informe de extraccion de papaina
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1. MARCO TEÓRICO 1.1. LA PAPAÍNA
La papaína es una enzima que se extrae del fruto llamado papaya y que
pertenece a una familia de proteínas relacionadas, que incluye
endopeptidasas, aminopeptidasas, dipeptidilpeptidasas y otras enzimas
con actividades tanto exo-peptolíticas como endo-peptolíticas.
Las propiedades peptolíticas de la papaína provocan la ruptura de
múltiples enlaces en las proteínas animales, lo que tiene por
consecuencia que se pueda utilizar para ablandar la carne destinada al
consumo humano. La papaína también hidroliza proteínas vegetales, y
es útil para evitar la formación de los sedimentos protéicos que produce
la proteína de la cebada en el proceso de fabricación de cerveza.
También posee propiedades antiinflamatorias cuando es consumida
directamente, por lo que los frutos que la contienen han sido usados
como medicamento natural. Un entorno alcalino con pH mayor de 8, o
una temperatura mayor de 37ºC desnaturaliza la papaína rápidamente.
El crecimiento del negocio relacionado con su uso para ablandar carnes
para consumo humano y para evitar la sedimentación durante la
producción de cerveza ha causado que el consumo mundial de papaína
haya aumentado hasta unos cien millones de dólares anuales.
La papaína se consigue por la extracción del látex, que es un líquido
blanco obtenido mediante cortes en los frutos de papaya inmaduros.
Luego, en el laboratorio se separa la enzima y se purifica hasta alcanzar
un nivel óptimo de calidad para su comercialización y uso.
Las enzimas, como catalizadores naturales son una riqueza de creciente
importancia. Su uso produce el tiempo invertido en un proceso
determinando, la cantidad de energía consumida disminuye la
posibilidad de subproductos indeseables.
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El látexextraído de la papaya común por incisiones en la superficie de
frutos verdes, contiene un complejo enzimático proteolítico compuesto
de papaína, quimopapainas A y B, papaya peptidasa, siendo las papaína
y las quimopeptidasas, las principales proteasas del látex.
La papaína es muy utilizada en el procesamiento de alimentos:
suavizado de carne, clarificado de la cerveza, extracción de proteínas;
en la industria farmacéutica (por sus propiedades antihelmínticas), de
cosméticos, textiles, de cueros, en el tratamiento de desechos y en la
elaboración de medios de cultivos, entre otros.
Actualmente, en BOLIVIA solo se explota lo que es la papaya y no se
extrae la papaína. Una utilización más racional, presentara una nueva
fuente de ingresos para el productor, y su exportación, una nueva
fuente de divisas para el país.
Otros beneficios que presenta la extracción del látex del fruto de
papaya son:
Maduración uniforme del fruto(que implica una mejor coloración)
Disminución de algunos aromas desagradables presentes en la
papaya.
Aumento de azucares en el fruto.
Uno de los factores que afectan la calidad de la enzima, es el método
utilizado para su deshidratación.
Así, solo llevando a cabo un estudio de los diferentes métodos de los
secados del látex, se puede determinar cuál es el método que,
brindando un producto de calidad aceptable en el mercado
internacional, sea adecuadamente rentable.
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2.2. PROPIEDADES
Es un polvo blanco o blanco-grisáceo. Tiene un olor ácido pungente y
algo agresivo. Es ligeramente higroscópico. Moderadamente soluble en
agua y glicerol y prácticamente insoluble en la mayoría de los
solventesorgánicos. Su temperatura óptima es de 65ºC y su rango de
pH óptimo está entre 5-7. Tiene un punto isoeléctrico de 9.6.
El tiempo de vida útil es corto; por lo tanto, se debe mantener en
ambiente seco y frío. No congelar en suspensiones acuosas.
Como material de embalaje se utilizan recipientes de polietileno o acero
inoxidable pues la papaína es potencialmente peligrosa; el contacto
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prolongado con esta produce daños en la piel de los trabajadores
incluso reacciones alérgicas.
