INFORME TECNICO FINAL EFECTO DEL ESTRÉS SOBRE LA PERMEABILIDAD E INFLAMACION

INTESTINAL EN RATAS Registro asignado por la CGPI: 20050397 Responsable: Dr Rafael Campos Rodríguez. ESM

ANTECEDENTES

Al estres físico y psicológico se les ha relacionado estrechamente con el curso clínico

de algunos cuadros intestinales agudos y crónicos. Es bien sabido que el estres físico

en traumas, quemaduras o cirugía mayor, es capaz de causar úlceras por estres,

disfunción orgánica múltiple, traslocación bacteriana e impermeabilidad intestinal

incrementada. La disfunción intestinal también se ha asociado con la depresión, y el

síndrome de colon irritable (IBS). En los modelos animales se ha demostrado la

influencia del estres psicológico y físico, en el desarrollo y cronicidad de la colitis, en la

modificación de la motilidad intestinal y como causa de la disfunción de la barrera

intestinal; todos factores que facilitan la entrada de material potencialmente nocivo.

Aunque se reconoce el papel del estrés en lo cuadros señalados, todavía no se

esclarecen todos los mecanismos participantes (Kiliaan et al 1998, Saunders et al

1994). La barrera intestinal además de ser una barrera fisiológica es una barrera inmunológica,

ya que con frecuencia, microorganismos y sustancias extrañas son una carga

antigénica. Alteraciones de la regulación de la respuesta inmune ocasionan la

disfunción de la barrera, que a su vez conduce a los cuadros inflamatorios intestinales

ya mencionados. En condiciones fisiológicas el balance se mantiene al disminuir la

respuesta inmune en el intestino (Maffei et al 2004).

En la barrera epitelial se valora su permeabilidad a varios “marcadores prueba o

sondas”; dicha valoración emplea una gran variedad de sondas, incluidas las sondas

proteicas. Una proteína frecuentemente empleada como sonda, es la peroxidasa de

rábano (HRP, PM 45); otras técnicas, emplean azúcares, en tanto otras más incluyen

mediciones del flujo agua y de iones de las asas intestinales. Otro factor que no debe

despreciarse, es el estrés resultante del manejo y transporte de los animales, ya que

modifica la barrera intestinal. Se aconseja un periodo de 1 a 2 semanas de reposo

después que los animales han sido cambiados de su ambiente, y antes de iniciar

cualquier estudio relacionado con estrés.

En el proceso inflamatorio de varios orígenes (estrés psicológico, quirúrgico) se ha

involucrado la participación de las citocinas, al NO (oxido nítrico) producido por la

NOS2 (oxido nitrico sintasa inducible) y la COX-2 (ciclooxigenasa 2). El NO se produce

en diferentes partes del tubo digestivo, y se le asocia tanto a estados fisiológicos como

patológicos. En modelos animales y humanos se ha demostrado su participación en los

eventos inflamatorios y en el desarrollo del IBS (Ebert EC 1995, Linehab J et al 2005;;

Lundbert JON, et al 1994).

La NOS2 suele expresarse en áreas preferentemente inflamadas, con grandes

cantidades de NO, y su regulación depende de las citocinas (Kolios G et al 1995,

Whittle BJ, 1995). Algunas citocinas pro-inflamatorias son IL-1, IL-8 TNF-�, IFN-�, que

inducen la producción de NO por las células epiteliales de la mucosa o bien por las

células del sistema inmune (Hirabayashi N et al 2005). Se considera que en los

procesos crónicos, las citocinas causan sobre-expresión de NOS2 (Rao CV 2004;

Vallance BA et al, 2004)

Las citocinas tienen un papel central en la modulación inmune de la patogénesis y

evolución de la respuesta del huésped frente a la invasión de microorganismos,

traumas, quemaduras o agentes estresantes. Se han detectado alteraciones en el perfil

intestinal de las citocinas en pacientes humanos con cuadros inflamatorios como la

enfermedad de Cröhn o colitis ulcerativa, tanto a nivel de proteínas como de RNA

mensajero. Por tanto su detección y el análisis de su producción son críticos en la

comprensión de la respuesta del huésped a una variedad de insultos de diferente origen

y durante el estrés (Kassper et al 2001, Ullett et al 2000, Yamamoto et al 2000).

