1

UUNNIIVVEERRSSIIDDAADD CCAATTÓÓLLIICCAA

DDEE LLAA SSAANNTTÍÍSSIIMMAA CCOONNCCEEPPCCIIÓÓNN

FFAACCUULLTTAADD DDEE MMEEDDIICCIINNAA

EESSCCUUEELLAA DDEE MMEEDDIICCIINNAA

DDEEPPTTOO.. DDEE BBIIOOQQUUÍÍMMIICCAA

IINNTTEEGGRRAANNTTEESS::

FFEERRNNAANNDDAA FFUUEENNTTEEAALLBBAA UULLLLOOAA

VVAALLEENNTTIINNAA FFUUEENNTTEESS CCOONNAAPPIIAADDOO

MMAACCAARREENNAA LLOOBBOO BBLLAANNCC

CCAARRLLAA MMOORRAA VVOOGGTT

RROOMMIINNAA PPUULLVVEERRMMÜÜLLLLEERR SSAALLVVAATTIIEERRRRAA

JJOONNAATTHHAANN RRIIQQUUEELLMMEE TTAAPPIIAA

DDOOCCEENNTTEESS::

DDrr.. RREEGGIINNAALLDD DDEELL PPOOZZOO,, PPhh..DD..

BBQQ.. MMIIRRNNAA MMUUÑÑOOZZ,, MM..SScc..

FFEECCHHAA:: MMIIÉÉRRCCOOLLEESS 3300 DDEE JJUUNNIIOO DDEE 22001100

2 INDICE

OBJETIVOS 02

INTRODUCCIÓN 03

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO 04

PROPIEDADES DE LOS INTERCAMBIADORES IÓNICOS 04

PROCEDIMIENTO 05

FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIÓN 06

RESULTADOS 08

APLICACIONES 09

MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA 09

DETERMINACIÓN DE PBG Y ALA EN ORINA 11

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 12

OTRAS APLICACIONES 12

CONCLUSIÓN 13

BIBLIOGRAFÍA 13

OBJETIVOS

Desarrollar el concepto de las técnicas

cromatográficas a nivel general.

Comprender los principios de la cromatografía de

intercambio iónico.

Analizar paso a paso el método de la técnica y

los distintos tipos de intercambiadores iónicos

que permiten su función.

Determinar los factores que afectan, interfieren o

alteran el procedimiento y su correcta ejecución

para lograr el objetivo deseado.

Reconocer las distintas aplicaciones

preferentemente en el ámbito médico y la

importancia de esta técnica cromatográfica.

3 INTRODUCCIÓN

Para el estudio de las sustancias se deben ocupar

diversas técnicas, que han ido evolucionando con el

paso de los años. Una de las técnicas más básicas es

la cromatografía, en sus múltiples variantes. Esta

técnica se da desde siempre en la naturaleza, como

en lo que efectúan las piedras, que permiten purificar

el agua.

La cromatografía como tal adquiere importancia

cuando en 1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba

con tintas, descubrió que los cationes orgánicos se

separaban por migración cuando se depositaba una

disolución que los contenía sobre un material poroso,

como papel. El botánico ruso Mijaíl Tswett empleó por

primera vez en 1906 el término "cromatografía" (que

proviene del griego χρομα y γραφω que significan

respectivamente chroma "color" y graphos "escribir").

Según la definición dada por Keulemans la

cromatografía es un método de separación en el que

los componentes a desglosar se distribuyen entre dos

fases, una de las cuales constituye un lecho

estacionario de amplio desarrollo superficial y la otra

es un fluido que pasa a través o a lo largo del lecho

estacionario. Recientemente la I.U.P.A.C define la

cromatografía de forma más amplia como(1)

: Método

usado principalmente para la separación de los

componentes de una muestra, en el cual los

componentes son distribuidos entre dos fases, una de

las cuales es estacionaria, mientras que la otra es

móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un

líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La

fase estacionaria puede ser empaquetada en una

columna, extendida en una capa, distribuida como

una película, etc.

Se basa en el principio de retención selectiva, cuyo

objetivo es separar los distintos componentes de una

mezcla, permitiendo identificar y determinar las

cantidades de dichos componentes. Las retenciones

mencionadas pueden tener su origen en dos

fenómenos de interacción que se dan entre las dos

fases y que pueden ser:

1. La adsorción, que es la retención de una

especie química por parte de los puntos activos

de la superficie de un sólido quedando delimitado

el fenómeno a la superficie que separa las fases

o superficie interfacial.

2. La absorción, que es la retención de una

especie química por parte de una masa, y debido

a la tendencia que esta tiene a formar mezcla

con la primera, absorción pura, o a reaccionar

químicamente con la misma, absorción con

reacción química, considerando ambas como un

fenómeno másico y no superficial.