Los enzimas vegetales no producen fenómenos tóxicos cuando se
administran por vía oral. La administración por vía inyectable puede
producir disminución de la coagulación y fenómenos de
hipersensibilidad
2.3. ASPECTOS SOBRE EL CULTIVO DE LA PAPAYA
Es una planta herbácea, de crecimiento rápido y vida útil corta (10
años). De tallo hueco excepto en los nudos. Los frutos se forman en las
axilas de las hojas. Tienen raíces ramificadas y penetrantes.
Pertenece al género de Carica, de la familia CARICACEANE. La carica
papaya, es la especie de mayor importancia comercial. Presenta tres
formas sexuales: femenino, masculino y hemafrodito. La importancia del
sexo radica en que los machos son improductivos, los femeninos son
productores continuos, mientras que los hemafroditos pueden ser
productores continuos o temporales.
La forma del fruto está determinada por el sexo del árbol. Frutos
hemafroditos son más alargados que los femeninos; presentan forma de
CAHCO.
Entre los frutos femeninos y hemafroditos, no existe diferencia en
relación con el grosor, diámetro, porcentaje de solidos solubles y días de
madures del primer fruto.
2.4. CARACTERÍSTICAS DE LA SIEMBRA
Temperatura optima de crecimiento:25°C
Altura recomendada: menor a 1000 msnm.
Suelos: ricos en materia orgánica, con buen drenaje, pH entre 6.5 y
7.0.
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La fruta se recolecta a las 8-10 meses después de la siembra. Produce
durante 10 años, pero el rendimiento óptimo es durante los primero
cuatro años.
Densidad de la siembra: se recomienda una separación de 2.5x2.5m, o
de 3x2.5m: aproximadamente 1350 árboles por hectárea.
2.5. CARACTERÍSTICAS DEL LÁTEX DE PAPAYA
La papaína utilizada como comerciante, es el látex seco extraído del
fruto de papaya por incisiones sobre la superficie del mismo. Se aplica
indistintamente el término papaína, a todo el látex, pese a que este
contiene diferentes fracciones de enzimas proteolíticas y lizocima
(carbohidratasa).
Las enzimas proteolíticas presentes en el látex son: papaína, papaya
peptidasa A y quimopapaina A y B, cada una de estas enzimas, difiere
de las otras en relación a su actividad proteolítica, concentración en el
látex, resistencia a la temperatura y productos resultantes después de
su acción sobre el sustrato.
Las principales proteasas del látex son: la papaína y la quimopapainas A
y B (presentes en las últimas en mayor cantidad, pero con menor
actividad proteolítica).
La acción proteolítica de la papaína, es menos específica que de las
otras proteasas, produciendo n gran cantidad amidas y aminoácidos
libres. La estructura de la molécula de la papaína, fue descrita por
DRENT en 1963 utilizando rayos X. consiste en un único péptido, que
modifica su estructura por tres residuos de cisteína que se encuentra en
la molécula. Esta última, se divide en 2 partes,
Estando el sitio activo en la mitad. La presencia de grupos sulfhidrilo en
el sitio activo, interactuando con la cisteína-25 y la histidina-159 de la
molécula, fueron estudiados por BROKLEURST y SHIPTON en 1973,
llegando a la conclusión que el sistema interactivo de la papaína es de
carácter nucleofilico.Página | 6
2.6. RECOLECCIÓN DE LA MATERIA PRIMA
Para la incisión de la fruta debe utilizarse una navaja de acero
inoxidable y la recolección debe realizarse por la mañana (entre cinco y
nueve de la mañana), de dos a tres incisiones. El látex exudado debe
recogerse en receptáculos de plástico. Es evidente, de acuerdo a la
naturaleza ácida del látex, la necesidad de utilizar guantes en este
proceso.
2.7. EXTRACCIÓN DEL LÁTEX
Las muestras de látex se recogieron del sembradío de papaya. Para la
extracción, se fijaron los siguientes parámetros:
-selección de árboles femeninos y hemafroditos, con frutos entre 2.5-3
meses de edad-
-hora de sangrado: entre las cinco y las ocho horas del día.
