Pontificia Universidad JaverianaFacultad de CienciasMicrobiología IndustrialInmunoquímica

INFORMEFraccionamiento de proteínas séricas y purificación de anticuerpos IgG

Resumen

Introducción

Para la purificación de proteínas existen diversas técnicas entre las cuales se encuentra la cromatografía, la cual permite separar moléculas en función a distintas características como peso molecular, afinidad, carga, etc. Este método se basa en la circulación de una fase móvil que arrastre los componentes de una muestra a través de una fase estacionaria. Dependiendo de la característica escogida para la separación, la composición de ambas fases cambiara, dándole a la técnica una especificidad diferente (Gutiérrez, Burdó & Cegarra, 2009)

La cromatografía de exclusión, también llamada filtración por gel, permite separar las moléculas de una muestra acorde con su tamaño molecular. Esta separación se da gracias a la fase estacionada utilizada en la columna cromatografía, la cual consiste en una matriz porosa que afectara las velocidades de migración de las moléculas dependiendo de su peso. Las moléculas de tamaño menor a los poros de la matriz de difundirán dentro de estos, siendo retenidos en la columna, aumentando el tiempo que tardaran dichas moléculas en salir de la misma. Entre mas pequeñas sean las moléculas, mas probabilidad tendrá en difundirse dentro y fuera de los poros, siendo mayor su grado de retención. Por otra parte, las moléculas de mayor tamaño se difundirán en menor proporción en los poros, y por tanto, serán mas fácilmente arrastrados por la fase móvil. Así, las moléculas de mayor tamaño migraran a mayor velocidad, siendo recuperados en las primeras fracciones mientras las moléculas mas pequeñas tendrán una menor velocidad de migración, saliendo tiempo después. De esta forma, se obtienen fracciones con moléculas de distintos tamaños, separándose del resto. (Amersham, n.d)

Al no generarse una interacción de unión a la fase estacionaria como si ocurre en las cromatografías de afinidad o intercambio iónico, este tipo de cromatografía ofrece diferentes ventajas como no se requiere asegurar condiciones ambientales especiales ni necesita el uso de varios buffers específicos, pues estos factores no influirán en la retención de las moléculas en la matriz porosa. Así, se puede obtener las proteínas (fracciones) en el buffer deseado. También es útil separar proteínas sensibles al pH (sus características cambian drásticamente por ligeras variaciones del pH) (Amersham, n.d).

La purificación de proteínas es un método mediante el cual se puede aislar dentro de la muestra evaluada  una proteína en específico. En este caso se trabajó con una muestra de suero humano y purificándolo, se lograron obtener las cadenas pesadas y livianas de los anticuerpos IgG que como se sabe es el más abundante en el suero y tiene un peso aproximado de 150kDa, siendo la más pequeña de todas las inmunoglobulinas.

Metodología

Resultados

Para poder observar los resultados obtenidos de las dos técnicas aplicadas a la muestra de suero humano, se realizo una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, mas conocida como SDS-PAGE (detergente aniónico dodecilsulfato sódico - polyacrylamide gel electrophoresis). Este es un procedimiento comúnmente usado para la separación de proteínas en función a su peso molecular, mediante la migración de las moléculas bajo un campo eléctrico. (Universidad de Alcalá, n.d.). El SDS-PAGE es un método analítico excelente para el monitoreo de técnicas de purificación de proteínas; También es empleado para determinar el peso molecular de las sub unidades de proteínas. Es de destacar que a escala analítica, los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad (García, 2000).

En la ilustración 1 se muestra la electroforesis obtenida de la purificación de IgG por afinidad. Los resultados de este grupo corresponden a los carriles 1AG, 2AG y 3AG; cada uno de los cuales contenía diferentes sobrenadantes obtenidos de las centrifugaciones. En el carril 1AG se sirvió la solución correspondiente a las proteínas séricas no afines a la resina A-agarosa, mientras que en los carriles 2AG y 3AG se encuentran el primer y segundo eludido, respectivamente. El carril demarcado como PM hace referencia al marcador de peso molecular.