A comienzos del año 1903, Mijail Tsvet usó columnas

de adsorción de líquidos para separar pigmentos

vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones

se hacían pasar a través de una columna de vidrio

rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido

de un material poroso que interacciona de forma

diferente con los componentes de la mezcla, de forma

que éstos se separaban en distintas bandas

coloreadas a lo largo de la columna.

Imagen 1. Separación de

clorofilas mediante cromatografía

en papel.

La cromatografía puede cumplir dos funciones

básicas, como son el de separar los componentes de

la mezcla, para así purificarlos, o para medir las

proporciones de los componentes.

Existen múltiples tipos de cromatografía, que se

pueden separar en dos grandes grupos:

a) Cromatografía plana. La fase estacionaria se

sitúa sobre una placa plana o sobre un papel.

Las principales técnicas son: Cromatografía en

papel, Cromatografía en capa fina.

b) Cromatografía en columna. La fase

estacionaria se sitúa dentro de una columna.

4

Según el fluido empleado como fase móvil se

distinguen: Cromatografía de líquidos,

Cromatografía de gases, Cromatografía de

fluidos supercríticos.

Dentro de la cromatografía en columna de líquidos,

están un grupo de técnicas, dentro de las que

queremos destacar la cromatografía de intercambio

iónico, que ocupa en su fase móvil un liquido polar, y

estacionaria un sólido. Esta cromatografía es un

proceso que permite la separación de iones y

moléculas polares basadas en las propiedades de

carga de moléculas.

Esta técnica apareció durante la II Guerra Mundial y

en principio tenía la finalidad de separar las tierras

raras y los elementos de transición. En 1938 Taylor y

Urey utilizan este método para separar isótopos de

Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. En 1939

Samuel logra sintetizar resinas de intercambio iónico.

Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula

cargada incluyendo grandes proteínas, pequeños

nucleótidos y aminoácidos. La solución que debe

inyectarse es usualmente llamada “muestra” y los

componentes separados individualmente son

llamados “analitos”. Es usada a menudo en

purificación de proteínas, análisis de agua o control

de calidad(2)

.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

La cromatografía de intercambio iónico es un método

de separación que permite la separación de

moléculas basada en sus propiedades de carga

eléctrica. Se compone de dos fases, la fase

estacionaria o intercambiador iónico y la fase móvil.

La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie

cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones

móviles que pueden intercambiarse por iones de la

fase móvil La fase móvil en cromatografía de

intercambio iónico suele ser una disolución acuosa

con cantidades moderadas de metanol u otro

disolvente orgánico miscible con agua que contiene

especies iónicas en forma, generalmente de buffer.

Los iones de la fase móvil compiten con los analitos

por los sitios activos de la fase estacionaria.

El principio básico de la cromatografía de intercambio

iónico(3)

es que las moléculas cargadas se adhieren a

los intercambiadores de forma reversible de modo

que dichas moléculas pueden ser unidas o desunidas

cambiando el ambiente iónico. La separación

mediante intercambiadores iónicos se realiza por lo

general, en dos fases: en la primera las sustancias a

separar se unen al intercambiador utilizando

condiciones que originan una unión fuerte y estable; a

continuación, se eluye de la columna con tampones

de diferentes pH o diferente fuerza iónica,

compitiendo los componentes del tampón con el

material, por los sitios de unión.

Imagen 2. (A) Con una fase

estacionaria cargada

negativamente son retenidas las

sustancias cargadas

positivamente. (B) Deben competir

con los contraiones (del

amortiguador). (C) Las sustancias

cargadas negativamente pasan a

través de la face estacionaria sin

enlazarse.

PROPIEDADES DE LOS

INTERCAMBIADORES IÓNICOS

Un intercambiador iónico es, por lo general, un

polímero que tiene grupos cargados unidos. Si un

grupo está cargado negativamente, podrá

intercambiar iones positivos y será un intercambiador

de cationes o catiónico. Un grupo típico que se utiliza

en los intercambiadores de cationes es el grupo

sulfónico, SO3-. Si se une un H+ al grupo, se dice que

el intercambiador se encuentra en forma ácida, y

puede por ejemplo intercambiar un H+ por un Na+ o

dos H+ por un Ca2+

. El grupo ácido sulfónico es un

intercambiador de cationes fuertemente acido. Otros

grupos de utilización corriente son el carbonilo e

hidroxilo fenólico, dos intercambiadores catiónicos

A

B

C

5 débilmente ácidos. Si el grupo cargado es positivo

(por ejemplo un grupo amino cuaternario), es un

intercambiador de aniones o aniónico fuertemente

básico. Los intercambiadores aniónicos débilmente

básicos más corrientes son grupos aminos alifáticos o

aromáticos.

Imagen 3. Estructuras de

Resinas Intercambiadoras de

Cationes. (A) Resina de

poliestireno, ácido fuerte

(Dowex-50). (B) Resina de

carboximetil celulosa, ácido

débil (CM Cellulose). (C)

Resina de poliestireno, ácido

débil y quelante (Chelex-100).

La matriz puede estar hecha de diferentes materiales.