.sangrado: incisiones longitudinales sobre la superficie del fruto de 2.5-
3mm de profundidad
-número de zanjas por fruto: cinco.
Inmediatamente después de la recolección del látex, se adicionaron
bisulfito de sodio sólido y químicamente puro en una concentración de
0.5%, como agente preservante, regulador de pH , antioxidante y citrato
de sodio sólido y químicamente puro, como anticoagulante, en una
concentración de 4.0%.
El látex coagulado sobre la superficie del fruto de desecho.
2.8. LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA
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La actividad proteolítica secretada por las células es un elemento
indispensable para la proliferación y migración celular. Esta actividad
está dada por una batería de enzimas y zimógenos secretados por la
célula hacia el espacio extracelular. Las colagenasas, metaloproteasas,
elastasas y otras enzimas degradativas conforman el amplio mundo de
proteasas que se encargan de degradar la matriz extracelular.
En condiciones normales la actividad proteolítica es modulada por el
entorno celular e inclusive por la propia matriz extracelular. Por
ejemplo, los factores de crecimiento (Growthfactors) al estimular la
proliferación modulan, muchas veces, la actividad proteolítica . De esta
forma una célula estimulada secreta los agentes que le permiten crear
las condiciones adecuadas para la progenie.
La plasmina es una importante enzima degradativa que es secretada
por la célula como zimógeno, denominado plasminógeno. El
plasminógeno queda retenido en la matriz extracelular no teniendo
actividad proteolítica sobre ella. La molécula que convierte al
plasminógeno en plasmina se denomina Activador de Plasminógeno y es
secretada por la célula en respuesta a ciertos estímulos. Existen dos
tipos de activadores de plasminógeno el uPA
(urokinaseplasminogenactivator) que se describió originalmente en la
orina, de donde proviene su nombre y el tPA
(tissueplasminogenactivator). Estos convierten al plasminógeno
enplasmina que a su vez actúa sobre la fibronectina, la laminina y
colagenasas latentes que resultan así son activadas.
Las metaloproteasas (MMP, de matrixmetalloproteinase) son una familia
de proteasas que incluye más de diez componentes.
Estas proteasas dependen para su accionar de la presencia de cationes
bivalentes (Zn++), actuando sobre una serie de sustratos según el tipo
de MMP. Los distintos tipos de colágeno son los sustratos principales de
estas proteasas.
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2.9. MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA
El parámetro de control de calidad de la papaína es la medición de su
actividad proteolítica; se expresa como el incremento en la velocidad de
reacción de la conversión de un sustrato en producto por intervención
del enzima. Esta acción catalítica se la puede medir también en
referencia a la digestión de un péptido o proteína y la extensión de tal
digestión es medida de diferentes formas; existen tres:
Métodos que se encargan de la medición de los residuos de un péptido
no digerido por el enzima.
Métodos que miden los grupos amino liberados en la catálisis.
Métodos que miden la rotación óptica de los residuos digeridos, el
tiempo de coagulación de una muestra de leche, el color producido por
un reactivo en los residuos digeridos y el aumento de los sólidos
solubles en el medio de reacción.
2.10. ESTRUCTURA QUÍMICA DE LA PAPAÍNA
2.11. RENDIMIENTO
DEL LÁTEX
Entre los principales factores que influyen en el rendimiento del látex
están: variedad de papaya, las condiciones ecológicas, el sistema de
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siembra, la edad del fruto y del árbol. Algunos autores concluyen que el
número de incisiones que se
realicen sobre el fruto, la frecuencia y la hora que se recolecte el látex,
depende del rendimiento del látex fresco y por consiguiente, el látex
seco.
