INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL...IV Abstract Chlamydomonas reinhardtii is a green microalgae that...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
TESIS
Presentada para obtener el grado de
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS
Por
Jhorman Alexis Niño Gómez
Microbiólogo Industrial
ANÁLISIS DE LOS FLUJOS METABÓLICOS DE Chlamydomonas reinhardtii PARA SU
APLICACIÓN EN LA PRODUCCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLES
Dirigida por
Dr. Edgar Salgado Manjarrez
Dr. Juan Silvestre Aranda Barradas.
México, D.F. 07 Noviembre de 2013
III
Resumen
Chlamydomonas reinhardtii es una microalga que posee la capacidad de acumular una buena
cantidad de lípidos que son usados en la fabricación de biodiesel. Esta microalga puede crecer
en autotrofía, mixotrofía y heterotrofía. Resulta muy útil poder conocer como varia el
metabolismo de C. reinhardtii bajo cada una de estas condiciones.
En este trabajo se realizó un pool de ensayos cinéticos que involucraban diferentes
condiciones de crecimiento con el propósito de obtener la información necesaria para realizar
un análisis de flujos metabólicos de estas condiciones. Las variables de los ensayos fueron la
intensidad de la luz y la concentración de nitrógeno mostrando como resultado que la mayor
velocidad de crecimiento encontrada fue de 2.4d-1 y una fracción lipídica máxima de 38.87%.
Análisis de superficies de respuesta arrojaron que los puntos más idóneos para alcanzar una
mejor productividad de lípidos, están en las zonas de alta intensidad de luz y baja
concentración de nitrógeno. Seguidamente el análisis de distribución de flujos de carbono
mostro que el metabolismo mixotrófico (CO2 y acetato) favorece en mejor medida la
acumulación de lípidos. Finalmente se concluye que la construcción de estos modelos
metabólicos sirven como base para la construcción de una herramienta cada vez más
poderosa en el análisis y simulación de la distribución del carbono en C. reinhardtii bajo
diferentes condiciones de crecimiento y/o modificaciones genéticas
IV
Abstract
Chlamydomonas reinhardtii is a green microalgae that has the ability to accumulate lipids which
can be used in the biodiesel production. This microalgae exhibits autotrophy, heterotrophy or
mixotrophy depending on environmental conditions, and it is very useful to know how C.
reinhardtii metabolism varies under each of these conditions in regard to its ability to
accumulate Lipids.
In this work, several kinetic assays involving different growth conditions were carried out, in
order to obtain essential information for the metabolic flux analysis of the algae under these
conditions. Assay variables were the light intensity and the nitrogen concentration. Results
show that the higher growth rate was 2.4 d-1 and a maximum lipid fraction of 38.87% of dry
biomass. Response surface analysis showed that the most suitable conditions for achieving
better lipid productivity, are high light intensity and low nitrogen concentration. Carbon flux
analysis shows that mixotrophic metabolism (CO2 and acetate) allows greater accumulation of
lipids.
Finally concluded that the construction of these metabolic models serve as a base for the
construction of increasingly powerful tool in the analysis and simulation of the carbon
distribution in C. reinhardtii under different growth conditions and / or genetic modifications
VI
Agradecimientos
Agradezco primero a Dios, por haberme dado la oportunidad de vivir esta maravillosa y
enriquecedora experiencia.
Agradezco a mi asesor Edgar salgado Manjarrez por toda su dedicación y colaboración en la
construcción de este trabajo.
A mi Prometida Mayerly Anaya quien con su incondicional y constante apoyo permitió que
pudiese seguir adelante a pesar de las dificultades.
A mis padres que a pesar de tantas vicisitudes siempre me han apoyado a alcanzar mis
sueños.
A los doctores Juan Aranda, Agustín Badillo y Elvia Inés García por sus aportes en cada
momento.
A mis amigos Exiliados (Juan, Daniel, Leidy, Julián), les deseo lo mejor en lo que falta de este
camino, a mis amigos Mexicanos (PePe, Karla, Ruben, Jacob) agradecimientos por hacernos
sentir a cada instante como en nuestra casa.
Finalmente un agradecimiento especial a CONACYT y al Instituto Politécnico Nacional, por
brindarme la oportunidad de seguir adelante en mi proceso de formación.
VII
Trabajo llevado a:
Evento: XV Congreso nacional de biotecnología y bioingeniería.
Fecha: 23-28 de junio de 2013.
Ciudad: Cancún, Quintana Roo.
Modalidad: Poster.
VIII
Contenido
1. Introducción general ............................................................................................................ 1
1.1. ANTECEDENTES......................................................................................................... 3 1.1.1. Las microalgas ....................................................................................................... 3 1.1.2. Chlamydomonas reinhardtii ................................................................................... 8 1.1.3. Compartimentalización metabólica ...................................................................... 24 1.1.4. Ingeniería metabólica. .......................................................................................... 27 1.1.5. Modelos estequiométricos del crecimiento celular ............................................... 29
1.2. JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................ 37 1.3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 38
1.3.1. Objetivo general ................................................................................................... 38 1.3.2. Objetivos específicos ........................................................................................... 38
1.4. HIPÓTESIS ................................................................................................................ 39
2. Materiales y métodos ........................................................................................................ 40
2.1. Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconinico (BCA) ................... 40 2.2. Cuantificación de carbohidratos por el método fenol-sulfúrico .................................... 41 2.3. Cuantificación de la biomasa seca .............................................................................. 42 2.4. Cuantificación de Acetato ........................................................................................... 44 2.5. Suministro de luz y medición de la intensidad lumínica .............................................. 44
3. Factores limitantes del crecimiento de Chlamydomonas reinhardtii ................................... 45
3.1. Introducción ................................................................................................................ 45 3.2. Materiales y Métodos .................................................................................................. 46 3.3. Resultados y discusión ............................................................................................... 47
3.3.1. Modelo de caja negra (CHONSP) al medio TAP .................................................. 48 3.4. Conclusiones .............................................................................................................. 51
4. Efecto de la intensidad luminosa y el fotoperiodo sobre el crecimiento de Chlamydomonas reinhardtii. ................................................................................................................................ 52
4.1. Introducción ................................................................................................................ 52 4.2. Materiales y Métodos .................................................................................................. 54
4.2.1. Evaluación de intensidad luminosa ...................................................................... 54 4.2.2. Evaluación de los fotoperiodos ............................................................................ 55
4.3. Resultados y discusión ............................................................................................... 55 4.3.1. Evaluación de la intensidad luminosa .................................................................. 55 4.3.2. Evaluación de fotoperiodo .................................................................................... 57
4.4. Conclusiones .............................................................................................................. 58
5. Efecto de la aeración sobre la velocidad de crecimiento en autotrofia ............................... 60
5.1. Introducción ................................................................................................................ 60 5.2. Materiales y métodos .................................................................................................. 62 5.3. Resultados y discusión ............................................................................................... 63 5.4. Conclusiones .............................................................................................................. 73
6. producción de moléculas candidato a biocombustible: superficie de respuesta ................. 74
6.1. Introducción ................................................................................................................ 74 6.2. Materiales y Métodos .................................................................................................. 74 6.3. Resultados y discusión ............................................................................................... 77 6.4. Conclusiones .............................................................................................................. 87
7. ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS ........................................................................... 88
IX
7.1. Introducción ................................................................................................................ 88 7.2. Materiales y métodos .................................................................................................. 90 7.3. Resultados y discusión ............................................................................................... 96 7.4. Conclusiones ............................................................................................................ 100
8. Anexos ............................................................................................................................ 101
8.1. Fundamento de las técnicas analíticas utilizadas ..................................................... 101 8.2. Abreviaciones de compuestos .................................................................................. 112
9. Bibliografía ...................................................................................................................... 115
X
Índice de ilustraciones
ILUSTRACIÓN 1. VÍAS HACIA VARIOS PRODUCTOS ENERGÉTICOS A PARTIR DE ALGAS. .............................................. 4
ILUSTRACIÓN 2. PRINCIPALES RUTAS METABÓLICAS PARA LA SÍNTESIS DE ALMIDÓN EN MICROALGAS. ................... 7
ILUSTRACIÓN 3. ESTRUCTURA CELULAR DE C. REINHARDTII. ....................................................................................... 8
ILUSTRACIÓN 4. CRECIMIENTO DE CÉLULAS EN CULTIVO SINCRÓNICO. ...................................................................... 9
ILUSTRACIÓN 5. CICLO SEXUAL Y ASEXUAL EN C. REINHARDTII. ................................................................................ 10
ILUSTRACIÓN 6. ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LUZ POR MICROALGAS Y CIANOBACTERIAS. .................................... 13
ILUSTRACIÓN 7. COMPORTAMIENTO DE LA INTENSIDAD LUMÍNICA A TRAVÉS DEL POND. (FLECHA SEÑALA EL
FONDO DEL POND) ............................................................................................................................................. 13
ILUSTRACIÓN 8. VELOCIDAD DE CRECIMIENTO DE C. REINHARDTII BAJO DIFERENTES INTENSIDADES DE LUZ. ....... 14
ILUSTRACIÓN 9. CURVAS DE CRECIMIENTO EN DIFERENTES CICLOS OSCURIDAD:LUZ PARA APHANOTHECE
MICROSCOPICA .................................................................................................................................................. 15
ILUSTRACIÓN 10. PORCENTAJE DE FIJACIÓN DE CO2 VS DISMINUCIÓN DEL TIEMPO DE LUZ EN EL CULTIVO DE
APHANOTHECE MICROSCOPICA ......................................................................................................................... 15
ILUSTRACIÓN 11. AGREGACIÓN DE LA PROTEÍNA LCIB EN PRESENCIA DE LUZ. ......................................................... 16
ILUSTRACIÓN 12 PROCESO DE FOTOSÍNTESIS EN CHLAMYDOMONAS REINHARDTII ................................................. 17
ILUSTRACIÓN 13. CICLO DE CALVIN BENSON. ............................................................................................................. 18
ILUSTRACIÓN 14. VIA C4 EN PLANTAS ........................................................................................................................ 18
ILUSTRACIÓN 15. VÍA METABÓLICA DEL GLIOXILATO, ASIMILACIÓN DEL ACETATO POR C. REINHARDTII. ............... 22
ILUSTRACIÓN 16. PRINCIPALES RUTAS METABÓLICAS DE C. REINHARDTII EN FOTOAUTOTROFÍA. ........................... 28
ILUSTRACIÓN 17. MODELO DE CAJA NEGRA. .............................................................................................................. 30
ILUSTRACIÓN 18. DISTRIBUCIÓN DE FLUJOS DE UNA RED METABÓLICA HIPOTÉTICA. .............................................. 31
ILUSTRACIÓN 19. DISTRIBUCIÓN DE FLUJOS METABÓLICOS DE UN CULTIVO MIXOTRÓFICO DE CHLORELLA SP. ..... 34
ILUSTRACIÓN 20. CURVA DE CALIBRACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO ............... 40
ILUSTRACIÓN 21. RESIDUOS DEL AJUSTE LINEAL DE LOS DATOS EXPERIMENTALES, METODO DE PROTEINAS. ....... 41
ILUSTRACIÓN 22. CURVA DE CALIBRACIÓN POR EL MÉTODO DE DUBOIS ................................................................. 41
ILUSTRACIÓN 23. RESIDUOS DEL AJUSTE LINEAL DE LOS DATOS EXPERIMENTALES, METODO DE CARBOHIDATOS. 42
ILUSTRACIÓN 24. CURVA DE CALIBRACIÓN BIOMASA SECA VERSUS ABSORBANCIA. ................................................ 43
ILUSTRACIÓN 25. CURVA DE CALIBRACIÓN RECUENTO CELULAR VERSUS ABSORBANCIA (675NM). ........................ 43
ILUSTRACIÓN 26. DIFERENTES INTENSIDADES DE LUZ EVALUADAS A NIVEL MATRAZ. .............................................. 54
ILUSTRACIÓN 27.CRECIMIENTO DE C. REINHARDTII MEDIDO EN ABSORBANCIA A 675NM EN DIFERENTES
INTENSIDADES DE LUZ ........................................................................................................................................ 56
ILUSTRACIÓN 28. VELOCIDADES DE CRECIMIENTO VS INTENSIDAD DE LUZ .............................................................. 57
ILUSTRACIÓN 29. CRECIMIENTO DE C. REINHARDTII EN DIFERENTES FOTOPERIODOS ............................................. 58
ILUSTRACIÓN 30 EVOLUCIÓN DE LAS ESPECIES QUÍMICAS DEL CO2 DISUELTAS EN AGUA. ....................................... 60
ILUSTRACIÓN 31. MECANISMOS DE CONCENTRACIÓN DE CARBONO INORGÁNICO. ................................................ 62
XI
ILUSTRACIÓN 32. MEDICIÓN DE CO2 AMBIENTAL. ..................................................................................................... 64
ILUSTRACIÓN 33. DISPONIBILIDAD DEL CARBONO EN UN SISTEMA AIREADO ........................................................... 67
ILUSTRACIÓN 34. DISPONIBILIDAD DEL CARBONO EN UN SISTEMA NO AIREADO ..................................................... 67
ILUSTRACIÓN 35. SISTEMA CERRADO DE CRECIMIENTO DE C. REINHARDTII ............................................................. 68
ILUSTRACIÓN 36. CRECIMIENTO DE C. REINHARDTII EN SISTEMA CERRADO, VALORES DE BIOMASA SECA. ............ 68
ILUSTRACIÓN 37. CONSUMO DE CO2 EN SISTEMA CERRADO, TRAMO DE LOS 2 PRIMEROS DÍAS. ............................ 69
ILUSTRACIÓN 38. GRÁFICA DEL MODELO PLANTEADO Y LOS DATOS ORIGINALES. ................................................... 70
ILUSTRACIÓN 39. DINÁMICA DE TRANSFERENCIA DE CO2 AL LÍQUIDO (MEDIO TAP). ............................................... 71
ILUSTRACIÓN 40. MODELO DEL PROCESO DE TRANSFERENCIA DEL CO2 EN EL MEDIO TAP. .................................... 72
ILUSTRACIÓN 41. DISEÑO EXPERIMENTAL TIPO BOX-BEHNKEN ................................................................................ 75
ILUSTRACIÓN 42. RESUMEN DEL COMPORTAMIENTO CINÉTICO EN LOS SISTEMAS A, B, K, L Y M. ........................... 78
ILUSTRACIÓN 43. RESUMEN DEL COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LOS SISTEMAS C Y D ........................................ 78
ILUSTRACIÓN 44. RESUMEN DEL COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LOS SISTEMAS E Y F. ........................................ 79
ILUSTRACIÓN 45. RESUMEN DEL COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LOS SISTEMAS G Y H. ....................................... 80
ILUSTRACIÓN 46. RESUMEN DEL COMPORTAMIENTO CINÉTICO DE LOS SISTEMAS I Y J. .......................................... 81
ILUSTRACIÓN 47. FRACCIÓN DE LÍPIDOS ACUMULADA EN LOS SISTEMAS CON Y SIN NITRÓGENO EN EL MEDIO. ... 83
ILUSTRACIÓN 48. FRACCIÓN DE LÍPIDOS EN MEDIO TAP CON AMONIO. ................................................................... 84
ILUSTRACIÓN 49.FRACCION DE LÍPIDOS EN MEDIO TAP SIN AMONIO. ...................................................................... 85
ILUSTRACIÓN 50. PRODUCTIVIDAD DE LÍPIDOS EN MEDIO TAP CON AMONIO. ........................................................ 85
ILUSTRACIÓN 51. PRODUCTIVIDAD DE LÍPIDOS EN MEDIO TAP SIN AMONIO. .......................................................... 86
ILUSTRACIÓN 52. RED METABÓLICA COMPLETA DEL SISTEMA MIXOTRÓFICO. ......................................................... 96
ILUSTRACIÓN 53. MAPA DE LOS FLUJOS METABÓLICOS DE C. REINHARDTII BAJO CRECIMIENTO MIXOTRÓFICO,
AUTOTRÓFICO Y HETEROTRÓFICO. .................................................................................................................... 98
ILUSTRACIÓN 54. REACCION DE CARBOHIDRATOS CON LA SOLUCION DE FENOL-SULFURICO-AGUA. .................... 104
ILUSTRACIÓN 55. ESQUEMA DE LA CÁMARA DE NEUBAUER. .................................................................................. 110
XII
Índice de Tablas
TABLA 1. RENDIMIENTOS DE ACEITES DE DIFERENTES CULTIVOS TERRESTRES VERSUS MICROALGAS. ...................... 4
TABLA 2. CONTENIDO DE LÍPIDOS DE DIVERSOS GRUPOS DE MICROALGAS. ............................................................... 5
TABLA 3 COMPOSICIÓN MILIMOLAR PRESENTE EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO PARA C. REINHARDTII .......... 11
TABLA 4. CONDICIONES DE CULTIVO EN LABORATORIO PARA C. REINHARDTII ......................................................... 12
TABLA 5. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE LA BIOMASA DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII CRECIDA EN
AUTOTROFÍA ...................................................................................................................................................... 19
TABLA 6. COMPOSICION DE LA BIOMASA DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII EN AUTOTROFÍA. .......................... 19
TABLA 7. RENDIMIENTOS ESPERADOS Y OBSERVADOS DE LA TECNOLOGÍA. ............................................................. 21
TABLA 8. INFLUENCIA DEL ACETATO EN LA FOTOSÍNTESIS DE C. REINHARDTII.......................................................... 22
TABLA 9. COMPOSICIÓN BIOQUÍMICA DE LA BIOMASA DE C. REINHARDTII CRECIDA EN MIXOTROFÍA. ................... 23
TABLA 10. RENDIMIENTO DEL CARBONO FIJADO EN TRES METABOLISMOS DIFERENTES EN C. REINHARDTII ......... 23
TABLA 11. COMPARTIMENTALIZACION DE ENZIMAS PRESENTES EN EL METABOLISMO CENTRAL DEL CARBONO EN
C. REINHARDTII. .................................................................................................................................................. 25
TABLA 12. ANÁLISIS DE VARIANZA PARA CURVA DE CALIBRACIÓN DE PROTEÍNAS. .................................................. 40
TABLA 13. ANALISIS DE VARIANZA PARA CURVA DE CALIBRACION DE CARBOHIDRATOS. ........................................ 41
TABLA 14. ANÁLISIS DE VARIANZA PARA CURVA DE CALIBRACIÓN DE BIOMASA SECA. ............................................ 44
TABLA 15. FÓRMULAS MÍNIMAS PARA BIOMASA DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII ........................................... 47
TABLA 16. SOLUCIONES DE SALES Y FOSFATOS DEL MEDIO TAP ................................................................................ 47
TABLA 17. ELEMENTOS TRAZA DEL MEDIO TAP.......................................................................................................... 48
TABLA 18. PERPARACION DE MEDIO TAP (1L) ............................................................................................................ 48
TABLA 19. RESULTADO DEL ANÁLISIS DE CAJA NEGRA AL MEDIO TAP PARA EL CRECIMIENTO DE C. REINHARDTII. . 49
TABLA 20. ANÁLISIS DE CAJA NEGRA ASUMIENDO AGOTAMIENTO DE NH3. .............................................................. 50
TABLA 21. CONDICIONES DE CULTIVO PRUEBA DE INTENSIDAD DE LUZ. ................................................................... 54
TABLA 22. CONDICIONES DE CULTIVO PARA LA PRUEBA DE FOTOPERIODO ............................................................. 55
TABLA 23. VELOCIDAD DE CRECIMIENTO EN FUNCIÓN DE LA INTENSIDAD DE LA LUZ. ............................................. 56
TABLA 24. VELOCIDAD DE CRECIMIENTO EN FUNCIÓN DEL FOTOPERIODO. ............................................................. 58
TABLA 25. VARIACIÓN EN LAS MEDICIONES DE CARBONO AMBIENTAL. ................................................................... 64
TABLA 26. CODIFICACIÓN DEL DISEÑO EXPERIMENTAL ............................................................................................. 75
TABLA 27. CONDICIONES DE CULTIVO EN ENSAYOS FINALES. .................................................................................... 76
TABLA 28. RESUMEN DE LOS PARÁMETROS CALCULADOS PARA LOS 5 SISTEMAS DE CRECIMIENTO. ...................... 82
TABLA 29. AUMENTO EN EL PORCENTAJE DE LÍPIDOS POR EL AGOTAMIENTO DEL NITRÓGENO. ............................ 83
TABLA 30. PRODUCTIVIDADES DE LIPIDOS EN LOS SISTEMAS CON Y SIN AMONIO. .................................................. 84
TABLA 31. RUTAS Y REACCIONES DE LA RED METABOLICA GENERAL. ....................................................................... 93
TABLA 32. TOPOLOGIA DE LA RED MIXOTRÓFICA. ..................................................................................................... 96
TABLA 33. MATRIZ ESTEQUIOMETRICA DEL MODELO MIXOTROFICO DE C. REINHARDTII. ....................................... 97
1
1. INTRODUCCIÓN GENERAL
Desde hace algunos años, ha aumentado en el mundo la necesidad de investigar sobre fuentes
de energía alternativas a las tradicionales, petróleo, gas y carbón, esto debido a la inminente
disminución en número de reservas lo que hace necesario el lanzamiento de nuevas opciones
energéticas que compitan tanto en calidad como en economía con las no renovables. Una de
tantas opciones es el uso de microalgas para la obtención de metabolitos de interés en la
fabricación de compuestos energéticos. Entre los más relevantes se encuentran la producción
de lípidos para fabricación de Biodiesel (Chisti, 2007) la obtención de carbohidratos para
fabricación de alcoholes (Leon-Banares et al., 2004), obtención de bío-moléculas altamente
energéticas tipo hidrocarburos (Banerjee, 2002), producción de biomasa completa y post-
proceso para obtención de Syngas (Field et al., 1998), metano, gasolina, keroseno, diesel e
hidrógeno (Rochaix, 2002). De esta manera, el espectro de acción que tienen las microalgas en
la industria energética es muy amplio, sin embargo no es el único sector en el que estos
importantes organismos fotosintéticos juegan un rol substancial, vale la pena mencionar el área
médico-farmacéutica en la que las microalgas tienen un aporte muy significativo en la síntesis
de moléculas que son objeto de investigación y desarrollo de nuevos fármacos y terapias
médicas, está también el sector de los alimentos, la industria textil y de tintes o pigmentos y
finalmente un tópico de alto interés en los últimos años, el consumo del CO2 ambiental. Este
tema ha sido centro de muchas discusiones gubernamentales y hoy en día se hace un
reconocimiento económico a las industrias que demuestren su aporte al medio ambiente
secuestrando CO2 de alguna forma ambientalmente amigable. En este sentido,
Chlamydomonas reinhardtii, una microalga verde perteneciente al orden de los Volvocales,
cumple con las anteriores premisas, y es objeto directo de esta investigación.
C. reinhardtii, tiene dentro de sus principales características que puede crecer autotrófica,
mixotrófica y heterotróficamente, sintetizando biomoléculas como las que se enunciaron
anteriormente, resaltando la producción de hidrógeno, y a la vez consumiendo CO2. Las
microalgas junto con otros organismos marinos son los responsables de la fijación de casi la
mitad del carbono de la atmósfera (Leon-Banares et al., 2004).
Esta microalga ha sido el organismo modelo en investigaciones sobre la genética y bioquímica
de los principales procesos foto-autotróficos como la fotosíntesis, el uso de carbono inorgánico
y la respiración autótrofa entre otros (Chisti, 2007). Sin embargo, como en la mayoría de
modelos biotecnológicos, esta alga eucariota tiene algunas limitaciones en la producción de los
metabolitos de interés. Estas barreras bio-tecnológicas pueden ser superadas con la ayuda de
la ingeniería metabólica y sus metodologías.
La ingeniería metabólica se puede definir como la modificación racional y directa de las
reacciones que constituyen el metabolismo de un organismo, con el propósito de mejorar sus
2
propiedades o su productividad (Qin et al., 2001). Dentro de las herramientas que ofrece la
ingeniería metabólica están el análisis de flujos metabólicos (AFM) y el análisis de flujos
metabólicos acoplados a carbono 13 (AFM 13-C). El AFM utiliza límites o restricciones
estequiométricas en forma de un modelo metabólico ajustado a mediciones de algunos
metabolitos de interés. Sin embargo esta técnica es mejorada cuando se implementa el método
de isotopos marcados (AFM 13-C), ya que permite analizar la distribución completa del carbono
en las redes metabólicas del microorganismo. El uso del análisis de flujos metabólicos (AFM)
de manera inicial, brinda una alternativa muy real en el cálculo de los flujos de un metabolismo
en particular. El cálculo de estos es una herramienta fundamental para estimar los flujos
intracelulares a partir de flujos extracelulares. La ventaja de este método es que permite
analizar a priori el efecto de las modificaciones ambientales o genéticas inducidas que pueden
imponerse a un microorganismo en el marco de un proceso biotecnológico (Manish et al.
2007), es también muy importante en el estudio de la fisiología celular ya que permite organizar
el conocimiento metabólico de un microorganismo en una red de reacciones bioquímicas y
provee una medida del grado de relación entre varias vías metabólicas (Nielsen et al. 1994).
El AFM también se ha utilizado para desarrollar estrategias de maximización en la
productividad de muchos metabolitos de interés comercial como: ácidos orgánicos,
aminoácidos, polisacáridos y antibióticos (Manish et al. 2007). Esto permite conocer mejor el
metabolismo celular del microorganismo bajo estudio y hacer mejoras en los rendimientos de
los metabolitos de interés.
En este trabajo se pretende realizar el análisis de flujos metabólicos de Chlamydomonas
reinhardtii bajo condiciones de mixotrofía con el propósito de vislumbrar las potencialidades de
la cepa bajo condiciones de cultivo específicas, en términos de acumulación de metabolitos
importantes para la fabricación de biocombustibles.
3
1.1. ANTECEDENTES
1.1.1. Las microalgas
Las microalgas son organismos unicelulares eucariotas que pertenecen junto con las
cianobacterias al grupo de fotótrofos más importantes en la fijación de más de la mitad del
dióxido de carbono (CO2) atmosférico y producción de altas cantidades de oxígeno.
