Influenza delle condizioni operative nella produzione di ...
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Influenza delle condizioni operative nella produzione di liposomi Luca Ivan Vicinanza Influenza delle condizioni operative nella produzione di liposomi Luca Ivan Vicinanza
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Influenza delle condizioni operative
nella produzione di liposomi
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Luca Ivan Vicinanza
UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SALERNO
Dipartimento di Ingegneria Industriale Corso di Laurea in Ingegneria Chimica
Influenza delle condizioni operative nella produzione di liposomi
Tesi in Principi di Ingegneria Chimica
Relatori: Candidato:
Prof. Ing. Gaetano Lamberti Luca Ivan Vicinanza
Ing. Sara Cascone Matricola 0612201724
Ing. Annalisa Dalmoro
Anno Accademico 2017/2018
A me!
Questo testo è stato stampato in proprio, in Times New Roman
La data prevista per la discussione della tesi è il 20/12/18 Fisciano, 12/12/2018
Sommario
Sommario .............................................................................. I
Indice delle figure ............................................................... V
Indice delle tabelle ............................................................ IX
Abstract .............................................................................. XI
Introduzione ........................................................................ 1
1.1 Definizione di liposoma: struttura e proprietà ___________ 2
1.2 Classificazione dei liposomi ________________________ 5
1.3 Modifiche indotte nei liposomi ______________________ 6
1.4 Stato dell’arte____________________________________ 7
1.5 Obiettivi ________________________________________ 9
Materiali, apparecchiature e metodi ............................... 11
2.1 Materiali ______________________________________ 12
2.1.1 Fosfatidilcolina 12
2.1.2 Solventi 12
2.2 Apparecchiature _________________________________ 13
2.2.1 Impianto per la produzione di liposomi 13 2.2.2 Turbidimetro 14
2.2.3 Nano Zetasizer 15
[I]
Pag. II Produzione di liposomi Luca Ivan Vicinanza
2.2.4 Master Sizer 17
2.3 Metodi ________________________________________ 18
2.3.1 Progettazione esperimenti tramite DOE 18
2.3.2 Caratterizzazione dei sistemi liposomiali 20
2.3.3 Funzioni di distribuzione delle dimensioni 22
Risultati e discussione ....................................................... 253.1 Distribuzioni dimensionali _________________________ 26
3.1.1 Concentrazione 1 mg/mL PC in etanolo 26
RUN1 ..................................................................................... 26
RUN3 ..................................................................................... 31
RUN4 ..................................................................................... 33
RUN5 ..................................................................................... 35 3.1.2 Concentrazione 10 mg/mL PC in etanolo 37
RUN6 ..................................................................................... 37
RUN7 ..................................................................................... 39
RUN8 ..................................................................................... 41
RUN9 ..................................................................................... 43
RUN10 ................................................................................... 45 3.1.3 Concentrazione 50 mg/mL PC in etanolo 47
RUN11 ................................................................................... 47
RUN12 ................................................................................... 50
RUN13 ................................................................................... 52
RUN14 ................................................................................... 53
RUN15 ................................................................................... 55
3.2 Discussioni _____________________________________ 57
3.2.1 Torbidità campioni 57
3.2.2 Dimensioni dei liposomi 58
3.3 Confronti ______________________________________ 61
Conclusioni ......................................................................... 63
Sommario e indici. Pag. III
4.1 Conclusioni ____________________________________ 64
Bibliografia ........................................................................ 67
Pag. IV Produzione di liposomi Luca Ivan Vicinanza
Sommario e indici. Pag. V
Indice delle figure
Figura 1. Struttura di un fosfolipide, la fosfatidilcolina [2]. ....................................... 2
Figura 2. Struttura del liposoma e possibili collocazioni delle molecole attive al suo interno [2]. ............................................................................................................ 3
Figura 3. Meccanismo di rilascio [2]. ......................................................................... 4
Figura 4. Classificazione dei liposomi in base a lamellarità e dimensioni [2]. ........... 6
Figura 5. Immagine Impianto studio Pradhan et al [6]. .............................................. 8
Figura 6. Fotografia impianto simil-microfluidico. .................................................. 13
Figura 7. Schematizzazione dell’intersezione dei flussi. .......................................... 14 Figura 8. Diffrazione della luce sulle particelle [9]. ................................................. 17
Figura 9. Struttura del modello Box-Behnken. ......................................................... 19
Figura 10. Trasformazione da distribuzione volumetrica a distribuzione numerica. .................................................................................................................. 24
Figura 11. Distribuzione numerica RUN1. ............................................................... 26 Figura 12. Distribuzione volumetrica RUN1. ........................................................... 27
Figura 13. Immagine campione RUN1. .................................................................... 28
Figura 14. Distribuzione numerica RUN2. ............................................................... 29
Figura 15. Distribuzione volumetrica RUN2. ........................................................... 29
Figura 16. Immagine campione RUN2. .................................................................... 30
Figura 17. Distribuzione numerica RUN3. ............................................................... 31 Figura 18. Distribuzione volumetrica RUN3. ........................................................... 31
Figura 19. Immagine campione RUN3. .................................................................... 32
Figura 20. Distribuzione numerica RUN4. ............................................................... 33