2.12. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD
PROTEOLÍTICA
OXIDACION QUIMICA
Agentes oxidantes como el yodo, bromo, peróxido de hidrogeno, el
oxígeno y los metales pesados, inactivan la enzima, mientras que el
ácido cianhídrico, la cisteína, el glutatión reducido, restauran u
actividad. Esto se explica debido a la participación de sulfhidrilos en la
acción catalítica de la enzima, que se activa en estado reducido y se
inactiva al oxidarse.
Otros agentes que impiden la oxidación de los grupos sulhhidrilos son el
sulfito de sodio o potasio, el dióxido de azufre, bisulfitos de sodio.
Potasio o amonio, el ácido tioglicolico y el ácido ascórbico.
COAGULACION
Debido a la naturaleza proteica y a la presencia de peptonas y
albuminoides en el látex fresco, este tiende a coagular después de su
extracción.
CAMBIOS DE pH
Una de las peculiaridades de la papaína es que mantiene su actividad
proteolítica en un amplio margen de Ph, desde 3 hasta 12, presentando
mayor actividad entre 5 y 6. El pH optimopara que la enzima actué,
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depende del tipo de sustrato sobre el cual ejerce su acción, ya que
coincide con el punto isoeléctrico del sustrato.
Entre los agentes amortiguadores más utilizados se encuentran: citrato
de sodio y potasio, fosfato de sodio o potasio.
CRECIMIENTO MICROBIANO
Debido a la naturaleza proteica del látex y la forma de recolección, esta
propensa a contaminación con microorganismos, que realizan sobre el
acción putrefactiva. Como agentes antimicrobianos se utilizan los
sulfitos y los bisulfitos de sodio y potasio, el fenol, el paranitrofenol, los
benzoatos, el resorcinol y el etil-fenol.
También encontró que tiene mayor actividad proteolítica el látex
extraído de los frutos femeninos que de los frutos hemafroditos.
OXIDACION POR LUZ
Se inactiva con luz ultra violeta, oxidándose rápidamente por
exposición a los rayos solares y el oxígeno.
HORA DE RECOLECCIÓN
Existen diferentes criterios, siendo el más corriente que la recolección
debe hacerse a horas tempranas del día, para evitar fuerte acción de los
rayos solares. No obstante algunos autores mencionan que no existe
diferencia significativa en actividad proteolítica de la papaína, al realizar
las extracciones entre las 5:30 am y las 14:00 pm del día: y que la
actividad proteolítica de la papaína extraída de frutos hemafroditos, es
mayor recolectarse al látex entre las 9 y las 10 horas del día.
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Para evitar la oxidación química dl látex, las incisiones deben realizarse
con instrumentos cortantes, de materiales no corrosivos: acero
inoxidable, vidrio, plástico.
La profundidad de las incisiones, para obtener un buen rendimiento y no
dañar la superficie del fruto, debe ser de 2.5 a 3 mm de profundidad.
Los recipientes de recolección, deben ser de plástico o lona, para evitar
la oxidación del látex.
2.13. SISTEMA DE SECADO
Al ser la papaína un compuesto fácilmente alterable por agentes tales
como el oxígeno, la luz solar y la temperatura, el sistema de secado
determina la cantidad de la enzima.
El secado bajo la oscuridad rinde un producto oscuro, de baja actividad
proteolítica, por lo que no se recomienda su utilización. Además, este
sistema de secado está sujeto a contaminaciones ambientales,
resultando un producto que deberá purificarse para ser utilizado en la
industria de alimentos o farmacéutica.
El secado por corrientes de aire caliente, rinde un mejor producto de
mejor calidad que el método anterior, más claro y con mayor cantidad
proteolítica. Se encontró que la temperatura óptima para el secado está
entre 50-55°C.
2.14. USOS Y APLICACIONES
En el área de la cosmética: donde se utiliza en la fabricación de cremas
desmanchadoras de la piel, que consumen aproximadamente un 10% de la
producción mundial, y van en alza.