El modelo experimental mas ampliamente usado, para medir la función intestinal

durante el estrés agudo, consiste en inmovilizar a roedores de manera mecánica, pero

suave, durante 30 minutos a 4 horas, y durante varios días. En otros modelos los

animales son también inmovilizados y colocados en ambiente frío (8° C), o bien

2

inmovilizados y sumergidos en agua a 20° C de manera vertical hasta el apéndice

xifoides por periodos de 2 a 5 horas. Estos modelos involucran elementos de estrés

físico y psicológico y se ha demostrado que inducen cambios en la barrera intestinal.

Se considera que la metodología RT-PCR es suficientemente exacta y sensible para

analizar el patrón de la expresión génica temporal y específica, de citocinas y enzimas,

cuantificando los transcriptos de RNAm. Este método también se emplea porque la

cantidad de moléculas producidas es muy pequeña. Se aisla RNA total como molécula

inicial para conocer dicha expresión.

JUSTIFICACION

Se considera al estrés físico y psicológico como fuente del origen y evolución del curso

clínico en algunos cuadros agudos y crónicos intestinales en el paciente humano y en

modelos animales. Es un hecho también que el estrés a través de la liberación de CRF

(corticotropina) y GC (glucocorticoides), disminuyan la permeabilidad intestinal y su

acción protectora contra la entrada de antígenos potencialmente nocivos. El estrés

también induce cambios del perfil intestinal de las citocinas pro-inflamatorias, de NOS2

y COX-2, que participan en la patogénesis y evolución de la respuesta del huésped.

El presente estudio pretende demostrar en el intestino delgado en un modelo animal,

que el estrés al disminuir la función protectora de la mucosa intestinal, incremente su

permeabilidad, permita la entrada de antígenos proteicos y la consecuente modificación

en la producción de anticuerpos específicos locales (en bilis y liquido intestinal) y

generales (en suero). Se intenta también demostrar cambios en el patrón de la

expresión de algunas citocinas, de NOS2 y COX-2,

OBJETIVOS

I Cuantificar anticuerpos en líquido, suero y bilis de ratas inmunizadas por via oral

y sistémica.

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II Determinar de paso de moléculas de diferente peso molecular por la mucosa

intestinal.

III Determinar inflamación cuantificando neutrófilos y monocitos/macrófagos en

mucosa intestinal.

IV Determinar la expresión de NO2 y COX2 en mucosa intestinal.

V Determinar la expresión de genes para mieloperoxidasa, IL-1, TNF� e ICAM-1,

en mucosa intestinal.

MATERIAL Y METODOS

Animales. Se utilizaron ratas Wistar machos de 200-250g de peso, desparasitadas y

con alimentación ad limitum. Los animales se someten a estrés por inmovilización de

una a tres horas durante tres días, y posteriormente se les sacrifica para conocer los

cambios arriba mencionados, en la primera sección del duodeno.

Ciclos de estrés e inoculación del antígeno. Ratas seleccionadas al azar, después de un periodo de recuperación de 15 días, se

someten a estrés por inmovilización, introduciéndose en recipientes estrechos de

acrílico. La inmovilización dura de una a tres horas, por tres días consecutivos. Al

grupo de ratas LNI (diabetes insípida) se les aplicó ciclo de estrés de una hora durante

el mismo número de días.

Al final de cada sesión de estrés, se aplica una mezcla de antígenos (ovoalbúmina,

albúmina bovina, caseína, peroxidasa de rábano, lectina de soya) a concentración de

10 mg/ml en un volumen total de 1 ml de solución salina. Previo a la aplicación se

administró solución de bicarbonato. Se utilizan diferentes mezclas de antígenos en los

diferentes grupos.

