D-Projektioneneiner 3D-Probe.
Durch Projektionen ver-schiedener Ansichten lässtsich die 3D-Struktur rekon-struieren.
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Elektronen Tomographie
• Semi-dünne Schnitte(250 nm)
• Aufnahme einerBildserie unterverschiedenenWinkeln (z.B.jedes 1° zwischen-70 und +70°)
• Bildverarbeitung(Alignment,Rekonstruktion)
Image width
Features insidefield of view
Features outsidefield of view
Images
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Elektronen Tomographie
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tilt series
Tecnai 200kV FE-TEM STEM mode
Elektronen Tomographie
(raw data)
virtual sectioning (reconstruction)
(C
hri
stia
n K
üb
el, F
EI
Ein
dh
ove
n)
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Image processing, 3D-modeling
Elektronen Tomographie
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Das Rasterelektronenmikroskop
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REM-ProbenkammerRasterelektronenmikros-kopische Proben könnensehr gross sein.Entsprechend gross istauch die Probenkammer.
Die Probenbühne ist in5 Achsen frei verfahrbar:X - Y - Z - T - R
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Elektronenoptik im REM
Die Linsen dienen der Kon-ditionierung des Elektronen-strahls. Es gibt keine ab-bildende Linse im SEM.
Kathode als Strahlquelle(z.B. Feldemissionskathode)
Die Probe wird von einem stakt gebündelten Elektronenstrahlabgetastet. Die entstehenden Signale werden von verschieden-en Detektoren gemessen.
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Abtasten der Probenoberfläche
Der Primärelektronenstrahl wird Punkt für Punkt über die Probe geführt. An jedemPunkt wird die Signalintensität gemessen. Die Messwerte werden in Graustufenübersetzt und im Rechner zu einer Bildmatrix zusammengesetzt -> ein Bild wirdgeneriert.
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Abtasten der Probenoberfläche
Elektromagnetische Linsen formen den Elektronenstahl zu einem eng fokussierten Bün-del. Ablenkspulen lenken den den Strahl in x- und y-Richtung ab. Ein Rastergeneratorsteuert die Ablenkung so, dass der Strahl Punkt für Punkt und Zeile für Zeile über dieProbe geführt wird. Die Signalintensität wird in jedem Punkt gemessen und als Hellig-keitswert auf dem Bildschirm „zeitgleich“ mittels Rastergenerator dargestellt.
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Durch zoomen werden die Messpunkte näher zueinander gelegt -> ein kleineres Feldder Probe wird vom Primärstrahl feiner abgerastert, das dabei entstehende Bild hatdie gleiche Anzahl Bildpunkte. Strukturen erscheinen grösser und Details werdensichtbar.
Vergrösserung durch Zoom
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Interaktion Elektronenstrahl - Probe
Elektronendiffusionshof an der Oberflächedicker Proben. Der Stahl kann über 10 µmtief in die Probe eindringen.
Simulation
Jedoch nur aus oberflächen-nahen Schichten könnenSignale (Elektronen, Strahl-ung) die Probe verlassen.
Eindringtiefe des Primärstrahls
Austrittstiefe
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Interaktionsvolumen der Primärelektronen
Während durch dünne Proben der Elektronenstrahlhindurchtritt, bleibt er in der dicken Probe stecken undbreitet sich aus.
TEM REM
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Aufladungsphänomene in REMKann die Ladungszufuhr durch den Primärelektronenstrahl nicht via Probenhalteroder Probenoberfläche abgeleitet werden kommt es zu Aufladungen der Probe,diese können sich z.B. in Ladungswolken oder Verzerrungen äussern. Im Extremfallbewegen sich Probenteile im Strahl oder fliegen ganz weg.
Minimieren von Aufladungsphänomenen z.B. durch geeignete Probenpräparation,Reduktion von Beschleunigungsspannung bzw. Strahlstrom, Variation des Kammervakuums.
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Simulationen verschiedener Eindringtiefen des Primärelektronen-strahls. Die Grösse und Form des Interaktionsvolumens hängt vonvon verschiedenen Faktoren ab: Eintrittswinkel und Energie derPrimärelektronen, Ordnungszahl oberflächlicher Probenatome.