En el área farmacéutica:
a) En Estados Unidos, se le han descubierto propiedades a la hora de tratar
males hepáticos y dolores lumbares: su uso médico ha sido aprobado para el Página | 12
tratamiento de estos últimos, mediante la inyección de la enzima al líquido
cefaloraquídeo de la espina dorsal con el fin de disipar los molestos dolores
del disco intervertebral. Todo esto con un éxito de hasta un 60% en los
pacientes tratados y un riesgo mínimo de alergia.
b) Es uno de los componentes utilizados por laboratorios oftalmológicos para
fabricar tabletas enzimáticas para la limpieza de lentes de contacto.
c)También forma parte de suplementos dietarios, debido a su capacidad de
favorecer el proceso digestivo, y de procesos de depuración de aguas.
Paralelamente, se comienzan a descubrir otras aplicaciones de la papaína en
negocios como la industria textil, papelera, curtiembre de cuero, en procesos
de depuración de resíduos líquidos y en investigación de química analítica.
Entre los países que la exportan se encuentran Tanzania, Uganda, Zaire, Sri
Lanka, Tailandia e India.
Como dato anexo, muchas de sus cualidades no han podido ser reproducidas
en una enzima sintética, lo que vuelve a la papaína insustituible en muchas
de estas áreas.
Las enzimas son, básicamente, agentes de transformación. En el caso de las
tecnoenzimas, estas son usadas en calidad de aditivos para mejorar la
aceptación de los productos tratados.
La papaína presente en ella tiene similares características a las de la
bromelina, una enzima presente en la piña. Sin embargo, esta última tiene
menos propiedades y aplicaciones, tanto en el área de la alimentación como
en la creación de fármacos y terapias.
Por esta y otras razones, y si bien las tradicionales confituras y
conservas al jugo siguen teniendo gran aceptación en el mercado, es en
el área biotecnológica donde se cree que este fruto tendrá importantes
aplicaciones en un futuro inmediato.
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3. MATERIALES Y REACTIVOS 3.1. MATERIALES
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CANTIDAD MATERIAL CAPACIDAD
1
-2
-2
-1
-1
EQUIPO PARA
FOLTRACION AL
VACIO
-MATRAZ QUITASATO
- MANGUERAS
-MOTOR
-EMBUDO DE
BUCHNER
-2
-2
-1
1
3 VASO DE
PRECIPITADO
100 ml
2 Papel filtro
1 piseta
1 Pipeta 10ml
1 propipeta
3 Vidrio reloj
1 espátula
1 cepillo
1 Estufa de secado
1 gradilla
10 Tubos de ensayo
1 termómetro
1 Mortero y pilón
3.2. REACTIVOS
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CANTIDAD REACTIVO FORMULA
2 ml buffer 7.01 pH
5 g BISULFITO
DE SODIO
5 g CITRATO DE
SODIO
20ml AGUA
DESTILADA
H2O
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4. PROCEDIMIENTO
4.1. PLANEACIÓN DEL TRABAJO EXPERIMENTAL
El punto de congruencia entre la parte teórica y la experimental, que
ayuda a definir las variables sujetas a estudio, lo constituye la
planeación del trabajo experimental; en ésta se definirá la estrategia
que ayudará a conseguir los objetivos planteados en este anteproyecto.
Es importante recalcar, además, que dicha estrategia será elaborada de
acuerdo a la disponibilidad de equipos y materiales; además, se
pretende evitar cualquier eventualidad que se presente a lo largo de la
experimentación.
Entonces, para facilitar su desenvolvimiento y asegurar la confiabilidad
de sus procedimientos y resultados, se propone que la estrategia
consista en dividir el trabajo en tres etapas:
Etapa de preparación
Etapa de ejecución
Etapa de examen de resultados
Este será el plan de trabajo que permitirá alcanzar los objetivos
propuestos aquí. A continuación se detallarán cada uno de los
componentes de lo mencionado.
¿EN QUÉ CONSISTE LA ETAPA DE PREPARACIÓN?