Los de uso más corriente son el dextrano, la celulosa

y copolímeros del estireno y divinilbenceno, en los

que el divinilbenceno contie los grupos cargados y se

entrecruza con las cadenas de poliestireno.

La elección entre intercambiadores fuertes o débiles

está basada en el efecto del pH sobre la carga y la

estabilidad. Por ejemplo, si se va a cromatografiar

una sustancia débilmente ácida que necesita pH muy

altos o muy bajos para su ionizacion, se requiere un

intercambiador fuerte debido que este funciona a pH

extremos. No obstante, si la sustancia es lábil, es

preferible la utilizacion de intercambiadores débiles.

Los intercambiadores débiles son tambien excelentes

para la separacion de moléculas con una carga

elevada de aquellas con poca carga, debido a que los

iones debilmente cargados no se unen, por lo

general, al intercambiador. Los intercambiadores

débiles permiten, asimismo, una mayor resolucion de

las sustancias si las diferencias de carga son muy

pequeñas.

Imagen 4. Estructuras de

Resinas Intercambiadoras de

Aniones. (A) Resina de

poliestireno, base fuerte (Dowex-

1). (B) Resina de dietilaminoetil

celulosa, ácido débil (DEAE).

Para una correcta elección de la porosidad y del

tamaño de la malla es necesario tener en cuenta que

las moléculas pequeñas se separan mejor sobre

matrices con tamaño de poro pequeño (o sea, un

elevado grado de entrecruzamientos) debido a que la

capacidad disponible es grande, mientras que las

macromoléculas necesitan un tamaño de poro mayor.

Los intercambiadores de celulosa han probado ser los

mejores para la purificación de moléculas grandes

como proteínas y polinucleótidos. Ello es debido a

que la matriz es fibrosa, por lo que todos los grupos

funcionales se encuentran en la superficie y

disponibles, incluso, para las moléculas mayores.

PROCEDIMIENTO

Para realizar una cromatografía de intercambio iónico

son necesarios los siguientes materiales: (1) Columna

de vidrio, (2) Matriz de intercambio iónico (Resina),

(3) Eluyente, (4) Muestra a fraccionar y (5)

Colectores(4)

.

La mayoría de los experimentos basados en esta

técnica están basados en 4 etapas(5)

.

1. Equilibrio: El primer paso es el equilibrio de la

fase estacionaria con las condiciones iniciales

deseadas. Cuando el equilibrio se ha logrado, toda

la fase estacionaria se encuentra asociada a iones

complementarios (que pueden ser cloro o sodio).

Por ejemplo, un intercambiador catiónico

sulfonado asociado a Na+ producto de la

disociación de NaOH.

2. Aplicación y Lavado: El paso siguiente es aplicar

la muestra la cual queremos filtrar a través de la

columna mediante un lavado específico. Para ello

es necesario aplicar un buffer con el mismo pH y

fuerza iónica que el buffer inicial para que todas

las proteínas cargadas se unan al intercambiador.

Por ejemplo: A la forma sódica de la resina lavada

se le añade una solución ácida (pH=3) de la

mezcla de aminoácidos; a dicho pH los

aminoácidos se encuentran en forma de cationes

con carga neta positiva. Los aminoácidos

catiónicos tienden a desplazar algunos de los

iones ligados a las partículas de resina. A pH 3 los

aminoácidos más básicos se unirán a la resina de

forma más estrecha y los más ácidos o menos

básicos, se unirán menos.

A

B

C

A

B

6

Imagen 5. Fases del procedimiento de cromatografía de

intercambio iónico. (A) Fase de Equilibrio en la parte

inferior. (A) y (B) Aplicación. (C) Elusión. (D)

Regeneración.

3. Elusión: Las moléculas captadas por el

intercambiador son eluídas debido a cambios en la

composición del buffer. Una manera común es

incrementando la fuerza iónica con cloruro de

sodio u otra sal común. Los aminoácidos serán

eluídos dependiendo de la carga neta que estos

posean. A medida que se aumenta gradualmente

el pH y la concentración de NaCl del medio

eluyente acuoso, los aminoácidos descienden en

la columna a velocidades diferentes y pueden

recogerse en muchas pequeñas fracciones. La

disminución del pH protonará a los grupos de los

aminoácidos por lo que su carga neta tenderá a

ser positiva, al revés si se aumenta el pH. Si se

aumenta la concentración de sal, sus iones

competirán mucho más por la resina y se

intercambiarán por los grupos de aminoácidos.

Las diversas fracciones pueden analizarse

cuantitativamente mediante la reacción con

ninhidrina. Los aminoácidos aniónicos aparecen

primero y los más catiónicos aparecen

posteriormente (con un intercambiador catiónico).

4. Regeneración: Por último, remover las partículas

que aún están asociadas al intercambiador. Para

ello se debe generar un cambio más drástico en el

pH y la concentración salina. Ahora la fase

estacionaria puede volver a ser utilizada.