Grupo 1 Ratas sanas Control positivo solo estrés Control negativo solo administración de antígenos Grupo problema estrés y administración de antígenos Antígenos lecitina de soya yHRP Grupo 2 Ratas sanas Control positivo solo estrés

4

Control negativo solo administración de antígenos Grupo problema estrés y administración de antígenos Antígenos ovoalbumina, albumina bovina y caseína Grupo 3 Ratas sham Control positivo solo estrés Control negativo solo administración de antígenos Grupo problema estrés y administración de antígenos Antígenos ovoalbumina y caseína Grupo 4 Ratas sham Control positivo solo estrés Control negativo solo administración de antígenos Grupo problema estrés y administración de antígenos Antígenos lecitina de soya, HRP, ovoalbumina, albumina, bovina y caseína Grupo 5 Ratas con diabetes insípida (LN 1) Control positivo solo estrés Control negativo solo administración de antígenos

Grupo problema estrés y administración de antígenos. Inmovilización durante una hora,

cuatro días consecutivos Antígenos lectina de soya, HRP, ovoalbumina, albumina, bovina y caseína Grupo 6 Ratas con diabetes insípida (LN 2) Control positivo solo estrés Control negativo solo administración de antígenos

Grupo problema estrés y administración de antígenos. Inmovilización durante tres horas,

cuatro días consecutivos Antígenos lecitina de soya, HRP, ovoalbumina, albumina, bovina y caseína Grupo 7 Ratas hipofisectomizadas Control positivo solo estrés Control negativo solo administración de antígenos

Grupo problema estrés y administración de antígenos. Antígenos lecitina de soya, HRP, ovoalbumina, albumina, bovina y caseína. Obtención del material biológico.

5

Intestino. Después del tercer día de tratamiento los animales se sacrifican por

anestesia con éter; se extrae el intestino delgado completo, del que se toman muestras

del segmento proximal de alrededor 5 cm de longitud. Una muestra de cada porción se

congela a –70°C; las muestras se almacenan para posteriormente exameninarlas. Otras

muestras se fijan por inmersión en formaldehído al 4% para posteriormente incluirlas

en parafina.

Liquido intestinal. Una vez tomadas las muestras de intestino, se realizan lavados con

5 ml de solución salina al 0.9% para obtener líquido intestinal; el liquido del lavado se

centrífuga y colecta el sobrenadante, que se almacena en congelación para

cuantificación de IgA mediante ELISA.

Obtención de bilis. A los tres días y bajo anestesia con Hidrato de cloral al 35%, los

animales se someten a cirugía para obtener el líquido biliar. Después de localizar el

duodeno se colectan aproximadamente 2ml de bilis de cada rata.

Inmunohistoquimicas

Las tinciones inmunohistoquímicas para identificación de diferentes poblaciones

celulares, se hacen en los cortes de 10 micras de espesor y montados en laminillas

previamente tratadas con Poli-L-Lysina al 7 %, y fijadas en acetona durante 15 minutos.

Previa a la tinción, la actividad de la peroxidasa endógena se bloquea incubando los

cortes en una solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en PBS, durante 10 min.

Los tiempos de incubación con los anticuerpos primarios es de 1 a 2 horas, y para la

estreptavidina de 1 hora; ambos incubados a temperatura ambiente. Después de cada

incubación se realizan lavados suaves con PBS.

La reacción de peroxidasa se reveló según el método de Karnovsky con DAB. Las

muestras se contra colorean con hematoxilina de Harris, se deshidratan y cubren con

resina sintética.

Para detectar las moléculas marcadas con fluoresceína (dextrana-FITC), se utiliza como

anticuerpo primario, un anticuerpo de conejo anti FITC y como secundario el anticuerpo

de cabra anti IgG de conejo marcado con peroxidasa.