Estos organismos son claves en el equilibrio planetario, ya que la dinámica del CO2 en la Tierra
está, en gran medida, determinada por ellos y, además, constituyen la base de las cadenas
tróficas que permiten la vida en los océanos (Banerjee et al., 2002).
Su función de crecimiento y reproducción también está asociada a labores ambientales como la
descontaminación de cuerpos de aguas, su presencia y/o ausencia también es indicadora de
contaminación de aguas y se conocen muchos usos industriales entre los que se tiene la
producción de pigmentos, proteína para consumo humano y animal, productos farmacéuticos,
producción de metabolitos de interés industrial, depuradores de aguas y recientemente tienen
interés en la producción de metabolitos para biocombustibles (Qin et al. 2001).
1.1.1.1. Potencial de las algas
Las microalgas han sido investigadas para diferentes propósitos encontrándose que de sus
componentes los más importantes para el hombre son lípidos, pigmentos, proteínas,
carbohidratos e hidrogeno.
En este sentido, una gran variedad de productos industriales pueden ser obtenidos de este
potencial, y esto se esquematiza en la ¡Error! La autoreferencia al marcador no es válida..
Los géneros de algas de interés para la producción de energía se ubican principalmente en los
grupos de algas verdes y diatomeas destacándose entre ellos los siguientes: Botryococcus sp.,
Scenedesmus sp., Chlorella sp., Chlamydomonas sp., Nitzschia sp., Prymnesium sp. (Chisti,
2007).
Producción de aceites para obtención de biodiesel
La característica que hace que las algas sean vistas como una importante alternativa en la
obtención de biocombustibles (especialmente biodiesel, ya que de la gasificación de la biomasa
y la fermentación de esta misma se producen otros biocombustibles líquidos y gaseosos) es el
alto porcentaje de aceites que acumulan estos microorganismos. Comparado con el aceite
4
extraído de los cultivos terrestres, las algas tienen un alto rendimiento en producción de aceite
transformable en biodiesel.
Fuente: Comprehensive Oilgae Report. July-2009
En la Tabla 1 se exponen diferentes cultivos oleaginosos terrestres que han sido empleados
hasta el momento en la producción de aceite para fabricación de biodiesel, encontrando a las
microalgas con un rendimiento de 1200-10000 galones por acre cultivado muy por encima del
cultivo de la palma con 635 galones por acre cultivado.
Tabla 1. Rendimientos de aceites de diferentes cultivos terrestres versus microalgas.
Cultivo Rendimiento de Aceite, Galones/Acre
Maíz 18
Algodón 35
Soya 48
Grano de mostaza 61
Girasol 102
Canola 127
Jatrofa 202
Palma 635
Alga (10g/m2dìa a 15% TAGs*) 1200
Alga (50g/m2dìa a 15% TAGs) 10000
Ilustración 1. Vías hacia varios productos energéticos a partir de algas.
5
*TAGs: triacil-gliceroles.
Fuente: Philip (NERL). 2007
La alta capacidad de acumulación de biomasa confiere a las algas productividades cerca de 30
a 35 veces mayor a la encontrada en el cultivo de palma, el cual es el cultivo oleaginoso de
preferencia en la producción de biodiesel en América. Además, el cultivo de microalgas posee
numerosas ventajas como por ejemplo: no son necesarias grandes extensiones de tierra, no se
necesitan terrenos fértiles, no es nocivo con el sitio de cultivo, no se necesita agua de calidad
(incluso es cultivada en aguas residuales).
La cantidad de aceite transformable varía entre las especies de algas. En cultivos controlados
en condiciones de laboratorio se han obtenido valores que oscilan entre 11-40% del peso seco
en aceite, aunque hay reportes de algunas especies que han alcanzado hasta 70-86 de su
peso seco en aceites (Qin et al., 2001). En la Tabla 2, se muestran los porcentajes de lípidos
en diferentes cepas de microalgas.
Tabla 2. Contenido de lípidos de diversos grupos de microalgas.
Cepas %lípidos
Scenedesmus obliquus
Scenedesmus quadricauda
Scenedesmus dimorphus
Chlamydomonas reinhardtii
Chlorella vulgaris
Chlorella pyrenoidosa
Spirogyra sp.
Dunaliella bioculata
Dunaliella salina
Euglena gracilis
Prymnesium parvum
Tetraselmis maculata
Porphyridium cruentum
Spirulina platenses
Spirulina maxima
Synechoccus sp.
Anabaena cylindrica
12–14
1.9
16–40
21
14–22
2
11–21
8
6
14–20
22–39
3
9–14
4–9
6–7
11
4–7
Fuente: Becker et al., 1994.
6
Producción de bioetanol
El bioetanol se ha convertido en una atractiva opción en el desarrollo de tecnologías que
complementen y finalmente remplacen el uso de la gasolina. El bioetanol es producido de
biomasa renovable como caña de azúcar o almidón y proporciona ciertas ventajas como por
ejemplo que es biodegradable, se mezcla fácilmente con la gasolina sin necesidad de
modificación alguna de los sistemas en donde es aplicado y proporciona altos niveles de
octanaje (Harris, 2009).
El bioetanol produce muy pocas emisiones de dióxido de carbono y material particulado,
aunque produce un nivel relativamente elevado de óxido nitroso. Diversos tipos de biomasa
pueden ubicarse como materia prima para la producción de bioetanol. Estas pueden
clasificarse generalmente en tres grupos: de base de sacarosa (caña de azúcar, remolacha),
de base de almidón (maíz) y lignocelulósicos (madera o residuos agrícolas). La elección de la
materia prima depende principalmente de factores económicos e industriales como la
disponibilidad y costo de los materiales de partida. Sin embargo, el problema principal con la
mayoría de los materiales mencionados es que compiten con la agricultura por la disponibilidad
de terrenos adecuados o que por el contrario su producción de etanol no es suficiente a escala
industrial. Además, la mayoría de los materiales de partida para producción bioetanol
dependen de las estaciones climáticas y de las locaciones geográficas. Otro problema presente
en los cultivos más empleados como es el caso del maíz y el almidón, es la necesidad de
implementar fertilizantes que erosionan los suelos empleados. Además, la lignina no puede ser
fermentada y su degradación biológica es muy difícil.
Las microalgas, han sido postuladas como potencial solución a los problemas en las materias
primas de los procesos de fermentación existentes (Heifetz et al., 2000). Las microalgas
proporcionan carbohidratos y proteínas que pueden emplearse como fuentes de carbono para
la fermentación, y últimamente se han reportado algas modificadas genéticamente que tiene la
capacidad de realizar fermentación de carbohidratos y producir alcohol. Además, presentan
una serie de ventajas comerciales y de sostenibilidad sobre los sistemas ya existentes. Estos
incluyen:
Crecen rápidamente con o sin presencia de suelo
Tiene el potencial de absorber CO2 y otros gases de invernadero para sus procesos
fotosintéticos, esto reduce la cantidad de estos gases en la atmosfera.
Poseen un ciclo muy pequeño de cosecha (~1-10 días) comparado con otras fuentes de
fermentación (cosecha en 1 a 2 años) y esto proporciona suficientes suministros para
satisfacer la demanda existente de producción de etanol (Báez et al. 2004).
7
A la fecha, pocos estudios reportan el uso de microalgas en la producción de bioetanol. Moen
et al., en 2008, demostraron que las algas marinas son un excelente sustrato en la producción
de bioetanol. Otro estudio realizado por Hirayama et al., en el 1998, proponen una auto-
fermentación de la biomasa de microalgas (que previamente fueron utilizadas en procesos
como la extracción de aceite) para producción de etanol. La técnica es simple y requiere un
tiempo de fermentación más corto que los de los sistemas convencionales. Ueda et al., en
1996 diseñaron un sistema detallado para fermentación de microalgas. En una primera etapa,
las células de Chlorella vulgaris fueron fermentadas en un ambiente anaeróbico de oscuridad
para producir el etanol. El etanol producido de los procesos fermentativos fue purificado y
utilizado como combustible. El CO2 producido fue recirculado y empleado en el cultivo de las
microalgas.
La segunda etapa comprende la utilización de la biomasa microalgal remanente en un proceso
de digestión anaeróbica. Este proceso produce metano, el cual puede usarse para producir
electricidad (Field et al., 1998). Hon-Nami en 2006, reportó que la fermentación de biomasa de
Chlamydomonas perigranulata, producía etanol, butanodiol, ácido acético y CO2.
Ilustración 2. Principales rutas metabólicas para la síntesis de almidón en microalgas.
Fuente: Radakovits et a.l, 2010
8
1.1.2. Chlamydomonas reinhardtii
Es un alga verde de aproximadamente 10 µm de tamaño, fotosintética. Su estructura celular es
eucariota similar a las plantas superiores con cloroplastos que tienen por lo general de 3 a 7
tilacoides agrupados en bandas, así como también pirenoides con gránulos de almidón
periféricos. Los tilacoides pueden estar organizados de manera semejante a los grana de las
plantas superiores. Los pirenoides se encuentran en muchas algas verdes y se ha demostrado
que constan de proteína y que contienen la enzima almidón sintetasa, la cual participa en la
producción de almidón. El nutriente de reserva primario es el almidón verdadero (Stern et al.
2009).
Ilustración 3. Estructura celular de C. reinhardtii.
Fuente: Nickelsen and Kück (2000).
En la Ilustración 3 se observa la estructura y organelos de la microalga detallados de la
siguiente manera: núcleo (N), nucléolo (Nu), flagelos (F), cloroplasto (C), mancha ocular ( E),
pirenoide (P), mitocondria (M), aparato de Golgi (G), gránulos de almidón (S) y vacuolas (V).
1.1.2.1. Ciclo de vida
En Chlamydomonas el ciclo de vida es muy variado y depende de las condiciones de
crecimiento que tengan las células. Las dos vías son la sexual y la asexual (Stern et al. 2009).
En la vía asexual, las células se dividen por mitosis y en la vía sexual lo hacen por meiosis.
9
La fase logarítmica de los cultivos es mantenida en un fotoperiodo de 12:12 (horas de luz :
oscuridad) a 22-25°C normalmente bajo dos o tres generaciones, en un periodo de 24 horas
toda la división en un ciclo toma lugar en una rápida sucesión en el periodo de oscuridad como
se indica en la Ilustración 4.
Todas las células hijas son retenidas dentro de la célula madre hasta que el periodo de división
es completado, y luego son liberadas por la acción de una enzima lítica, normalmente justo
antes del fin del periodo de oscuridad.
El número de divisiones en un ciclo de 24 horas es altamente dependiente de las condiciones
de crecimiento. En luz a 25°C normalmente las células se dividen 3 veces produciendo 8 hijas,
pero a baja luz o baja temperatura normalmente se dan solo dos divisiones (Andersen, 2005).
En la Ilustración 4 se observa un cultivo en ciclo 12:12, mostrando un incremento en el tamaño
celular al inicio del periodo de luz (hora 0) y posterior división en 8 células hijas en las
siguientes 2 - 4 horas del periodo oscuridad (hora 14 en adelante).
El otro tipo de reproducción es la sexual o meiótica. Como se observa en la Ilustración 5 las
células son haploides y en este género la célula vegetativa sufre cambios hasta funcionar como
un gametangio. Se divide y se forman 4, 8, 16 a 32 gametos flagelados, que son liberadas al
agua. Allí se unen dos gametos formando un huevo o cigoto. Este cigoto luego se divide
meióticamente dando cuatro zoosporas flageladas, las que aumentan de volumen dando una
célula vegetativa cada una, como se observa en la ilustración 5. Pueden crecer en un simple
medio de sales inorgánicas, también pueden crecer en la oscuridad total si se presenta una
Ilustración 4. Crecimiento de células en cultivo sincrónico.
Fuente: Harris, 2009
Hora 0 Hora 8
Hora 14 Hora 16
10
fuente alterna de carbono. En la división de las clorófitas, los flagelados inicialmente, poseen
clorofila a, b y carotenoides que amplían el espectro de calor para fotosintetizar (Stern et al.
2009).
Fuente: Karen VanWinkle-Swift, 2010
C. reinhardtii ha sido ampliamente utilizada como modelo en diferentes áreas como la biología
celular, molecular, en genética, en optimización de bio-procesos entre otras, debido
principalmente a que presenta una gran facilidad de ser cultivada en laboratorio tanto en
medios líquidos como sólidos y no es altamente estricta en sus condiciones de crecimiento.
Puede crecer autotrófica, mixotrófica o heterotróficamente y en diferentes condiciones
ambientales, esto ha permitido tener un amplio espectro de condiciones de crecimiento en
laboratorio, empezando por los medios de cultivo. Existen varios medios probados para el buen
crecimiento de esta microalga como se observa en la Tabla 3 Composición milimolar presente
en diferentes Medios de cultivo para C. reinhardtiisin embargo el más ampliamente usado es el
TAP (Tris–acetato–fosfato) (Stern et al. 2009).
Ilustración 5. Ciclo sexual y asexual en C. reinhardtii.
11
Tabla 3 Composición milimolar presente en diferentes Medios de cultivo para C. reinhardtii
Componente Sager-granick Eversole Sueoka Kuhl Bold TAP
Macronutrientes mM
NH4 3.7 93.5 9.35 6x10-5 - 7.48
K 1.88 0.52 22.12 10.0 2.70 1.94
Na 5.1 0.0027 0.27 5.5 3.37 0.27
Ca 0.36 0.09 0.068 0.10 0.17 0.34
Mg 1.2 2.03 0.081 1.0 0.30 0.41
Fe+3 0.37 - - - - -
NO3 3.7 - - 10.0 2.94 -
Cl 1.83 112.9 9.55 0.20 0.78 8.22
SO4 1.2 2.03 0.182 1.03 0.38 0.51
PO4 1.31 0.115 13.6 5.0 1.72 1.00
Tris - 50.0 - - - 20.0
Citrato 1.7 - - - - -
Acetato - - - - - 17.4
Nutrientes traza
Fe+2 - 1.79 17.9 25 17.9 17.9
Zn 3.5 7.65 76.5 1.0 30.7 76.5
Cu 0.25 0.63 6.3 0.001 6.3 6.3
Co 0.84 0.68 6.8 - 1.7 6.8
Mn 2.0 2.56 25.6 1.0 7.3 25.6
Mo 0.82 0.62 6.2 0.007 4.9 6.2
BO3 16 18.4 184 1.0 184 184
EDTA - 13.4 134 25 171.1 134
Fuente: Bold, 1942, Watanabe, 2005, Gorman y Levine, 1965.
C. reinhardtii crece muy bien en acetato, sin embargo otras fuentes de carbono han sido
probadas como glucosa, arabinosa y galactosa encontrando que aunque no es tóxico y no
inhibe el crecimiento, no permite un buen desarrollo de la cepa en condiciones de no
fotosíntesis. Como fuentes de nitrógeno se han probado con buenos resultados el amonio, el
nitrato, la urea, glutamina y arginina. El pH puede mantenerse en un rango de 7-8, para esto el
medio TAP presenta el mejor sistema de amortiguamiento (Grossman et al. 2007).
En la Tabla 4 se muestran las condiciones de cultivo para inóculos de experimentación a nivel
de laboratorio más recomendados (Andersen, 2005).
12
Tabla 4. Condiciones de cultivo en laboratorio para C. reinhardtii
Parametro Rango Recomendado
Temperatura (°C) 15-35 20-25
pH 6-8.5 7-8
Intensidad luz (μmol/m 2s PAR) 35-700 100
Fotoperiodo horas (luz:oscuridad) - 12:12
CO2 (%v/v) 0.03-5 1
Densidad celular (cell/mL) 1-5x106 3x106
Aireación (vvm) 0.5-3 1-1.5
Fuente: Forster et al., 2005
1.1.2.2. Luz y fotoperiodo
Dentro de los factores ambientales que más afectan el crecimiento de las microalgas se
encuentra a la luz como uno de los más relevantes. En la naturaleza la intensidad de la luz
puede encontrarse en algunos lugares lo suficientemente baja como para no permitir que la
población se desarrolle de manera adecuada, o por el contrario, lo suficientemente alta como
para actuar de manera inhibitoria sobre las células. La intensidad de saturación o inhibición
depende de manera conjunta de otros factores ambientales como la temperatura, los niveles de
CO2 y la disponibilidad de nutrientes (Andersen, 2005).
Del espectro completo que emite la luz, el rango que es eficientemente asimilado por las
microalgas se encuentra entre los 400 y 700 nanómetros (nm) como se observa en la
Ilustración 6, esta parte del espectro solar es llamado radiación fotosintética activa (siglas en
ingles PAR) (Jacob-Lopes et al., 2008).
En los proyectos de investigación en microalgas conviene más utilizar luz artificial dentro de los
laboratorios en lugar de usar la luz del sol, con la intención de minimizar el error aportado por la
alta variabilidad en radiación a lo largo del día. Además, se sabe que en los procesos que se
usan piscinas o sistemas abiertos tipo estanques (ponds), la agitación se vuelve un factor
limitante en la eficiencia fotosintética ya que la concentración de luz transmitida a la superficie
del estanque va disminuyendo a medida que aumenta la profundidad del mismo, como se
observa en la Ilustración 7.
En la Ilustración 8 se observa la velocidad específica de crecimiento de C. reinhardtii bajo
diferentes intensidades de luz, encontrando su máxima en un intervalo entre 400-650 µmol/m/s.
Este intervalo de iluminación es el más ampliamente utilizado en investigación con C.
reinhardtii.
13
Ilustración 6. Espectro de absorción de luz por microalgas y cianobacterias.
Fuente: Marcel Jensen, 2004.
Ilustración 7. Comportamiento de la intensidad lumínica a través del pond. (Flecha señala el fondo del
pond)
Fuente: Marcel Jensen, 2004.
14
Ilustración 8. Velocidad de crecimiento de C. reinhardtii bajo diferentes intensidades de luz.
Fuente: Marcel Jensen, 2004.
De manera paralela a la intensidad de la luz, los ciclos de fotoperiodo son otro factor relevante
en el crecimiento de las microalgas y cianobacterias. Como se ve en la Ilustración 9 e
Ilustración 10, Eduardo Jacob-López et al., en 2008, reportaron el efecto de los fotoperiodos en
el crecimiento, acumulación de biomasa y fijación de carbono inorgánico en una cianobateria.
Ellos encontraron que los ciclos de fotoperiodo en los que prevalece la luz sobre la oscuridad
favorecen el crecimiento y por tanto la fijación de carbono como se ve en las gráficas de la
Ilustración 9, además de que en cianobacterias aún no está demostrada la capacidad de
acumular energía fotosintética para la fase de oscuridad (Stephanopoulos, 1998).
15
Ilustración 10. Porcentaje de fijación de CO2 vs disminución del tiempo de luz en el cultivo de
Aphanothece microscopica
Fuente: Eduardo Jacob-Lopes et al, 2008
Ilustración 9. Curvas de crecimiento en diferentes ciclos oscuridad:luz para Aphanothece microscopica
16
En C. reinhardtii, el efecto que tiene la intensidad de la luz y los fotoperiodos aplicados al
cultivo ha sido estudiado con diferentes propósitos. Pedro J. Aparicio et al., en 1985 estudiaron
el efecto que tiene la intensidad de la luz en la producción de hidrógeno encontrando que
cuando el cultivo es expuesto a bajas irradiancias (30 µE.m2.s-1) o total oscuridad, la
producción de hidrógeno aumenta y se hace constante hasta por 50 horas (Mittag, 2005).
La luz y el fotoperiodo también tiene una implicación bastante importante en el ritmo circadiano
de la célula. Mittag et al., en 2005, reportaron la influencia de los fotoperiodos y la intensidad de
la luz en los ciclos circadianos de C. reinhardtii. Los ritmos o ciclos circadianos son programas
de regulación endógena que controlan procesos metabólicos, fisiológicos y de motilidad celular.
Modulan procesos como la foto-acumulación o fototaxis, quimiotaxis hacia nutrientes, por
ejemplo hacia las fuentes de nitrógeno en total oscuridad, la capacidad celular de adhesión a
las superficies de vidrio y la división celular entre otros (Jansenn et al., 2004.)
La presencia de luz en cultivos de C. reinhardtii también es fundamental en procesos de
transporte carbono inorgánico. Yamano et al., en 2010, demostraron la influencia de la luz en la
producción de la proteína LCIB transportadora de carbono inorgánico al interior del cloroplasto
como se observa en la Ilustración 11, cuando al quitarse el suministro de luz, la proteína
marcada fluorescentemente se disocia en la célula perdiendo su función.
Fuente: Yamano et al, 2010
C. reinhardtii es una de las microalgas reportadas con mayor potencial para la obtención de
metabolitos de interés en la mayoría de sectores que se mencionaron anteriormente. Esta
microalga tiene la capacidad de crecer autótrofamente usando CO2 y luz, mixótrofamente
usando acetato y luz y heterótrofamente usando solo fuentes de carbono orgánicas
principalmente el acetato.
Ilustración 11. Agregación de la proteína LCIB en presencia de luz.
17
1.1.2.3. Crecimiento autotrófico
Chlamydomonas reinhardtii tiene de manera natural los mecanismos fisiológicos requeridos
para crecer en autotrofia inclusive cuando la concentración de CO2 es baja. El proceso de
fotosíntesis realizado por esta microalga proporciona el potencial reductor necesario para que
se dé la fijación de CO2 por el ciclo de Calvin. Como se observa en la Ilustración 12 la
fotosíntesis aporta a la célula el ATP y NADPH+ necesarios para que posteriormente se fije el
carbono que ha entrado a la célula en forma de CO2 o HCO3 (Stern et al., 2009). El mecanismo
de fijación requiere de la concentración de carbono inorgánico cerca del pirenoide donde se
ubica la enzima RuBisCo que es la que realiza la primera parte del ciclo de fijación. Si la
concentración es como la del aire o más alta, el ciclo de Calvin es la ruta que se usa
(Ilustración 13), si es más baja, se usa una vía alterna similar a la de las plantas, la vía C4
Ilustración 14.
Ilustración 12 proceso de fotosíntesis en Chlamydomonas reinhardtii
Fuente: tomada de http://www.kegg.jp
18
Ilustración 13. Ciclo de Calvin Benson.
Fuente: Takashi yamano et al, 2008
Ilustración 14. Via C4 en plantas
Fuente: Takashi yamano et al, 2008
Este modelo autotrófico de crecimiento es el más ampliamente utilizado por las microalgas de
manera natural ya que utiliza como fuentes de carbono y energéticas sustratos de fácil
adquisición en los ecosistemas naturales. También es el modelo preferido en los escenarios de
investigación y producción de biomasa de microalgas de manera artificial, ya que además de
19
ser su metabolismo natural, estos procesos involucran el secuestro de CO2 que al ser un gas
de efecto invernadero provoca la investigación sobre su reducción ambiental (Grossman et al.,
2007).
Los cultivos de C. reinhardtii crecidos en autotrofia al igual que otras microalgas varían sus
parámetros cinéticos y composición bioquímica según los mecanismos usados en el cultivo
como medio de cultivo, irradiación, ciclos de luz: oscuridad, relación nitrógeno-fósforo, cantidad
de CO2, estrategia de cultivo (continuo, discontinuo, lote) entre otros, así se tiene que la
composición y productividad de un cultivo de esta microalga puede variar ampliamente de un
sistema a otro. Por ejemplo, en la Tabla 5 se observa los resultados obtenidos por Nanette R.
Boyle and John A. Morgan en el 2009, la composición de la biomasa de Chlamydomonas
reinhardtii obtenida vía fotosintética con una velocidad de crecimiento de 0.066 ± 0.007 h-1,
usando medio TAP a 25°C con agitación de 200 rpm, irradiación de 65 µE/m2/s, CO2 0.03% y
ciclos de 16:8 (Stern et al., 2009).
Tabla 5. Composición bioquímica de la biomasa de Chlamydomonas reinhardtii crecida en
autotrofía
Componente celular Composición porcentual de la biomasa total
Carbohidratos 50.8
Proteína 26.1
Lípidos 18.9
Clorofila a 0.9
Clorofila b 1.5
Fuente: Nanette R Boyle and John A Morgan, 2009.
De manera comparativa, Anna M. J. Kliphuis et al en 2011, cultivaron Chlamydomonas
reinhardtii en fotosíntesis obteniendo los resultados que se muestran en la Tabla 6.
El medio de cultivo usado TAP a 25°C con agitación de 200 rpm, irradiación de 45 µE/m2/s,
CO2 0.03% y ciclos de 16:8.
Tabla 6. Composicion de la biomasa de Chlamydomonas reinhardtii en autotrofía.
Componente celular Composición porcentual de la biomasa total
Proteína 40.23
Carbohidratos 25.47
Lípidos 17.28
DNA 0.21
20
Fuente: Anna M. J. Kliphuis et al, 2011
1.1.2.4. Crecimiento heterotrófico
En el crecimiento heterótrofo, las células son crecidas en oscuridad utilizando una fuente de
carbono orgánica como el acetato y el oxígeno como aceptor de electrones. Los productos del
metabolismo son el CO2 y el agua. Ya que en el metabolismo heterótrofo la fuente de carbono
actúa a la vez como fuente de energía, el rendimiento del carbono celular es mucho menor
comparado con la biomasa fotosintética que usa a la luz como fuente de energía.
Debido a que el cultivo de microalgas vía heterotrófica se asemeja al ya conocido cultivo de
bacterias y no implica el desarrollo de fotobiorreactores y sistemas de iluminación, los costos
de producción y operación de los sistemas pueden reducirse considerablemente. Sin embargo
el uso de fuentes de carbono como glucosa o acetato no es económicamente viable a escala
industrial, por lo cual se ha explorado el uso de otras tecnologías como la ingeniería genética
para reducir costos. En el caso de C. reinhardtii, se ha probado una modificación para que la
cepa fotótrofa sea heterótrofa obligada, aumentando sus rendimientos de lípidos y justificando
así el uso de fuentes orgánicas costosas (Aparicio et al. 1985 ).