Imagen 6. (A) Resina de intercambio catiónico antes de

añadir la muestra. (B) Se añade la muestra, una mezcla

de Asp, Ser y Lys. (C) Se añade Na+ (NaCl), el Asp, el

aminoácido con menos carga positiva eluye el primero.

(D) Se aumenta el Na+, a continuación eluye la Ser. (E)

Se aumenta el Na+, la Lys, el que posee más carga

positiva eluye el último.

FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIÓN

Tiempo de retención (Tr): se describe como el

tiempo que transcurre después de la inyección de

la muestra hasta que la mayor concentración del

analito alcanza el detector (cuando se ha

separado todo el analito), es decir, el tiempo que

un compuesto tarda en salir de la columna. En la

cromatografía de intercambio iónico la retención

está basada en la atracción entre iones del soluto

y la carga complementaria de la fase estacionaria.

Los intercambiadores iónicos favorecen la unión

de iones de mayor carga y radio inferior. Cuando

la retención de los compuestos se ve afectada, se

favorece la elusión de ellos para ser recolectados

en una serie de fracciones.

pH: Los intercambiadores iónicos se clasifican en

ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las resinas

ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en

disoluciones muy ácidas, en cambio las resinas

ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y

pierden su capacidad de intercambio catiónico,

reduciéndose así, el tiempo de retención. Los

grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen

siendo catiónicos a cualquier valor de pH. Los

básicos débiles de amonio terciario se

desprotonan en disoluciones moderadamente

básicas y pierden entonces su capacidad,

reduciéndose también el tiempo de retención.

Cargas: La fuerza de enlace de la muestra

depende de la magnitud de la carga. La fuerza de

retención es mayor y, por consiguiente la de

elusión es menor, mientras más cargado se

encuentre el compuesto, ya sea negativa

(aniones) o positivamente (cationes). Los iones

A B C D

A B

C D E

7

polivalentes se unen con mayor fuerza a la fase

estacionaria que los monovalentes.

Imagen 7. Muestra el intercambio catiónico a la

izquierda desde los menos absorbidos a los más

absorbidos. A la derecha se muestra la fuerza eluyente

en el intercambio aniónico.

Gradiente: Aumentando la concentración de la

fase móvil, los iones compiten cada vez más

favorablemente con la muestra por los sitios

activos cargados de la fase estacionaria.

Imagen 8. Esquema del gradiente del Buffer con

contraiones cargados negativamente. Se presenta un

gráfico con el poder de elusión (fuerza iónica) y el

porcentaje de proteína eluída, que muestra una gradiente

directamente proporcional.

Porosidad: El tamaño del poro de la resina al que

se une el compuesto móvil por intercambio iónico

influye directamente en la capacidad de unión. En

membranas cuyo tamaño de poro es pequeño

(menor de 600Å) no hay espacio suficiente para

unir el ión dentro de dichos poros por lo que la

cantidad de intercambiador por unidad de

superficie es menor. Sin embargo, en membranas

con tamaño de poro mayor (mayor de 600Å) se

puede unir el compuesto móvil dentro de dichos

poros, con lo que se incrementa la cantidad de

intercambiador por unidad de superficie. La

porosidad busca una mayor superficie de

intercambio.

Imagen 9. Donde existe mayor porosidad (derecha), se

puede unir el compuesto móvil dentro de estos poros

incrementando la cantidad de intercambiador

de superficie.

Supresor es de iones: La

cromatografía iónica tardó en

desarrollarse debido a la falta de un

buen sistema de detección. La

elección evidente es un detector

conductimétrico. El problema es

debido a la elevada concentración

iónica necesaria para eluir a la

mayoría de los iones en un tiempo

razonable. Ello hace que la

conductibilidad de la propia fase móvil

sea muy elevada haciendo muy difícil

la detección de pequeñas

concentraciones de analito. Este

problema se resolvió mediante un

sistema supresor de conductibilidad

colocado a la salida de la columna

cromatográfica. Los primeros

supresores fueron columna de intercambio iónico

que convierten los iones del disolvente en

especies moleculares poco ionizadas y por lo tanto

poco conductoras. Así, por ejemplo, cuando se

separan cationes es frecuente emplear una

8

disolución de HCl como eluyente. La columna

supresora es anionica y contiene iones OH-. Al

paso de la fase móvil por la columna supresora

los Cl- son intercambiados por iones OH

-. De este

modo se ha sustituido el HCl muy conductor por

H2O poco conductora. En la separación de iones

es frecuente usar HCO3Na y CO3Na2 en la fase

móvil. La columna supresora es en este caso

catiónica. De este modo el Na+ es sustituido por H

+

formándose un electrolito débil como H2CO3.

Imagen 10. (A) Esquema del mecanismo de supresión

de iones. (B) Reacciones de supresión de iones.

RESULTADOS

El cromatograma es el resultado gráfico de la

cromatografía. En el caso de separación óptima, los

diferentes picos o manchas del cromatograma se

corresponden a los componentes de la mezcla

separada.