6

Una vez realizadas las tinciones de todos los grupos, en los cortes teñidos con H-E, se

mide el área total en μm2 de las placas de Peyer, en el que se emplea un micrómetro

de ocular. En los cortes con diferentes anticuerpos se cuentan las diferentes

poblaciones celulares en la lámina propia de 5 vellosidades elegidas al azar.

Posteriormente el número de células se ajusta a un área de 25 x 103 μm2.

Cuantificación de IgA en líquido intestinal e IgG en suero

La IgA se cuantifica por el método de ELISA. Las placas se cubren e incuban con 20

μg/ml de Igs de conejo anti-IgA de ratón por pozo, durante 18 h a 4 o C; después se

lavan tres veces con PBS-T (pH 7.2-0.05% tween 20). Posteriormente se bloquean con

PBS-leche descremada (Svelty) al 5%, durante 1h a 37 o C, y se lavan nuevamente con

PBS-T.

Para las muestras de líquido intestinal, ésas se diluyen 1:2 en PBS-T, e incuban

durante 2 h, a 37 oC; al término, las placas se lavan 5 veces con PBS-T y 5 veces con

PBS. Se incuban nuevamente durante 2 h a 37 o C con el conjugado de cabra anti IgA

de ratón (Serotec) diluido 1:2000 en PBS-T. Finalmente, las placas se lavan 3 veces

más con PBS-T y otras 3 veces con PBS. Después se adiciona el sustrato

(ortofenilendiamina). Luego de 15 minutos a temperatura ambiente, la reacción se

detiene con ácido sulfúrico al 2.5 M, y la absorbancia se determina a una longitud de

onda de 492 nm.

Para cuantificar IgG se utiliza suero de cabra marcado con peroxidasa específico para

cadenas gamma de rata.

RT-PCR

Se mencionó que la metodología RT-PCR es suficientemente exacta y sensible para

analizar el patrón de la expresión génica temporal y específica de las citocinas

cuantificando los transcriptos de RNAm. Se aisla RNA total para conocer dicha

expresión. La metodología comprende las siguientes etapas:

1. Extracción de RNA total 2. Transcripción de RNA a cDNA(RT) 3. Amplificación de cDNA (PCR) 4. PCR Semi-cuantitativa o cuantitativa

7

1. Extracción de RNA

El RNA total se aisló por el método de Chomczynski y Sacchi, bajo condiciones libres

de RNAasas y de acuerdo al protocolo para RT-PCR (Chomczynski, 1987, 1993).

Dentro de los lineamientos más importantes para el manejo de RNA, es indispensable

observar las siguientes reglas:

i se requiere usar guantes a lo largo de todo el proceso.

ii la inactivación de RNasas del material de vidrio, puede conseguirse bien

esterilizándolo o bien sometiéndolo a l50°C durante 4h. Los viales de plástico o puntas

deben esterilizarse y estar completamente secos previo a su uso. Todas las soluciones

deben preparase con H2O estéril previamente tratada con DEPC (dietilpirocarbonato).

iii las micropipetas empleadas deben ser de uso exclusivo para RNA.

iv el reactivo de Trizol deberá manejarse estrictamente dentro de una campana con

extracción.

v el aislamiento del RNA requiere inactivar la liberación inmediata de las RNasas de los

compartimientos celulares procedentes de las muestras, de manera que éstas deben

procesarse rápida y cuidadosamente. La inactivación se logra al congelar

inmediatamente las muestras en nitrógeno líquido o bien al homogenizar los tejidos con

la solución de lisis de Trizol. Esta es una solución monofásica de fenol que se emplea

en el método conocido como de un solo paso con ácido guanidin tiocianato-fenol-

cloroformo (AGPC). El reactivo de Trizol GIBCO BRL se usa de acuerdo al método

desarrollado por Chomczynski y Sacchi.