Simulation der Interaktionsvolumen
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Parameter des Interaktionsvolumens
Die Eindringtiefeist bei Materialienniedriger Ordungs-zahl grösser.
Die Eindringtiefedes Primärelek-tronenstrahlsnimmt mit derSpannung zu.
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Beispiel SignaltiefeJe nach Wahl der Beschleu-nigungsspannung derPrimärelektronen ist dieSignaltiefe verschieden.
SE
SE
18 kV
6 kV
Bei kleinen Beschleuni-ungsspannungen stammendie Signale unmittelbar vonder Probenoberfläche.
Bei höheren Spannungenkommt die Information ausgrösseren Tiefen der Probe.
Verschiedene Materialienliefern unterschiedlicheSignalausbeuten.
Zellen auf Mikrochip. Pt-coated.
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Signalentstehung im REM
Primärelektronen desStrahls werden anProbenatomen abge-lenkt: gestreut odersogar reflektiert (Rück-streuelektronen BSE).
Elektronen der Proben-atome selbst (Sekundär-elektronen SE) werdendabei gelegentlich ausihrer Schale geschlagen(inelastische Streuung).
BSE
SE
SE
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Signalentstehung im REM
PE
BSE
SE IISE I
Polschuh undSäuleninnenwände
SE III
Primärelektronen des Strahlsdringen in die Probe ein undwerden dabei an den Proben-atomen mehrfach gestreut.Rückgestreute Elektronenverlassen die Probe wieder.
Bei inelastischen Zusammen-stössen der Primärelektronenmit Probenatomen werdenüberall im Interaktionsvolu-men Sekundärelektronen frei.Jedoch nur SE unmittelbar ander Oberfläche können dieProbe verlassen.
Unerwünschte SE entstehenauch an den Innenflächen derProbenkammer.
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Unterscheidung SE BSE
Sekundärelektronen und Rückstreuelektronenunterscheiden sich signifikant in ihrem Ener-giegehalt. SE sind sehr niederenergetisch.BSE haben nahezu die gleiche Energie wiedie Primärelektronen.
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Interaktionsbirne und AuflösungSE treten direkt an der Proben-oberfläche aus, aus einer Tiefevon 1 nm (Pt) bis zu 10 nm (C).Sie geben das topografisch ge-naueste Signal. Ihre Austritts-tiefe ist von der Beschleunig-ungsspannug unabhängig.
BSE stammen aus tieferenSchichten (1-2 µm). Röntgen-Strahlen für die Elementana-lyse kommen aus noch ober-flächenferneren Regionen (bis10 µm). Die Austrittstiefe dieserSignale ist von der Bescheunig-ungsspannung der Primär-elektronen abhängig.
SignalauflösungenSignalauflösungen SE BSE X-ray
Austr
itts
tiefe
nA
ustr
itts
tiefe
n
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Signaldetektion im REM
Materialbeschaffenheit (Ordnungszahl, Ladungsunter- schiede, Magnetismus, mole- kulare Orientierung, ...)
Topografie (Kontext, molekulare Auflösung, Quantifizierung).
Elementverteilung (EDX, WDX)
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Topografische Abbildung
HR -REMP. Walther P. Walther
Hohe Tiefenschärfe bei der topografischen Abbildung (SE) dreidimensionaler Proben.Stark variabler Vergrösserungsbereich erlaubt Darstellung sowohl ganzer Organismenals auch von Zellen & Makromoleküle. Auflösungsvermögen ca. 1-3 nm.
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Darstellung nicht-topografischerProbeneigenschaften (Beispiele)
Materialkontrast, BSE Elementverteilung, Röntgenstrahlen
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Geräteparameter & Detektoren
Je nach Einstellungen am SEM und Auswahl des Detektors, könnenunterschiedliche Eigenschaften einer Probe dargestellt werden.
SE-Signal bei 2kV BSE-Signal bei 30kV
aufgebrochenen Pflanzenzelle mit Metalleinlagerung in den Chloroplasten.