Imagen 11. Cromatograma. (A) Aniones. (B) Cationes.

La cromatografía iónica es una variante de la

cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Es un

método eficaz para la separación y determinación de

iones, basado en el uso de resinas de intercambio

iónico. Cuando una muestra iónica atraviesa estas

columnas, los iones presentes sufren una separación

debido a las diferentes retenciones que sufren al

interactuar con la fase fija de las columnas analíticas.

Una vez separada, la muestra pasa a través de un

detector (conductimétrico, amperométrico, UV, etc.)

donde se registra la señal obtenida respecto al tiempo

de retención. El resultado son los cromatogramas

donde la posición de los máximos nos indica el ión

presente (carácter Cualitativo) y su área nos indica la

cantidad existente de dicho ión (carácter

Cuantitativo)(6)

.

Imagen 12. El Servicio de

Análisis del ICB dispone

de un cromatógrafo iónico

Metrohm con columna

Metrosep A Supp 5 y

detector conductimétrico,

que se emplea en la

determinación de

fluoruros, cloruros, nitritos,

nitratos, bromuros fosfatos

y sulfatos.

A

B

A B

9 APLICACIONES

MEDICIÓN DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA

La diabetes mellitus(7)

es una condición metabólica de

incidencia creciente, caracterizada por disfunción en

la homeostasis de la glucosa, con hiperglicemia

crónica por inmunodeficiencia absoluta o relativa. La

enfermedad es progresiva y asociada con alto riesgo

de desarrollar compromiso vascular.

La determinación de los niveles de glucosa en sangre

y orina y de los cuerpos cetónicos en la orina

suministran una información muy útil para el

tratamiento diario de la diabetes. Sin embargo,

ninguno de estos tests facilita al paciente y al equipo

de cuidados médicos un valor representativo y

cuantitativo de la glicemia a lo largo del tiempo.

La determinación de las proteínas glicosiladas, sobre

todo de la hemoglobina y de las proteínas séricas, ha

añadido una nueva dimensión a la evaluación de la

glicemia. Mediante una simple medida, estos tests

permiten cuantificar los valores de la glicemia media

durante semanas e incluso meses, complementando

los análisis que el paciente lleva a cabo día a día.

La hemoglobina(8)

es una proteína que se encuentra

en los glóbulos rojos de la sangre (hematíes) y sirve

para aprovisionar de oxígeno al resto de nuestras

células y tejidos. Esta proteína se une a la glucosa

circulante por el torrente sanguíneo. El porcentaje de

proteína unida a la glucosa es lo que se denomina

hemoglobina glicosilada (HbA1). Esto sucede también

en las personas sin diabetes. Cuanto mayor es la

cantidad de glucosa en la sangre, más se une a las

proteínas y su porcentaje de unión indica cual ha sido

la cantidad media de glucosa circulante durante el

tiempo de vida de la hemoglobina.

La HbA1 describe una serie de componentes estables

minoritarios de la hemoglobina que se forman

lentamente y sin intervención enzimática, a partir de

la hemoglobina y la glucosa. La velocidad de

formación de HbA1 es directamente proporcional al

nivel de glucosa en la sangre y al ciclo de vida de las

proteínas glicosiladas.

La hemoglobina es una de las proteínas de la sangre

que pueden glicosilarse en proporción a la

concentración de glucosa en plasma, dependiendo

solamente de la concentración de glucosa y del

tiempo de exposición celular a la misma. Como los

eritrocitos son fácilmente permeables a la glucosa, el

nivel de la HbA1 en una muestra de sangre facilita la

historia glicémica de los 120 días anteriores, que

corresponde a la vida media de estas células. En la

mujer en gestación, el estado de la glicemia se

relaciona con las últimas 4 semanas precedentes

debido al acelerado recambio de los eritrocitos.

La American Diabetes Association recomienda que el

objetivo de todo tratamiento debe ser un valor de la

HbA1 menor a 7% y que los médicos deben de

reevaluar cualquier régimen de tratamiento en el que

los valores sean consistentemente mayores de 8%.

Estos valores específicos de la HbA1 se refieren sólo

a los que han sido obtenidos por medios validados

frente al método de referencia(9)

.

HbA1c (%) Promedio de Glicemias (mg/dl)

Calificación

5-6 80-120 Excelente 6-7 120-150 Muy Bueno 7-8 150-180 Bueno 8-9 180-210 Regular

9-10 210-240 Problemático 10-11 240-270 Malo 11-12 270-300 Muy Malo

Tabla 1. La hemoglobina glicosilada (HbA1c) refleja la

concentración de la glucosa en los últimos 120 días. El

porcentaje de HbA1c se aumenta en proporción a las

cifras de glicemia que han precedido en las últimas 6-8

semanas. En general por cada 1% de aumento en la

HbA1c, evidencia un incremento en los promedios de

glicemia de aproximadamente 30mg/dl. Una HbA1c de

6% refleja un promedio de glicemia de 120mg/dl. Es

deseable que las personas con diabetes mantengan un

promedio de HbA1c inferior a 7%.