Sin embargo, en el tema energético, esta microalga pese a tener potencial, aun no produce las
cantidades de metabolitos que se requieren para que un proceso sea totalmente competitivo.
Hoy en día se han identificado varios cuellos de botella en cada una de las etapas de
producción de metabolitos para biocombustibles. Ejemplificando en el caso de producción de
aceites para transesterificación, se identifican desafíos muy grandes en las etapas de cultivo,
cosecha, extracción y manejo de residuos, es decir en todas las etapas del proceso. Sin
embargo una ventaja que tiene este proceso es que comparte tecnología con los procesos de
industrias establecidas hace muchos años. En la etapa de separación de biomasa, de
extracción de aceites y de transesterificación, se han logrado tener homologaciones de
tecnología muy importantes. Sin embargo, en la fase de cultivo y selección de cepas, las
tecnologías no resultan muy homologables, y se requiere investigar mucho más en esta fase
para obtener un organismo que pueda satisfacer la demanda del proceso. En la Tabla 7 se
puede observar lo que para estos autores en 2010 se consideran rendimientos que pueden
RNA 5.99
Clorofila 5.14
cenizas 5.68
21
llegar a ser competitivos con el combustible fósil a nivel comercial, y se ve también los
resultados más optimistas hasta esta fecha en procesos inferiores a escala industrial.
Tabla 7. Rendimientos esperados y observados de la tecnología.
Criterio Esperado Observado
Rendimiento de alga por
hectárea por año (Ton)
150 5-70
% de aceite por biomasa seca 30 4-25
Fuente: NREL document learned lessons ASP program 2010
Esta realidad, ha impactado diversos sectores del mundo energético. En algunos casos, se ha
estimulado el desarrollo de nuevas y diferentes tecnologías (optimización en procesos de
separación de biomasa y extracción de acetites), en otros se ha profundizado en la
investigación a nivel genético de las microalgas. Muchas empresas han cesado sus actividades
al encontrarse en una escala piloto o semi-industrial con que sus productividades no alcanzan
lo mínimo necesario. Otras, por el contrario, como es el caso de Solazyme (www.
Solazyme.com) o Sapphire Energy (www.sapphireenergy.com), han buscado apoyo económico
externo para financiar sus actividades de contingencia ante esta lamentable realidad. Por
ejemplo, estas empresas, han enfocado sus investigaciones en la primera etapa del proceso,
basándose en lo que se describió arriba: que en las etapas corriente abajo del cultivo otras
tecnologías ya existentes pueden colaborar mucho, por lo que sus esfuerzos se enfocan
principalmente a la búsqueda de cepas con potenciales muy altos; a la reducción de costos de
cultivo mediante uso de materiales económicos; y a la modificación genética y metabólica de
las cepas de microalgas. A esta última opción (modificación genética, silenciamiento de rutas
metabólicas) ha enfocado sus esfuerzos Solazayme, encontrando rendimientos de biomasa y
aceites muy superiores a los convencionales (150g/L de biomasa seca con 70-75% de aceite.
1.1.2.5. Crecimiento mixotrófico
Chlamydomonas reinhardtii es facultativa, capaz de crecer mixótrofamente en acetato, pero no
tan bien en glucosa u otra fuente de carbono similar (Field, 1998). Muchos estudios de estrés y
regulación de luz han sido llevados a cabo en células crecidas usando acetato. Heifetz et al.,
en 2000, se interesaron por el efecto del acetato en la fotosíntesis y en procesos relacionados.
El acetato es metabolizado a triosa, seguidamente y en vía dependiente de ATP, entra al ciclo
22
del glioxilato, si el carbono inorgánico es reducido a triosa durante la fotosíntesis (ver
Ilustración 15) (Stern, 2009).
Ilustración 15. Vía metabólica del glioxilato, asimilación del acetato por C. reinhardtii.
Fuente: Allmer et al, 2006
El metabolismo del acetato puede afectar negativamente la utilización del carbono inorgánico.
Estudios previos han reportado que el acetato inhibe la fotosíntesis y simula la respiración de
células en presencia de luz y posiblemente incrementa la actividad oxidasa alternativa (Nielsen
y Villadsen, 1994).
La capacidad del acetato para inducir liasa-isocitrato, enzima clave en el ciclo del glioxilato, es
atenuada en presencia de luz y carbono inorgánico (Nielsen y Villadsen, 1994). Por el contrario,
el acetato reprime la expresión de proteínas de cloroplasto involucradas en la captura de luz y
fijación de carbono.
Sin embargo, Heifetz et al., en 2000, encontraron que pese a la disminución de la actividad
fotosintética en presencia de acetato, la velocidad de crecimiento no disminuía manteniendo
valores muy similares a medida que aumentaba la concentración de acetato.
Como se ve en la Tabla 8 la velocidad de crecimiento no varía considerablemente en presencia
de acetato, sin embargo la fijación de carbono inorgánico sí lo hace, lo cual indica el aumento
en la fijación de carbono orgánico en detrimento de la fijación del inorgánico.
Tabla 8. Influencia del acetato en la fotosíntesis de C. reinhardtii.
Acetato mM Tasa de crecimiento h-1 Fotosíntesis (fijación de CO2)
0 0.149 465
3.7 0.162 308
7.4 0.153 360
14.7 0.153 257
23
29.4 0.148 207
Fuente: Heifetz et al., en 2000
De manera comparativa con la Tabla 5 en ese mismo estudio se realizó un crecimiento
mixotrófico de Chlamydomonas reinhardtii para evaluar las diferencias composicionales. Lo
resultados se muestran en la Tabla 9
Tabla 9. Composición bioquímica de la biomasa de C. reinhardtii crecida en mixotrofía.
Componente celular Composición porcentual de la biomasa
Carbohidratos 38.1
Proteína 30.3
Lípidos 27.9
Clorofila a 0.7
Clorofila b 1.3
Fuente: Nanette R Boyle and John A Morgan, 2009
En mixotrofía se presentan como productos del crecimiento los relacionados tanto al
crecimiento autótrofo como heterótrofo, esto es, oxígeno, agua y CO2. Usando balances
estequiométricos entre estos productos y los sustratos del cultivo se pueden estimar las
diferencias entre el metabolismo autótrofo y el mixótrofo de la cepa, determinando así los flujos
de carbono en la red para realizar una posible modificación sobre el sistema que permita
obtener más de algún metabolito en especial (Kliphuis et al. 2011). Debido a la variación en la
distribución del carbono en cada esquema de crecimiento (mixo, auto y heterotrofia), los
rendimientos celulares varía, y esto se ve relacionado de manera directa con la productividad
de biomoleculas internas como los lípidos.
En la Tabla 10 se observa que el rendimiento fotosintético es mayor y que el 100% del carbono
fotosintético es usado para sintetizar material celular.
Tabla 10. Rendimiento del carbono fijado en tres metabolismos diferentes en C. reinhardtii
Condición de crecimiento Rendimiento (g biomasa/mol carbono)
Autotrófico 28.9
Heterotrófico 15.6
Mixotrófico Incrementa cuando incrementa la intensidad de luz
13.5 a 22.9
Fuente: Nanette R Boyle and John A Morgan, 2009
24
Como se observa en esta tabla, en el crecimiento mixotrófico el rendimiento de carbón fijado
aumenta a medida que aumenta la luz, esto quiere decir que a medida que aumenta la
actividad fotosintética la fijación de carbono inorgánico se establece predominante y la fuente
de energía se diferencia del carbono (Kliphuis et al. 2011).
1.1.3. Compartimentalización metabólica
La compartimentalización celular es la diferenciación de proteínas y procesos bioquímicos de
síntesis y degradación especializada en organelos que permite a la célula realizar funciones
específicas en zonas particulares de su estructura (Atteia A, 2009).
Es muy conocido que en el caso de las microalgas el cloroplasto resulta ser uno de los
organelos más funcionales de la célula, ya que es allí donde se realizan funciones vitales como
la fotosíntesis y fijación del CO2 entre otras.
El almidón es sintetizado y degradado también en el cloroplasto en los ciclos de luz: oscuridad.
Bajo condiciones de no estrés el almidón parece ser el material de reserva preferido por las
células de C. reinhardtii, pero cuando hay condiciones de estrés, las células aumentan la
acumulación de lípidos (Spalding, 2009).
Como ya se ha dicho, bajo condiciones de mixotrofía C. reinhardtii puede asimilar CO2 y
acetato como fuentes de carbono.
El acetato es incorporado a la célula e inmediatamente transformado en AcCoA (Acetil CoA)
principalmente por dos vías mediadas por ATP, una vía lo hace de manera directa y la otra vía
involucra dos enzimas en dos pasos hasta llegar a AcCoA.
En cultivos heterótrofos (oscuridad), la asimilación de acetato esta reportada para metabolismo
aerobio (respiración) pero no para el anaerobio (fermentación) (Xenie Jonhson, 2013).
El AcCoA es utilizado en el ciclo TCA (ácidos tricarboxilicos) para obtener 3 moléculas de
NADH, 1 de FADH2, 2 de ATP y 2 de CO2, el NADH y el FADH2 son oxidados en la cadena
respiratoria para producir más ATP. Cuando el ATP está presente, el oxalacetato es convertido
en fosfoenol piruvato (PEP), este PEP es utilizado en la gluconeogénesis hasta llegar a
glucosa. Así las células de C. reinhardtii crecidas en la oscuridad y con acetato en condiciones
aeróbicas acumulan almidón. Posteriormente cuando el acetato se acaba, el almidón es
degradado por via glucolisis para proveer de ATP y NADH al sistema.
La via de las pentosas fosfato puede actuar de diferentes ―modos‖, un modo consume ATP,
para liberar estructuras de carbono requeridas en otras vías sintéticas, otro modo libera poder
reductor y un tercer modo esta acoplado a la parte alta de la vía de glicolisis, el cual produce
ATP, NADPH y CO2. Estos modos se activan y desactivan dependiendo de las necesidades
25
energéticas del sistema. La vía de las pentosas fosfato puede ser considerada como una vía
alterna a la parte alta de la glicolisis: G6P puede ser convertida en F6P (Xenie Jonhson, 2013).
En C. reinhardtii se encontró que la vía glicolítica está altamente compartimentalizada. Esta vía
es dividida en dos parte, una parte alta, que va desde la glucosa hasta el G3P (gliceraldehido 3
fosfato) ubicada en el cloroplasto y una parte baja que va desde el G3P hasta el piruvato,
ubicada en el citosol. En la tabla se muestra la compartimentalización de diferentes enzimas
participantes en las principales vías del metabolismo del carbono en C. reinhardtii
Tabla 11. Compartimentalizacion de enzimas presentes en el metabolismo central del carbono en C. reinhardtii.
Enzima Reacción Mit Cit Clor
Síntesis de almidón
amilasa Almidón -> glucosa - - √
Almidón fosforilasa Almidón -> G1P - - √
fosfoglucomutasa G1P -> G6P - - √
Glicolisis
Hexokinasa Glucosa + ATP -> G6P - - √
ADP-glucosa pirofosforilasa ADP- glucosa <- G1P + ATP - - √
Fosfoglucosa isomerasa G6P -> F6P - - √
Fosfofructokinasa F6P + ATP -> F16P - - √
Fructosa 1,6 bifosfatasa F6P <- F16P - - √
Fructosa bifosfato aldolasa F16 <-> G3P - - √
Triosa fosfato isomerasa G3P <-> DHAP - - √
Gliceraldehido fosfato deshidrogenasa G3P <-> G13P - √ √
Fosfoglicerato kinasa G13P <-> 3PGA - √ √
Fosfoglicerato mutasa 3PGA <-> 2PGA - √ -
Enolasa 2PGA <-> PEP - √ -
Piruvato kinasa PEP -> Piruvato + ATP - √ -
Fosfoenol piruvato carboxikinasa PEP + HCO3 -> oxalacetato + GTP - √ -
Fosfoenol piruvato carboxilasa PEP + HCO3 -> oxalacetato - √ -
Vía pentosas fosfato
Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa G6P ->6-PGL + NADPH - √ √
6 fosfogluconato deshidrogenasa 6-PGL ->Ru5P + NADPH + CO2 - √ √
Asimilación de acetato
Acetil-coa sintetasa AcCoA <- acetato + ATP √ √ √
Fosfato acetil transferasa AcCoA <- Acetil-P √ - √
26
Acetato kinasa Acetil-P <- acetato + ATP √ - √
Síntesis de lípidos
Acetil-coa carboxilasa Malonil-Coa <- Actil-Coa + ATP +
HCO3
- - √
B- cetoacetil sintetasa, ácido graso
sintetasa
FA + HCO3 <- ac-Coa + ma-Coa +
NAPH
- - √
Glicerol 3 fosfato deshidrogenasa Glicerol 3P <- DHAP + NADPH - - √
Mit: mitocondria, Cit: citosol, Clor: cloroplasto.
(-): ausencia
(√): presencia
Fuente: Xenie Jonhson, 2013
Ball en 1998 realizo ensayos con carbono marcado radioactivamente que demostraron que el
cloroplasto de C. reinhardtii exporta un 23% de 3-PGA (acido 3 fosfoglicerico), 15% de DHAP
(dihidroxi acetona fosfato), 20% de hexosas fosfato y 13% de glicolato formados en presencia
de luz y CO2.
En condiciones heterotróficas, la fosforilación oxidativa está sustentada por la asimilación de
acetato que alimenta el ciclo TCA, y el ATP producido allí es exportado fuera de la mitocondria.
Si el ATP es abundandte en el citosol, esto puede reversar la actividad de la fosfoglicerato
kinasa en el citosol y así permitir la liberación de 1,3BPG (1,3-bifosfoglicerato) y G3P. Este G3P
es importado al cloroplasto donde una parte es usada para la síntesis de hexosas
(gluconeogenesis), la otra parte puede ser oxidad y desfosforilada en cloroplasto produciendo
ATP y 3PGA, este último puede ser retornado al citosol, donde podría ser tenido en cuenta
para la síntesis de almidón en la oscuridad (Harris, 2009).
Biosíntesis de lípidos en Chlamydomonas reinhardtii
Así como en el caso del almidón, los precursores para síntesis de ácidos grasos están en el
cloroplasto. La acumulación y posterior activación de AcCoA y malCoA (malonil-CoA) en el
cloroplasto, origina la ruta de síntesis de ácidos grasos. Aunque no está aún clara la interacción
del CO2 y el acetato en el origen de AcCoA, se presume que la via que viene desde el 3-PGA a
PEP es la principal ruta de acción (Fan J, 2011).
Se sabe que la síntesis de ácidos grasos más importante que se lleva a cabo bajo condiciones
de no estrés es la de lípidos polares asociados a constituyentes celulares como los de las
membranas. La síntesis de lípidos constituidos por triacil gliceroles (TAG`s) que son los ácidos
grasos importantes en la fabricación de biodiesel, está asociada a condiciones de estrés,
donde las células inician un proceso de acumulación de TAG`s como material de reserva
27
energético que posteriormente puede ser utilizado por vía de la beta oxidación de ácidos
grasos (Nguyen HM, 2011).
La acumulación de lípidos neutros en C. reinhardtii por estrés nutricional puede deberse a
procesos multifactoriales. Una condición altamente conocida y aplicada en la industria es la
deprivación de nitrógeno en el medio. Bajo este modelo de crecimiento la célula inicia una alta
acumulación de TAG`s como material de reserva dando altos rendimientos lipídicos (Fan J,
2011). Esta técnica es muy promisoria, aunque tiene dos aspectos claves en la manipulación.
Primero, bajo limitación de nitrógeno, el crecimiento celular es reducido, lo cual implica que
para obtener algo de aumento en la biomasa se tendrá que usar el material energético
acumulado. Y segundo, la deprivación de nitrógeno también induce la anulación del aparto
fotosintético, lo cual obliga a el uso de fuentes de carbono externas del tipo orgánicas,
haciendo esto que se deban revalorar los niveles costo-efectivos de la producción de lípidos.
En condiciones de autotrofía donde el CO2 es la única fuente de carbono, la vía de
acumulación de almidón es la vía más eficiente en reserva de carbono, por otra parte la
acumulación de ácidos grasos es un proceso que deriva en un mayor gasto energético y
perdida de carbono, por tanto no es el principal proceso de acumulación de materiales
energéticos en sistemas sin limitación de nutrientes. Finalmente cabe resaltar que
investigaciones relacionadas al efecto dual en la acumulación de lípidos y almidón han
mostrado diversos resultados, y que las pruebas fehacientes del mecanismo energético
utilizado por C. reinhardtii para estos casos aún no están muy claras (Xenie Jonhson, 2013).
1.1.4. Ingeniería metabólica.
La ingeniería metabólica es un área que incluye la construcción, re-direccionamiento y
manipulación del metabolismo celular a través de actividades enzimáticas heterólogas y/o
endógenas a niveles que permiten la biosíntesis o biocatálisis de compuestos deseados
(Palsson, 2009). Los investigadores en ingeniería metabólica, parecen ver a las células como
fábricas bioquímicas que transforman un material en un compuesto de valor agregado. Debido
a que los rendimientos y productividades de los procesos están ligados a su viabilidad
comercial, la capacidad de regular de manera precisa el flujo de energía y material a través de
vías celulares se convierte en un punto crítico en la optimización del proceso, ofreciendo
alternativas a la ingeniería tradicional o a los procesos de diseño químico (Báez et al. 2004).
La aplicación de la ingeniería metabólica comienza con un análisis de una función celular
especifica (puede ser una ruta o grupos de rutas metabólicas) basada en los resultados de este
análisis se diseñan cepas mejoradas y subsecuentemente se construyen con ingeniería
genética. Simultáneamente se determinan las condiciones ambientales que propician la
28
producción del conjunto enzimático para conducir el metabolismo hacia la obtención del
producto requerido.
Algunos de los campos en los que más ha incidido la ingeniería metabólica son [11]:
Producción de proteínas heterólogas
Extensión de la gama de sustratos de un microorganismo
Rutas metabólicas para nuevos productos
Rutas metabólicas para la degradación de xenobióticos
Mejoras en la fisiología celular total
Eliminación o reducción de la formación de subproductos
Mejoras de los rendimientos o productividad
Fuente: Randor Radakovits et al, 2010
El comportamiento celular no puede ser explicado solamente considerando los elementos
constitutivos de la célula, el metabolismo celular comprende un gran número de rutas
metabólicas (Harris, 2009). Además, los procesos biológicos presentan relaciones complejas y
tienen un comportamiento cinético no lineal y heterogéneo por lo que es deseable la
construcción de modelos matemáticos que describan éstos procesos y permitan el análisis de
sistemas biológicos complejos.
Ilustración 16. Principales rutas metabólicas de C. reinhardtii en fotoautotrofía.
29
Los modelos estequiométricos basados en representaciones del metabolismo celular
comparten dos características: el uso de una red metabólica y el asumir estado pseudo-
estable. Estos modelos derivan de una red metabólica del microorganismo bajo investigación
por lo que la información de las reacciones estequiométricas involucradas en la red metabólica
es el punto de inicio; además, desprecian el comportamiento dinámico intracelular, asumiendo
el estado pseudo-estable de los metabolitos intracelulares. Las dos razones principales para
utilizar esta suposición son: primero, porque esto evita las dificultades en el desarrollo del
modelo cinético lo cual es una consecuencia de la falta de mediciones intracelulares
experimentales y segundo porque sólo el análisis estructural del metabolismo proporciona
información acerca de las características del estado estable de la célula bajo estudio (Baker et
al. 2007).
Los modelos estequiométricos han sido utilizados para estimar la distribución de los flujos
metabólicos bajo circunstancias dadas en la célula a un momento determinado (análisis de
flujos metabólico), para predecir los flujos sobre la base de alguna hipótesis optimizada
(análisis de flujo de balance) y como herramienta para el análisis estructural del metabolismo
(Nielsen y Villadsen, 1994).
Una de las grandes contribuciones de la ingeniería metabólica a la biología y a la biotecnología
es la integración del análisis macroscópico de un bioproceso como la fermentación y el análisis
microscópico de las reacciones de los metabolitos intracelulares como la red de reacciones
Enzimáticas (Stephanopoulos, 1998).
1.1.5. Modelos estequiométricos del crecimiento celular
1.1.5.1. Modelo de caja negra
En este modelo la biomasa celular es considerada una caja negra que intercambia material con
el ambiente, como se muestra en la Ilustración 17, y procesando esto a través de muchas
reacciones celulares agrupadas en una, normalmente el crecimiento de la biomasa. Los flujos
de entrada y salida de la caja negra son: tasas de consumo de sustratos y tasas de formación
de productos. Adicionalmente hay una acumulación de biomasa dentro de la caja negra que es
representado por un flujo particular que es la tasa especifica de crecimiento µ (Klamt et al,
2002). Se considera entonces una sola reacción:
S + N + O2 X + P+ CO2 Ecuación 1
Dónde:
S: sustrato carbonado.
30
N: fuente de nitrógeno.
X: biomasa.
P: producto.
Esto implica que todos los rendimientos de biomasa en sustrato (así como los de otros
compuestos consumidos y producidos por la célula) permanecen constantes.
Consecuentemente la tasa de captación de sustrato es proporcional con la tasa específica de
crecimiento de la biomasa:
-qs= Yxs. µ Ecuación 2
Dónde:
qs: tasa de consumo de sustratos.
Yxs: rendimiento de biomasa en sustrato.
µ: tasa especifica de crecimiento.
rs rp
µ
Ilustración 17. Modelo de caja negra.
La ecuación 1 podría ser esquematizada en una matriz elemental E de m sustancias y n
elementos obteniendo:
Que puede reacomodarse como:
Gl=m-n Ecuación 3
Donde Gl: son los grados de libertad de la matriz E.
Si la resta entre los elementos que componen las diferentes sustancias y las sustancias es de
por ejemplo 1, esto significa que se requiere medir una sustancia en el sistema para satisfacer
los grados de libertad. Con el valor de esta sustancia medida, se podrán calcular los valores
correspondientes a las sustancias no medidas. La cantidad de sustancias que se midan serán
las restricciones que tendrá el sistema, y esto le otorgara la característica de
sobredeterminado, subdeterminado o determinado.
31
1.1.5.2. Análisis de flujos metabólicos
Al conjunto de coeficientes de reacción en una ruta metabólica se le llama distribución de flujos
metabólicos. La fisiología celular puede ser interpretada y comprendida observando la
distribución de flujos metabólicos bajo las condiciones de investigación de una fermentación. El
impacto de una modificación genética sobre metabolismo en un microorganismo determinado
puede ser estudiado comparando la distribución de los flujos entre la cepa sin modificación del
microorganismo y la del microorganismo recombinante en el cual, un gen específico ha sido
introducido, mejorado o borrado genéticamente (Llaneras et al. 2008).
Si se conocen las rutas o redes metabólicas del microorganismo que se piensa analizar, se
pueden calcular los flujos metabólicos internos con la ayuda de flujos externos o tasas o
rendimientos del proceso como se observa en la ¡Error! No se encuentra el origen de la
eferencia..
Ilustración 18. Distribución de flujos de una red metabólica hipotética.
Fuente: Jan Tanis, 2006.
El punto de inicio para realizar este análisis es el establecimiento de la red o redes metabólicas
que se piensas usar en el modelo. Una red metabólica está definida por un conjunto de
compuestos (nodos) y un conjunto de reacciones o flujos que conectan un compuesto con otro
(flechas) como se ve en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.. La
nformación genómica es un buen punto de inicio para la reconstrucción de una ruta metabólica.
32
De allí se obtienen tanto las enzimas que participan en una ruta como el conjunto completo de
proteínas que pueden participar (Stephanopoulos, 1998).
En la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. se esquematiza que el flujo 3 y 4
orman una reacción reversible. Esto significa que B o D pueden ser transformados de vuelta a
su estructura química original. En muchos documentos esta reacción es dividida en 2 flujos
separados, lo cual resultara en flujos positivos en lugar de una mezcla de flujos positivos y
negativos.
El criterio más importante en el análisis de flujos metabólicos es la consideración del estado
estable en el sistema. Esto significa que todas las concentraciones de intermediarios
metabólicos en el modelo son constantes, en otras palabras, que su cambio en el tiempo debe
ser igual a 0. Esta consideración es hecha debido a que los cambios en las concentraciones de
los metabolitos son mucho más rápidos que los cambios en la tasa de crecimiento o en la
dinámica extracelular. Este estado estable puede ser escrito en ecuaciones en términos de
balance de masa. Estas ecuaciones describen el cambio de concentración sobre el tiempo
basado en los flujos a través de la red metabólica. El cambio de concentración es la diferencia
entre las tasas en las cuales el metabolito es producido o consumido. Un ejemplo de
ecuaciones de balance de masa extraído de la ¡Error! No se encuentra el origen de la
eferencia., se presenta en la ecuación 4.
dA/dt = -q1+b1
dB/dt = q1+q4-q2-q3
dC/dt= q2-q5-q6-b2
dD/dt = q3+q5-q4-q7-b3
dE/dt = q6+q7-b4 Ecuación 4.
En la Ilustración 18, los flujos Vi se reprensentan por la letra q en la ecucion 4.
La información estequiométrica involucrada en una ruta metabólica con m metabolitos y n
reacciones puede ser representada por una matriz estequiométrica (M) en la cual, los
renglones corresponden a los metabolitos y las columnas a las reacciones. Esta matriz es muy
importante ya que representa la transformación del conocimiento biológico en términos
matemáticos.
Una vez que la matriz es establecida, los balances de masa que involucran a los metabolitos
intracelulares pueden ser representados por la ecuación diferencial ordinaria (Nielsen y
Villadsen, 1994):
33
Un balance de sustancias al interior de las células conduce a:
q q Ecuación 5
Donde x es la fracción masa de la sustancia en la biomasa, Y es la matriz estequiométrica de
las reacciones metabólicas, qI el vector de las de intercambio, llamadas todas de manera
genérica ―flujos metabólicos‖.
