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INDICACIONES GENERALES DE USO Almacenamiento Los medios de cultivo deshidratados son mezclas de sustancias higroscpicas, sensibles a la humedad, el calor y la luz. A pesar de que el envase de los medios deshidratados est protegido contra la luz y la humedad, el almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas indicadas en los botes para conservar sus propiedades iniciales. Se debe evitar en la medida de los posible, los cambios bruscos de temperatura y una vez abierto el bote, es necesario mantenerlo cerrado para mantenerlo protegido de la hidratacin. El polvo de los medios de cultivo deshidratados debe ser homogneo, libre de flculos y deben tener el color inicial indicado para cada medio. Si hay algn cambio de la apariencia fsica, descartar el medio. La mayora de los medios deben ser almacenados a temperatura ambiental entre 2-25C. Para ciertos medios de cultivo, el almacenamiento debe ser en nevera en un rango de temperatura de 2-8C. Si no se describe lo contrario, los medios de cultivo de este manual se almacenaran a 2-25C. Dependiendo del medio y en condiciones adecuadas los medios de cultivo tienen una fecha de caducidad de entre 2 y 4 aos. Los medios de cultivo deshidratados no deben consumirse despus de la fecha de caducidad. Es importante que el stock de los cultivos en polvo sea lo suficientemente grande para asegurar las aplicaciones necesarias, pero lo suficientemente pequeo para asegurar la rotacin continua. A pesar de que la mayora de los medios de cultivo pueden mantenerse en condiciones ambientales durante largos periodos de tiempo, no todos son estables indefinidamente. Antes del almacenamiento de los medios de cultivo, se deben revisar las indicaciones de su etiqueta. En la etiqueta podrn encontrar diferentes smbolos detallados a continuacin: Mantener protegido de la humedad. Mantener alejado de la luz Se indica lmite mximo y mnimo de temperatura Preparacin Antes de la preparacin del medio, se debe comprobar que el material que se va a utilizar est en perfectas condiciones de limpieza. Todo el material debe estar aclarado con agua destilada o desionizada. Tambin debe comprobarse que el medio no este deteriorado o haya cambiado de su aspecto inicial. Se debe aadir la cantidad exacta indicada para cada medio en la cantidad de agua tambin determinada. El agua debe ser destilada o desionizada y no debe contener cloro, cobre, plomo, ni detergentes que puedan afectar al medio. La buena disolucin del medio determina la claridad y efectividad del producto final. Es fundamental obtener una disolucin homognea con la mnima exposicin al calor. La cantidad de polvo requerida debe ser aadida a la mitad del volumen de agua. Despus de que el polvo y el agua se mezclen totalmente, aadir el resto del agua, teniendo la precaucin