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red blood cells labeled against surface proteins
SE BSE
Detektoren im REM: SE vs. BSETopografie & Antigen-Lokalisation
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Anordnung der Detektoren
PEBSESE
Die hochenergetischen BSE werden von einem Ringdetektor gemessen,der um den Primärstrahl herum direkt unterhalb der Endlinse positioniertist.
Der SE-Detektor sitzt meist seitlich. Die niederenergetischen SE werdenvom Detektor mittels eines positiv geladenen Käfigs angesaugt. DieFlugbahnen der BSE werden durch diese geringe Saugspannung (ca.300 V) nicht beeinträchtigt.
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Der SE-Detektor
SE-Detektoren sind eine Kombination aus Szintillator und Photomulti-pliertube. Der Szintillator reagiert auf Elektronenkontakt mit Lumineszenz.Die Photonen werden in einer vielstufigen Kaskade vermehrt und dasSignal in einen Stromimpuls (output) verwandelt.
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Flächenneigungskontrast
Durch die seitliche Anordnung und die an-liegende Saugspannung des SE-Detektorsentsteht eine Richtungsabhängigkeit desSignals mit topografieabhängigen Hellig-keitsverteilung und Abschattungen.
„Stehlampen-Effekt“
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Kantenkontrast
An Kanten tretenmehr Sekundär-elektronen ausals in der Ebene.
Auch bei kleinenPartikeln undMikrorauhigkeitder Oberflächekönnen SEvermehrt dieProbe verlassen.
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Der BSE-Detektor
Der BSE-Detektor besteht aus einer Anordnung mehrerer Detektorfelder (Ring), derenSignale miteinander verrechnet werden.Der Detektor besteht aus einer goldbeschicht-eten Silizium-Diode. Hochenergetische Rückstreuelektronen duchdringen die dünneGoldschicht und ionisieren die darunterliegenden Silizium-Atome. Es kommt zu einerWanderung von Ladungsträgern im Silizium und somit zum Stromfluß =Signal.
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Die Probe emittiert unter Beschuss mit energiereichen Primärelektronen Röntgenstrahlung.Diese kann mit einem seitlich angebrachten, LN2-gekühlten Si(Li)-Kristall detektiert werden.
EDX Elementanalyse EDX = Elementdispersive Röntgenmikroanalyse
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Schalenmodell des Atoms: Elektronenbewegen sich auf Bahnen („Schalen“)um den Atomkern. Jedes Element be-sitzt eine typische Anornung seinerElektronenschalen. Elektronen aus einerSchale können in eine andere über-treten. Innere Schalen sind energetischgünstiger als weiter aussen liegendeSchalen.
Primärelektronen stossen Elektronenaus kernnahen Schalen der Proben-atome heraus. In die entstandenenLücken fallen Elektronen aus weitervom Atomkern entfernten Elektronen-schalen. Dabei wird Röntgen-Strahlungfrei. Die Energie der Strahlung istcharakteristisch für jedes Element.
CharakteristischeRöntgenstrahlung
verlässt das Atom
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Die Röntgenquanten werden detektiert. Die Impulsewerden verstärkt und A/D-gewandelt. Ein Vielkanal-analysator zählt die Röntgenquanten nach ihremEnergiegehalt einzeln aus. Auf dem Bildschirmwächst ein Spektrum (Intensität vs. Energie) heran.
Röntgenstrahldetektion
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energiedispersives Röntgenspektrum
Die gemessene Röntgenstrahlung wird hinsichtlich ihrer Energie analysiert und in einemSpektrum dargestellt. Die im Röntgenspektrum enthaltenen Spektrallinien erlauben es,anhand der Energieverteilung die Elementzusammensetzung der Probe zu identifizierenund über die Intensitäten auch zu quantifizieren.
Röntgenquanten-Energie
Zahl der
Impuls
e p
ro E
nerg
iein
terv
all
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Punktgenaue RöntgenanalyseDas Röntgenspektrum kannals Summenspektrum für einganzes Bild aufgenommenwerden oder für einzelneMesspunkte bzw. Regionen.
Das Röntgensignalkommt stets aus einergrösseren Tiefe derProbe (etwa 2-10 µm)als das topografischeBild.