Figura 21. Distribuzione volumetrica RUN4. ........................................................... 33
Figura 22. Immagine campione RUN4. .................................................................... 34
Figura 23. Distribuzione numerica RUN5. ............................................................... 35
Pag. VI Produzione di liposomi Luca Ivan Vicinanza
Figura 24. Distribuzione volumetrica RUN5. ........................................................... 35
Figura 25. Immagine campione RUN5. .................................................................... 36
Figura 26. Distribuzione numerica RUN6. ............................................................... 37
Figura 27. Distribuzione volumetrica RUN6. ........................................................... 37
Figura 28. Immagine campione RUN6. .................................................................... 38 Figura 29. Distribuzione numerica RUN7. ............................................................... 39
Figura 30. Distribuzione volumetrica RUN7. ........................................................... 39
Figura 31. Immagine campione RUN7. .................................................................... 40
Figura 32. Distribuzione numerica RUN8. ............................................................... 41
Figura 33. Distribuzione volumetrica RUN8. ........................................................... 41
Figura 34. Immagine campione RUN8. .................................................................... 42 Figura 35. Distribuzione numerica RUN9. ............................................................... 43
Figura 36. Distribuzione volumetrica RUN9. ........................................................... 43
Figura 37. Immagine campione RUN9. .................................................................... 44
Figura 38. Distribuzione numerica RUN10. ............................................................. 45
Figura 39. Distribuzione volumetrica RUN10. ......................................................... 45 Figura 40. Immagine campione RUN10. .................................................................. 46
Figura 41. Distribuzione numerica RUN11. ............................................................. 48
Figura 42. Distribuzione volumetrica RUN11. ......................................................... 48
Figura 43. Immagine campione RUN11. .................................................................. 49
Figura 44. Distribuzione numerica RUN12. ............................................................. 50
Figura 45. Distribuzione volumetrica RUN12. ......................................................... 50 Figura 46. Immagine campione RUN12. .................................................................. 51
Figura 47. Distribuzione numerica RUN13. ............................................................. 52
Figura 48. Distribuzione volumetrica RUN13. ......................................................... 52
Figura 49. Distribuzione numerica RUN14. ............................................................. 53
Figura 50. Distribuzione volumetrica RUN14. ......................................................... 54
Figura 51. Immagine campione RUN14. .................................................................. 54 Figura 52. Distribuzione numerica RUN15. ............................................................. 55
Figura 53. Distribuzione volumetrica RUN15. ......................................................... 55
Figura 54. Immagine campione RUN15. .................................................................. 56
Figura 55. Andamento torbidità vs concentrazione finale. ....................................... 57
Sommario e indici. Pag. VII
Figura 56. Diametri medi risultanti sulla struttura Box-Behnken. ............................ 59
Pag. VIII Produzione di liposomi Luca Ivan Vicinanza
Sommario e indici. Pag. IX
Indice delle tabelle
Tabella 1. Composizione della L- α-fosfatidilcolina. ............................................... 12
Tabella 2. Valore dei livelli di variazione dei parametri. .......................................... 18 Tabella 3. Tabella delle condizioni operative degli esperimenti. .............................. 20
Tabella 4. Tabella con i valori salienti RUN1. .......................................................... 28
Tabella 5. Tabella con i valori salienti RUN2. .......................................................... 30
Tabella 6. Tabella con i valori salienti RUN3. .......................................................... 32
Tabella 7. Tabella con i valori salienti RUN4. .......................................................... 34
Tabella 8. Tabella con i valori salienti RUN5. .......................................................... 36 Tabella 9. Tabella con i valori salienti RUN6. .......................................................... 38
Tabella 10. Tabella con i valori salienti RUN7. ........................................................ 40
Tabella 11. Tabella con i valori salienti RUN8. ........................................................ 42
Tabella 12. Tabella con i valori salienti RUN9. ........................................................ 44
Tabella 13. Tabella con i valori salienti RUN10. ...................................................... 46 Tabella 14. Tabella con i valori salienti RUN12. ...................................................... 51
Tabella 15. Tabella con i valori salienti RUN13. ...................................................... 53
Tabella 16. Tabella con i valori salienti RUN14. ...................................................... 54
Tabella 17. Tabella con i valori salienti RUN15. ...................................................... 56
Tabella 18. Tabella con i valori di rilievo di tutta sperimentazione. ......................... 60
Pag. X Produzione di liposomi Luca Ivan Vicinanza
Abstract
Liposomes are phospholipid vesicles, which in the last decades attracted a lot of interest in pharmaceutical field, as carriers of drug and active molecules, being biocompatible and selective towards the target organ for which they were designed.
The aim of this thesis is to evaluate the influence of operative parameters in the liposomes production process, through a microfluidic-like plant system, realized by the Transport Phenomena and Process group, on their final dimension. The plant is composed of: two peristaltic pumps connected to the corresponding power suppliers, two silicone tubes and a needle which creates the crossing section between the deionized water flow and the alcohol solution flow. Compared to other methods of liposome production, this method is simpler, faster and cheaper and has the potential to be reproduced on large scale.