Esta es la ecuación de balance de masa dinámico y describe la evolución sobre el tiempo de la
concentración de cada metabolito, Esta ecuación implica que, para conocer la evolución
dinámica de los metabolitos intracelulares, información acerca de la estequiometría (M),
crecimiento de biomasa (μ) y las reacciones de los flujos intracelulares debe ser conocida
Si las concentraciones de la biomasa se encuentran en estado estable o equilibrio dinámico
nos referimos a ese estado como crecimiento balanceado y entonces,
Ecuación 6
La mayor parte de las sustancias se encuentran a muy baja concentración, estos
―intermediarios metabólicos‖ que son usualmente moléculas pequeñas contribuyen muy poco a
la biomasa total y para ellas,
Ecuación 7
De manera general pueden encontrarse ciertos flujos en función de otros, como se hace con
los modelos de caja negra. Para esto puede acomodarse la ecuación 7 como:
q q (
) (
q
q )
Donde M es una matriz metabólica que incluye tanto la información del metabolismo como la de
intercambio. De esta manera, pueden encontrarse algunos flujos en función de otros como se
mostrará más adelante.
Este análisis establece un mapa que proporciona información acerca de la contribución de
cada reacción a todo el proceso metabólico de consumo de sustrato y formación de productos
como se observa en la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia..
34
Ilustración 19. Distribución de flujos metabólicos de un cultivo mixotrófico de Chlorella sp.
Fuente: Chen Yang, 2000.
Para realizar un análisis de los flujos de cierta red metabólica se debe tener en cuenta las
características de esta red metabólica para así conocer la capacidad de resolución que tiene el
sistema.
El análisis de grados de libertad muestra cuántas variables mínimas deben medirse para poder
resolver el modelo matemático. De aquí se dividen los sistemas en determinados, sub-
determinados y sobre-determinados.
1.1.5.3. Sistemas determinados.
Este tipo de sistemas son aquellos en los que pueden ser calculados de manera directa los
flujos ya que el número de variables es igual al número de ecuaciones o en este caso flujos y
metabolitos.
35
En el sistema determinado la solución es única si exactamente son medidos Gl flujos. Para
obtener la solución, los flujos que van a ser medidos en q pueden ser agrupados en un nuevo
vector qm y los elementos restantes (los que necesitan ser calculados) en otro vector qc. De
manera similar, los coeficientes estequiométricos de la matriz M son divididos agrupando los de
las reacciones medidas en Mm y los restantes en Mc de tal forma que la ecuación general se
convierte en (Smolke, 2010):
Mm qm + Mc qc = 0 Ecuación 8
Si Mc es una matriz cuadrada (dimensiones mxm) y puede ser invertida, qc (flujos
intracelulares desconocidos) puede ser encontrada a partir de (Manish et al. 2007):
qc = -(Mc)-1 Mm qm Ecuación 9
Si menos de los flujos Gl son medidos, el sistema está subdeterminado y los flujos
desconocidos pueden ser determinados imponiendo un criterio de optimización sobre los
balances metabólicos (Stephanopoulos, 1998).
1.1.5.4. Sistema sub-determinado.
Si el número de flujos medidos es más pequeño o menor que los grados de libertad del sistema
(¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.3), un número infinito de soluciones
xisten para resolver los flujos de esta red.
En este caso la programación lineal u optimización lineal puede ser usada para determinar la
distribución de flujos intracelulares, siempre que haya un objetivo función claro se pueda
especificar (por ejemplo la maximización de la tasa de crecimiento celular). Con este
acercamiento es posible tener una única solución para los flujos intracelulares por optimización
del objetivo función sujeto a los límites del balance de metabolitos (Nielsen y Villadsen, 1994).
El sistema indeterminado origina un infinito de soluciones a la ecuación, pero las que tienen
sentido biológico residen en un subconjunto llamado el conjunto factible. Este se puede definir
como las capacidades del genotipo metabólico de un organismo, puesto que define todas las
distribuciones de flujo que se pueden lograr con un juego particular de genes metabólicos. El
uso particular del genotipo metabólico bajo unas condiciones concretas se puede definir como
fenotipo metabólico desplegado en esas condiciones.
36
1.1.5.5. Sistemas sobre-determinado
Si más de los flujos Gl son medidos el sistema se vuelve sobre-determinado y si la matriz Mc
es de rango completo, los flujos metabólicos son calculados usando valores medidos con el
método de mínimos cuadrados de tal forma que (Shimizu et al. 2002):
Mc = -[(Mc)T Mc]
-1 (Mc)T qm Ecuación 10
Así, por supuesto, los flujos obtenidos en un sistema sobre-determinado pueden usarse para
calcular no solo un mejor estimado de los flujos no medidos, sino también de los flujos
medidos.
En este sistema la matriz estequiométrica no es cuadrada y no puede ser invertida (ya que se
están midiendo más flujos de los necesarios), para resolver este inconveniente se aplica la
pseudo-inversa de Moore-Penrose como se observa en la Mc = -[(Mc)T Mc]-1 (Mc)T qm
Ecuación 10
De esta manera los requerimientos para la resolución de un sistema sobre-determinado se
vuelven los mismos que para un sistema determinado.
Como se mencionó anteriormente, en el proceso de uso de microalgas para producir
biocombustibles, es necesario que se optimicen los niveles de producción de metabolitos,
usando cualquiera de las estrategias mencionadas. Es por esto, que en este proyecto se
propone analizar los flujos metabólicos de Chlamydomonas reinhardtii con el fin de describir
los patrones metabólicos involucrados en el proceso de producción de dichos metabolitos.
37
1.2. JUSTIFICACIÓN
El inminente agotamiento de las reservas de crudo, los fenómenos causados por el
calentamiento global y la contaminación ambiental entre otros muchos factores han estimulado
de manera significativa el avance en los estudios científicos que lleven a obtener nuevas
fuentes energéticas a un costo competitivo y ambientalmente amigables. Resaltan dentro de
las más importantes en estas alternativas la eólica, la energía solar, la hidroeléctrica, los
biogases y los biocombustibles líquidos, dentro de este último grupo los más importantes son el
biodiesel y el bioetanol. Estos combustibles líquidos y biogases pueden ser obtenidos de
diversas fuentes, una de ellas son las microalgas.
La síntesis y producción de sustancias biocombustibles en algas se realiza por la fijación del
CO2, siendo esta otra razón más para interesarse en el uso de microalgas para la obtención de
una fuente alternativa de energía. Sin embargo, es ampliamente conocido que el desarrollo de
muchas energías renovables esta apenas surgiendo y que cada una de ellas se encuentra en
el camino barreras técnico-económicas importantes que los mantiene aún al margen del
comercio mundial. Uno de los desafíos que tienen los biocombustibles es lograr competir
económicamente con el precio actual del petróleo. Para esto es necesario, lograr aumentar los
rendimientos y las productividades en la producción de biocombustibles de microalgas. En este
punto la biotecnología, específicamente la ingeniería metabólica juega un papel muy importante
en lograr superar estas barreras tecnológicas que hoy separan las energías alternativas de la
realidad mundial.
El uso de herramientas como el análisis de flujos metabólicos permite al hombre poder
vislumbrar los niveles máximos de producción a los que determinado organismo puede llegar, y
usando modelos matemáticos se puede predecir el comportamiento específico de un
organismo bajo determinadas condiciones. En el caso de C. reinhardtii, objeto de este estudio,
se realizó un análisis de sus flujos metabólicos bajo condiciones de crecimiento mixótrofas para
conocer las interacciones existentes entre las rutas bioquímicas de los principales metabolitos
de interés y las reacciones involucradas en la fijación de CO2, pensando en evaluar sus
máximos rendimientos teóricos para proponer futuras estrategias de optimización del proceso.
38
1.3. OBJETIVOS
1.3.1. Objetivo general
Analizar los flujos metabólicos de la microalga Chlamydomonas reinhardtii con el propósito de
vislumbrar posibles optimizaciones en la obtención de metabolitos de interés en el marco de la
producción de biocombustibles.
1.3.2. Objetivos específicos
Definir y montar las técnicas para determinación de los productos, sustratos y/o
metabolitos de interés.
Diseñar y ejecutar los experimentos relacionados al cultivo de Chlamydomonas
reinhardtii bajo diferentes grados de mixotrofía.
Establecer un modelo metabólico de Chlamydomonas reinhardtii en mixotrofía para la
producción de biocombustibles
Realizar el análisis de flujos metabólicos para las condiciones evaluadas.
39
1.4. HIPÓTESIS
Analizando la distribución de flujos metabólicos en función de las condiciones de cultivo, se
puede llegar a establecer las condiciones de cultivo más convenientes así como las rutas
bioquímicas de Chlamydomonas reinhardtii que convienen re-direccionar con el fin de
maximizar la producción de compuestos de interés en el marco de la obtención de
biocombustibles.
40
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Las curvas de calibración fueron estandarizadas de acuerdo con lo indicado en la metodología
específica de cada una (ver anexo 1) mostrando los siguientes resultados:
Las muestras se realizaron por triplicado, y se analizaron utilizando el software Wolfram
Mathematica Ver 9.
2.1. Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconinico (BCA)
Y= Ecuación 11
Ilustración 20. Curva de calibración de proteínas por el método del ácido bicinconínico
En la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. se observan además del ajuste
ineal obtenido en la ecuación, las bandas de confiabilidad del método (bandas en color
Morado), estas bandas reflejan la zona de predicción de valores ajustados al método, o
intervalo de confianza
Tabla 12. Análisis de varianza para curva de calibración de proteínas.
Grados de libertad Suma de cuadrados Suma de Medias Valor- F Valor- p
X 1 2.39 2.39 847.09 1.79x10-22
Error 28 0.079 0.0028
Total 29 2.475
41
En la Tabla 12 se observan los valores del error y el valor P que reflejan buena confianza
estadística así como en la se muestra la distribución normal de los residuos del método.
Ilustración 21. Residuos del ajuste lineal de los datos experimentales, metodo de proteinas.
2.2. Cuantificación de carbohidratos por el método fenol-sulfúrico
Y= Ecuación 12
Ilustración 22. Curva de calibración por el método de Dubois
El análisis de varianza del método demuestra un valor P muy pequeño reflejando alta confianza
en los resultados del método.
Tabla 13. Analisis de varianza para curva de calibracion de carbohidratos.
Grados de libertad Suma de cuadrados Suma de Medias Valor- F Valor- p
X 1 2.7 2.75 907.28 3.65x10-21
Error 25 0.075 0.0031
42
Total 26 2.81
En la tabla 13 se observan los residuos distribuidos de en una forma normal aleatoria.
Ilustración 23. Residuos del ajuste lineal de los datos experimentales, metodo de carbohidatos.
2.3. Cuantificación de la biomasa seca
La curva de calibración de esta técnica debe ser realizada cada vez que alguna condición
externa (nutricional o medioambiental) que pueda afectar la morfología o cantidad de pigmento
celular sea varíe sobre el sistema.
En este caso se usaron las condiciones enumeradas en condiciones de cultivo para C.
reinhardtii:
Medio de cultivo: TAP
Tiempo: 4 días
Diluciones usadas: 0%, 10%, 25%, 50%, 75% y 100%
En esta técnica se midió la biomasa seca, el recuento celular usando la técnica de recuento en
cámara de Neubauer y la Absorbancia a 675 nm de longitud de onda, con el propósito de
obtener más información con la medición de una sola variable (absorbancia).
El ajuste lineal a las variables biomasa seca en gramos/L y Absorbancia en nanómetros está
dado por a siguiente ecuación:
Ecuación 13
43
Ilustración 24. Curva de calibración biomasa seca versus absorbancia.
Igualmente se obtuvo la regresión lineal de los datos de recuento versus la absorbancia
respondiendo al siguiente ajuste:
Ecuación 14
Ilustración 25. Curva de calibración recuento celular versus absorbancia (675nm).
Con respecto a la técnica de lípidos, a continuación se muestra la gráfica que representa los
experimentos de estandarización con sus respectivas bandas de confianza.
El bajo valor de P muestra los niveles de confianza en el método, preferentemente dentro del
intervalo de confianza obtenido en el Anova.
44
Tabla 14. Análisis de varianza para curva de calibración de biomasa seca.
Grados de libertad Suma de cuadrados Suma de Medias Valor- F Valor- p
X 1 0.928 0.928 984.545 1.13x10-15
Error 16 0.018 0.000097
Total 17 0.945
Las técnicas de cuantificación de CO2 e intensidad de luz, fueron realizadas con equipos
especiales, ya que no se requirieron curvas de calibración, sus fundamentos se muestran en el
Anexo 1.
2.4. Cuantificación de Acetato
El acetato (ácido acético) hace parte del medio de cultivo en los ensayos de mixotrofia y
heterotrofia.
Su cuantificación se realiza por medio de cromatografía liquida de alta resolución HPLC en un
cromtografo Varian con bomba Pro Star 210 y detector de índice refractivo Pro Star 350. La
columna que se usó para la cuantificación es la Resex ROA-organic acid de Phenomenex
cuyas características son:
Dimensiones: 300x7.8mm
Fase móvil: ácido sulfúrico 0.005N
Flujo: 0.6mL/min
2.5. Suministro de luz y medición de la intensidad lumínica
En los cultivos que requieren iluminación se usaran tiras flexibles de bombillos tipo led
monocromáticos color blanco frio de 12V.
La intensidad lumínica se ajustó usando un led-dimmer de 12V.
La intensidad lumínica en luxes se cuantificó con un Luxómetro digital marca Steren modelo
HER-410.
45
3. FACTORES LIMITANTES DEL CRECIMIENTO DE Chlamydomonas reinhardtii
3.1. Introducción
El crecimiento de C. reinhardtti está gobernado por varios factores nutricionales y medio
ambientales dentro de los que resaltan, la fuente de carbono, la luz y la fuente de nitrógeno
como los más relevantes. Para tener altas tasas de producción autotrófica, los suplementos
más importantes son de CO2 y HCO3. Contrario a las plantas terrestres el CO2 atmosférico no
satisface los requerimientos de carbono para la alta productividad de los sistemas de
producción algal. Las tasas de difusión del CO2 atmosférico en los estanques abiertos pueden
sustentar productividades de cerca de 10 g m-2 d-1 en masa seca (Lee et al., 1995). El sistema
CO2-H2CO3-HCO3-CO3 es el amortiguador más importante generalmente presente en cuerpos
de agua dulce y es el mejor control para mantener los niveles de pH en los rangos óptimos
para el crecimiento de especies de microalgas cultivadas. Cultivar microalgas con el CO2
ambiental es una estrategia muy extendida a nivel mundial, teniendo en cuenta que enriquecer
el medio con CO2 puro resulta en un incremento considerable de los costos del proceso.
Después del carbono, el nitrógeno es el nutriente más importante que contribuye a la
producción de biomasa. El contenido de nitrógeno de la biomasa puede estar entre el 1-10% y
esto no solo varía entre diferentes grupos (bajo en diatomeas) sino entre especies particulares,
dependiendo de la adición y la disponibilidad. La limitación de nitrógeno en el medio de cultivo
tiene como consecuencias entre otras la decoloración de las células (disminución de la clorofila
y aumento de los carotenoides) y acumulación de ciertos compuestos orgánicos como
polisacáridos y ciertos aceites (Becker, 1994). Es un constituyente esencial de todas las
proteínas estructurales y funcionales en las células algales. Cuando las microalgas son
crecidas bajo condiciones limitadas de nitrógeno, el más sorprendente efecto es la activa y
específica degradación de ficobilisomas (Collier & Grossman, 1992), los cuales participan muy
activamente en la recolección de la luz y están constituidos en parte por proteínas. Numerosos
estudios muestran que la biosíntesis y acumulación de lípidos esta reforzada por la limitación
de nitrógeno o cultivos privados de microalgas de varios grupos taxonómicos. En contraste con
los lípidos polares de células con suficiente nitrógeno, los lípidos neutros en forma de
triacilglicerol se vuelven componentes predominantes de las algas con limitación de nitrógeno
(Thompson, 1996).
El medio de cultivo TAP como se mencionó en el capítulo 1, aporta nitrógeno y carbono
orgánico, sin embargo y teniendo en cuenta que C. reinhardtii puede crecer bajo condiciones
de mixotrofía en donde puede llegar a usar las dos fuentes de carbono, es necesario realizar
cálculos previos en los que se encuentre la disponibilidad teórica de estos nutrientes. El
46
nitrógeno puede llegar a ser un nutriente limitante muy importante en el crecimiento de C.
reinhardtii. La estimación de factores limitantes del crecimiento es una herramienta crucial en el
desarrollo de la experimentación que permite la seguridad de elaborar un análisis basado en la
composición bioquímica del microorganismo conociendo en qué punto se dio alguna limitación
de un nutriente específico. El modelo de caja negra permite obtener datos de consumo de
nutrientes y producción de metabolitos externos, dejando ver las cantidades de nutrientes que
se requieren para alcanzar determinada cantidad de biomasa o de sustancia específica.
Por otra parte, C. reinhardtii puede crecer bajo condiciones de heterotrofia, esto es, usando una
fuente de carbono orgánica y el oxígeno como aceptor de electrones. Bajo estas condiciones
las microalgas utilizan el carbono disponible tanto para fuente de carbono como de energía,
produciendo menos cantidad de biomasa, y al ser el oxígeno el aceptor de electrones tiende a
parecerse a un cultivo aerobio de bacterias, lo que facilita los cálculos para el rendimiento de
biomasa con respecto a la aireación.
Para el desarrollo de los cálculos pertinentes en los capítulos siguientes es necesario conocer
rendimientos teóricos de carbono, oxígeno, acetato y amonio. Debido a esto es importante
determinar si algún nutriente puede llegar a limitar el crecimiento normal en algún punto del
ensayo.
3.2. Materiales y Métodos
Para el desarrollo de este trabajo fue necesario el montaje y la estandarización de las técnicas
analíticas que se listan a continuación y que han sido detalladas en el capítulo 2:
Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconínico (BCA)
Cuantificación de carbohidratos por el método fenol-sulfúrico
Cuantificación de la biomasa seca
Cuantificación de lípidos por gravimetría y fluorescencia
Cuantificación de clorofila
Cuantificación de acetato
Cuantificación de CO2
Medición de la intensidad de la luz.
Se utilizó el software Mathematica 9.0 para determinar mediante la aplicación del modelo
de caja negra, las limitaciones en nutrientes que pudiese tener el medio TAP. Así mismo se
estimaron los rendimientos teóricos correspondientes a los sistemas de mixotrofía y
heterotrofía.
47
3.3. Resultados y discusión
En procura de obtener los datos de los rendimientos teóricos de conversión de sustratos y
aprovechamiento de nutrientes del medio TAP, el primer paso fue la elección de la formula
mínima de la biomasa con la que se realizarían estos cálculos.
Para esta elección se revisaron fuentes bibliográficas (Kliphuis, 2011, Janssen, 2011, Nannet
R Boyle, 2009, Jansenn, 2004, Pallson et al, 2011) que aportan datos de formulaciones de
biomasa de Chlamydomonas reinhardtii bajo condiciones de crecimeinto específicas como se
observa en la Tabla 15.
Tabla 15. Fórmulas mínimas para biomasa de Chlamydomonas reinhardtii
Modelo Formula Referencia
Autotrofía CH1.62O0.41N0.14S0.003P0.01 Kliphuis et al 2011
Autotrofía CH1.821O0.605N0.103
Boyle and Morgan, 2009
Mixotrofía CH1.869O0.561N0.059
Heterotrofía CH1.829O0.465N0.178
Autotrofía CH1.7O0.47N0.18S0.06P0.021 Palsson et al, 2011
Heterotrofía CH1.81O0.58N0.2 Microorganismo estándar
Por comparación de las condiciones de crecimiento utilizadas en los diferentes ensayos, las
fórmulas elegidas fueron CH1.62O0.41N0.14S0.003P0.01 publicada por Kliphuis et al 2011 y
CH1.869O0.561N0.059 publicada por Boyle y Morgan en 2009, para los sistemas autótrofo y
mixotrofo respectivamente.
El primer cálculo que se realizó fue aplicar el modelo de caja negra al medio de cultivo TAP que
se utilizara en los ensayos para determinar aspectos como la producción de biomasa máxima
teórica, la disponibilidad de nutrientes y algunos elementos limitantes del medio.
El medio de cultivo TAP tiene la siguiente composición:
Tabla 16. Soluciones de sales y fosfatos del medio TAP
Solución de sales Cantidad
NH4Cl 15.0 g
MgSO4. 7H2O 4.0 g
48
CaCl2. 2H2O 2.0 g
Agua 1L
SOLUCIÓN FOSFATOS
K2HPO4 28.8 g
KH2PO4 14.4 g
agua 100mL
Tabla 17. Elementos traza del medio TAP
Compuesto Cantidad Agua
EDTA 50 g 250 ml
ZnSO4. 7 H2O 22 g 100 ml
H3BO3 11.4 g 200 ml
MnCl2. 4 H2O 5.06 g 50 ml
CoCl2. 6 H2O 1.61 g 50 ml
CuSO4. 5 H2O 1.57 g 50 ml
(NH4)6Mo7O24. 4 H2O 1.10 g 50 ml
FeSO4. 7 H2O 4.99 g 50 ml
Tabla 18. Perparacion de medio TAP (1L)
Compuesto/solución Cantidad
Tris-HCL 2.42 g
Solución de sales 25 ml
Solución de fosfatos 0.375 ml
Solución elementos traza 1.0 ml solución
Acido glacial acético 1.0 ml
Fuente: Gorman, D.S., and R.P. Levine (1965).
3.3.1. Modelo de caja negra (CHONSP) al medio TAP
Fuente de carbono: CO2 (autotrofia)
CO2 + H2O + NH3 + H2SO4 + H3PO4 CH1.62O0.41N0.14S0.003P0.01 + O2 Ecuación 15
Gl= 7-6 = 1.
49
Asumiendo 1C-mol de biomasa (para satisfacer el grado de libertad de la ecuación 16) y CO2
como única fuente de carbono (suministrado de manera constante al medio), se procede a
multiplicar la matriz estequiométrica que relaciona los coeficientes de la ecuación 8, por un
vector que contiene los coeficientes de la fórmula mínima de la biomasa.
Dónde:
qc: corresponde al vector que contiene los compuestos del medio que se quieren calcular
Los resultados del análisis se muestran en la Tabla 19.
Tabla 19. Resultado del análisis de caja negra al medio TAP para el crecimiento de C.
reinhardtii.
Sustancia Biomasa 1*
mol
Biomasa 2*
mol
TAP/L
mol
CO2 -1 -1 -
H2O -0.582 0.123 55
NH3 -0.14 -0.12 0.007
H2SO4 -0.003 -0.003 0.0008
H3PO4 -0.01 -0.01 0.007
O2 1.112 0.56
1C-mol X 23.72 g 28.2 g
NH3 limitante (0.007) 1.18g/L 1.41g/L
Biomasa 1: CH1.62O0.41N0.14S0.003P0.01
Biomasa 2: CH1.869O0.561N0.059
qc
ηc ηh ηN ηs ηpηo
−1
∗
Ecuación 16
50
Como se observa, el compuesto NH3 que aporta la fuente de nitrógeno puede llegar en un
momento determinado a ser el limitante para el crecimiento ya que se encuentra 20 veces
menos de lo que se requiere para la producción de 1C-mol de biomasa. Asumiendo
formalmente al NH3 como el compuesto más limitante del medio se realizó el cálculo de la
cantidad de biomasa que puede aportar el medio TAP bajo estas condiciones, y se evaluó si
algún otro componente puede llegar a ser limitante. El resultado para la fórmula mínima que se
está empleando en este trabajo (formula en autotrofia tabla 11) es 1.18g/L (0.05C-mol) usando
CO2 como única fuente de carbono.
Tabla 20. Análisis de caja negra asumiendo agotamiento de NH3.
Sustancia Biomasa 1*
mol
CO2 -0.05
H2O -0.029
H2SO4 -0.00015
H3PO4 -0.0005
O2 0.055
biomasa 0.05
Como se observa en la tabla 20, una vez se agota el NH3 y teniendo en cuenta que el
suministro de CO2 es constante, ninguna sustancia aparece como limitante, esto es, el
consumo requerido hasta el agotamiento del amonio, es menor a la cantidad aportada por el
medio de cultivo (ver Tabla 19). Este calculó teórico no pudo realizarse en los caso de
mixotrofía y heterotrofía debido a que sus ecuaciones estequiométricas dan más de 1 grado de
libertad.
Por otra parte, se calculó el rendimiento de la biomasa con respecto a la fuente de carbono
orgánico (acetato) para los sistemas que la contengan.
Según la fórmula de heterotrofia el carbono presente en la biomasa es:
Ccel = 0,47gCcel/gcel
El carbono presente en el acetato es:
CH2O = 0,4 gC/gsust
El rendimiento de la biomasa con respecto al acetato se calcula de la siguiente manera:
Yxsg = 0,66 * 0,41g/0,4g
51
Yxsg = 0,78
Dónde:
Ccel: gramos de carbono que contiene la biomasa/g de biomasa
CH2O: gramos de carbono que contiene el ácido acético/gramos de ácido acético
Yxsg: rendimiento de biomasa con respecto al sustrato (en gramos).
Con esta información se puede entonces calcular el rendimiento celular con respecto al
oxígeno, esto pensando en los ensayos de mixotrofía y heterotrofía.
Así pues tenemos que según la fórmula para calcular el rendimiento de oxígeno según la
fuente de carbono y la composición de la biomasa:
1
−
1
Ecuación 17
Dónde:
YO2: rendimiento de oxígeno
X: átomos de carbono de la fuente de carbono
W: átomos de hidrógeno de la fuente de carbono
Z: átomos de oxígeno de la fuente de carbono
%O: porcentaje de oxígeno en la biomasa
%C porcentaje de carbono en la biomasa
%N: porcentaje de nitrógeno en la biomasa
%H: porcentaje de hidrógeno en la biomasa
1
−
1
11
Ecuación 18
YO2= 0.93
3.4. Conclusiones
El modelo de caja negra aplicado sobre el medio de cultivo (TAP), para el crecimiento bajo
condiciones de autotrofía, reflejo que el nutriente limitante es el nitrógeno. Por el contrario las
fuentes de carbono no mostraron valores limitantes permitiendo el desarrollo del sistema hasta
el agotamiento de la fuente de nitrógeno.