Für eine EDX-Messungist eine hohe Beschleu-nigungsspannung not-wendig (ca. 2-3facheEnergie der zu mess-enden Röntgenquan-ten).-> die Primärelektronendringen somit tief in dieProbe ein: grossesInteraktionsvolumen,geringe örtlicheAuflösung)
Energie
Inte
nsitä
t
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Elementverteilungsbilder
1. Aufnahme eines
REM-Bildes eines
interessierenden
Bereichs
2. Aufnahme eines
Summenspektrums
und Indizierung der
vorkommenden
Elemente
3. Auswahl der
relevanten Elemente
und Aufnahme von
Elementverteilungs-
bildern
2.
1. 3. 3.
3.3.3.
Durch Abtastung mittels fokussierten Primärelektronenstrahl kann die Ele-mentverteilung auf der Probenoberfläche im REM örtlich aufgelöst gemessenwerden.
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"
REM StereobilderDurch Kippung der Probe um5-10° entstehen 2 verschiedeneAnsichten des Objekts. DurchRot-Grün-Überblendung dieserAnsichten kann mit einer ent-sprechenden Brille die Proben-topografie dreidimensional be-trachtet werden.
Geeignete Software erlaubt die quan-titative Auswertung definiert erstellterStereobilder -> Höhenmessungen, Be-stimmung der Mikrorauhigkeit.
P. Walther
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Pseudoskorpion (Zentrum Mikroskopie Uni Basel, für wdr)
Kurzzeitige Lebendbeobachtungen strahlenresistenter Organismenunter Niedervakuumbedingungen im REM möglich!! Jedoch dabei
keine Hochauflösung von Oberflächendetails.
Lebendbeobachtungen im ESEM
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Hydratisierte Blattoberfläche.
-> Die Strukturen sind von einendünnen Wasserfilm überzogen.
Niedervakuumbedingungen in der Proben-kammer. Es herrscht ein kontrollierterWasserdampf-Partialdruck. Aufspreitungdes Elektronenstrahls. Zusammenstössezwischen Elektronen und Wasser-molekülen.
Niedervakuum-REM (ESEM)
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Lufttrocknung führt zuKollaps und Verformung.
Wasser ist für Elektronennicht transluzent, d.h. nur
die Wasseroberfläche wirdabbgebildet. -> Selbst
dünne Wasserfilmeverdecken Details der
Probenoberfläche.
EnvironmentalSEM in der
Biologie
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„Cross beam SEM“
FIB/SEM ist eine Kombination aus gerasterter Gallium-Ionenquelle (FocusedIon Beam, FIB) mit einem hochauflösenden Rasterelektronenmikroskop.
Ionenstrahl und Elektronenstrahl kreuzen sich („cross beam“) auf der Probe.Die Abbildung der Probe kann mittels Elektronen oder mit dem FIBvorgenommen werden.
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Cross beam SEM
Mit dem Ionenstrahl lässt sich gezielt die Probe an vordefinierterStelle bestrahlen. Die Ionen tragen dabei Probenmaterial ab(Ionenätzung). Damit können Schnitte der Probe senkrecht zurProbenoberfläche hergestellt werden.
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Cross beam SEM
-> sequentielle Mikro-Querschnitte liefern räumliche Informationen und erlauben eine 3D-Re-konstruktion. Der Ionenätzprozess kann sogar als Film in Echtzeit mit dem REM aufgezeichnetwerden.
Typisches Volumenfür 3D-Abbildungen:
200-500 µm3
ca. 10 µm x 5 µm x 10 µm
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1897 Discovery of the electron (J.J. Thompson)
1924 particle/wave dualism (P.De Broglie)
1927 Electron beams can be focused(H. Busch)
1931 the first TEM was built (M. Knoll and E. Ruska)
1935 SEM theory (M. Knoll)
1938 the first SEM was constructed(M. von Ardenne)
1939 First commercial TEM by Siemens
1951 X-ray spectroscopy (R. Castaing)
1960 Improved signal detection in SEM (Everhart & thornley)
1964 First commercial SEM by Cambridge Instruments
~1970 HRTEM microscopes with a resolution better than 4 Å
1971 first SEM with Field emission gun (Crewe & Wall)
Geschichte der Elektronenmikroskopie