La extracción del RNA comprende los siguientes pasos: homogeneización,

precipitación, lavado y solubilización.

Homogeneización, se usa un homogenizador PGC para viales de 1.5ml; durante la

homogenización y lisis, el reactivo mantiene la integridad del RNA. De no emplearse el

volumen suficiente se corre el riesgo de contaminar el RNA con DNA. Se requiere l ml

de Trizol por cada 50 a 100 mg de tejido; la muestra no debe exceder el 10% del

volumen empleado. Una vez homogenizados los tejidos se les deja incubar durante 5

minutos a temperatura ambiente para completar la disociación de las nucleoproteínas.

8

Separación, al homogenizado se agregan 0.2 ml de Cloroformo por cada ml del

reactivo de Trizol empleado. Los viales se cierran y agitan fuertemente durante 30

segundos; se incuban durante 2 o 3 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se

centrifugan a 12 000 rpm durante 15 minutos a 4°C. La fase acuosa incolora contiene

el RNA y su volumen es alrededor del 60% del volumen inicial del reactivo empleado

para la homogenización. La fase acuosa se transfiere a un vial nuevo.

Precipitación, a la fase acuosa se agrega 0.5ml de Isopropanol (ISPP) por cada ml de

reactivo de lisis y se mantiene a -20°C durante toda la noche. Posteriormente las

muestras se centrifugan a 12 000 rpm durante 10 minutos a 4°C.

Lavado del RNA, el pellet de RNA se lava con 1 ml de etanol al 75%, por cada ml de

Trizol usado durante la homogenización. Centrifugar posteriormente a 7 500 rpm

durante 5 minutos a 4°C.

Solubilización del RNA, se emplean de 50 a 100�l de H2O tratada con DEPC. La

relación de la DO (A280/260) del RNA debe ser al menos 1.8, e indica el grado de pureza

del mismo. Las muestras se almacenan entre -20 y -80°C, lo que depende del plazo de

su uso. De preferencia se alícuota en muestras de volúmenes pequeños.

Detección del RNA

El método empleado para detectar RNAs, es separarlo de acuerdo a su tamaño por

electroforesis en gel de agarosa al 1%. El método puede emplear buffer

desnaturalizante con formaldehído, o bien TAE 1X. La electroforesis se corre entre 70 y

100 mV durante 90 minutos. Más tarde el gel se tiñe con bromuro de etidio 0.5 �g/ml

durante 90 minutos. Las bandas se visualizan por transiluminación UV a 254 �M, y son

analizados con software para análisis molecular (Lab Works UVP).

Eliminación de proteinglicanos y polisacáridos Estas modificaciones se hacen en la media del contenido de RNasas presentes, o de la

contaminación con algunos otros componentes celulares de los tejidos empleados.

Estos pueden ser DNA genómico, polisacáridos, proteinglicanos, o algún otro polianion

componente del mucus intestinal, con posible efecto inhibitorio de la retrotranscripción

(RT) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

9

Después de homogenizar el tejido, el RNA en la fase acuosa se precipita combinando el

50% del volumen del ISPP y el 50% de una solución fuertemente salina. Esta última

contiene 1.2M de NaCl y 0.8 M de citrato de sodio (no se requiere ajustar el pH).

Posteriormente la muestra se centrifuga a l0 000 rpm durante 15 minutos. Los

proteinglicanos permanecen en solución y en el pellet no visible se halla el RNA

(Chomczynski et al 1995, Groppe et al 1993, Schick et al 1995).

Eliminación de DNA genómico

En los métodos para aislar RNA consistentemente hay contaminación con pequeñas

cantidades de DNA genómico, que interfieren con las reacciones RT- PCR, y que puede

ser eliminado con el empleo de DNasas. Es importante recordar que las DNasa I se

obtienen a partir del páncreas de bovino, y debe estar libre de RNasas que pueden

degradar el RNA que se trata de purificar. Las RNasas también pueden provenir del mal

manejo de los reactivos. Por tanto es indispensable emplear DNasa I libre de RNasas.