52
4. EFECTO DE LA INTENSIDAD LUMINOSA Y EL FOTOPERIODO SOBRE EL CRECIMIENTO DE Chlamydomonas reinhardtii.
4.1. Introducción
Entre los factores ambientales que afectan la tasa de crecimiento de las microalgas, la luz es
uno de los más importantes. La intensidad de la luz para el cultivo de microalgas se maneja en
un intervalo bastante amplio, entre 500 y 50.000 Lux, y tanto los valores de crecimiento como el
de fotoinhibición depende de muchos factores entre los que se cuenta la temperatura, el nivel
de CO2 presente en el medio, la concentración y tipos de nutrientes, entre otros (Janssen,
2002).
Los efectos de la luz en la composición bioquímica de las microalgas son ampliamente
controlados por los procesos llamados fotoaclimatación o fotoadaptación. En estos procesos,
las células algales bajo cambios dinámicos en composición celular, propiedades fisiológicas,
biofísicas y de ultraestructura aumentan la fotosíntesis y el crecimiento (Dubinzky Z, 1995). Una
tendencia común de la respuesta celular a la disminución de la intensidad de la luz es
incrementar la clorofila a y otros pigmentos (como clorofila b, c, ficobiliproteinas y carotenoides
principalmente). De otro lado en respuesta a la alta intensidad de la luz, la clorofila a y otros
pigmentos (zeaxantinas, B-carotenos, astaxantina) que sirven como fotoprotectores tales como
plastoglobuli o plástidos (Ben-Amonts et al., 1982) o cuerpos lipídicos citoplasmáticos juegan
un rol en prevenir la energía de la luz excesiva que llega a la maquinaria fotosintética. La
acumulación de carotenoides puede, en general resultar de la alteración de la acumulación de
carbono y flujo de nitrógeno dentro de las condiciones de estrés celular (Harris, 2009).
Las altas intensidades de luz tienden a reforzar la producción de polisacáridos en células de
microalgas. Friedman et al, en 1991 reportaron un aumento de 0.6 a 3 veces más en
polisacáridos obtenidos en cultivos de Porphiridium sp y Porfiridium aeurogineum, cuando
crecieron en intensidad lumínica aumentada de 5500 a 22000 lux. Numerosos estudios con
microalgas de varios grupos sugieren que el contenido celular de lípidos y ácidos grasos
poliinsaturados (PFUA), incluyendo el ácido eicosapentaenoico (EPA 20:5ω3), está relacionado
a la intensidad de la luz. Assaf Sukenyk, en 2002 mostró que Nannochloropsis presentó un alto
contenido de lípidos y altas proporciones de ácido eicosapentaenoico al ser cultivada bajo
condiciones de limitación de luz. Krauss et al en 2002 demostraron que C. reinhardtii tuvo su
máxima tasa de crecimiento cuando fue sometida a 20,000 lux de intensidad en ensayos de
laboratorio.
Así como la intensidad de la luz juega un papel muy importante en el desarrollo de la célula, el
tiempo de exposición a esta luz aparece como otro factor muy importante. La fotosíntesis es un
proceso que comprende dos pasos, el primero es llamado reacciones de luz, que solo ocurren
53
cuando el cultivo está expuesto a la iluminación y el segundo llamado reacciones de oscuridad
o de fijación de carbono o reacciones sin luz que ocurre tanto en ausencia como en presencia
de luz. De esta manera, en el primer paso las células transforman la luz en energía química
que es almacenada en compuestos altamente energéticos que son usados posteriormente en
las reacciones de fijación de carbono (Iverson, 2006).
En cultivos fotosintéticos la cantidad de energía recibida de la luz tiene una relación directa con
la tasa de fijación de carbono determinando la productividad de la biomasa y el crecimiento
celular. En la naturaleza la disponibilidad de la luz está en forma no continua (día y noche).
Sicko-Good en 1998 demostró la importancia de los fotoperiodos en el metabolismo de las
microalgas (especialmente diatomeas). Esta investigación reveló que las células se dividen
principalmente en el inicio de la fase lumínica, y que la acumulación de lípidos se da
mayormente en la fase oscura. Así mismo se encontró que después de evaluar 10
combinaciones de fotoperiodos, los mejores rendimientos celulares se obtuvieron en el periodo
de total iluminación seguido del periodo 12:12, demostrando así la importancia de los ritmos
circadianos naturales de las microalgas.
Debido a lo anterior, es claro que para poder encontrar el mayor potencial de una cepa de
microalga se deben realizar estudios de estandarización de las condiciones óptimas de
crecimiento, y así como se hace con los nutrientes, se debe hacer también con la intensidad de
la luz y el fotoperiodo. En este apartado se muestran los resultados de las evaluaciones
experimentales de intensidad de luz (3000, 8000, 20000 y 3000 lux) y fotoperiodo (12:12 y
8:16, luz y oscuridad respectivamente) sobre el crecimiento de C. reinhardtii con el propósito de
encontrar la mejor condición que nos permitiera realizar una evaluación metabólica con menos
limitaciones.
54
4.2. Materiales y Métodos
4.2.1. Evaluación de intensidad luminosa
Ilustración 26. Diferentes intensidades de luz evaluadas a nivel matraz.
La evaluación consistió en seguir el crecimiento de C. reinhardtii durante 8 días a diferentes
intensidades de luz (3000, 8000, 20000 y 30000 lux), con el propósito de encontrar el intervalo
de mejor crecimiento para posteriormente realizar la evaluación de fotoperiodo.
Las condiciones de la prueba fueron las siguientes:
Tabla 21. Condiciones de cultivo prueba de intensidad de luz.
Condición Valor
Inoculo 10%
Volumen de trabajo 400 mL
Volumen del reactor 1000 mL
Fuente de luz Tira LED de 9 voltios
Intensidades evaluadas 3000, 8000, 20000 y 30000 Lux.
Tiempo de la prueba 8 días
Intervalo de muestreo 1 día
Temperatura 27ºC
Medio de cultivo TAP
Agitación 110 rpm
55
Las muestras fueron procesadas bajo la técnica de peso seco para obtener los datos de
recuento celular y biomasa seca a partir de la absorbancia. Cada intensidad de luz se evaluó
en sistemas duplicados y cada punto de muestreo se midió por triplicado.
La intensidad de la luz fue ajustada y medida como se describe en el apartado de
estandarización de técnicas analíticas.
4.2.2. Evaluación de los fotoperiodos
Esta se realizó en los intervalos reportados en los que se presenta mejor crecimiento para C.
reinhardtii. Las condiciones de la prueba se muestran en la Tabla 22
Tabla 22. Condiciones de cultivo para la prueba de fotoperiodo
Condición Valor
Inoculo 10%
Volumen de trabajo 400 mL
Volumen del reactor 1000 mL
Fuente de luz Bombillos LED de 9 voltios
Fotoperiodos evaluados (L:O) 24:0, 12:12, 8:16.
Intensidad de luz 15 000 Lux
Tiempo de la prueba 8 días
Intervalo de muestreo* 1 día
Temperatura 27ºC
Medio de cultivo TAP
Agitación 110 rpm
*Las muestras fueron tomadas tanto en la fase oscura como en la de luz
4.3. Resultados y discusión
4.3.1. Evaluación de la intensidad luminosa
En la Ilustración 27 se muestra el crecimiento medido en absorbancia a 657 nm de longitud de
onda para cada uno de los sistemas evaluados.
56
Ilustración 27.crecimiento de C. reinhardtii medido en absorbancia a 675nm en diferentes intensidades
de luz
Las velocidades de crecimiento de los sistemas por duplicado fueron calculadas por estimación
de parámetros en el programa Mathematica 9.0 bajo la siguiente ecuación:
Ecuación 19.
Arrojando los siguientes resultados:
Tabla 23. Velocidad de crecimiento en función de la intensidad de la luz.
Velocidad de crecimiento (d-1) Intensidad de luz (Lux)
0.56 ± 0.0075 3000
0.86 ± 0.0025 8000
1.09 ± 0.005 20000
0.98 ± 0.029 30000
El error señalado corresponde a la desviación estándar.
Estas velocidades se trazaron en una gráfica en contraste a la intensidad de la luz con el
propósito de encontrar un punto de máxima velocidad.
57
Ilustración 28. Velocidades de crecimiento vs intensidad de luz
En la Ilustración 28 se observa que la intensidad de la luz tiene un efecto en la velocidad de
crecimiento alcanzando la máxima en la zona de los 20000 lux, y que después de ésta el efecto
tiende a disminuir. En los ensayos con 30000 lux, se presentó una alta tasa de evaporación, lo
cual dificulta el normal desarrollo y comparación con los demás sistemas (esta evaporación fue
compensada por adición de volumen en cada muestreo). En los sistemas con 20000 lux
también se presentó evaporación aunque en menor medida, y finalmente en los sistemas de
3000 y 8000 lux no se dio evaporación notable.
Teniendo en cuenta esto y sabiendo que el propósito es encontrar una condición que ofrezca si
no la máxima, la más cercana a la máxima velocidad de crecimiento para proceder con los
ensayos de fotoperiodo, la intensidad de luz con mayor tasa de crecimiento sin llegar a
presentar problemas de calentamiento y/o evaporación es de aproximadamente 15000 lux.
4.3.2. Evaluación de fotoperiodo
En la Ilustración 29 se muestra el comportamiento global del crecimiento de C. reinhardtii en
los diferentes fotoperiodos.
58
Ilustración 29. Crecimiento de C. reinhardtii en diferentes fotoperiodos
Las velocidades de crecimiento de los sistemas por duplicado fueron calculadas por estimación
de parámetros en el programa Mathematica 9.0 bajo la ecuación 19 mostrando los siguientes
resultados:
Tabla 24. Velocidad de crecimiento en función del fotoperiodo.
Velocidad de crecimiento (d-1) Tiempo de duplicación (días) Fotoperiodo (L:O*)
0.8±0.06 0.86 8:16
1.1±0.05 0.63 12:12
1.09±0.005 0.64 24:0
*L:O= luz : oscuridad
4.4. Conclusiones
Muy similar a lo que reporto Krauss et al en 2002, la mejor velocidad de crecimiento se alcanzó
cerca de los 20000 lux de intensidad. Sin embargo como se mencionó en los resultados las
altas intensidades de luz (20000 y 30000) se presentó un problema de calentamiento y
evaporación de agua del sistema, incorporando un ruido perjudicial para el análisis de los datos
en los ensayos metabólicos. En la curva de velocidades de crecimiento versus intensidades de
luz se aprecia que la intensidad deja de aportar al crecimiento de manera importante después
de pasar la barrera de los 18000 a 20000 lux, por lo que se decidió utilizar 15000 lux como una
intensidad apropiada para realizar los posteriores ensayos de metabolismo. Con respecto al
fotoperiodo sucedió algo similar, se encontró que en los ensayos de 12:12 y 24:0 se obtuvieron
las velocidades de crecimiento más altas (1.1±0.05 d-1 y 1.09±0.005 d-1 respectivamente), sin
59
embargo se decidió utilizar la condición de 12:12 para los posteriores ensayos teniendo en
cuenta dos factores principalmente:
Variabilidad metabólica bajo periodos de luz:oscuridad
Ahorro de energía en los ensayos.
De esta manera quedaron las condiciones de luz y fotoperiodo establecidas en 15000 lux
como intensidad máxima y 12:12 de fotoperiodo.
60
5. EFECTO DE LA AERACIÓN SOBRE LA VELOCIDAD DE CRECIMIENTO EN AUTOTROFIA
5.1. Introducción
Los niveles de CO2 son un factor limitante para el crecimiento de las microalgas, no solo por su
baja concentración en el ambiente, sino también por su baja afinidad y por la muy baja rotación
catalítica de la Ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (enzima presente en la fijación de
carbono vía fotosíntesis). Normalmente el equilibrio entre el CO2 disuelto en los ambientes
acuáticos y el presente en la atmósfera es muy lento y a esto se le suma la muy baja difusión
del CO2 en el agua comparada con la difusión en el aire (104 veces menos). Martin H. Spalding
en 1982 reportó que las especies de CO2 disueltas que representan el carbono inorgánico (Ci)
disponible para la fotosíntesis son CO2, HCO3 y CO3-2, obtenidas después de una serie de
reacciones de protonización, hidratación y deshidratación. En la Ilustración 30 se observan
estas especies y sus cambios con respecto al pH.
Fuente: http://www.ugr.es/~fgarciac/qma_practica_1_2.html
Igualmente Spalding en 1982 reporta una baja hidratación de CO2 a HCO3 debido al consumo
de CO2 para fotosíntesis. A pH por encima de 6.3 la especie predominante es el HCO3. Esto,
sumado a la baja disolución de HCO3 a CO2 y a la baja solubilidad del CO2 atmosférico son las
causas principales de la baja disponibilidad de Ci en las aguas naturales. Esto ha hecho que
Chlamydomonas así como otras especies fotosintéticas desarrollen mecanismos que permiten
asimilar CO2 y HCO3 para soportar la fotosíntesis, también como mecanismos para acoplarse
bien y rápidamente a los cambios bruscos de Ci en el medio. Uno de los principales son los
mecanismos de concentrar el CO2 de manera intracelular para abastecerse en períodos de
poco Ci disuelto.
Ilustración 30 Evolución de las especies químicas del CO2
disueltas en agua.
61
Berry et al. (1976) demostró que C. reinhardtii puede crecer en altas (1-5%) o en bajas (0.03%)
concentraciones de CO2 observándose cambios fisiológicos importantes como el metabolismo
de plantas C3 y C4 respectivamente.
En Chlamydomonas sp., Marcus, et al. (1984) y Tsuzuki M (1983) reportaron que el transporte
de CO2 es pasivo y que el transporte de la especie HCO3 es activo, también reportaron esto
debido a la velocidad de transporte celular. Dieter F. Sultemeyer et al 1989, demostraron que
las dos especies son transportadas de manera activa pero que el CO2 disuelto es la
selectivamente más preferida por Chlamydomonas sp.
Sin embargo la afinidad por el CO2 también depende de la aclimatación de las células, Badger
y Price en 1992, demostraron que las células que estaban aclimatadas a concentraciones altas
(1-5%) de CO2 presentaban una K1/2 Ci similar a la Km de la RubisCo. Por el contrario las
células crecidas en condiciones limitantes de CO2 (0.03%) mostraron una afinidad de 10 a 100
veces menor por el Ci (Thyssen et al., 2001).
Se han detectado rasgos característicos de las células que crecen en baja o alta concentración
de CO2. Las células que crecen en bajas concentraciones activan genes que regulan los
mecanismos de concentración de carbono (CCM) y a su vez se ha demostrado que en bajas
concentraciones se presenta un crecimiento células retardado, un tamaño celular más pequeño
y una disminución paulatina de la constante de afinidad K1/2. Además se puede distinguir un
tercer estado de aclimatación a muy baja concentración de CO2, presentando los mismos
rasgos e incluyendo la poca cantidad de clorofila. Los genes involucrados, aumentan su
transcripción a medida que el CO2 del medio disminuye. Se ha encontrado en C. reinhardtii la
expresión de varios genes envueltos en la aclimatación a bajas concentraciones de CO2, estos
actúan principalmente en el transporte de Ci, la anhidrasa carbónica y la fotorespiración.
La expresión o represión de genes involucrados en la disponibilidad del CO2 no solo tienen
efecto en estos mecanismos sino que afectan de manera significativa al conjunto de vías
metabólicas, por lo tanto la regulación debe estar mediada por otras variables también, como la
cantidad de luz, de nitrógeno, de fósforo entre otros. Uno de los cambios metabólicos más
relevantes a la aclimatación en bajas concentraciones de CO2, es la acumulación de almidón
cerca del pirenoide en el cloroplasto. (Kuchitsu et al., 1988, 1991 ; Ramazanov et al., 1994;
Geraghty and Spalding, 1996).
En la Ilustración 31 se esquematiza el proceso de activación de los mecanismos de
concentración de carbón inorgánico por parte de C. reinhardtii cuando las células están
expuestas a bajas concentraciones de CO2.
62
Ilustración 31. Mecanismos de concentración de carbono inorgánico.
Teniendo en cuenta los cambios metabólicos importantes que puede sufrir el cultivo al
someterse a muy bajos niveles de carbono inorgánico, es necesario realizar algunos ensayos
previos para garantizar la no limitación de la fuente de carbono en el sistema.
5.2. Materiales y métodos
Según se describió en la sección de métodos analíticos, se midió el CO2 en las zonas de
cultivos con el propósito de evaluar su variación en el tiempo. Así mismo, se realizaron ensayos
en sistemas cerrados para determinar la transferencia de carbono y su velocidad de consumo.
Para calcular las velocidades de transferencia y consumo de CO2 las condiciones asumidas
fueron las siguientes:
Reactor: Erlenmeyer de 1L
Volumen de trabajo: 500 mL
pH:7
Concentración del CO2 en el aire: 400 ppm
Coeficiente Kl para sistemas aireados con 1v/v/m flujo: 26.2 cm/h*
Coeficiente Kl para sistemas agitados y sin aireación: 6.4 cm/h*
Área de transferencia: 0.1cm-1*
*datos obtenidos de un trabajo de evaluación de transferencia de CO2 en condiciones similares a las
aquí planteadas (Chai, 2012).
Como se observa, el valor de Kl fue diferente para los sistemas (con y sin aireación), utilizando
la misma área con el propósito de determinar la velocidad de transferencia en cada caso.
Para los ensayos en el sistema cerrado se usaron las siguientes condiciones de cultivo:
63
Medio de cultivo: TAP
Volumen de trabajo: 400 mL
Velocidad de la bomba peristáltica: 1000 rpm
Volumen de gas (aire): 1340 mL
Concentración inicial de CO2: 5854 ppm (aire enriquecido por adición de CO2 gaseoso
inyectado al sistema)
Concentración inicial de biomasa seca: 157 ppm
Para estimar los parámetros cinéticos se usó la función FindFit en el programa Mathematica
ver. 9.0, ajustando los datos a la siguiente ecuación:
∗ Ecuación 20
5.3. Resultados y discusión
Se realizaron mediciones de la concentración de CO2 ambiental en el laboratorio de
bioingeniería con el propósito de determinar la concentración y analizar la variación de este gas
en el tiempo. Estos datos son fundamentales ya que los sistemas de crecimiento mixo y
autotróficos requieren la inyección de aire para suministrar la fuente de carbono, a su vez debe
poderse cuantificar el consumo del CO2 en el sistema para determinar parámetros cinéticos
como por ejemplo rendimientos, velocidades de consumo y transferencia de masa.
Debido a que la velocidad de consumo de carbono inorgánico en los sistemas aireados no es
muy alta, la variación de CO2 en el ambiente puede llegar a incorporar demasiado ruido en los
datos obtenidos de forma que se dificulte obtener los parámetros cinéticos representativos.
Teniendo en cuenta que para producir 0.1 g de biomasa se requiere el consumo de 180 ppm
de CO2 (según los cálculos teóricos del capítulo 2) entonces el sistema en teoría consume entre
7-10 ppm de CO2 por hora (para una velocidad de crecimiento de 0.025h-1).
Debido a esto se realizaron mediciones de CO2 en el cuarto de siembras (zona donde se
realiza la experimentación), en tres ocasiones distintas, dos mediciones que tuvieron una
duración de 24 h y la última medición que duro 72 h como se observa en la Ilustración 32.
64
Como se puede ver en la Tabla 25. Variación en las mediciones de carbono ambiental. la
variación en el ambiente del laboratorio es más alta que el consumo por hora del sistema, por
lo que no es posible realizar una estimación adecuada de los parámetros con tal variación, por
tanto se requirió la implementación de un sistema de ambiente controlado para poder
cuantificar la disminución del CO2.
Tabla 25. Variación en las mediciones de carbono ambiental.
Parámetro Día 1 Día 2 Día 3-4-5
Desv. estándar (ppm) 36.69 34.65 14.55
Promedio (ppm) 549.739 568.963 558.436
Max (ppm) 864 846 798
Min (ppm) 500 540 531
La opción para contrarrestar este ruido aportado por el ambiente es entonces realizar ensayos
de crecimiento y consumo de CO2 en sistemas cerrados para evaluar tanto las velocidades de
consumo y crecimiento, como la transferencia del gas en el sistema, sin embargo inicialmente
se realizaron cálculos teóricos de la disponibilidad del CO2.
Para determinar teóricamente si el carbono suministrado al sistema (CO2 del aire), es suficiente
para soportar el crecimiento del alga, se realizó un cálculo teórico de la velocidad de consumo
y transferencia del CO2.
Sabiendo que la velocidad de transferencia del CO2 en el sistema acuoso se calcula de la
siguiente forma:
Ilustración 32. Medición de CO2 ambiental.
65
∗ Ecuación 21
Dónde:
VTCO2: es la velocidad de transferencia del CO2 a la fase acuosa
CL*: concentración de equilibrio en el líquido.
CL: concentración en el líquido.
Asumiendo que se alcanza rápidamente el equilibrio entre las fases se puede calcular la
concentración del gas en el líquido usando la ecuación de la ley de Henry:
[CO2 ac] = Xa*H Ecuación 22
Dónde:
[CO2 ac] : es la concentración del CO2 disuelta en el sistema.
Xa: es la fracción molar del CO2 presente en el gas de entrada al sistema.
H: es la constante de Henry para el CO2 bajo condiciones establecidas.
En función del pH tenemos que:
1 1 − − 1 1 Ecuación 23
Dónde:
Ka1: constante acida para el H2CO2
Ka2: constante acida para el HCO3
Finalmente resolviendo las ecuaciones anteriores usando las condiciones iniciales tenemos
que en un sistema aireado de este tipo, la velocidad de transferencia del CO2 es:
VTCO2= 156.781 ppm de CO2/L/h Ecuación 24
Y que por tanto para un sistema no aireado (agitado a 120rpm), la velocidad de transferencia
es de:
VTCO2= 38.3 ppm de CO2/L/h Ecuación 25
Asumiendo que en un sistema aireado se producen aproximadamente 0.1g de biomasa seca
diaria, y que para un sistema no aireado la producción diaria es aproximadamente 0.07g de
biomasa seca, se puede obtener datos de estimación de la velocidad de consumo de CO2:
66
Condiciones iniciales:
Velocidad de crecimiento µ: 0.25 d-1
Rendimiento del sustrato en biomasa Yxs: 0.17
Biomasa inicial X: 100 mg/L
VCCO2
Ecuación 26
Dónde:
VCCO2: es la velocidad de consumo del sistema.
Resolviendo la VTCO2= 38.3 ppm de CO2/L/h Ecuación 256 con las condiciones
iniciales, se tiene que:
Para un sistema aireado la velocidad de consumo del CO2 es:
VCCO2= 147 ppm/L/d Ecuación 27
Para un sistema agitado la velocidad de consumo es:
VCCO2= 102.9 ppm/L/d Ecuación 28
Finalmente para calcular la disponibilidad del CO2 disuelto que el cultivo podría consumir basta
con restar las dos velocidades obtenidas anteriormente:
DCO2 = VTCO2 – VCCO2 Ecuación 29
La disponibilidad de CO2 disuelto varía en función de la velocidad de consumo ya que ésta
aumenta al aumentar la cantidad de biomasa en el sistema. En cultivo de microalgas aireados
como se mencionó arriba, la biomasa puede llegar a duplicarse cada 24 h, y en sistemas no
aireados el crecimiento sería menor, aproximadamente 0.07 g/d (datos obtenidos del modelo
de caja negra).
Asumiendo estas condiciones, se puede calcular el tiempo aproximado en el que el sistema
podría empezar a presentar problemas de disponibilidad de CO2 disuelto para el consumo.
67
Ilustración 33. Disponibilidad del carbono en un sistema aireado
Ilustración 34. Disponibilidad del carbono en un sistema no aireado
Como se puede observar en la Ilustración 33 y en la Ilustración 34 la disponibilidad del CO2 en
el sistema aireado llegaría hasta los 11 días aproximadamente, esto debido a su alto
coeficiente de transferencia impulsado por la aireación, por el contrario en un sistema agitado
sin aireación el CO2 se transfiere mucho menos mostrando una disponibilidad cercana a los 4
días.
De acuerdo a lo calculado, se realizaron ensayos de crecimiento en sistemas cerrados con el
propósito de mantener una concentración de gas inicial homogénea y así poder evaluar el
consumo del CO2 en el tiempo omitiendo el error proporcionado por la variación del medio
ambiente.
Estos ensayos aportarían información fundamental para los ensayos futuros de mixotrofía y
autotrofía, y los parámetros más importantes que se pueden deducir serán el coeficiente de
transferencia de gas al líquido, la constante de Henry experimental, y las condiciones de
68
consumo necearías para el óptimo crecimiento de Chlamydomonas reinhardtii usando CO2
como fuente de carbono.
El sistema que se utilizó se muestra en la Ilustración 35. Sistema cerrado de crecimiento de C.
reinhardtii
En este ensayo (sistema cerrado), se midió el crecimiento versus el consumo del CO2, este
último parámetro fue tomado de la lectura que marcaba el sensor de la fase gaseosa.
En la Ilustración 36 se muestra el comportamiento de la microalga durante los 11 días de
evaluación.
Ilustración 36. Crecimiento de C. reinhardtii en sistema cerrado, valores de biomasa seca.
En esta grafica se puede ver los datos experimentales (puntos), y el ajuste a la ecuación de
crecimiento exponencial (línea).
Los datos fueron ajustados a la ecuación de crecimiento exponencial (Ley de Malthus) para
obtener los mejores parámetros del modelo y analizar si corresponden a este comportamiento y
cuál es el tramo de los datos que se escogerán para calcular los parámetros.