Existen varios métodos para la determinación de la

hemoglobina glicosilada, a manera informativa se

encuentran las pruebas inmunoquímicas, la

electroforesis, la cromatografía de afinidad al borato,

la cromatografía líquida de alta presión y la

cromatografía de intercambio iónico.

El método de cromatografía de intercambio iónico(10)

se basa en la elusión diferencial de la hemoglobina

glicosilada por el cambio de carga que se produce en

la molécula debido a la glicación del grupo amino

terminal de la cadena. Para realizar el procedimiento

se utiliza carboximetil celulosa cargada (-).

10

Imagen 13. Esquema de las variantes de hemoglobina

encontradas en el torrente sanguíneo; incluye el

porcentaje de HbA1 en estados “normales” en la sangre

para el control de la glicemia.

La hemoglobina adulta humana usualmente consiste

de HbA (97% del total), HbA2 (2,5%) y HbF (0,5%). El

análisis cromatográfico de la HbA identifica distintas

hemoglobinas menores llamadas HbA1a, HbA1b,

HbA1c, que colectivamente se denominan HbA1,

glicohemoglobinas o hemoglobinas glicadas.

La hemoglobina glicosilada A1c es el componente

mayoritario (80%) de la hemoglobina A1. La HbA1c

es el resultado de la condensación de la glucosa con

la valina N-terminal de la cadena β de la

hemoglobina. La incorporación de glucosa es un

proceso no enzimático e irreversible.

Imagen 14. La glucosa se una de las cadenas β de la

hemoglobina en el extremo Val terminal, transformando

la HbAo en HbA1c.

El valor de la HbA1c ha

mostrado su utilidad para

predecir el riesgo del desarrollo

de muchas de las

complicaciones crónicas de la

diabetes. La determinación de

la HbA1c debe ser realizada

rutinariamente en todos los

pacientes con diabetes, en

primer lugar para documentar el

grado de control glicémico al

inicio del tratamiento, y luego

como parte del mismo.

Para cada paciente individual,

la frecuencia de la

determinación de HbA1c

dependerá del régimen de

tratamiento utilizado y del

criterio del médico. En ausencia

de estudios bien controlados que sugieran un

protocolo definido, la opinión de los expertos es que

se deben practicar al menos dos determinaciones de

la hemoglobina glicosilada en los pacientes bien

controlados que se mantienen estables y al menos

cada tres meses en sujetos que no han alcanzado un

nivel de glicemia óptimo o en los que se ha

modificado el tratamiento.

Como cualquier otro parámetro, la hemoglobina

glicosilada puede resultar modificada por alteraciones

que varíen el natural recambio de los glóbulos rojos,

tales como por hemorragias, anemia hemolítica,

transfusiones, embarazos, etc., situaciones que

producirían falsos descensos. También se puede ver

alterada por la ingestión de dosis elevadas de ácido

acetil salicílico, vitamina C, alcohol, altas cifras de

lípidos en sangre, etc., que conducirían a falsos

aumentos.

La HbA1c puede valorar además el éxito del

tratamiento antidiabético; permite comparar y

comprobar la eficacia de nuevos tratamientos; nos

posibilita determinar la duración de la hiperglicemia y

a su vez individualizar los regímenes del control

antidiabético.

La hemoglobina glicosilada es muy importante, sin

embargo no puede sustituir al monitoreo de glicemias,

ya que ésta no puede medir su control diario y por lo

tanto no le permite ajustar sus dosis de

11 medicamentos orales, de insulina, de actividad física

o de ingesta de alimentos en el día a día.

DETERMINACIÓN DE PBG Y ALA EN ORINA

Las porfirias son un grupo de enfermedades de origen

genético o adquirido que tienen como característica

común una alteración en la actividad de una o varias

enzimas de la vía metabólica del grupo HEM, lo que

ocasiona niveles anormalmente elevados de

porfirinas o sus precursores (p. ej., ácido delta-

aminolevulínico [ALA] y porfobilinógeno [PBG]). Estos

se acumulan en los tejidos y se excretan en la orina y

las heces. Las manifestaciones patológicas son

producidas casi en su totalidad por los efectos sobre

el sistema nervioso y la piel(11)

.

Imagen 15. Estructuras químicas del Aminolevulinato y

del porfobilinógeno.

Las variedades de porfiria que presentan

sobreproducción de los precursores de las porfirinas -

ácido delta aminolevulínico (ALA) y porfobilinógeno

(PBG)- suelen presentar crisis agudas, las que

pueden ser muy graves y causa de muerte. Estas

crisis se caracterizan por síntomas digestivos (dolor

cólico, vómitos, estreñimiento), neuropsíquicos

(paresias, parestesias, parálisis, confusión, depresión,

alucinaciones y psicosis), cardiovasculares

(taquicardia e hipertensión) y otros (secreción

inadecuada de la hormona antidiurética, intolerancia a

la glucosa, alteración de los niveles de la hormona del

crecimiento e hipercolesterolemia). Su patogenia ha

sido explicada en parte por un efecto neurotóxico del

ALA y PBG, y por un déficit del grupo HEM(12)

.