2C

25C

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de arrastrar todos los restos de la pared del recipiente y remover todo junto con cuidado. En algunas ocasiones, antes de aadir el polvo, es recomendable calentar el agua a aproximadamente 50C para mejorar la disolucin. Dejar reposar la mezcla durante 5 minutos ayuda a obtener una suspensin uniforme. Algunas de las formulas que no contienen gelatina o agar, se pueden disolver sin calor, sin embargo existen medios que requieren calor para su disolucin completa y en ocasiones agitacin. Aplicar calor uniformemente, la ebullicin debe ser lo ms breve posible (normalmente un minuto o dos son suficientes). Seguir las instrucciones que aparecen en la etiqueta o en la ficha tcnica para cada medio especfico. Los medios que contienen agar pueden hervir repentinamente y salirse del recipiente donde se est preparando. Para evitar lo se debe agitar frecuentemente cuando el medio empiece a hervir. Algunos medios, debido a su composicin, presentan una ligera turbidez o precipitacin. Es fundamental en este tipo de medios que los componentes insolubles se distribuyan lo mejor posible para que los nutrientes se distribuyan homogneamente. AJUSTE DE pH El pH de los medios se ajusta en el momento de la fabricacin, sin embargo, la calidad del agua utilizada para la hidratacin o la utilizacin de medios no recientes pueden modificar este parmetro por lo que es aconsejable verificarlo y reajustarlo si fuera necesario. Para la verificacin del pH, se debe medir una muestra extrada del volumen total del medio preparado a 25C, tanto en medios lquidos como slidos. En los casos donde se deba reajustar el pH, se puede utilizar una solucin estril de cido clorhdrico (para acidificar el medio) o hidrxido sdico (para basificar el medio). En medios slidos, el reajuste de pH debe ser realizado antes de la solidificacin, por lo que ser necesario utilizar una muestra del volumen total para la medicin a 25C y otra muestra a 45C para conocer el volumen de cido clorhdrico o hidrxido sdico que hay que aadir en un volumen conocido. Esterilizacin Los medios de cultivo contienen diferentes organismos que proceden de las diferentes materias primas y de los recipientes utilizados. Estos organismos deben ser eliminados antes de la inoculacin para evitar falsos resultados. Existe una gran variedad de mtodos de esterilizacin pero el ms utilizado es la esterilizacin por calor. Las clulas vegetativas se eliminan rpidamente y a temperaturas alrededor de los 60C durante 5-10 minutos, sin embargo, para la eliminacin de las esporas se necesitan una temperatura de 121C durante 15 minutos. Para la esterilizacin del medio seguir las instrucciones de preparacin de la etiqueta de cada medio. En general, estas instrucciones son para volumen de medio pequeo. Para volmenes ms grandes, es necesario incrementar el tiempo de esterilizacin. Hay que tener en cuenta que aunque el tiempo de esterilizacin incremente, la temperatura utilizada se debe mantener. En este caso, se deben hacer estudios de validacin para determinar cual es el ciclo necesario para cada volumen. Los medios que contienen carbohidratos no deben ser autoclavados a una temperatura que exceda los 116-118C. En todos los casos se debe evitar el sobrecalentamiento. En algunos medios lquidos, el calentamiento puede dar lugar a perdida de actividad de algunos componentes. En estos casos se debe esterilizar por filtracin. La muestra se pasa a travs de unos filtros en lo que se quedan retenidos los microorganismos, la eficacia de estos

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sistemas depende del tamao del poro del filtro o bien de su carga elctrica; a pH ptimo la mayora de las bacterias tienen una carga de superficie negativa por lo que la filtracin ser ms eficaz cuando ms positiva sea la carga del filtro. Incorporacin de los Suplementos Debido a que la mayora de los suplementos tienen algn compuesto termosensible, el medio tiene que haberse enfriado a una temperatura de entre 45-50C. En el caso de los medios slidos, es importante que no se enfre en exceso ya que si empieza a solidificar, el suplemento no podr homogeneizarse bien en el medio. En general, los suplementos estn liofilizados. La reconstitucin de los mismos debe ser realizada con la sustancia indicada en cada caso. En el caso de que el suplemento deba ser reconstituido con agua, se debe usar agua destilada estril. El suplemento reconstituido debe aadirse cuando la suspensin este a temperatura ambiente. (25C). Si se encuentra a una temperatura menor, la adicin del suplemento puede formar grumos debido a la diferencia de temperatura del medio y del suplemento, provocando una mala homogenizacin del suplemento. Despus de la adicin del suplemento es fundamental realizar una buena homogenizacin. Verter en placas Antes de verter el agar en placas, se debe esperar a que el medio tenga una temperatura de 45-50C. Si la temperatura es ms alta, se puede formar una formacin excesiva de agua condensada en las placas. Antes de verter el medio en placas, se debe mezclar para la correcta homogenizacin. El volumen en placas de 90 mm puede variar entre 15-20 ml, para generar una capa de 2-3 mm de agar, a no ser que en las instrucciones de preparacin se indique una cantidad especfica. Las placas se deben dejar enfriar a temperatura ambiente, en una superficie horizontal con la tapa de la placa puesta. No se deben mover las placas hasta que solidifiquen. Se debe tener la precaucin de evitar la formacin de burbujas en la superficie del agar. Una vez que las placas estn solidificadas. Mantener en posicin invertida. Conservacin de los medios preparados Los ms recomendable es preparar el medio cuando se va a emplear, si esto no fuera posible, es imprescindible que el medio preparado se mantenga en refrigeracin a 2-8C, apartado de la luz. La refrigeracin favorece la deshidratacin del medio, por lo que antes de la utilizacin del medio se debe observar si existe evidencia de deshidratacin. Se debe evitar la condensacin ya que el depsito de gotas puede causar la alteracin del medio. Recalentamiento El recalentamiento del medio se debe hacer poniendo el frasco o tubo con la tapa cerrada en bao mara, microondas o en autoclave en vapor fuerte. En medios que han sido esterilizados, el recalentamiento debe ser el mnimo para evitar que el medio pierda calidad. Los medios refundidos tienen una cierta tendencia al oscurecimiento o precipitacin, que aumenta cuando se mantienen fundidos durante largos periodos de tiempo. El sobrecalentamiento debe ser evitado. Nunca refundir el agar ms de una vez.