Ilustración 35. Sistema cerrado de crecimiento de C. reinhardtii
Recirculación de aire
Sensor de CO2
69
En la gráfica la línea azul representa los datos ajustados al modelo planteado en la anterior
ecuación, lo cual muestra un buen comportamiento de los datos experimentales y un punto final
(día 8) de la fase exponencial.
En los datos de consumo de CO2, se observa una rápida caída en la concentración, pasando
de 5800 ppm a cerca de 1000 ppm en tan solo un día aproximadamente, por esta razón y para
efectos de visualización gráfica no se incluyen todos los datos en la figura, solo se incluyen los
datos de la zona de la caída hasta que se llega a una concentración constante (cerca de los
400 ppm de CO2).
Ilustración 37. Consumo de CO2 en sistema cerrado, tramo de los 2 primeros días.
El ajuste de parámetros no lineal utilizado permitió la estimación de la velocidad de crecimiento
(µ= 0.16 d-1) y la concentración de biomasa inicial (xo=0.32g/L).
Esta información se utilizó para desarrollar un modelo de crecimiento y consumo que se
acoplara a los datos experimentales, las ecuaciones utilizadas para modelarlo fueron las
siguientes:
Crecimiento de C. reinhardtii (ecuación de Monod)
r
Ecuación 30
Consumo de CO2 (ecuación de Pirt)
Ecuación 31
Resolviendo estas ecuaciones para las siguientes condiciones iniciales se obtiene la ilustración
38
70
Ks=0.01, so=4.8, tf=15.
Dónde:
Ks: constant de afinidad al sustrato.
So= concentración de sustrato inicial (g/L).
Tf= tiempo final del ensayo (dias).
Ilustración 38. Gráfica del modelo planteado y los datos originales.
En esta grafica se observa que los datos de crecimiento se ajustan al modelo planteado, sin
embargo los datos de consumo no se acercan a lo descrito en el modelo.
Este comportamiento del consumo requiere un tratamiento un poco más detallado para obtener
un parámetro más confiable, por esta razón se realizó un experimento sobre la transferencia
del CO2 del gas al medio de cultivo sin microorganismos.
Este ensayo conto con condiciones similares al anterior, sin microorganismos y con una
concentración de CO2 inicial más elevada (7090 ppm).
71
Ilustración 39. Dinámica de transferencia de CO2 al líquido (medio TAP).
En esta gráfica se observa que la transferencia del carbono al líquido es alta hasta las 3 horas
aproximadamente, en donde llega a alcanzar un equilibrio. El proceso de transferencia del CO2
al medio liquido está gobernado por la influencia de parámetros como el coeficiente de
transferencia (KL), el área de transferencia (A) y la constante de partición de la ley de Henrry
(He) principalmente, por tanto responde a la siguiente ecuación:
∗
∗ (
∗
) ∗ ∗
∗ Ecuación 32
Dónde:
Vg=volumen del gas
y0= concentración inicial del CO2 en el gas
A=área de transferencia
Kg=coeficiente de transferencia en el gas
He= constante de Henry
VL= volumen del liquido
y= concentración del CO2 en el líquido.
Sabiendo esto se puede simular el comportamiento del fenómeno de transferencia del carbono
en el medio de cultivo y compararlo con los datos experimentales.
72
Ilustración 40. Modelo del proceso de transferencia del CO2 en el medio TAP.
Un previo ajuste de parámetros sobre la ecuación 32 , permitió encontrar los valores de Kga,
He y y0 que mejor se ajustaban a los datos experimentales:
Kga= 0.038 minutos-1
He=14.8 L*atm/mol
y0=6793 ppm
Debido a que en la gráfica de crecimiento, el aumento de la biomasa es constante aún en este
intervalo de tiempo, lo que esto sugiere es que la transferencia del carbono es alta en el
sistema (que inicialmente no tiene carbono disuelto), y que por tanto este comportamiento se
enmascara en la simulación del consumo dando la impresión de que la velocidad de consumo
es muy alta.
En la Ilustración 37 igualmente se observa un tramo largo de aparente consumo que en
realidad es transferencia al líquido, y posteriormente se ve el inicio del consumo de CO2, sin
embargo, en este tramo de la curva, también sucede algo particular, es que el consumo de
carbono llega a un punto en que se detiene, y sin embargo el microorganismo sigue creciendo.
Sin haber medido composición interna y sabiendo que no existe ninguna otra fuente de
carbono en el medio, una alternativa viable puede ser la activación de un metabolismo mixto en
el sistema. Lo anterior es, que una porción del cultivo está utilizando el carbono como fuente de
crecimiento y otra parte no, esta parte que no lo está usando, puede estar usando el oxígeno
producto de la fotosíntesis para activar la vía de la fotorespiración. Esta vía puede activarse en
el momento en el que el sistema llega a niveles de CO2 inferiores a los del ambiente. La enzima
RuBisco puede llegar a reconocer al oxígeno como a un sustrato, esto se llama reacción
paralela o secundaria.
73
5.4. Conclusiones
La alta variación del CO2 en el medio ambiente hizo que se precisara de un sistema cerrado
para estimar los parámetros de transferencia y consumo de carbono inorgánico en el medio,
encontrando que bajo las condiciones de experimentación descritas, el sistema no presenta
limitaciones en la transferencia de carbono. Para las condiciones experimentales reportadas se
obtuvo un Kga de 0.038 min-1, muy parecidos a los reportados por Malcata et al, en 2003 bajo
condiciones experimentales muy similares ( 0.0148 min -1).
Con estos resultados se puede realizar la experimentacion bajo las condiciones de aireación y
agitación descritas teneindo la seguridad de que el carbono inorgánico no va a ser nutriente
limitante en el proceso.
74
6. PRODUCCIÓN DE MOLÉCULAS CANDIDATO A BIOCOMBUSTIBLE: SUPERFICIE DE RESPUESTA
6.1. Introducción
Como se mencionó en los capítulos anteriores, el aumento en la acumulación de lípidos
supone uno de los principales retos en los proyectos de biocombustibles a partir de microalgas.
Para esto, evaluar las condiciones fisicoquímicas más influyentes en la acumulación, es la
estrategia más practicada, encontrándose variaciones en las condiciones ambientales como
intensidad de la luz, temperatura, salinidad e inyección de CO2, así como nutrientes tipo fuente
de carbono y de nitrógeno. C. reinhardtii puede asimilar acetato como fuente de carbono bajo
condiciones de mixotrofía y de heterotrofía. El acetato es incorporado a la célula por proteínas
transportadoras mediadas por ATP, y una vez dentro de la célula puede ser procesado por dos
vías. La vía del glioxilato y el ciclo del TCA. En condiciones heterótrofas (aerobiosis y
oscuridad), la vía que se activa es la del glyoxilato principalmente, y en condiciones de
mixotrofía el ciclo de TCA y la vía de las pentosas se activan aportando esqueletos
carbonados, energía así como poder reductor. (Nannet & Boyle, 2009.). Después del carbono,
el hidrógeno y el oxígeno, el nitrógeno es elemento más importante en la formación de
estructura celular conteniéndose en la masa seca de microalgas en un promedio del 1-10%. C
reinhardtii puede asimilar el amonio (NH4), como fuente de nitrógeno principalmente debido a
que es una fuente energéticamente eficiente y que requiere menor gasto energético para su
asimilación (Harris, 2009). El crecimiento microlgal depende de la presencia de nitrógeno, sin
embargo Jezequel et al en 2000, reportan un pequeño periodo de tiempo de crecimiento
después del agotamiento de la fuente de nitrógeno. Este leve aumento de biomasa se debe al
uso de nitrógeno interno (proteínas). El agotamiento del nitrógeno induce en las células de C.
reinhardtii el aumento en la acumulación de lípidos como material de reserva. Teniendo en
cuenta lo plateado en el capítulo 3, se determinó que la intensidad de la luz y la concentración
de nitrógeno serían las variables a evaluar en estos ensayos, con el propósito de conocer la
respuesta de C. reinhardtii cultivada en zonas de hetero, mixo y autotrofía (Ferreiraa, 2007).
6.2. Materiales y Métodos
Basados en los datos obtenidos en los capítulos anteriores, se realizó el montaje de los
ensayos en los que se evaluó el crecimiento y la acumulación de algunos metabolitos bajo un
diseño experimental en el que se analizaron dos variables que permitían hacer un recorrido por
el metabolismo desde la zona heterótrofa hasta la zona autótrofa pasando por la mixótrofa.
75
Diseño experimental:
El diseño experimental se basó en la metodología Box-Behnken para dos factores con tres
niveles (Ferreiraa, 2007).
La elección de esta metodología obedeció a la ventaja que presenta este modelo de requerir
menor cantidad de ensayos utilizando 4 puntos radiales en su valor medio y un punto central.
Ilustración 41. Diseño experimental tipo Box-Behnken
El diseño propone realizar 2 repeticiones en todos los puntos radiales y 5 repeticiones para el
punto central.
Cada factor se evalúa en 3 niveles (-1, 0 y 1).
La concentración de amonio máxima correspondió a la reportada en el medio TAP, la
concentración intermedia es 1/2 de la máxima y la concentración mínima es 1/3 de la máxima.
Las variables fueron denominadas como:
N: nitrógeno
ƛ: intensidad luminosa
En la Tabla 26 se listan los ensayos realizados.
Tabla 26. Codificación del diseño experimental
variables naturales variables codificadas
código Nitrógeno (mg/L) intensidad luz (Lux) X Y
E 187.5 0 0 -1
F 187.5 0 0 -1
G 125 7500 -1 0
H 125 7500 -1 0
Nitrógeno
Intensidad
de Luz
76
C 375 7500 1 0
D 375 7500 1 0
I 187.5 15000 0 1
J 187.5 15000 0 1
A 187.5 7500 0 0
B 187.5 7500 0 0
K 187.5 7500 0 0
L 187.5 7500 0 0
M 187.5 7500 0 0
Las demás condiciones de cultivo y operación se muestran en la Tabla 27.
Tabla 27. Condiciones de cultivo en ensayos finales.
Condición Valor
Inoculo 10%
Volumen de trabajo 400 mL
Volumen del reactor 1000 mL
Fuente de luz Tira LED de 9 voltios
Tiempo de la prueba 12 días
Tiempo de muestreo 1 día
Temperatura 27ºC
Medio de cultivo TAP
Agitación 110 rpm
Con el propósito de cuantificar la mayor cantidad de sustancias posibles para reducir los
grados de libertad del sistema, se decidió medir las siguientes sustancias
Acetato
Amonio
Lípidos
Proteínas
Carbohidratos
Clorofila
Biomasa
Las técnicas de medición se puntualizaron en el capítulo 2.
Para la estimación de parámetros se utilizaron las siguientes ecuaciones:
77
Biomasa:
∗ Ecuación 33
∗
Ecuación 34
Sustratos:
∗ Ecuación 35
Ecuación 36
Productos:
∗ Ecuación 37
∗ Ecuación 38.
6.3. Resultados y discusión
Una vez obtenidos los datos de las variables medidas se realizó un alisamiento de los datos
con el propósito de disminuir el error experimental. Esta técnica se aplicó para todos los datos y
se realizó en el programa Mathematica 9.0, usando una función de interpolación y ajuste
manual. Con la recuperación de los datos alisados se procedió a calcular los parámetros
necesarios para el análisis de los datos.
En las siguientes gráficas se muestra el promedio del comportamiento de cada uno de los
sistemas agrupados por puntos experimentales.
78
N:0 ƛ:0
Ilustración 42. Resumen del comportamiento cinético en los sistemas A, B, K, L y M.
En este sistema donde la concentración de nitrógeno inicial fue de 192 mg/L en promedio de
las 5 réplicas, se observa un crecimiento aparentemente exponencial hasta el día 5
aproximadamente, donde la concentración de amonio presente en el sistema estaba por debajo
de 1 mg/L. Este sistema presentó las siguientes características:
Biomasa máxima: 839.5 mg/L
Fracción de lípidos máxima: 35.66%
N:1 ƛ:0
Ilustración 43. Resumen del comportamiento cinético de los sistemas C y D
%
Días
mg/L
%
Días
mg/L
79
En los sistemas C y D como se ve en la
Ilustración 433 el crecimiento se dio hasta el día 10 aproximadamente, casi al final de la cinética.
Siendo estos sistemas los que tenían mayor concentración de nitrógeno inicial (381.5)
permitieron una buena acumulación de biomasa, sin embargo la producción de lípidos no fue
tan elevada.
Estos sistemas presentaron las siguientes características:
Biomasa máxima: 1524.36 mg/L
Fracción de lípidos máxima: 24.43%
N:0 ƛ:-1
Ilustración 44. Resumen del comportamiento cinético de los sistemas E y F.
Los sistemas E y F, representan el único punto heterótrofo de la evaluación. Al no tener luz y
usar el acetato como fuente de carbono, este sistema presentó menor crecimiento que los
mixótrofos. La concentración inicial de amonio fue en promedio de 189 mg/L, permitiendo el
crecimiento hasta el día 5 aproximadamente. En este sistema se puede ver al nitrógeno
%
mg/L
Días
80
actuando como nutriente limitante tal como se describió en el capítulo 2, ya que requiere hacer
un gasto energético mayor para sintetizar los metabolitos usando al acetato como fuente de
carbono y energía a la vez.
Estos sistemas presentaron las siguientes características:
Biomasa máxima: 417.4 mg/L
Fracción de lípidos máxima: 31.69%
N: -1 ƛ:0
Ilustración 45. Resumen del comportamiento cinético de los sistemas G y H.
Los sistemas G y H como se puede apreciar en el diseño experimental (tabla 26), corresponden
al punto en el que la concentración de nitrógeno es la mínima de toda la evaluación (124.41
mg/L en promedio). Por tal motivo el crecimiento en estos sistemas fue muy bajo, contrastando
esto con una buena acumulación de lípidos.
Las características de los sistemas son:
Biomasa máxima: 483.5 mg/L
Fracción de lípidos máxima: 35.57%
N: 0 ƛ: 1
%
mg/L
Días
mg/L
81
Ilustración 46. Resumen del comportamiento cinético de los sistemas I y J.
Finalmente los sistemas I y J representan la zona con mayor intensidad de luz y concentración
media de nitrógeno, en ese punto se ve un crecimiento hasta el día 4 aproximadamente,
limitado igualmente por el nitrógeno.
Las características de estos sistemas fueron:
Biomasa máxima: 926.8 mg/L
Fracción máxima de lípidos: 31.96%
Griffiths en 2009, reportó que para las microalgas verdes un tiempo promedio de duplicación
corresponde a 24 h, equivalente esto a una velocidad de crecimeinto de 0.69 d-1. En los 13
puntos experimentales evaluados en este trabajo se encontró que la menor velocidad de
crecimeinto fue de 0.84 d-1 para el sistema F (N:0 ƛ:-1) y la máxima velocidad encontrada fue
de 2.1 d-1 para el sistema B (N:0 ƛ:0).
En la tabla 27 se muestran los resultados de los parámetros calculados según la metodología
para cada uno de los puntos experimentales.
82
Tabla 28. Resumen de los parámetros calculados para los 5 sistemas de crecimiento.
Variables naturales variables codificadas Respuestas
código Nitrógeno (mg/L) intensidad luz (Lux) X Y vel cto d-1
Yxs Ypn %Lip NH4+ %Lip NH4- P NH4+ P NH4-
E 187.5 0 0 -1 0.986 0.3 0.71 11.58 32.56 16.22 18.5
F 187.5 0 0 -1 0.84 0.37 0.91 12.97 30.82 18.72 19.96
G 125 7500 -1 0 1.37 0.32 0.94 18.3 34.91 26.44 17.39
H 125 7500 -1 0 1.37 0.54 1.76 21.27 35.56 42.63 36.25
C 375 7500 1 0 1.93 0.77 0.85 14.5 33.2 28.93 28.93
D 375 7500 1 0 1.73 0.7 0.76 18.67 34.3
27.54 27.54
I 187.5 15000 0 1 1.81 0.68 1.26 16.9 30.911 34.15 31.94
J 187.5 15000 0 1 1.93 0.71 1.24 15.6 33.03 36.7 32.22
A 187.5 7500 0 0 1.765 0.69 1.52 18.3 38.68 25.93 33.13
B 187.5 7500 0 0 2.1 0.77 1.67 17.87 38.87 38.17 39.9
K 187.5 7500 0 0 1.51 0.52 1.34 22.5 34.04 35.57 33.23
L 187.5 7500 0 0 1.43 0.39 1.33 21 34.91 27.48 29.91
M 187.5 7500 0 0 1.4 0.36 1.13 20.42 32.5 29.13 28.18
Vel cto: velocidad de crecimiento.
Yxs: rendimiento de la biomasa con respecto al sustrato.
Ypn: rendimiento del producto (lípidos) con respecto al nitrógeno.
P: productividad
83
Se realizó un análisis de la productividad de lípidos en la fase del crecimiento que tenía amonio
en el medio, y en la zona en la que ya el amonio había sido totalmente consumido, con el
propósito de encontrar información sobre la acumulación de lípidos producto de la ausencia de
nitrógeno.
Ilustración 47. Fracción de lípidos acumulada en los sistemas con y sin nitrógeno en el medio.
En la Ilustración 47 se aprecia claramente el aumento del porcentaje de acumulación de
lípidos, pasando de la zona en la que el medio aún tiene amonio (círculos sin relleno) a la zona
en la que este porcentaje aumenta una vez se agota el nitrógeno del medio (círculos con
relleno).
En la Tabla 29 se puede ver el aumento que tuvo cada sistema una vez se agotó el nitrógeno
del medio de cultivo (los códigos en el eje X de la ilustración 68 corresponden a cada sistema).
De esta manera se aprecia que el aumento es muy similar en todos los sistemas evaluados, las
diferencia principales en la productividad de cada sistema se debe a la concentración inicial de
nitrógeno que tenía el medio, esto influyó en la producción de biomasa y en el tiempo en el que
se dio el aumento de lípidos.
Tabla 29. Aumento en el porcentaje de lípidos por el agotamiento del nitrógeno.
Código Sistema Aumento en la fracción (%)
1 N:0 ƛ:-1 19.415 ± 1.10
2 N:-1 ƛ:0 15.45 ± 1.27
3 N:1 ƛ:0 17.41 ± 2.03
4 N:0 ƛ:1 15.7205 ± 1.20
5 N:0 ƛ:0 15.782 ± 2.38
NH4 -
O NH4 +
84
Sheehan et al. 1998 reportaron productividades de 25-50 mg/L/día para C. reinhardtii cultivada
en medio TAP. En la Tabla 30 se muestran las productividades de lípidos obtenidas en los 5
sistemas de evaluación con y sin amonio en el medio de cultivo.
Tabla 30. Productividades de lipidos en los sistemas con y sin amonio.
Sistema NH4 +
mg/L/día
NH4 –
mg/L/día
N:0 ƛ:-1 17.47 19.23
N:-1 ƛ:0 34.535 26.82
N:1 ƛ:0 28.235 28.235
N:0 ƛ:1 35.425 32.08
N:0 ƛ:0 31.2 32.87
Como se explicó en la metodología de este capítulo, se calcularon los rendimientos de lípidos
en mg/L/día para cada sistema experimental, así como los rendimientos de este metabolito.
Estos datos fueron usados para trazar las gráficas de superficie de respuesta. En estas
gráficas se muestran las zonas con mayor actividad del parámetro evaluado, así como su valor
máximo y coordenadas de ubicación. A continuación se exponen las gráficas correspondientes
a las fracciones de lípido y sus productividades tanto en el medio con amonio como en el medio
sin amonio.
Ilustración 48. Fracción de lípidos en medio TAP con amonio.
85
El valor máximo de la fracción de lípidos que se estimó por el método cuadrático fue de 20.54%
con respecto a la biomasa, y se ubica en la zona de color naranja en la coordenadas X:-0.43 Y:
0.17.
Ilustración 49.Fraccion de lípidos en medio TAP sin amonio.
Esta gráfica que corresponde a los días en los que el amonio se agotó totalmente para cada
uno de los sistemas refleja el aumento en la fracción de lípidos encontrando un máximo valor
de 37.14% ubicado en X: -0.45 Y:0.017.
Ilustración 50. Productividad de lípidos en medio TAP con amonio.
Como se observa en la Ilustración 50, la zona donde se encuentra el valor máximo está en la
frontera del gráfico ubicándose por encima de los 35 mg/L/día y en la zona de menor
concentración de nitrógeno y mayor intensidad de luz.
86
Ilustración 51. Productividad de lípidos en medio TAP sin amonio.
En las gráficas de superficie de respuesta se aprecia que con respecto a la fracción de lípidos
(porcentaje), esta fue más alta en la zona en la que se había agotado el nitrógeno en el medio.
Sin embargo un comportamiento común en las dos gráficas es que la mayor acumulación se
ubica en la misma zona, cerca de la máxima intensidad de luz y muy baja concentración de
nitrógeno.
Por otra parte en las gráficas de productividad (Ilustración 50 y Ilustración 51), en donde se
relaciona más directamente la biomasa se observa que en presencia de nitrógeno la máxima
productividad se ubica en la zona de alta intensidad de luz y baja concentración de nitrógeno,
pero una vez se agota el amonio (grafica sin NH4), la productividad máxima cambia de zona
ubicándose cerca de una media-alta intensidad de luz y alta concentración de nitrógeno. Esto
tiene que ver con el hecho de que la alta producción de biomasa está ligada al nitrógeno y que
una vez este se agote la productividad de lípidos será mayor en el punto donde se alcanzó
mayor concentración de biomasa.
Ya que las ilustraciones 50 y 51 sugieren que una mayor intensidad de luz aumentaría la
productividad cabe recordar que en el capítulo 4 en la ilustración 29 se observa que la
acumulación de biomasa empieza a disminuir por encima de los 20000 lux y allí mismo se
discuten las razones de no realizar las evaluaciones con más de 15000 lux de intensidad.
Como se esperaba la productividad más alta está presente en los puntos que tienen una mayor
concentración de nitrógeno, ya que alcanzan mayor cantidad de biomasa, sin embrago estos
resultados aplican para cultivos en lote, en los que habría que esperar a que se agote el
nitrógeno o se logre el máximo de biomasa para inducir la acumulación por ausencia de
nitrógeno.
87
James et al en 2010, reportaron un aumento en porcentaje total de lípidos en C. reinhardtii de
16 a 40% una vez se agotaba el nitrógeno del medio de cultivo.
Finalmente, los datos obtenidos en la experimentación de este capítulo fueron analizados para
obtener los parámetros requeridos para realizar el análisis de flujos metabólicos. Estos
parámetros se muestran en el anexo.
6.4. Conclusiones
De los puntos experimentales evaluados, los que sugieren ser más idóneos para alcanzar una
mejor productividad de lípidos, están en las zonas de alta intensidad de luz y baja
concentración de nitrógeno. Sin embargo la alta concentración de nitrógeno inicial permitiría
una mayor cantidad de biomasa, resultando esto en una alta productividad de lípidos.
Una posible estrategia sugerida por los resultados plasmados en las gráficas de superficie de
repuesta podría ser un lote alimentado o un sistema continuo en el que se logre una cantidad
de biomasa alta producto de una alta concentración de nitrógeno inicial, y cuando esta
sustancia (nitrógeno) empiece a agotarse y llegue cerca de los 10 mg (zona en la que se
dispara el aumento de lípidos) el sistema empezará a acumular lípidos, de tal forma que se
alimente el cultivo con nitrógeno sin sobrepasar esta frontera cercana a los 10 mg,
garantizando así el estrés celular por carencia de nitrógeno pero con la cantidad mínima
suficiente para que las células puedan seguirse reproduciendo.
88
7. ANÁLISIS DE FLUJOS METABÓLICOS
7.1. Introducción
El metabolismo es la suma de todas las transformaciones que toman lugar en una célula u
organismo. Estas transformaciones ocurren a través de una serie de reacciones que
constituyen las vías metabólicas. Estas vías metabólicas ayudan principalmente a obtener
energía por la degradación de nutrientes ricos en energía captados del ambiente, convertir
moléculas de nutrientes en moléculas características de las células (precursores), transformar
estos precursores en macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos y sintetizar y
degradar biomoléculas específicas para funciones celulares especializadas (Provost, 2006).
En términos generales el metabolismo se compone de las vías y reacciones cuya función es
sintetizar moléculas mayores que sirven como estructura celular o reservas energéticas
(anabolismo) y por otra parte de las vías y reacciones que se encargan de degradar moléculas
grandes con el propósito de obtener la energía necesaria para que se puedan realizar las
funciones de síntesis y polimerización (catabolismo).
De acuerdo el nivel de complejidad celular existen más o menos reacciones metabólicas. En el
caso de Chlamydomonas reinhardtii, el metabolismo primario se puede resumir en las
siguientes vías:
Fotosíntesis
Ciclo de Calvin
Ciclo de Krebs
Vía de las pentosas fosfato
Síntesis de pigmentos
Síntesis de aminoácidos
Síntesis de ácidos grasos
Síntesis de ácidos nucleicos
Reacciones de inter-conversión
Metabolismo del piruvato
Metabolismo del tetrahidrofoláto
Vía de glicolisis/gluconeogénesis
Vía de la beta-oxidación
Reacciones energéticas asociadas a motilidad
Vía de producción de hidrogeno
Asimilación de nitrógeno
Asimilación de azufre
Reacciones de transporte intra/extra-celular
89
En términos generales estas reacciones metabólicas pueden ser descritas como flujos, y las
sustancias que en ellas participan (metabolitos) son llamados nodos metabólicos. Los nodos
conectan las reacciones en una red, y los flujos aportan la información de trayectoria en la
distribución del carbono a través de la red metabólica.
La cuantificación precisa de la magnitud de los flujos de tales vías metabólicas, es de hecho un
logro importante para la fisiología celular y la ingería metabólica, especialmente en el contexto
de la producción de metabolitos donde el objetivo principal es tratar de convertir la mayor parte
de sustratos en productos de interés (Nielsen & Stephanopoulos, 1998). Esta cuantificación de
flujos metabólicos se realiza por la aplicación de modelos matemáticos que describen el
comportamiento de la red metabólica de estudio.