Los pacientes con variedades de porfirias que

presentan producción aumentada de porfirinas

manifiestan fotosensibilidad debido a la activación de

estos compuestos por acción de la luz UV. Las

alteraciones cutáneas se caracterizan por eritema y

ampollas, que al mejorar dejan cicatrices hiper o

hipopigmentadas.

La Porfiria Intermitente Aguda (PAI) es una de las

más comunes y severas de las porfirias heredadas.

Es un desorden autosómico dominante, que causa

deficiencia parcial de la actividad de la

porfobilinógeno desaminasa (PBGD), tercera enzima

de la ruta de síntesis del grupo HEM.

Imagen 16. Signos de una crisis aguda de porfiria.

Cambio de Porfobilinógeno de coloración normal a

Uroporfiria I en la orina reposa.

Cuando los pacientes con PAI presentan una crisis

aguda, disminuye la actividad de la PBGD y, como

consecuencia los niveles de Porfobilinógeno (BPG)

y/o Ácido 5- Aminolevulónico (ALA) en la orina se

incrementan significativamente. Por lo cual es

necesario contar con un método que cuantifique estos

precursores metabólicos para una pronta

confirmación del diagnóstico e inicio del tratamiento.

Durante la crisis aguda, el PBG urinario aumenta de

20 a 200 mg/día, cuyos valores de referencia son de

0-4 mg/día, y la excreción de ALA se eleva

aproximadamente a la mitad, 10-100 mg/día, cuando

sus valores de referencia son 0-7mg/día. El método

de Mauzerall-Granick y otros parecidos son los más

usados para la cuantificación de estos dos

precursores(13)

. Este método se basa en la técnica de

cromatografía de intercambio iónico, en la cual se

utilizan columnas con resinas aniónicas y catiónicas.

El PBG se queda retenido en la aniónica y el ALA en

la catiónica. En la columna con PBG, se utiliza ácido

12 acético 1M para que éste eluya y pueda ser

cuantificado. En la columna con ALA, se le agrega

acetato de sodio 1M para que éste eluya y sea

cuantificado. Luego, el eluido de cada columna

reacciona con Reactivo de Ehrlich, formando un

producto rojo intenso. Este reactivo está conformado

por 4-dimetilbenceno diluido en ácido acético y ácido

perclórico. El producto es medido

espectrofotométricamente a 553 nm, y a partir de esta

medición se puede calcular la concentración de estos

intermediarios.

En casos de intoxicación por plomo pueden

detectarse concentraciones de ALA elevadas en orina

también, ya que el plomo puede bloquear la vía

metabólica en la que interviene el ALA. Por lo tanto, la

determinación conjunta de ALA y PBG permite

diferenciar las porfirias de la intoxicación por

plomo(14)

.

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS

NUCLEICOS

La cromatografía de intercambio iónico es el método

más utilizado para la separación de ácidos nucleicos.

Un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se

unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados

positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar el

pH del tampón (tampón de elusión) ya que los iones

del tampón de elusión interaccionan con los grupos

cargados del ácido nucleico o del intercambiador

iónico. Primero fluirán de la columna las moléculas

cargadas positivamente que no se unen a la fase

estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de

elusión, eluiran las moléculas con poca carga

negativa neta y luego las de mayor carga negativa

neta(15)

.

Actualmente se utilizan dos tipos de intercambiadores

aniónicos(16)

: el metilaminoetanol (MAE) o el

dietilaminoetil (DEAE). La unión del ADN (cargado

negativamente) depende principalmente del

componente estérico de los grupos funcionales y de

la afinidad del intercambiador aniónico por el

respectivo ácido nucleico; puesto que el grupo MAE

es menos voluminoso y más hidrofílico que el DEAE,

la unión de los ácidos nucleicos a los primeros es

más efectiva que a los segundos.

Una modificación de este método es la extracción en

fase sólida, en la que se utiliza una matriz

intercambiadora de aniones empaquetada en

columnas de polipropileno. La unión se produce bajo

condiciones de baja salinidad y durante los pasos de

lavado y elusión se va incrementando la

concentración de sales en los tampones

correspondientes. Las impurezas se eliminan debido

a su diferente capacidad de unión y se obtiene una

rápida y eficiente purificación de los ácidos nucleicos

(ADN y/o ARN). Al final los ácidos nucleicos se eluyen

con un tampón de máxima salinidad. Por último, se

precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos

los restos de impurezas, finalmente, se reconstituye el

ADN de elevada pureza en un tampón de baja

salinidad para su posterior utilización o

almacenamiento.