Después del tratamiento se requiere eliminarla la DNAasa I por calentamiento o con

EDTA 25 mM.

Otra manera de eliminar el DNA involucra una precipitación extra seguida a la lisis de

las células con el Trizol. Después de homogenizar, el RNA se precipita por la adición de

1/3 del volumen de etanol al 95%, seguidamente la mezcla se incuba en hielo durante

cinco minutos. Después de centrifugar durante 15 minutos, el sobrenadante se separa,

y el pellet que contiene el RNA se redisuelve en ½ volumen de reactivo de Trizol. El

resto del procedimiento es el mismo (Chomczynski 1992, 1993, Nadin-Davis et al 1982,

Noonbeg et al 1995).

2. RT (transcripción reversa)

Esta primera reacción tiene por objeto la conversión enzimática de RNA a cDNA de

una cadena, que es el templado que se usará en la PCR. Un primer,

oligodesoxiribonucleótido se hibridiza al RNA en presencia de una DNA polimerasa

dependiente de RNA para crear una copia de DNA (cDNA), que luego será amplificada

por PCR. Dependiendo del propósito del ensayo, el primer para la síntesis de cDNA,

puede hibridizarse a cualquier sección del RNAm, o bien usar un primer particular que

10

se hibridiza a una sección específica del RNAm. A los controles negativos no se les

agrega la enzima (no RT). La reacción se corre en tubos Eppendorf de 200 �l

(Sambrook et al 2001).

En la tabla se muestran los reactivos señalando su volumen para de cada uno de ellos.

Todos los reactivos son para uso exclusivo de Biología Molecular Invitrogen.

Reactivos Volumen

RNA total 1-500 �g Oligo (dT) 12-18 1 �l d NTP 1 �l (mezcla de dATP, dGTP, dCTP y dTTP, 10 mM) H2O DEPC 12 �l Desnaturalizacion durante 10 minutos a 65°C, después colocar en hielo, mientras se agregan el resto de los reactivos Buffer 5x 4 �l DTT 2 �l *SS II (200 U) 1 �l Incubar durante 1 h a 42°C Inactivar por calentamiento durante 15 minutos a 70°C * SS II Super Script II Transcriptasa Inversa

3. PCR (reacción en cadena de la DNA polimerasa)

Una reacción típica de PCR incluye los reactivos y las condiciones en las cuales se

corre el ensayo. Los reactivos son: Taq DNA polimerasa, el cDNA que es el templado o

plantilla, los primers sense y anti-sense, iones Mg++, la mezcla de desoxiribinucleótidos,

el buffer de amplificación para PCR, y agua tratada con DPCE o agua para inyectables.

De acuerdo a los primers empleados la temperatura de hibridación varía entre 60 y

75°C; la reacción se corre un promedio de 25 ciclos. A continuación se muestra tabla de

los reactivos señalando volumen y concentración final de cada uno de ellos. La reacción

de PCR se corre por duplicado, en tubos Eppendorf de 200 �l (Sambrook et al 2001).

Todos los reactivos son para uso exclusivo de Biología Molecular Invitrogen.

Reactivo Volumen Conc final

Taq* DNA pol recombinante 0.2 �l 1 U c DNA 2.0 �l variable primer sense 4.0 �l 300 �� primer anti-sense 4.0 �l 300 ��

11

Mg++ 0.75 �l 1.5 mM d NTPs 0.75 �l 300 �� buffer 10X, amplificación 2.50 �l 1 X H2O DEPC 10.8 �l cbp Volumen total 25.0 �l * Taq DNA pol recombinante de Invitrogen

La ensayo de PCR debe incluir controles (positivo) que permitan detectar la

contaminación con DNA genómico que frecuentemente se halla al aislar RNA. La mejor

manera es agregar un tubo control “no RT” para cada muestra de RNA; esto es durante

la amplificación se usa una muestra de RNA que no se ha retrotranscrito en vez de

cDNA. Si el producto se amplifica, indica la presencia de DNA, que proviene de la

extracción de RNA. Es obligado agregar otro control (negativo) en donde el templado es

substituido por H2O para conocer si la contaminación proviene del resto de otros

reactivos. Lo anterior justificado por el hecho de que la enzima (Taq polimerasa) no

puede discriminar entre cDNA (proveniente de RT) o DNA genómico (Zhi-Wei et al,

1997).