De la cromatografía de exclusión se obtuvieron 8 fracciones las cuales fueron dispuestas en cada carril del gel de poliacrilamida, como se muestra en la ilustración 2. Los carriles fueron numerados en función al orden de las fracciones, siendo el carril 1 donde se coloco la primera fracción recuperada y en el carril 8 la ultima fracción obtenida. PM es el marcador de peso molecular.

Discusión

Purificación de IgG por afinidad.

Cadena liviana (25KDa)

Cadena pesada (50KDa)

Albumina (67KDa)

Ilustración 1. SDS-PAGE; Purificación de IgG por afinidad

Ilustración 2. SDS-PAGE; Cromatografía de exclusión

Para esta práctica se utilizó una resina de A-agarosa. Esta está compuesta por agarosa, polisacárido de galactan formado por agarobiosas-1,3-1,4. (Condalab, 2010). La A que acompaña a la agarosa hace referencia a la proteína A del microorganismo S. aureus (coco Gram positivo) la cual tiene afinidad con la Fc (fracción cristalizable) de las IgG, de manera que estas serían las que quedarían adheridas a las perlas de agarosa y por lo tanto serían estas las que en últimas, gracias a la acción de los lavados con los buffers, quedaran purificadas y pudieron ser observadas posteriormente en el gel (Ilustración 1).

También cabe aclarar que los dos buffers que se usaron eran diferentes. Uno denominado como buffer A o buffer de unión que contenía NaH2PO4 0,02M y NaCl 0,15M con un pH de 8 lo que hace que se favoreciera la afinidad unión entre la proteína A y la Fc del anticuerpo. Después, se utilizó un buffer B o buffer de elución que contenía NaH2PO4 0,2M y ácido cítrico 0,1M, con un pH de 4, lo que incrementó la fuerza iónica del sistema, inestabilizando la unión proteína A - Ac haciendo que se separen y los anticuerpos pudieran salir libres.

Mediante el protocolo establecido en clase, la muestra de suero humano se sometió a centrifugaciones y resuspensiones antes de correr la electroforesis. El primer tubo eppendorf fue nombrado como 1AG y contenía las proteínas séricas no unidas, de manera que es el carril donde hay más concentración de los componentes de la solución (albúmina, proteínas sanguíneas y anticuerpos), el segundo tubo eppendorf, nombrado como 2AG contenía el eludido 1 (E1) el cual se obtuvo después de agregar el buffer de elución. Por último se encuentra el tercer tubo eppendorf que contenía el eludido 2 (E2), obtenido de un nuevo lavado y la adición de más buffer de elución.

Como se puede observar en la ilustración 2, en los tres carriles se puede observar que efectivamente hubo una separación, pues pueden observarse con claridad tres bandas: de arriba hacia abajo, la primera banda corresponde a las cadenas pesadas de los anticuerpos (con un peso aproximado de 50kDa cada una), la segunda banda corresponde a las cadenas livianas de los anticuerpos (con un peso aproximado de 25kDa cada una) (López, 2011) y por último, una banda de peso desconocido perteneciente a una proteína contaminante no identificada. Cabe resaltar que al inicio de cada carril se encuentra la albúmina, que es la proteína más abundante que tiene la sangre con un peso aproximado de 66kDa (BIO-RAD, n.d), por esta razón sobretodo el carril que contenía las proteínas séricas no unidas, presenta una deformación.