Debido a la elevada pureza del ADN obtenido con

esta tecnología, la principal aplicación de esta

cromatografía es la purificación de ADN plasmídico

para transfección (introducción de material genético

externo en células eucariotas mediante plásmidos).

Esta técnica incluye un pretratamiento de la muestra

que consiste en una lisis bacteriana en condiciones

alcalinas que ocasiona una desnaturalización del

ADN cromosómico y plasmídico. Antes de la

introducción de la muestra en la columna se trata con

acetato potásico, lo que ocasiona que el ADN

cromosómico precipite junto con el resto de

componentes de la muestra, mientras que el ADN

plasmídico se renaturaliza y permanece en disolución.

OTRAS APLICACIONES

Purificación de agua

Purificación del fibrinógeno de la leche

Determinación de anticonvulsantes en el suero

después de la extracción de la fase sólida.

Análisis de antibióticos de poliéter

Determinación de pesticidas.

Identificación de ácidos orgánicos en la fruta y en el jugo.

Detección de derivación-fluorescencia post-columna para análisis para varios tipos de pesticidas agrícolas .

Determinación de metabolitos de Triptofan en el suero umbilical.

13 CONCLUSIÓN

La cromatografía de intercambio iónico, también

llamada cromatografía iónica o cromatografía del ión,

es una técnica que permite la separación de iones y

moléculas polares basada en las propiedades de

carga de las moléculas. Puede ser usada en casi

cualquier tipo de molécula con carga. La solución que

debe inyectarse es llamada "muestra" y los

componentes separados individualmente; “analitos”.

El intercambio iónico es el intercambio reversible y

estequiométrico de iones entre una fase sólida y una

fase líquida. Si nos interesa separar analitos

catiónicos se utiliza una fase estacionaria que

contenga sitios activos negativos, los cuales deberán

encontrarse unidos a algún catión que mantenga la

electroneutralidad. Este catión deberá ser desplazado

por el analito para establecer el equilibrio y unirse al

sitio aniónico de la fase estacionaria. De manera

análoga, para separar aniones se utilizan fases

estacionarias con cargas fijas positivas que se

encontrarán unidas a algún anión encargado de

mantener la electroneutralidad, y que será

desplazado por el analito para el establecimiento del

equilibrio.

Diversos factores como el pH, cargas, gradiente y

porosidad afectan el tiempo que un compuesto

demora en eluir de la columna (tiempo de retención).

Los resultados se muestran en un cromatograma, que

es una representación gráfica de los resultados

obtenidos; en el caso de separación óptima, los

diferentes picos o manchas del cromatograma se

corresponden a los componentes de la mezcla

separada.

Este tipo de cromatografía presenta diversas

aplicaciones, en este informe se mecionaron la

determinación de la hemoglobina glicosilada,

determinación de PBG y ALA en orina y separación

de ácidos nucleicos, pero su uso no termina allí, ya

que hay numerosos usos más, como por ejemplo,

análisis de proteínas en la industria alimenticia con

valor nutricional, y en la purificación del agua; así

como también a lo largo de la historia cobró

relevancia en el Proyecto Manhattan durante la

segunda guerra mundial para la fabricación de la

bomba atómica.

BIBLIOGRAFÍA

(1) http://www.textoscientificos.com/quimica/cromato

grafia

(2) Harris, Daniel C. “Análisis Químico Cuantitativo”,

3ª Edición, Editorial Reverté. (Página 641).

(3) Freifelder, D. “Técnicas de Bioquímica y Biología

Molecular”, Editorial Reverté. (Página 217).

(4) http://www.mnstate.edu/provost/IonExchangeProt

ocol.pdf

(5) http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivo

s/Quimica%20analitica%20ambiental/Tema6.pdf

(6) http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/

class/08_chrom.pdf

(7) Costanzo, Linda S. “Fisiología”, 2000, McGraw-

Hill, México. (Página 416).

(8) http://www.diabetesalinstante.com/index.php?id=

7

(9) Hernández Ventura, Jaime Roberto. “Importancia

de la Hemoglobina Glicosilada”, SlideShare.net

(Documento Power Point).

(10) “Hemoglobina Glicosilada, el marcador de la

diabetes”. Diagnostics Roche. (Folleto

informativo)

(11) http://manualmerck.tripod.com/MMCap14.htm (12) http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S0212-

71992003000600012&script=sci_arttext

(13) http://www.aebm.org/formacion%20distancia/dist

ancia%202007-2008/taller/monografias/3.-

%20PORFIRIAS.pdf

(14) http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos/CROM

ATOGRAFIA/11017c.pdf

(15) http://interware.org/labeutm2006/wp-

content/uploads/2007/09/practico-eutm.doc

(16) http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluci

ones-QPCR-protocolos.pdf

**** Voet, Donald; Voet, Judith. “Bioquímica” 3a

Edición 2006

**** Texto base guía para todo el desarrollo y

entendimiento de la investigación sobre cromatografía

de intercambio iónico.