Los parámetros del termociclador (Mastercycler Eppendorf 5331) empleados fueron:

95°C por 2 min., seguida por 25 ciclos con desnaturalización por 50s, hibridización del

primer y del templado 60°C por 50s, primera extensión 72° por 1 min. La extensión final

es a 72°C durante 10 min. Los productos de PCR se identifican por electroforesis en gel

de agarosa al 1%. La electroforesis se corre entre 70 y 100 mV durante 90 minutos;

más tarde el gel se tiñe con bromuro de etidio 0.5 �g/ml durante 90 minutos. Las

bandas se visualizan con transiluminación UV a 254 �M, y son analizados con software

para análisis molecular (Lab Works UVP). Se usa un marcador de DNA de 100 pb

(Gibco-BRL Life Technologies).

ANALISIS ESTADÍSTICO

Para la evaluación estadística de los resultados obtenidos se utiliza la prueba de

análisis de varianza (ANOVA).

12

RESULTADOS I. Cuantificación anticuerpos en líquido, suero y bilis de ratas inmunizadas por vías intraperitoneal y parenteral. No se observa diferencia significativa en los niveles de IgA, ni en bilis ni en líquido

intestinal, cuando los diferentes antígenos son administrados por via intraperitoneal. Los

niveles de IgA en suero son significativamente diferentes cuando el antígenos se

administra por vía parenteral. Lo que confirma que los antígenos son inmunogénicos.

(Figuras 1,2 y 3)

II. Determinación del paso de moléculas de diferente peso molecular por la mucosa intestinal Con el objetivo de establecer si el estrés aumenta el paso de moléculas a través de la

luz intestinal de la mucosa, se administran por via intragástrica Dextrana-FITC de pesos

moleculares de 4000, 40,000 y 400,000 daltones, a ratas estresadas y sin estrés. Una

hora después se toman muestras que se procesan para el estudio inmunohistoquímico

utilizando anticuerpos anti FITC. En ninguna de las muestras se detecta el paso de las

moléculas a través de la mucosa intestinal. Los resultados demuestran que en estas

condiciones, el estrés no incrementa la permeabilidad,.

13

Figura 1. Niveles de anticuerpos IgA bilis de ratas inoculadas con mezcla de antígenos por vía sistémica.

Figura 2. Niveles de anticuerpos IgA en bilis de ratas inoculadas con mezcla de antígenos por vía sistémica.

Figura 3. Niveles de anticuerpos IgA en líquido intestinal de ratas inoculadas con mezcla de de antígenos por vía sistémica

10

III. Determinación el grado de inflamación por cuantificación de neutrófilos y monocitos/macrofagos en mucosa intestinal Para determinar el grado de inflamación se cuantifica el número de neutrófilos y

monocitos/macrófagos presentes en la mucosa intestinal de ratas, sin y con estrés de 1

y 3 horas. El estrés durante una hora, no causa inflamación ya que el número de

neutrófilos es el mismo para ambos grupos de ratas. Sin embargo, el estrés durante 3

horas si causa reducción significativa en el número de monocitos, quizá por disminución

en su migración. (Figura 4).