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Controles de calidad Materias primas y fabricacin Los controles de las materias primas es sumamente importante para posteriormente tener un medio deshidratado de calidad. Es por ello que se deben hacer pruebas de compatibilidad con otros ingredientes, de rendimiento y realizar pruebas fsico-qumicas. Algunos de los constituyentes bsicos de los medios de cultivo son productos naturales y como consecuencia, existe la posibilidad de que haya pequeas variaciones de sus caractersticas de lote a lote. Es por ello que, adems de realizar los mismos controles que al resto de materias primas, se hace un riguroso estudio para garantizar que los medios de cultivo tengan una reproductividad de lote a lote. Todas las fases de produccin se desarrollan de acuerdo a los controles de calidad internos entre los que se encuentran mantenimiento, limpieza y calibracin de los equipos, control de almacn y almacenamiento. Tras la fabricacin, se controlan la apariencia, homogeneidad y humedad y se prepara el medio para comprobar que todas las caractersticas tales como apariencia, pH, caractersticas fsico qumicas y crecimiento sean correctos. Todos los controles se hacen en paralelo con un lote de referencia aprobado anteriormente que permita que todos los lotes sean uniformes. Controles de calidad del cliente Los medios de cultivo deben mantener las caractersticas indicadas en la etiqueta y el control de calidad si el medio ha sido preparado adecuadamente. Para asegurar su calidad, se deben hacer controles de cada lote para comprobar que todos los parmetros son correctos. Se debe comprobar:

o pH: Todos los medios de cultivo deshidratados son fabricados de acuerdo a los valores de pH indicados en la etiqueta. A pesar de esto, se debe verificar despus de la esterilizacin, que el pH del medio concuerda con el correcto. La medicin del pH debe ser realizada a una temperatura de 25C. Si fuera necesario, este pH se puede ajustar antes de que el medio solidifique. Se debe evitar el exceso de ajuste de pH, ya que esto puede alterar la composicin qumica del medio.

o Esterilidad: Se debe verificar que el medio este estril, incubando una muestra

significativa de las placas preparadas y dejando incubar a la temperatura indicada para cada medio.

o Caractersticas fsico qumicas. Se debe observar el color del medio, la transparencia,

la existencia de partculas extraas.

o Crecimiento/inhibicin de organismos clave. Posibles fallos Cambio en el pH:

o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado o Almacenamiento inadecuado o Agua impura o Pesada incorrecta o Residuos en los recipientes utilizados o utilizacin de cristal alcalino o Falta de homogenizacin o Sobrecalentamiento o Esterilizacin prolongada

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o pH medido a temperatura por encima de los 25C o Recalentamientos repetidos

Solubilidad: Precipitacin (en ocasiones la precipitacin puede ser parte esencial del medio, xej. Bismuto Sulfite Agar)

o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado o Almacenamiento inadecuado o Agua impura o Pesada incorrecta o Residuos en los recipientes utilizados o Agitacin insuficiente o Falta de homogenizacin

Turbidez

o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado o Almacenamiento inadecuado o No se ha utilizado el agua adecuada o Falta de homogenizacin o pH incorrecto o Disolucin incompleta o Sobrecalentamiento o Prdida de agua del medio preparado debido a la evaporacin

Ennegrecimiento

o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado o Pesada incorrecta o Agitacin insuficiente o Sobrecalentamiento o pH incorrecto o Recalentamientos repetidos

Gel Hidrolizado

o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado o Pesada incorrecta o Agitacin insuficiente o Falta de homogenizacin o Sobrecalentamiento o Hidrlisis cida del agar o Agar demasiado diluido o Recalentamientos repetidos

Crecimiento escaso Debido a los medios de cultivo

o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado o Pesada inadecuada o Disolucin incompleta o Sobrecalentamiento o Recalentamientos repetidos o Agar demasiado diluido

Debido a los suplementos

o El suplemento estaba caducado o deteriorado o Mala reconstitucin del suplemento o Adiccin de una concentracin menor de la requerida o Mala homogeneizacin del suplemento con el medio de cultivo

Otros factores

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o Los organismos utilizados para el control del medio estaban daados o Malas condiciones de cultivo