El modelamiento matemático es una herramienta muy poderosa en física, química, biología e
ingeniería para la interpretación y predicción de fenómenos naturales y resultados
experimentales.
Un modelo matemático es siempre una simplificación del fenómeno actual, por medio del cual
además es posible establecer diferentes estrategias matemáticas que resuelvan el mismo
modelo, dependiendo de los objetivos de este modelo y de las medidas disponibles (Dochain &
Bastin, 1990).
En la biotecnología se han implementado diversos modelos matemáticos con el propósito de
elucidar procesos metabólicos difíciles de entender a simple vista. Inicialmente funcionaban
para describir procesos macroscópicos que involucraban la transformación de sustratos en
productos, estos modelos fueron originalmente conocidos como modelos de caja negra ya que
el funcionamiento interno no era esclarecido entonces (Provost, 2006).
Recientemente los esfuerzos se han dirigido hacia la obtención de modelos macroscópicos que
permitan la descripción del metabolismo intracelular (Hagg, Wower, & Bogaerts, 2005). Como
se describió en el capítulo 1 (Introducción), una metodología poderosa para la cuantificación
de estos flujos es el análisis de flujos metabólicos, que basa su funcionamiento en la
descripción de flujos intracelulares a través de una matriz estequiométrica usando tasas
extracelulares relativamente fáciles de medir experimentalmente.
En este trabajo se usó como base la metodología descrita por Provost en 2006, del cual se
obtienen flujos metabólicos de una red extensa a través de varios pasos que involucran el
análisis convexo en lugar del algebra lineal.
El análisis convexo se basa en la resolución geométrica de sistemas lineales no negativos
(redes metabólicas), generando como respuesta un grupo de vectores conocidos como ―rayos
90
extremos‖. Posteriormente y como se muestra en la metodología de este capítulo, estos rayos
son computarizados para obtener vectores de flujos metabólicos asociados a las reacciones de
la red.
En este capítulo se detalla la aplicación de esta metodología de análisis convexo y se
presentan los resultados de los diferentes sistemas metabólicos descritos en el capítulo 6, así
como las diferencias en la distribución del carbono para cada condición de crecimiento.
7.2. Materiales y métodos
A continuación se detallan los procedimientos matemáticos necesarios para obtener flujos
metabólicos a partir de la matriz estequiométrica inicial del sistema.
Desarrollo matemático
Por definición, el objetivo del análisis de flujos metabólicos es determinar la distribución del flujo
del carbono en un sistema vivo. En este caso el sistema se basa en el crecimiento de C.
reinhardtii bajo diferentes condiciones externas que influyeron en su crecimiento y acumulación
de ciertos componentes celulares (ver capítulos anteriores para mayor detalle). Teniendo en
cuenta estas variaciones metabólicas en el sistema tenemos que:
Ecuación 39
Dónde:
x= metabolito interno, (sustrato, producto o componente celular).
Y= matriz estequiométrica del sistema.
qm= vector de tasas metabólicas.
qI= vector de tasas de intercambio.
µ= velocidad de crecimiento.
x= concentración de sustancia.
Para este caso específico donde el interés son los flujos metabólicos podemos reacomodar la
Ecuación 39 de la siguiente manera:
91
Ecuación 40
De la ecuación 40 vale la pena destacar que qI solo aplica a las sustancias intercambiadas con
el medio ambiente y que para el caso de los intermediarios metabólicos (metabolitos pequeños)
como su concentración es muy pequeña su acumulación es normalmente 0 o muy cercana a 0
pudiendo así descartarse este componente de la ecuación.
En el mismo sentido, como la concentración del metabolito es muy baja, el término de dilución,
μx, es también despreciable.
Estos intermediarios metabolicos entran en la definición de modos elementales. Los cuales se
definen como el conjunto de soluciones qm que satisfacen:
Ecuación 41
Sin embargo, considerar el sistema en la forma de Y solo permite analizar el movimiento de los
flujos intracelulares (ciclos) con lo cual conviene adicionar las sustancias intercambiadas
(sustratos y productos) a la matriz Y para obtener una matriz estequiométrica de forma M que
contenga las entradas y salidas de sistema. Atendiendo a lo anterior podemos escribir la
ecuación de balance como:
(
) (
) ( − −
) (
) Ecuación 42
Dónde:
qs= mediciones experimentales de sustratos.
qp= mediciones experimentales de productos.
En la ecuación 42 se ha partido Y en tres matrices para separar sustratos y productos de las
otras sustancias que son estrictamente intracelulares. Con este arreglo los modos elementales
se definen como las qm contenidas en los primeros n renglones de q que satisfacen:
Ecuación 43
En este trabajo se usó algoritmo propuesto por el grupo de trabajo de S. Schuster y R.
Schuster en 1993 llamado ―METATOOL1‖, para la resolución de los modos elementales
partiendo del sistema mostrado en la ecuación 42.
1 Fuente de METATOOL:
http://pinguin.biologie.unijena.de/bioinformatik/networks/metatool/metatool5.0/metatool5.0.html
92
Conviene notar que usualmente existen varios modos elementales que satisfacen la ecuación,
por lo que pueden acomodarse en una matriz E, de modos elementales que satisface, en
congruencia con la anterior,
Una vez obtenidos los modos elementales Enxe se puede tomar una parte de la ecuación 42 y
realizar un cálculo que involucre la matriz estequiométrica Y y los recién obtenidos modos E:
(
)
(
) Ecuación 44
Aunque los modos elementales ofrecen diversas soluciones para el sistema Y qM =0, no todas
esas soluciones satisfacen a la ecuación 44, de hecho, sólo una combinación de los modos
elementales pueden reproducir los resultados experimentales,
q
Donde w es un vector de pesos, De ahí que la ecuación 44 pueda ser reescrita como:
( s
p) (
qs
qp) (
q
q ) (
)
Esta matriz es ejecutada bajo el algoritmo de METATOOL ver 5.0, arrojando como resultado
una matriz W que incluye columnas cuyos valores son los pesos (w) y un último renglón de
unos que involucra el producto necesario para el arreglo mostrado en la ecuación 44. Cada
vector de pesos multiplicado por los modos elementales E proporciona un grupo de vectores
cuyas dimensiones son por un lado la cantidad de reacciones de la red y por otro la cantidad de
pesos encontrados en W. De esta manera tenemos los flujos metabólicos asociados a cada
reacción, notando que la suma de todos estos vectores son las posibles combinaciones que se
pueden obtener en la distribución del carbono por la red metabólica (posibles escenarios de
distribución de los flujos metabólicos).
Modelo metabólico
Se tomaron como base los modelos metabólicos reportados en (Nannet & Boyle, 2009) y en
(Klipuis, 2010), además se usaron las bases de datos KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and
genomes) y BioCyc (data base collection) como elementos de partida para la construcción del
modelo metabólico aquí reportado.
93
Rutas metabólicas
Como se detalló en el capítulo 6, los sistemas experimentales corresponden a crecimiento en
autotrofía, mixotrofía y heterotrofía, y teniendo en cuenta las sustancias o metabolitos de
interés, se obtuvo una red metabólica con las siguientes características:
Tabla 31. Rutas y reacciones de la red metabolica general.
Ruta metabólica Reacciones
Fotosíntesis 8 Light + 3 ADP + 3 Pi + H[+] + 2 cNADP O2 + H2O + 2 cNADPH + 3 ATP
Ciclo de Calvin CO2 + H2O + cRu15DP 2 cG3P
ATP + cG3P ADP + H[+] + c13DPG
H[+] + cNADPH + c13DPG cNADP + Pi + cGAP
cGAP cDHAP
cDHAP + cGAP cF16P
H2O + cF16P Pi + cF6P
cF6P + cGAP cE4P + cX5P
H2O + cE4P + cGAP Pi + cS7P
cGAP + cS7P cR5P + cX5P
cX5P cRu5P
cR5P cRu5P
ATP + cRu5P ADP + H[+] + cRu15DP
Glicolisis/gluconeogénesis G6P G1P
F6P G6P
ATP + F6P ADP + F16P + H[+]
F16P + H2O F6P + Pi
DHAP + GAP F16P
DHAP GAP
GAP + NAD+Pi 13DPG + H[+] + NADH
13DPG + ADP 3PG + ATP
3PG 2PG
2PG H2O + PEP
ADP + H[+] + PEP ATP + PYR
Ciclo del ácido cítrico CoA + NAD + PYR AcCoA + CO2 + NADH
AcCoA + H2O + OXA CIT + CoA + H[+]
CIT + NAD AKG + CO2 + NADH
AKG + CoA + NAD CO2 + NADH + SUCCoA
ADP + Pi + SUCCoA ATP + CoA + SUC
FAD + SUC FADH2 + FUM
FUM + H2O MAL
FAD + MAL FADH2 + OXA (cambia el NAD y NADH por FAD y FADH)
ATP + CO2 + H2O + PYR ADP + OXA + Pi + 2 H[+]
ATP + OXA ADP + CO2 + PEP (aparece en gluconeogenesis)
CO2 + H2O + PEP H[+] + OXA + Pi (aparece en gluconeogenesis)
Ciclo de las pentosas fosfato G6P + H2O + NADP 6PG + NADPH + 2 H[+]
6PG + NADP CO2 + NADPH + RU5P
RU5P R5P
RU5P X5P
94
R5P + X5P GAP + S7P
GAP + S7P E4P + F6P
F6P + GAP E4P + X5P
Síntesis de
aminoácidos/proteína
AKG + H[+] + NADPH + NH4[+] GLU + H2O + NADP
ATP + GLU + NH4[+] ADP + GLN + H[+] + Pi
AKG + GLN + H[+] + NADPH NADP + 2 GLU
3PG + GLU + H2O + NAD AKG + H[+] + NADH + Pi + SER
SER NH4[+] + PYR
AcCoA + H2S + SER Ace + CYS + CoA + H[+]
ATP + Ace + CoA ADP + AcCoA + Pi
GLU + PYR AKG + ALA
H[+] + THR 2-oxobutan + NH4[+]
2-oxobutan + GLU + H[+] + NADPH + PYR AKG + CO2 + H2O + ILE + NADP
2 H[+] + ALA + NADPH + PYR CO2 + H2O + NADP + VAL
2 PYR + AcCoA + GLU + H[+] + NAD + NADPH AKG + CoA + LEU + NADH + NADP + 2 CO2
2 PEP + ATP + E4P + NADPH ADP + CHO + NAD P + 4 Pi
CHO PRE
GLU + H[+] + PRE AKG + CO2 + H2O + PHE
GLU + NAD + PRE AKG + CO2 + NADH + TYR
CHO + GLN ANTH + GLU + H[+] + PYR
ANTH + H[+] + PRPP + SER CO2 + GAP + PPi + TRYP + 2 H2O
3 H2O + 2 NAD + ATP + GLN + PRPP AICAR + AKG + HIS + Pi + 2 NADH + 2 PPi + 5 H[+]
GLU + OXA AKG + ASP
ASP + ATP + GLN + H2O ADP + ASN + GLU + H[+] + Pi
2 ATP + 2 H2O + CO2 + GLN CaP + GLU + Pi + 2 ADP + 3 H[+]
2 GLU + ASP + ATP + CaP + NADH AKG + AMP + ARG + FUM + H2O + NAD + PPi + Pi
3 H[+] + 2 NADH + GLU PRO + 2 H2O + 2 NAD
AKG + O2 + PRO CO2 + HydPro + SUC
ASP + ATP + H[+] + NADPH ADP + ASA + NADP + Pi
2 H[+] + ASA + GLU + NADH + PYR AKG + DAP + H2O + NAD
DAP CO2 + H[+] + LYS
ASA + H[+] + NADPH HSER + NADP
ATP + H2O + HSER ADP + H[+] + Pi + THR
AcCoA + CYS + H2O + HSER Ace + CoA + HCYS + H[+] + NH4[+] + PYR
HCYS + MTHF H[+] + MET + THF
4.306 ATP + 3.306 H2O + 0.111 ALA + 0.094 GLY + 0.093 LEU + 0.059 PRO + 0.059 VAL + 0.058 LYS + 0.057 THR + 0.055 SER + 0.05 GLN + 0.05 GLU + 0.047 ARG + 0.047 ASN + 0.047 ASP + 0.045 PHE + 0.036 ILE + 0.031 TYR + 0.022 MET + 0.017 HIS + 0.013 HydPro + 0.012 CYS + 0.001 TRYP PROTEINA + 4.306 ADP + 4.306 Pi + 4.314 H[+]
Síntesis de ácidos
grasos/lípidos
ACP + AcCoA + H[+] AcACP + CoA
ATP + AcCoA + CO2 + H2O ADP + H[+] + MalCoA + Pi
ACP + MalCoA CoA + MalACP
10 H[+] + 10 NADPH + 5 MalACP + AcACP C12:0ACP + 5 ACP + 5 CO2 + 5 H2O + 10 NADP
12 H[+] + 12 NADPH + 6 MalACP + AcACP C14:0ACP + 6 ACP + 6 CO2 + 6 H2O + 12 NADP
14 H[+] + 14 NADPH + 7 MalACP + AcACP C16:0ACP + 7 ACP + 7 CO2 + 7 H2O + 14 NADP
C160ACP + H[+] + NADH + O2 C16:1ACP + NAD + 2 H2O
C161ACP + H[+] + NADH + O2 C16:2ACP + NAD + 2 H2O
C162ACP + H[+] + NADH + O2 C16:3ACP + NAD + 2 H2O
16 H[+] + 16 NADPH + 8 MalACP + AcACP C18:0ACP + 8 ACP + 8 CO2 + 8 H2O + 16 NADP
C180ACP + H[+] + NADH + O2 C18:1ACP + NAD + 2 H2O
95
C181ACP + H[+] + NADH + O2 C18:2ACP + NAD + 2 H2O
C182ACP + H[+] + NADH + O2 C18:3ACP + NAD + 2 H2O
GLYC3P + 0.474 C16:0ACP + 0.446 C18:3ACP + 0.276 C18:2ACP + 0.253 C16:3ACP + 0.16 C18:1ACP + 0.148 C16:2ACP + 0.104 C12:0ACP + 0.051
C14:0ACP + 0.048 C18:0ACP + 0.04 C16:1ACP Lipido + 2 ACP + 2 H[+]
Síntesis de ácidos nucleicos 4 ATP + 2 GLN + 2 H2O + ASP + CO2 + GLY + N10FTHF + PRPP AICAR + FUM
+ PPi + THF + 2 GLU + 4 ADP + 4 Pi + 7 H[+]
ASP + CaP + H[+] + O2 + PRPP CO2 + H2O + H2O2 + PPi + Pi + UMP
2 H2O2 O2 + 2 H2O
ATP + UMP ADP + UDP
ATP + UDP ADP + UTP
ATP + GLN + H2O + UTP ADP + CTP + GLU + Pi + 2 H[+]
ATP + CDP ADP + CTP
AICAR + N10FTHF H2O + IMP + THF
ATP + H2O + IMP + NAD + NH4[+] AMP + GMP + NADH + PPi + 3 H[+]
ATP + GMP ADP + GDP
ATP + GDP ADP + GTP
ASP + GTP + IMP AMP + FUM + GDP + Pi + 2 H[+]
ATP + H[+] + METHF + NADPH + UDP ADP + DHF + H2O + NADP + dTTP
ATP + CDP + H[+] + NADPH ADP + H2O + NADP + dCTP
ATP + GDP + H[+] + NADPH ADP + H2O + NADP + dGTP
ATP + H[+] + NADPH H2O + NADP + dATP
2.372 H2O + 1.372 ATP + 0.18 dATP + 0.18 dTTP + 0.32 dCTP + 0.32 dGTP
DNA + PPi + 1.372 ADP + 1.372 Pi + 2.372 H[+]
1.4 H2O + 0.56 ATP + 0.34 GTP + 0.16 UTP + 0.34 CTP 0.4 ADP + 0.4 H[+] +
0.4 Pi + PPi + RNA
Síntesis de clorofila 12 H[+] + 8 ATP + 8 GLU + 8 NADPH + 2.5 O2 PPorphyrin + 4 NH4[+] + 6
CO2 + 8 AMP + 8 NADP + 8 PPi + 13 H2O
18 H[+] + 15 NADPH + 8 ATP + 4 GAP + 4 PYR Phytyl-PP + 4 ADP + 4 AMP +
4 CO2 + 7 PPi + 8 H2O + 15 NADP
ATP + H2O + MET AdMET + H[+] + PPi + Pi
AdHCYS + H2O Ad + HCYS
ATP + Ad ADP + AMP + H[+]
144 4 NADPH + 2.5 O2 + 2 ATP + AdMET + Mg2[+] + PPorphyrin + Phytyl-PP AdHCYS + Clorofila + PPi + 2 ADP + 2 H2O + 2 Pi + 3 H[+] + 4 NADP
Síntesis de carbohidratos G1P Pi + STARCH
G1P Carbohidratos + Pi
Las reacciones correspondientes a síntesis de aminoácidos, ácidos nucleicos, ácidos grasos, y
clorofila fueron transformadas a reacciones resumidas que parten de los intermediarios
metabólicos (AcCoA, ATP, GAP etc.). Estas rutas pasaron de varias reacciones a una reacción
general de síntesis, con el propósito de disminuir la cantidad de sustancias presentes en la red.
De esta manera se obtuvo una red metabólica general (mixotrofía) que fue usada como base
para evaluar los sistemas autótrofos y heterótrofos eliminando las rutas metabólicas que no
correspondían con cada tipo de metabolismo.
96
7.3. Resultados y discusión
Topología de la red
La red metabólica tiene las siguientes características:
Tabla 32. Topologia de la red mixotrófica.
Variable Codificación Numero
Reacciones n 55
Sustratos Ys 3*
Productos Yp 6*
Intermediarios metabolicos Yx 42
*El CO2 puede actuar como sustrato o producto dependiendo del sistema evaluado.
Diagrama de la red metabólica
El siguiente diagrama de adyacencia fue obtenido con el software Mathematica 9.0. En este
diagrama se aprecian los metabolitos como nodos (puntos) y las reacciones que estos
conectan aparecen como flechas.
Ilustración 52. Red metabólica completa del sistema mixotrófico.
Este diagrama representa el modelo completo en mixotrofía, del mismo se derivan los modelos
autotróficos y heterotróficos al suprimir las reacciones propias de cada sistema.
97
Calculo de los flujos metabólicos
Para el cálculo de los flujos metabólicos se usaron las velocidades de consumo y generación
de sustancias determinadas en el capítulo 6.
Se decidió realizar el análisis de la distribución de los flujos de carbono en los puntos de
mixotrofía, autotrofia y heterotrofia para los 5 puntos experimentales mostrados en el diseño de
Box-Behnken. Debido a la similitud en las velocidades dentro de cada grupo (mixo, auto y
heterotrofía) se promediaron los flujos de cada grupo y se obtuvo así un mapa de flujos
representativo para cada grupo. A continuación se muestra la matriz estequiometria base de
los cálculos y el mapa de flujos obtenido para los tres modelos metabólicos planteados.
Tabla 33. Matriz estequiometrica del modelo mixotrofico de C. reinhardtii.
Filas: sustancias; Columnas: reacciones.
En gris los valores diferentes de 0; en Azul los sustratos; en naranja los productos.
CO2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
NH4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Acetato 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Lípidos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -3105 0 -14711 0 0 0 0 -16711 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -29422 0 -1000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1000 0 0
Carbohidratos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 2 0 0 0
Proteína 0 77 0 0 -368 0 1 0 0 170 0 -1632 -70 0 0 0 -153 -269 219 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1871 0 0 0 -1 0 -35 -569 170 0 0 0 0 -1368 1
SUC 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FUM 0 -1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
FADH2 0 0 1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
MAL 0 0 0 0 0 -1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
OXA 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
DHAP 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
GAP 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
F16P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
D13PG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
NADH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
P3G 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 -1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
ATP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
PEP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
F6P 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G6P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G1P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AcCoA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 -1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AKG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 -1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
cNADPH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
c13DPG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
cGAP 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
cDHAP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
cF16P 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
cF6P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
cE4P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
cX5P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
cS7P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
cR5P 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
cRu5P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
DHA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0
NADPH 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0
GLYC 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
GLYC3P 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 -1 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
RU5P 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0
R5P 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
X5P 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 -1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
E4P 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
PYR 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
cRu15DP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0
cG3P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
98
Ilustración 53. Mapa de los flujos metabólicos de C. reinhardtii bajo crecimiento mixotrófico,
autotrófico y heterotrófico.
99
Cabe la pena destacar dentro el procedimiento del algoritmo METATOOL que la sensibilidad es
bastante alta, lo cual hace bastante complejo el cálculo de los flujos, debido a que no pueden
calcularse todos los flujos usando todas las sustancias medidas a la vez como restricciones del
sistema. Sin embargo, en el cálculo de los pesos (Ecuación 44), pueden usarse combinaciones
de estas sustancias que permitan al algoritmo devolver los valores adecuados para todas las
sustancias, incluyendo aquellas que no se usaron en el cálculo de los pesos. En el caso de
estos flujos se utilizaron diferentes combinaciones en cada caso, realizándose la corroboración
de los valores arrojados en el producto E*W´ para las sustancias no usadas en el cálculo (ver
ecuación 43).
Análisis de los flujos metabólicos
Como se observa en la Ilustración 53, el sistema mixotrófico (cuadros amarillos) tiene una
distribución a lo largo de toda la red, fijando carbono inorgánico en el cloroplasto por medio de
las reacciones de fotosíntesis y ciclo de Calvin. Así mismo realiza la incorporación del acetato
al citosol que es rápidamente convertido en AcCoA. Teniendo en cuenta que la mixotrofìa en
los 4 puntos experimentales mostrados en el capítulo 6, corresponde a los puntos iniciales del
sistema, momento en el cual el medio de cultivo contenía acetato (días iniciales de la
evaluación), se aprecia una mayor captación de carbono inorgánico que en el modelo
autotrófico. El modelo autotrófico fue asumido una vez se agota el acetato del medio del cultivo
(después del 4 día aproximadamente), en este momento se aprecia una disminución de la
velocidad de crecimiento y en términos de velocidad, una disminución en la velocidad de
acumulación de lípidos. En el mapa de flujos de carbono se aprecia que la cantidad de
precursor para la síntesis de lípidos (AcCoA) es menor en el punto autótrofo que en el punto
mixotrofo, esto debido principalmente a la cantidad de carbono que ingresa a cada sistema y a
los esfuerzos energéticos de cada modelo. Cuando el microorganismo solo dispone de CO2
para su crecimiento, la fotosíntesis es quien realiza el mayor trabajo energético del sistema, por
otra parte cuando se dispone de acetato en el medio de cultivo, el gasto energético se suple
por el funcionamiento de la vía de las pentosas fosfato y el ciclo de Krebs principalmente. Así
que, al tener un metabolismo mixto se dispone de mayor carbono para la síntesis de moléculas
intermediarias.
Por su parte, el modelo heterotrófico representado en el mapa metabólico en cuadros azules,
muestra ser menos eficiente en la síntesis de intermediarios metabólicos como la AcCoA, ya
que este sistema debe disponer del acetato para realizar la polimerización de macromoléculas
así como la producción de la energía requerida. Como se aprecia en el mapa, el
funcionamiento del modelo heterotrófico tiene un aspecto diferente a los otros dos, esto es
100
debido a que el carbono ingresa al sistema en forma de AcCoA, teniendo que dirigirse hasta las
vías de pentosas y síntesis de carbohidratos en contraflujo de los sistemas mixotroficos y
autotróficos.
En este trabajo no se modelo la parte energética de cada sistema, debido a la complejidad en
el cálculo de los flujos, sin embargo esto complementaria mucho más el análisis.
Otro punto importante de resaltar, es que la simplificación que se realizó de la síntesis de
lípidos y proteínas (usando solo intermediarios metabólicos) no permite en gran medida un
análisis más profundo sobre la distribución del carbono en estos puntos. Por ahora solo se
puede realizar un juicio sobre la distribución del carbono hasta el intermediario mayor y
precursor de estos componentes celulares (AcCoA).
7.4. Conclusiones
Vale la pena incorporar al modelo, una red metabólica que incluya los componentes
energéticos completos para que el análisis pueda ser mucho más profundo.
El uso de redes cada vez más complejas podría aportar más información en el análisis, aunque
es bien conocido de la complejidad de manejar matemáticamente sistemas muy grandes, sin
embargo este modelo podría mejorarse al usar las reacciones completas de síntesis de
macromoléculas.
De igual forma que como se concluyó en el capítulo 6, el sistema mixotrófico involucra una
mayor productividad de lípidos, por tanto se muestra como el modelo metabólico más eficiente
en este trabajo.
En el mapa metabólico así como en los resultados de las cinéticas mostrados en el capítulo 6,
se logra inferir que el sistema de mixotrofía efectivamente parece ser la suma de los
metabolismos auto y heterotrófico. Esto tiene mucho significado si se logra pensar en procesos
de producción que logren combinar la fijación del CO2 (gas de efecto invernadero), y el uso de
residuos orgánicos que contengan fuentes de carbono como el acetato (aguas residuales
domesticas o industriales), combinando en un solo proceso una solución a dos impactos
ambientales y optimizando la producción de biomasa y lípidos de microalgas.
Estos modelos metabólicos aquí planteados pueden usarse como base en la construcción de
una herramienta más poderosa para la simulación metabólica de C. reinhardtii bajo diferentes
condiciones de crecimiento y/o modificaciones genéticas, permitiendo analizar la distribución
del carbono y afectación de rutas metabólicas.
101
8. ANEXOS
8.1. Fundamento de las técnicas analíticas utilizadas
Cuantificación de proteínas por el método del ácido bicinconínico (BCA)
El ensayo del ácido Bicinconínico fue descrito en primera instancia por Smith et al (1) de
manera similar al ensayo de Lowry, ya que depende de la conversión de Cu+2 a Cu+ en
condiciones alcalinas. Este Cu+ es luego detectado por reacción con el BCA. Los dos ensayos
son similares en sensibilidad, pero el BCA es más estable bajo condiciones alcalinas, y además
tiene la ventaja de que puede ser llevado a cabo en un solo paso comparado con los dos pasos
requeridos en Lowry.