The operative variables taken in account in this work are the lipid concentration (phosphatidylcholine) in the alcoholic solution (C), the ratio between alcoholic solution flow and hydrating solvent flow (R), and the diameter of the needle used to guarantee the interdiffusion within the plant (D); each variable has been changed on 3 levels (-1, 0, +1). To achieve this goal an experimental design was created to allow to study most of the combinations of the variables with the least number of experiments. The type of Design of Experiment chosen was Box Behnken, thanks to which from an initial number of 27 experiments, it led to only 15 experiments per batch, almost halving the experimental work necessary to investigate any existing correlations. Through the combinations of the parameters in the experiments carried out it was possible to understand the effective influence of each variable and also its relative weight. For the characterization of the liposomal systems produced, three instruments
[XI]
Pag. XII Produzione di liposomi Luca Ivan Vicinanza
were used: a turbidimeter to evaluate the turbidity, and two devices for the determination of dimensional distributions: the nano zetasizer and the master sizer.
From the results it emerged that the variable with the greatest influence is the ratio between flow rates (which is the real rudder of this experimentation). Even for the concentration of the solution it was possible to identify an influence, albeit minimal, while for the third variable, the diameter of the needle, it was discovered that is present a negligible dependency. Having evaluated the trend of the average particle diameter with the selected variables, it is at least possible to guess what order of magnitude will be the particles produced by setting the 3 parameters C, D, R, in the field of analysis used in this thesis. It can be concluded that is possible to produce liposomes with the desired diameter simply by conveniently tuning the 3 selected parameters, ratio between flows, concentration of the alcoholic solution and diameter of the needle. For future experiments is advisable to neglect the variable D, in favour of a more detailed analysis of the other two, perhaps also aimed to identifying a correlation of the first two with the average diameter, in such a way as to be predictive of the final average value.
Bibliografia
1. F. Recupido, Produzioni di nanoliposomi per applicazioni nutraceutiche mediante un approccio simil-microfluidico, Tesi in Trasport Phenomena in Food Processes (Anno Accademico 2015/2016)
2. https://www.my-personaltrainer.it/fisiologia/liposomi.html
3. A. Akbarzadeh et al., Liposome: classification, preparation, and applications, Nanoscale Research Letters, 8, 102-111 (2013)
4. M.R. Mozafari, Liposomes: an overview of manufacturing techniques, Cellular & Molecular Biology Letters, 10, 711-719 (2005)
5. L.A. Meure et al., Conventional and dense gas techniques for the production of liposomes: a review, AAPS PharmSciTech, 9, (3) 798-809 (2008)
6. P. Pradhan et al., Analysis and methylcellulose: powders, gels and matrix tablets, Anticancer Research 28, 943-948 (2008)
7. https://www.sigmaaldrich.com/Graphics/COfAInfo/fluka/pdf/PDF548388.pdf
8. http://www.pce-italia.it/html/dati-tecnici-1/turbidimetro-pce-tum20.htm
9. https://www.malvernpanalytical.com/en/products/product-range/mastersizer-range/mastersizer-3000
10. M. Collado-Fernàndez et al., Evaluation of turbidity: correlation between Kerstez turbidimeter and nephelometric turbidimeter, Analytical, Nutritional and Clinical Methods Section, 71, 563-566 (2000)
Ringraziamenti In primis, grazie al Professor Lamberti per avermi concesso l’opportunità di far parte del gruppo TPP, che negli ultimi mesi si è rivelato una grande famiglia. Grazie alle mie correlatrici Sara e Annalisa che mi hanno guidato in questo cammino, con pazienza e passione, insegnandomi ogni giorno qualcosa di nuovo. Grazie a Diego per avermi assistito nei momenti di difficoltà. Grazie ai ragazzi del laboratorio T5 per aver condiviso con me questo percorso, rendendolo meno arduo, e per aver creato un ambiente piacevole in cui lavorare e al contempo divertirsi. Grazie soprattutto per avermi aperto la porta ogni giorno. Grazie alla mia famiglia, non semplicemente per essermi stata sempre vicino, ma per aver fatto di me l’uomo che sono, con tutti i difetti e pregi del caso. Avete fatto davvero un ottimo lavoro, complimenti! Grazie a Valentina, la mia metà, per aver condiviso con me questo percorso dal primo giorno (in realtà dal terzo, ho fatto tardi), fino alla sua fine, oggi (giorno 1192). È stato un piacere condividere con te gioie, sofferenze, ansie, sofferenze, pause pranzo e anche qualche sofferenza. Grazie davvero. Grazie a Cosimo, Antonella e tutti i compagni di avventura conosciuti 3 anni orsono, che da colleghi sono diventati prima conoscenti e poi amici. È stato un piacere condividere con voi tutto questo. IUPAC. Grazie a Luis Sal per avermi influenzato con il suo movimento artistico/culturale/sociale e avermi reso una persona migliore. “Che io possa avere la forza di cambiare le cose che posso cambiare, che io possa avere la pazienza di accettare le cose che non posso cambiare, che io possa avere soprattutto l’intelligenza di saperle distinguere.” [Tommaso Moro] A buon intenditor…