Color anormal del medio

o El medio de cultivo estaba caducado o deteriorado o Agua impura o Residuos en los recipientes utilizados o Sobrecalentamiento o pH incorrecto en el caso de que el medio lleve indicadores de pH

Toxicidad

o Residuos en los recipientes utilizados o Agua impura

Contaminacin

o Esterilizacin insuficiente o inapropiada o Fallos en la adiccin de suplementos o aditivos

Otros posibles errores en la preparacin de los medios

o El proceso de enfriamiento despus de la esterilizacin debe ser lento ya que un enfriamiento brusco puede dar lugar a una prdida de las caractersticas del medio.

o Los medios que contienen tampones fosfatados y glucosa u otro carbohidrato pueden oscurecer si existe sobrecalentamiento. Tambin puede aparecer un precipitado en estos medios cuando se usa un agua de baja calidad

o Un fenmeno comn del sobrecalentamiento es la reaccin de Maillard, que causa una decoloracin del medio y prdida de la calidad nutricional del medio. Esta reaccin es causado normalmente por la reduccin de los azcares que interactan con los aminocidos procedentes de las protenas. En estos casos los carbohidratos deben ser esterilizados por separado.

Seguridad Los medios de cultivo deben ser utilizados slo para Diagnostico in vitro. Las directrices de preparacin deben ser ledas y seguidas escrupulosamente. Los medios de cultivo deshidratados pueden contener sustancias peligrosas o txicas. Una excesiva concentracin de polvo en el lugar de trabajo puede reducir la visibilidad y se pueden depositar en ojos, odos o tracto respiratorio. La inhalacin de estas sustancias en altas concentraciones puede ser perjudicial provocando irritacin de la nariz, garganta y tracto respiratorio. por lo que es recomendable llevar mascarilla en el momento de utilizacin de los medios deshidratados y proteccin en los ojos. Tambin es recomendable el uso de guantes. Algunas de las sustancias peligrosas utilizadas en los medios de cultivo son: Acetamida, Acriflavina, Sales Biliares, Verde Brillante, Cetrimida, Cloranfenicol, Cicloheximida, Dicloran, Cloruro de Litio, Verde Malaquita, Rosa Bengal, Azida Sdica, Tergitol Nunca se debe calentar un recipiente totalmente cerrado, ya que este puede explotar. Al calentar un recipiente abierto, la abertura de debe dirigir en una direccin en la que si se produce alguna salpicadura o proyeccin, no provoque lesin a alguien prximo o a uno mismo. Si durante el cultivo se utiliza un mechero de gas (por ejemplo un mechero Bunsen), asegurarse de que no haya cerca productos inflamables. Nunca se debe utilizar una llama directa para calentar. El medio ya cultivado debe ser autoclavado a 121C durante 30 minutos antes de su desecho definitivo. Se debe hacer lo mismo con el material de laboratorio antes del lavado y nuevo uso.

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Los residuos txicos que se originen deben ser depositarlos en los contenedores especiales que estn destinados para su recogida al igual que los productos de vidrio. Los productos slidos tales como el agar no deben tirarse por el desage ya que se puede atascar el sumidero. Para ms informacin sobre seguridad existen a su disposicin MSDS GUIA RAPIDA DE UTILIZACIN Abreviaturas usadas APHA American Public Health Association AOAC Official Methods of Analysis of AOAC International ATCC American Type Culture Collection BAM Bacteriological Analytical Manual CECT Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (Spanish Type Culture Collection) DEV Deutsches Einheitverfahren zur Wasser-, Abwasser-, und Schlammuntersuchung (German Methods for the examinations of Water, Wastewater and Sludge EP European Pharmacopeia ISO International Organization for Standarization NCCLS National Commitee of Clinical Laboratory Standards NCTC National Collection of Type Cultures USP United States Pharmacopeia WHO World Health Organization Informacin adicional para usuarios

o Estos productos son para uso profesional exclusivamente y deben ser utilizados slo por personal capacitado o cualificado. No deben ser utilizados para anlisis auto administrados por los pacientes.

o Las decisiones e interpretacin del diagnstico debe ser realizado por personal capacitado o cualificado.

o No utilizar los medios preparados si muestran evidencia de contaminacin microbiana, decoloracin, deshidratacin, grietas o cualquier otro signo de deterioro.

o Se deben seguir los protocolos estndar de extraccin, transporte y procesamiento de muestras