La reacción resulta en el desarrollo de un color purpura intenso con un máximo de absorbancia
a 562 nm. Ya que la producción de Cu+ en esta prueba es función de la concentración de la
proteína y el tiempo de incubación, el contenido de proteínas de muestras desconocidas puede
ser determinado espectrofotométricamente por comparación con unos patrones de proteína
estándar.
Proteína + Cu2+ • Cu1+
Cu1+ + BCA complejo purpura BCA- Cu1+ Ecuación 45
Otra ventaja es que es el BCA presenta poca interferencia con sustancias como si lo presenta
el método de Lowry. En particular, no es afectado por detergentes ni agentes desnaturalizantes
como la urea o el cloruro de guanidina, aunque es más sensible a la presencia de azúcares
reductores.
Esta metodología ya ha sido altamente utilizada en procesos que incluyen biomasa de
microalgas (Nannet R Boyle, 2009.), (Markus Fuhrmann, 2001.), (Schwenzfeier, Wierenga, &
Gruppen, 2011)
Reactivo de BCA
Preparación del reactivo:
Reactivo A: BCA 1%, Na2CO3 2%, tartrato sódico 0,16%, NaOH 0,4% y NaHCO3 0,95%.
Ajustar a pH 11,25 con NaOH. Echo para 100 mL de agua.
Reactivo B: CuSO4 al 4%.
Reactivo de trabajo (RT): mezclar 100 volúmenes de A con 2 volúmenes de B.
102
La solución es de color verde manzana y es estable por una semana a temperatura ambiente y
protegida de la luz.
Se debe preparar una curva de calibración con diferentes diluciones de un stock de 1mg/mL de
BSA.
Una vez obtenida la curva las muestras se miden así:
Se prepara una solución acuosa de biomasa aproximadamente de 1-5 mg de Biomasa /10mL
de agua. (Ver nota 5 para la adición de SDS)
De esta solución se toman 100 µL y se le adicionan 2 mL del reactivo de trabajo RT.
Se incuba a 60°C por 30 min.
Enfriar la muestra a temperatura ambiente
Medir absorbancia a 562 nm.
Notas:
Los reactivos A y B son estables indefinidamente a temperatura ambiente y protegidos de la
luz.
La sensibilidad del ensayo puede ser incrementada por la incubación de las muestras más
tiempo. Alternativamente, si el color se torna más oscuro, calentar las muestras puede ayudar a
detener esta reacción. Tener cuidado de hacerlo igual para todas las muestras.
Seguido al paso de calentamiento, el desarrollo de color es estable por al menos una hora.
Nótese que como en el ensayo de Lowry, la respuesta del ensayo BCA es dependiente de la
composición de aminoácidos en la proteína y además una concentración absoluta de proteína
no puede ser determinada. La curva estándar BCA puede ser usada solo para comparar
concentraciones de proteína similares en las soluciones.
Algunos reactivos interfieren con el ensayo BCA, pero mucho menos que como en Lowry. La
presencia de lípidos da absorbancias muy altas por lo que se recomienda adicionar
dodecilsulfato de sodio al 2% (SDS) en las muestras.
Cuantificación de carbohidratos por el método fenol-sulfúrico
Este procedimiento se basa en la técnica descrita para la determinación espectrofotométrica de
carbohidratos, mono y polisacáridos (Dubois M, 1956) además del procedimiento descrito por
(Arredondo, 2007) para el análisis de carbohidratos de microalgas.
103
Los métodos clásicos en análisis cuantitativo de carbohidratos están basados en la formación
de productos coloreados al tratar los analitos con ácidos inorgánicos fuertes y la condensación
del producto final furfural con agentes cromogénicos fuertes (usualmente fenol o una amina
aromática).
Diversos procedimientos incluyen la reacción del ácido sulfúrico con fenol, orcinol, cisteína y
antrona. El método de Dubois et al. 1956, fue originalmente descrito como una técnica no
específica para carbohidratos, pero posteriormente fue comparado con el método de la antrona
y con el N-etilcarbazol y se encontró que era el más adecuado para el análisis de
carbohidratos. El método colorimétrico de fenol-ácido sulfúrico (Dubois) involucra el tratamiento
de la solución que contiene los carbohidratos (5- 100 mg/mL) con una solución acuosa de fenol
(5% m/v) y el ácido sulfúrico concentrado: un producto característico de color amarillo es
producido, con una absorción máxima para las hexosas en 490 nm y 480 nm para las
pentosas, deoxi azucares y ácido urónico. Este método es sensible a una amplia variedad de
carbohidratos, incluyendo azúcares, azúcares metilados y polisacáridos acídicos y neutros; es
poco sensible a la interferencia con proteínas y el color producido es muy estable. Su único
inconveniente es la interferencia de las pentosas de los ácidos nucleícos, pero por su gran
simplicidad es el de uso más extendido en las investigaciones con especies microalgales
(Churms, 2005).
El fenol es un alcohol altamente reactivo que reacciona con los azúcares reductores.
Este proceso requiere una gran cantidad de energía, proporcionada por la reacción entre el
ácido sulfúrico y el agua.
El producto resultante es un compuesto amarillo-marrón, con pico de absorción a 485 nm,
longitud a la cual la relación entre la concentración y la intensidad del color es lineal ver
Ilustración 54
104
Ilustración 54. Reaccion de carbohidratos con la solucion de fenol-sulfurico-agua.
Materiales y reactivos empleados:
Vortex
Plancha de calentamiento
Balanza analitica
Agitador orbital
Centrífuga
Horno
Cabina de extracción
Pipeta graduada 1 mL
Pipeta graduada 5 mL
Tubo de vidrio tapa rosca 20 mL
Pipeta pasteur
Tubo de vidrio para centrifuga 20 mL
Espectrofómetro perkinElmer Lambda XLS
Ácido Sulfúrico
Fenol
Agua tipo1 ASTM
HCl
Procedimiento:
Etapa de lisis:
El material debe ser lavado con jabón libre de fosfatos y HCl al 10% v/v (lavar con
abundante agua destilada)
Pesar en un tubo de vidrio tapa rosca 5 mg de muestra de biomasa de microalgas.
Rotular cada uno de los tubos y sus réplicas con la identificación asignada a la muestra
Adicionar con una pipeta graduada de 5 mL, 5 mL de una solución de ácido sulfúrico 1M
(realizar en la cabina de extracción)
Agitar el tubo en vortex durante 1 min
Introducir el tubo en el baño ultrasonido a la máxima potencia durante un ciclo de 20
min (emplear la respectiva protección auditiva).
Retirar el tubo del baño ultrasonido y secarlo
Agitar el tubo en vortex durante 1 min
Cubrir el tubo con papel aluminio
Calentar en un baño termostato durante 60 min a 100ºC (realizar en cabina de
extracción)
Dejar reposar a temperatura ambiente (realizar en cabina de extracción)
Agitar los tubos en vortex durante 1 min
Etapa de extracción:
Centrifugar durante 20 min a 4000 rpm a 4°C en tubos de vidrio para centrifuga de 20
mL.
Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur teniendo la precaución de no redisolver
los restos celulares sedimentados (realizar en cabina de extracción)
105
Medir el volumen de extracto ácido retirado del tubo de centrífuga
Etapa de cuantificación:
Adicionar 1 mL de extracto ácido en un tubo de vidrio tapa rosca con una pipeta de 1
mL (realizar en cabina de extracción).
Adicionar 1 mL de fenol, mezclar en vortex durante 1 min
Dejar reposar la mezcla durante 40 min (realizar en cabina de extracción)
Adicionar 5 mL de ácido sulfúrico concentrado (realizar en cabina de extracción). Esta
reacción es muy fuerte, deben tomarse todas las precauciones del caso.
Agitar en vortex el tubo por 1 min (realizar en cabina de extracción)
Dejar reposar a temperatura ambiente (realizar en cabina de extracción).
Leer en el espectrofotómetro a 485 nm
La lectura del blanco se realiza remplazando el extracto ácido por 1 mL de ácido
sulfúrico 1M
En caso de ser necesario diluir debe tenerse en cuenta este dato en los cálculos finales
Determinar el valor del porcentaje de carbohidratos a través de la siguiente expresión:
% Carbohidratos = {[(m.A485nm)/Vm].Ve}/Ps.100 Ecuación 46.
Dónde:
Ps= Peso de la biomasa (aprox. 5 mg)
Ve= Volumen del extracto ácido
Vm= Volumen de la muestra (1 ml o menos si es necesario diluir)
m= pendiente de la curva de calibración (anexo 1)
A485nm= Absorbancia registrada por la muestra a 485 nm
Cuantificación de clorofila
Esta metodología detalla el procedimiento de análisis en laboratorio para la cuantificación por
espectrofotometría de la Clorofila a, b y c (método tricromático).
Materiales y reactivos empleados:
Filtros de fibra de vidrio Whatman (GF/F 0.7 µm de diámetro).
Tubos de Centrífuga
Papel aluminio
Acetona 90%
Refrigerador
Macerador de vidrio
Equipo de Ultrasonido
Centrífuga refrigerada
Pipetas de 5, 10 ml
Espectrofotómetro perkinElmer Lambda XLS
106
Para la preparación de acetona al 90% realice la siguiente operación:
C1*V1=C2*V2 Ecuación 47.
Donde,
C1= Concentración de la Acetona pura (grado analítico)
C2= Concentración requerida (90%)
V1= Volumen requerido de la acetona analítica
V2= Volumen a ser preparado
Procedimiento:
Tomar una muestra del cultivo y filtrarla
Los filtros debidamente doblados se colocan dentro de tubos de centrifuga previamente
forrados en papel aluminio, con el fin de evitar la degradación de la clorofila por la
exposición directa a la luz
Agregar 5 ml de acetona al 90% al tubo de ensayo y colóquelo en un equipo ultrasonido
al máximo nivel de intensidad por 1 minuto.
Ajustar el volumen a 10 ml y refrigérelos inmediatamente a 4 ºC por 24 horas.
Centrifugue por 15 min a 4000 rpm.
Proceder a la lectura de las absorbancias a las longitudes de onda de 750, 664, 667 y
630 nm.
Medir cuidadosamente con una pipeta el volumen que queda en el tubo de centrífuga,
sumarlo al volumen usado en la celda de cuarzo y anotarlo como volumen total del
extracto.
Cálculo de los resultados:
Los cálculos para encontrar la cantidad de clorofila-a en mg/m3 se realizan aplicando las
ecuaciones de Jeffrey & Humphrey (1975), que se describen a continuación.
(Ca) Clorofila-a = 11.85*(E664) - 1.54*(E647) - 0.08*(E630). Ecuación 48
(Cb) Clorofila-b = 21.03*(E647) - 5.43*(E664) – 2.66*(E630). Ecuación 49
(Cc) Clorofila-c = 24.52*(E630) - 7.60*(E647) – 1.67*(E664). Ecuación 50
Dónde:
E: Es la absorbancia obtenida a las diferentes longitudes de onda. A cada longitud de onda se
le debe restar la lectura control (750 nm) hace antes de aplicar la ecuación, (664nm-750nm;
647nm-750nm y 630nm-750nm).
Finalmente, después de aplicar las ecuaciones anteriores, la concentración de clorofila a, b o c,
en la muestra, se cuantifica de la siguiente manera:
107
Ecuación 51.
Donde;
Ca es la concentración de Clorofila a ó b ó c
Cuantificación de CO2:
El CO2 de la fase gaseosa se mide con el equipo Extech CO2 datalogger.
Este equipo mide en un rango entre 1-10.000 ppm de CO2 de la fase gaseosa del sistema, con
un record de muestreo de hasta 5000 datos.
Cuantificación de la biomasa seca:
El cálculo de la biomasa seca de un cultivo de microalgas se realiza usando como herramienta
analítica fundamental las curvas de calibración por peso seco de microalgas realizadas
anteriormente. Se debe tener claro que para usar una curva de calibración para calcular la
biomasa seca de un cultivo de microalgas, este debe cumplir las mismas condiciones de
crecimiento del inóculo usado en la realización de la curva de peso seco.
Este procedimiento está basado en el manual de métodos y herramientas analíticas en la
evaluación de la biomasa microalgal (Voltolina, 2007). En este se describe el procedimiento
para realizar el cálculo de la biomasa seca basados en el uso de una curva de calibración por
peso seco para microalgas, además de explicar la importancia de esta herramienta analítica
para realizar un seguimiento a los procesos de cultivo de microalgas.
El crecimiento microbiano se puede determinar de diferentes formas entre las que se incluye el
recuento celular en cámara o en placa, la densidad óptica, la estimación de biomasa en peso
seco y en el caso específico de las microalgas la cuantificación de la clorofila (Becker, 1994).
Estas técnicas indican crecimiento celular y desarrollo de un cultivo pero si hablamos en
términos de productividad la técnica de estimación de la biomasa por peso seco es la que
brinda datos más reales, ya que por ejemplo el recuento celular en cámara es una técnica
usada para indicar concentración celular pero no indica cantidad celular en masa que es el dato
que al final se usa para evaluar la productividad y redimiendo de un proceso o un cultivo. El
recuento en cámara tiene la ventaja que permite evaluar las condiciones en las que se
encuentra el cultivo (contaminación, inhibición etc.) pero tiene la desventaja de no poder ser
reproducible ya que los errores adicionados en cada conteo se suman, el muestreo, la dilución,
el llenado de la cámara y el rango de concentración celular. La cuantificación por absorbancia
directa del cultivo tiene la ventaja de ser una técnica rápida, pero la desventaja de ser
imprecisa ya que la absorbancia está basada en la clorofila y todos los cultivos no tienen la
108
misma concentración siempre, un cultivo con menos luz es un cultivo con alta concentración de
clorofila pero la misma concentración celular por tanto tampoco es reproducible. Determinar la
cantidad de biomasa en peso seco de un cultivo es una técnica que permite al evaluador
establecer que bajo determinadas condiciones nutricionales y ambientales (componentes de
medio de cultivo, luz, agitación, aireación, temperatura, pH etc.) el microorganismo se
desarrolla de una forma específica y que esta representa en términos de peso equis cantidad
de biomasa, dándole una herramienta importante en la evaluación de condiciones o variables
en el proceso de optimización de un cultivo.
La evaluación de biomasa en peso establece como resultado la cantidad en gramos que tiene
un cultivo celular de determinada edad y con determinadas condiciones y por esto es necesario
realizar la calibración de la curva cada vez que las condiciones anteriormente mencionadas
cambien de manera incidente sobre el crecimiento del microorganismo.
Materiales y reactivos empleados:
Espectrofotómetro y celdas.
Solución salina al 0.85%
Viales muestreadores.
Papel absorbente
Procedimiento:
Teniendo en cuenta lo aclarado en el alcance, que el cultivo debe cumplir con las mismas
condiciones de cultivo y obviamente ser la misma cepa de microalga, el cálculo de la biomasa
seca es una medición simple y muy fácil de realizar.
Lo primero que se debe hacer es homogenizar muy bien el cultivo a evaluar. Seguidamente
procedemos a tomar la muestra de cultivo en un vial muestreador (5mL aproximadamente). Si
se sospecha o se conoce de sustancias o partículas suspendidas que interfieran con la
medición se procede a lavar la muestra con solución salina. La muestra se procede a leer en el
espectrofotómetro a 675nm.
Este dato obtenido de absorbancia va a ser remplazado posteriormente en la formula obtenida
en la curva de calibración por peso seco.
Cuantificación del crecimiento por recuento en cámara de Neubauer
El crecimiento de un cultivo de microalgas se expresa como el incremento de biomasa ya sea
en forma de número de células (cel/mL), o en peso seco, cantidad de proteína, de pigmentos
109
etc. Este incremento puede ser estimado por diferentes métodos, entre los cuales los más
utilizados en los laboratorios son el recuento celular a través de microscopio o mediante
contadores de partículas (aunque estos son generalmente costosos), determinación del cambio
de densidad óptica del cultivo o por cuantificación de biomasa seca. De estos, el recuento
celular es el más utilizado por ser un método sencillo y poco costoso, el cual permite además
un mejor seguimiento del cultivo mediante su inspección visual. La correspondencia entre la
concentración celular y la información proporcionada por otros métodos no es constante, ya
que éstos dependen del estado fisiológico de las células, de la fase de crecimiento y de las
condiciones ambientales a las cuales está sometido el cultivo (Voltolina, 2007).
Para obtener resultados confiables se recomienda aplicar algunos métodos simultáneamente
incluyendo observaciones microscópicas cualitativas para evitar errores debido a la
contaminación de los cultivos.
Materiales y reactivos empleados:
Cámara de Neubauer
Micropipeta de 10-10 microlitros
Microscopio
Puntas para micropipeta
Procedimiento:
A continuación se describen las actividades para recuento de microalgas en cámara de
Neubauer.
Una de las dificultades para el recuento al microscopio es obtener una buena reproducibilidad,
por lo cual es importante seleccionar un adecuado tamaño de muestra, dilución, tipo de cámara
de recuento, objetivo del microscopio y técnica de llenado de la cámara.
Para microalgas de mayores dimensiones como muchos dinoflagelados, los tipos de cámara
que se usan comúnmente son la Sedwick-Rafter con regilla de Fuchs-Rosenthal.
En este procedimiento se establecen las condiciones para en cámara de Neubauer la cual tiene
0.1 mm de profundidad, consta de 9 cuadros con lados de 1 mm (área total de recuento 0.9
mm2), cada uno de los cuales corresponde a un volumen de 0.1 microlitro. Los cuatro extremos
están subdivididos en 16 cuadros pequeños. El cuadro central contiene 25 cuadros, cada uno
con un área de 0.04 mm2, a su vez divididos en 16 cuadros más pequeños ver Ilustración 55.
Para células más grandes de 6 micras, y con cultivos relativamente poco concentrados, se
aconseja que el recuento se haga en los cuatro cuadros marcados como L.
110
Ilustración 55. Esquema de la cámara de Neubauer.
Cuando las células son pequeñas y la concentración del cultivo es alta, es preferible usar 5
cuadros menores del cuadro central marcado como X.
Agitar el cultivo para permitir homogeneidad de la muestra.
Tomar una muestra de 1 mL y colocarla en un tubo previamente lavado y seco.
Si la muestra está muy concentrada realizar diluciones en serie hasta alcanzar una
adecuada concentración para contar en la cámara
Agitar la alícuota y tomar 10 micro litros de muestra
Montar en la cámara de Neubauer en una celda
Realizar el mismo procedimiento para la otra celda de la cámara.
Montar al microscopio y contar en 10x.
Realizar el recuento y anotar los datos en la bitácora.
Cálculos:
Si se contaron todas las células presentes en los 4 cuadros de 1 mm2 marcados como L, la
concentración celular se calcula de acuerdo a la siguiente fórmula:
C:N*104*dil. Ecuación 52
Dónde:
C= células/mL
N= Promedio de células presentes en los cuatro cuadros (1mm2)
dil = Factor de dilución. (Cuando se consideró necesario).
104= Factor de conversión de 0,1 GL a 1 mL
111
Si la células se cuentan en el cuadro central (25 cuadros) considerando solo los 5 cuadros
menores del cuadro marcado con X, la fórmula para calcular la concentración celular es la
siguiente:
C: {(N/ (4*10-6))}*dil Ecuación 53
Donde:
C: cel. /mL
N: promedio de células presentes en los 5 cuadros del cuadro central.
dil = Factor de dilución. (Cuando se consideró necesario).
Cuantificación de CO2:
Fase gaseosa:
El CO2 en la fase gaseosa es determinado mediante el equipo Extech detector air quality CO2
datalogger (CO210) de la compañía Flir. Este instrumento tiene un rango de medición de 1-
10000 ppm de CO2 en la fase gaseosa y una memoria de muestreo de 5000 datos. El principio
de monitoreo depende de la técnica de absorción en el infrarojo cercano no dispersivo.
Fase líquida:
Teniendo en cuenta que el CO2 en la fase gaseosa se disuelve originando diversas especies
que están en función del pH, la concentración de CO2 disuelto en la fase líquido es
determinando utilizando los datos de la fase gaseosa y aplicando la ley de Henry como se
muestra a continuación:
CO2 + H2O CO2ac +H2O Ecuación 54
CO2ac +H2O H2CO3 Ecuación 55
H2CO3 H+ + HCO3- Ecuación 56
HCO3- H+ + CO3
-2 Ecuación 57
Según la ley de Henry:
Xa= Pa / H Ecuación 58
Dónde:
Xa: fracción molar del compuesto a
Pa: presión parcial del compuesto a
H: constante de Henrry
112
Así, se puede calcular la concentración de CO2 disuelto en el agua de la siguiente forma:
[CO2ac]=Xa * H Ecuación 59
1 1 − − Ecuación 60
Dónde:
Ka1: constante ácida para el H2CO2
Ka2: constante ácida para el HCO3 -
8.2. Abreviaciones de compuestos
Abreviación Compuesto
13DPG 1,3-difosfoglicerato FADH2 Flavin adenin dinucleotido reducido
2-oxobutan 2-oxobutanoato FORM Ácido Formico
2PG 2-fosfoglicerato FUM Fumarato
3PG 3-fosfoglicreato G1P Glucosa 1-fosfato
5FTHF 5-Formil-THF G6P Glucosa 6-fosfato
6PG 6-fosfogluconato GAP Gliceraldehido 3-fosfate
AcACP Acetil-ACP GDP Guanosina difosfato
AcCOA Acetil-CoA GLN Glutamino
Ace Acetato GLU Glutamato
ACP Acetil-transportador GLY Glicina
Ad Adenosina GLYC Glicerol
AdHCYS S-Adenosil-L-homocisteina GLYC3P Glicerol 3-phosphate
AdMET S-Adenosil-L-metionina Glycerate Glicerato
ADP Adenosina difosfato GLYC_ex Glicerol (extracelular)
AICAR 5-Aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleina glyoxylate Glioxilato
AKG 2-Oxoglutarato (alfa-ketoglutarato) GMP Guanosina monofosfato
ALA Alanina GTP Guanosina trifosfato
AMP Adenosina monofosfato H[+] Protón
ANTH Antranilato H[+]_ex Proton (extracelular)
APS Adenilil sulfato H2O agua
ARG Arginina H2O2 Hidrógeno peróxido
ASA L-Aspártico semialdehido H2O_ex agua (extracelular)
ASN Asparagina H2S Sulfuro de hidrógeno
ASP Aspartato HCYS Homocisteina
ATP Adenosina trifosfato HIS Histidina
Biomass Biomasa HSER Homoserina
113
Biomass_ex Biomasa (g) HydPro Hidroxiprolina
C12:0ACP Dodecanoil-ACP (ácido Laurico) HydPyr 3-Hidroxipiruvato
C14:0ACP Tetradecanoil-ACP (ácido Miristico) ILE Isoleucina
C16:0ACP Hexadecanoil-ACP (ácido Palmitico) IMP Inosina monofosfato
C16:1ACP Trans-Hexadeca-2-enoil-ACP (ácido
Palmitoleico)
LEU Leucina
C16:2ACP Ácido Hexadecadienoico Light Fotones
C16:3ACP Ácido Hexadecatrienoico Light_ex Fotones (extracelular)
C18:0ACP Octadecanoil-ACP (ácido estearico) LYS Lisina
C18:1ACP Cis-11-ocadecanoate-ACP (ácido Oleico) MAL Malato
C18:2ACP Ácido Linoleico MalCoA Malonil-CoA
C18:3ACP Acido Alfa-linoleico MET Metionina
CaP Carbamoil fosfato METHF 5,10-Methileo-THF
CARB Carbohidrato Mg2[+] Magnesio
CDP Citidin difosfate Mg2[+]_ex Magnesio (extracelular)
Chlorophyll Clorofila MTHF Methil-THF
CHO Corismato MYLTHF 5,10-Methenil-THF
CIT Citrato N10FTHF 10-Formil-THF
CO2 Carbón dioxido NAD Nicotinamida oxidizado
CO2_ex Carbón dioxido (extracelular) NADH Nicotinamida reducido
CoA Coenzima A NADP Nicotinamidafosfato oxidizado
CTP Citidin trifosfato NADPH Nicotinamidafosfato reducido
CYS Cisteina NH4[+] Amonio
DAP Diaminopimelato NH4[+]_ex Amonio (extracelular)
dATP Deoxi ATP NO2 Nitrito
dCTP Deoxi CTP NO3 Nitrato
dGTP Deoxi GTP NO3_ex Nitrato (extracelular)
DHA Dihidroxiacetona (Glicerona) O2 Oxígeno
DHAP Dihidroxiacetona-P O2_ex Oxígeno (extracelular)
DHF Dihidrofolato OXA Oxaloacetato
DNA Ácido Deoxiribonucleico
dTTP Deoxi TTP PEP Fosfoenolpiruvato
E4P Eritrosa 4-phosphate PHE Fenilalanina
F16P Fructoae 1,6-bifosfato Phytyl-PP Fitil-difosfato
F6P Fructosa 6-fosfate Pi Ortofosfate
FAD Flavin adenina dinucleotido oxidizado Pi_ex Ortofofate (extracelular)
PPi Pirfosfato SO4_ex Sulfato (extracelular)
PPorphyrin Protoporfirina STARCH Almidón
PRE Prefanato STARCH_ex Almidón (extracelular)
PRO Prolina SUC Succinato
PROTEIN Proteina SUCCoA Succinil Coenzima A
PRPP Fosforibosilpirofosfato THF Tetrahidrofolato
114
PYR Piruvato THR Treonina
R5P Ribosa 5-fosfato TRYP Triptofano
RNA Ácido Ribonucleico TYR Tirosine
Ru15DP Ribulosa 1,5-bisfosfato UDP Uridin difosfato
RU5P Ribulosa 5-fosfato UMP Uridin monofosfato
S7P Sedoheptulosa 7-fosfate UTP Uridin trifosfato
SER Serina VAL Valina
SO3 Sulfito X5P Xilulosa 5-fosfato
SO4 Sulfato
115
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