11

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100No estresEstres 1hEstres 3 h

No

célu

las

/ 104 μ

2

Neutrofilos Monocitos

*

Figura 4. Número de neutrófilos y macrófagos en mucosa intestinal de rata. Los neutrófilos y monocitos se identifican mediante tinción con anticuerpos específicos: anti-CD15 (neutrófilos), anti F4/80 (monocitos). Cada barra representa la media +/- la desviación estándar, n=5 (* P< 0.05)

IV. Determinación de la expresión de sintasa de NOS2 y COX-2 en mucosa intestinal Empleando el método de RT-PCR se cuantifica el proceso inflamatorio de la mucosa

intestinal, a través de la expresión relativa de los genes para NO2 y COX-2 (Figuras 5 y

6). No hubo diferencias significativas en la expresión relativa de COX-2 y NOS-2. Lo

que indica que el estrés, bajo las condiciones citadas, no afecta la expresión de esos

genes.

12

Figura 5. Expresión de NOS2 y COX-2 en mucosa intestinal de ratas.

0

2

4

6

8

10

0

2

4

6

8

10No estresEstres 1hEstres 3 h

Exp

resi

ón re

lativ

a

COX-2 NOS-2

Figura 6. Expresión relativa de NOS2 y COX-2 en mucosa intestinal de ratas.

V. Determinación mediante RT-PCR de la expresión de genes para

mieloperoxidasa, IL-1, TNF-α e ICAM-1

Para confirmar que el estrés de corta duración no causa inflamación de la mucosa

intestinal de ratas, se cuantifica la expresión relativa de los genes de mieloperoxidasa

que se encuentra en neutrófilos, así como de genes de citocinas pro-inflamatorias como

IL-1 y TNF� y de molécula de adhesión ICAM-1, que suelen incrementarse durante los

procesos inflamatorios. Como se observa en la figura 7, no hay incremento en la

expresión de ninguno de esos genes en ratas estresadas durante 1 o 3 horas.

13

0

5

10

15

20

25

30

0

5

10

15

20

25

30

No estresEstres 1 hEstres 3 h

Expr

esió

n re

lativ

a

MPO IL-1 TNF-a ICAM-1

Figura 7. Expresión relativa de MPO, citocinas pro-inflamatorias e ICAM-1.

CONCLUSIONES

El aspecto más relevante del proyecto es que se demuestra que el estrés por

inmovilización, con las condiciones establecidas, no incrementa la entrada de antígenos

de la luz intestinal a la lámina propia y consecuentemente no se induce la producción de

anticuerpos contra esos antígenos.

En animales estresados y sin estrés, inoculados por vía intragástrica con Dextrana-

FITC de diferentes pesos moleculares, muestran que el estrés no incrementa la

permeabilidad de las moléculas en las condiciones citadas.

14

La producción de anticuerpos en las ratas estresadas y no estresadas, se comporta de

forma similar, lo que indica que las ratas no responden a los antígenos, o que los

antígenos no son inmunogénicos por vía oral.

La concentración de anticuerpos anti-albúmina y anti-ovoalbúmina, en el grupo sham y

de ratas normales bajo estrés e inmunizadas, es menor al compararlo con el grupo no

inmunizado; esto indica que la respuesta basal disminuye en el estrés, probablemente

debido a la liberación de glucocorticoides.

En las ratas que carecen de hipófisis y por lo tanto de la influencia de glucocorticoides

no hubo disminución de la producción basal de anticuerpos, confirmándose que los

glucocorticoides interfieren con la producción de anticuerpos.

La cuantificación del número de neutrófilos y monocitos/macrófagos en mucosa

intestinal, no causa inflamación en animales estresados y sin estresar. Sin embargo el

estrés de 3 horas causa reducción significativa en el número de monocitos, tal vez por

disminución en su migración.

El estrés tampoco causó cambios significativos en la expresión de los genes NOS2,

COX-2, ni en la expresión de las citocinas pro-inflamatorias IL-1, ��F�, así como la

molécula ICAM-1.

Probablemente la falta de respuesta sea debida al tiempo al que los animales fueron

sometidos a estrés; quizá dicho tiempo deba ser incrementado.

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