Consistirá en organizar todo lo necesario para el trabajo experimental
(lista de materiales, equipos y reactivos) y ensayar pruebas de habilidad
tanto con los protocolos experimentales como con los equipos (pruebas
operacionales). También se realizarán ensayos acerca de la adaptación
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de ciertos métodos experimentales de acuerdo a nuestras posibilidades
técnicas y económicas. Finalmente se ensayarán las pruebas
exploratorias de los rangos óptimos de concentraciones, tiempos y
temperaturas de operación.
En la etapa de preparación, antes de ensayar los métodos de análisis,
se fijarán los factores que determinen la calidad de las materias primas
y de los productos obtenidos; pues es imperativo primero determinar
qué parámetros evaluaremos y en función de esto, se establecerán los
respectivos métodos para el control de calidad.
¿EN QUÉ CONSISTE LA ETAPA DE EJECUCIÓN?
En referencia a la etapa anterior, donde se ensayaron pruebas
exploratorias y preparatorias, en esta etapa se llevarán a cabo las
pruebas finales y de reproducibilidad. En la redacción de este
experimento se detallaran los procedimientos finales y sus resultados.
¿EN QUÉ CONSISTE LA ETAPA DE EXAMEN DE
RESULTADOS?
De acuerdo a la información obtenida del experimento, aquí
corresponderá analizar todos los resultados obtenidos y sus eficiencias.
De acuerdo al informe de resultados.
4.2. FIJACIÓN DE LOS FACTORES DE CALIDAD
El fundamento que regirá la selección de los métodos de análisis para el
control de calidad de las materias primas y de los productos, se refiere a
los factores que conjuntamente establecen su calidad.
Los siguientes son los factores que definen la calidad de la papaya apta
para la recolección de su látex:
o Estado de madurez: entre 9-14 meses de plantación
o Tamaño adecuado: papaya tamaño mediano (tipo hawaiana)
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o La bibliografía recomienda que las condiciones ambientales para la
recolección del látex sean:
o Condiciones de trabajo: evitar contacto prolongado con el ambiente
o Color blanco.- un cambio a pardo claro-oscuro indica la
desnaturalización del enzima. Esta característica sensorial es una
forma rápida y eficaz acerca de la calidad del látex después de un
periodo de almacenamiento.
o Olor ácido.- La oxidación además de producir un cambio de color en el
látex también produce un olor a sulfuro de hidrógeno; esta es otra
alternativa para evaluar la calidad del látex.
4.3. PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO
4.3.1. EXTRACCIÓN DEL LÁTEX QUE CONTIENE LA
PAPAÍNA
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Para la extracción del látex se seleccionan frutos verdes y completamente
desarrollados, de 3-4 meses de edad aproximadamente. El número de
frutas que deben tomarse para efectuar las sangrías puede variar de seis
a diez o más. Usualmente el número seleccionado es arbitrario.
El fruto puede recibir varias incisiones repetidamente a intervalos de
cinco a ocho días, hasta que el fruto del látex comience a disminuir, al
extremo que justifique la remoción de la fruta del árbol.
Se ha reportado que incisiones hechas cada dos semanas proporcionan
mayores rendimientos que las realizadas semanalmente. También el
tamaño del fruto tiene importancia en el rendimiento del látex.
Los frutos de 2 a 2.5 meses de edad presentan las más altas
producciones de látex y papaína cruda. Igualmente, frutas de 23 a 25 cm.
de largo producen los más altos rendimientos en ambos productos y
tienen una mayor actividad de extracción.
Todas las incisiones deben ser hechas verticalmente y no más de 4
sangrías deben hacerse a un fruto al mismo tiempo. Cuando la fruta,
independientemente de su tamaño comienza a presentar los primeros
síntomas de madurez, la producción de látex y la concentración de
enzimas disminuyen rápidamente.
4.3.2. PROCESAMIENTO DEL LÁTEX
El látex debe ser procesado (secado) inmediatamente después de ser
extraído del fruto. El proceso de secado puede hacerse a pleno sol o
también utilizando otra fuente de calor. En este último caso, el uso de
hornos es esencial. El diseño y características del tipo de horno más
adecuado dependen de la disponibilidad de la fuente de calor. Éstos
deben ser regulados para garantizar un suministro promedio de 25 ºC, ya
que el calor excesivo destruye el principio activo de la papaína. Si se
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proporcionan las condiciones óptimas de calor, el proceso de secado del
látex puede ser completado en aproximadamente 20 horas.