Cromatografía de exclusión. La cromatografía por exclusión se basa en la separación de moléculas de una muestra en

función al tamaño molecular. Esto se da gracias a que la fase estacionaria es una matriz porosa. Los poros retienen las moléculas de menor tamaño pues estas quedan atrapadas en los aberturas momentáneamente, siendo su migración mas lenta a través de la columna. Paralelamente, las moléculas de mayor tamaño, al no poderse difundir en los poros de la fase estacionaria, recorrerán la columna con una mayor velocidad. De esta forma, las primeras fracciones recuperadas de la columna de cromatografía contendrán las proteínas de mayor peso molecular (menor grado de retención), y con el paso del tiempo, el tamaño de las moléculas en las fracciones irán disminuyendo. (Amersham, n.d)

En la ilustración 2, se observa el comportamiento descrito anteriormente. En el primer carril, correspondiente a la primera fracción, se obtuvieron tres bandas donde: la superior corresponde a la albumina (67KDa), las intermedia a las cadenas pesadas (50KDa) de las Igs y la banda inferior a las cadenas livianas (25KDa). El segundo carril contiene las mismas proteínas que la primera pero en menor cantidad; esto se puede deber a que la mayor cantidad de estas proteínas salieron

el las primeras 10 gotas recuperadas. Desde la tercera fracción en adelante no se observa la presencia de albumina ni de las sub unidades de las Igs pero si de una banda de menor tamaño de la cadena liviana, teniendo un tamaño menor a 25KDa. De esta forma, se observa que dichas proteínas se retuvieron durante un periodo mas prolongado de tiempo que de aquellas de mayor tamaño.

Aun así, la purificación de Igs no se logro adecuadamente, pues junto a estos también fue recuperada albumina. El resultado ideal seria que en las primeras fracciones se obtuviera únicamente las Igs, principalmente IgG (mas abundantes en el suero) pues son los de mayor peso molecular (150KDa) y en las fracciones posteriores obtener la albumina y otras proteínas. Es importante resaltar que al realizar la electroforesis SDS-PAGE, las proteínas son denaturadas por acción del detergente aniónico dodecilsulfato sódico, separando las sub unidades que conforman las Igs (rompimiento de puentes disulfuro) (García, 2000).. Por esta razón, en la electroforesis parecerá que hay dos proteínas de diferentes pesos moleculares (cadena pesada y liviana de las inmunogubulinas) en una misma fracción y que además son mas pequeñas que la albumina, pero en realidad lo que se observa son las sub unidades de una proteína, y que en sumatoria, es mas pesada en su conformación nativa (forma en la que se encuentre en la fracción recuperada)

El resultado obtenido no quiere decir que la cromatografía de exclusión no permite una adecuada purificación de anticuerpos, pues como se observa en el estudio de Aguillon y colaboradores (1997), estos lograron separar exitosamente anticuerpos de salmón por “cromatografía por tamaño molecular”, en donde las primeras 3 fracciones con contenido proteico correspondían a las Igs, y en las siguientes fracciones se obtuvieron otras proteínas y remanentes de albumina sérica. Por lo tanto, el resultado observado en la electroforesis (ilustración 2) se debe a un error en el desarrollo de la técnica, impidiendo una separación adecuada de las proteínas del suero.

Teniendo en cuenta que en la primera y segunda fracción se obtuvieron dos moléculas de distinto tamaño, se puede inferir que el tiempo de retención de la albumina no fue lo suficientemente largo para que los anticuerpos salieran puros. Así, el problema pudo deberse a la altura de la columna; entre mas larga sea esta, mayor distancia tendrán que recorrer los analitos y por tanto el tiempo de retención de las moléculas aumentara.

Conclusiones

Bibliografía

Aguillon J, Smith P, Colombo A, Molina M, Ferreira A (1997) Anticuerpos policlonales antiinmunoglobulinas de salmón; herramientas potenciales para diagnóstico. Arch. med. Vet ISSN 0301-732X

Amersham. Gel filtration, Principios y métodos. Ed AI 18-1022-18

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Gutiérrez M, Burdó A, Cegarra J (2009) La cromatografía de exclusión: análisis de la distribución de pesos moleculares en siliconas por GPC. Boletín intexter No 135.

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