El látex coagulado puede producir el 25% de su peso en polvo seco, el
cual aún contiene 6-10% de humedad y presenta una coloración blanco-
cremosa.
El producto comercial se considera de buena calidad cuando tiene la
capacidad de digerir 35 veces su propio peso. La pérdida de calidad está
asociada con numerosos factores, entre los cuales merecen destacarse, la
edad de los árboles, madurez de los frutos, tiempo de extracción del
látex, velocidad de secado, cantidad de lluvia caída, temperatura a la cual
el látex es secado, sistema de almacenamiento, etc. La papaína comienza
a mostrar signos de descomposición
por la liberación de fuertes olores de
productos volátiles, acompañados por
un rápido cambio de color blanco
cremoso a marrón.
4.3.3. SISTEMA DE SECADO
LÁTEX SECADO CON AIRE
CALIENTE
Utilizando aire caliente, se obtiene un
producto de color oscuro y grumoso,
que necesita molienda para su
posterior utilizaci6n.
La presencia de oxigeno durante el
tratamiento térmico, y el tiempo que
dura el proceso (6 horas), son dos
factores, que influyen considerablemente en la baja actividad de la
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papaína seca. Sumado a los otros dos factores, esta la molienda,
posterior al secado, que debe ser realizada para brindar un producto
homogéneo. En este último proceso, el producto se somete a exposici6n
al aire y q calentamiento, ocasionado por las fuerzas de fricción durante
la molienda.
Por el tiempo de exposición al aire, que es mayor que en los dos casos
anteriores, el producto seco puede absorber humedad del medio
ambiente.
La actividad proteolítica de las muestras empacadas al vacio, es mayor
que las empacadas sin vacio durante el periodo de almacenamiento.
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4.3.4. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
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Para la determinación de la actividad enzimática, se detallaran a continuación los dos métodos, utilizados para comprobar la existencia de la enzima papaína y su efectividad.
1. Método de coagulación de leche (Balls and Hoover).
Hay diferentes métodos de comprobación de actividad de una enzima. Este método confía en la capacidad de la papaína en coagular la leche, los análisis se realizaran en 10 mililitros de leche deshidratada, a diferentes concentraciones de papaína (0.0025, 0.005, 0.01 y 0.02) gramos por mililitro de ácido acético, una vez preparada la solución de papaína con ácido agregar a la leche (0.5, 1, 2, 4, 6 y 7) mililitros respectivamente.
Esterilizar los instrumentos que se van a utilizar en el autoclave por 45 minutos, y luego colocarlos en la estufa a 120ºC por 30 minutos para eliminar residuos de agua. Se deja enfriar a temperatura ambiente (28 ± 2 ºC).
Pesar 7.75 gramos de leche en polvo. Colocar 54 mililitros de agua en un vaso de precipitación. Diluir la leche en el agua y calentarla a 30ºC en un baño de agua y
mantener esta temperatura, en una cocineta eléctrica. Pesar las diferentes cantidades del polvo de látex seco (0.0025, 0.005, 0.01
y 0.02) gramos por mililitros de ácido acético. A una cantidad determinada de leche (10 mililitros), agregar las cantidades
de la solución de látex seco diluido en ácido acético (0.5, 1, 2, 4, 6 y 7) mililitros.
Mezclar el contenido a fondo y controlar el tiempo que demora para detectar la coagulación de la leche (formación de coágulos).
El tiempo tomado para alcanzar esta etapa, de cuando el polvo de látex seco diluido en el ácido fue agregado a la leche, se registra para cada uno de los experimentos.
Las diversas cantidades de muestra del polvo de látex seco usado deben dar una gama de los tiempos de coagulación entre 20 y 150 segundos para los resultados óptimos.
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