XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁNNHIỄM INFLUENZA A/H1N1 (2009)

TS BS Nguyễn Văn Vĩnh ChâuBệnh viện Bệnh Nhiệt Đới

2

Thaønh coâng cuûa chaån ñoaùn virus Influenza phuï thuoäc raát nhieàu vaøo

Thôøi ñieåm laáy beänh phaåm (3 ngaøy ñaàu sau khôûi beänh)

Chaát löôïng cuûa beänh phaåm (kyõ thuaät laáy beänh phaåm)

Ñieàu kieän baûo quaûn vaø vaän chuyeån beänh phaåm

(Viruùt naèm trong teá baøo bieåu moâ ñöôøng hoâ haáp)

Chuù yù tuaân thuû caùc quy taéc veà an toaøn sinh hoïc (biosafety)

laáy beänh phaåm (ngöôøi thuïc hieän, trang phuïc)

vaän chuyeån beänh phaåm (thieát bò & phöông tieän vaän chuyeån)

Nguyeân taéc laáy beänh phaåmNguyeân taéc laáy beänh phaåm

3

Beänh phaåm ñöôøng hoâ haáp TREÂN Pheát muõi.Pheát haàu hoïng. Dòch tî haàu.Dòch röûa muõi.Dòch suùc hoïng.

Beänh phaåm ñöôøng hoâ haáp DÖÔÙI Dòch pheá quaûn. Dòch pheá nang.

Huyeát thanh Giai ñoaïn caápGiai ñoaïn hoài phuïc

Loaïi beänh phaåmLoaïi beänh phaåm

4

Beänh phaåm ñöôøng hoâ haápQue caùn nhöïa ñaàu coù boâng sôïi toång hôïp (khoâng duøng que caùn tre hoaëc goã)Duïng cuï laáy dòch khí pheá quaûnMoâi tröôøng vaän chuyeån virus (1-2mL) chöùa trong loï coù naép vaën, baûo quaûnôû nhiệt độ –20oC (chæ coù theå baûo quaûn ôû 4oC trong 1 – 2 ngaøy)

nöôùc muoái sinh lyù, moâi tröôøng nuoâi teá baøo (MEM), canh thang trytose -phosphat, canh thang beâ, ñeäm sucrose - phosphat..Moâi tröôøng chöùa BSA; khaùng sinh (Penicillin G (2x106 U/L), Streptomycin (200 mg/L), Polymixin B (2x106 U/L), Gentamycin (250 mg/L), nystatin (0.5x106

U/L), Ofloxacin HCl (60mg/L), sulfamethoxazole (0.2g/L).

Huyeát thanh Duïng cuï laáy maùu tónh maïchTube nhöïa khoâng coù chaát choáng ñoâng coù naép vaën

Trang bò caàn thieát ñeå laáy beänh phaåmTrang bò caàn thieát ñeå laáy beänh phaåm

5

6

Pheát muõiLuoàn que boâng vaøo 1 loã muõi, ñöa song song vôùi voømmuõi vaøo saâu ñeán khi bò khaùng trôû, ñeå yeân vaøi giaây roài ruùtra töø töø ñoàng thôøi xoay troøn que chaø saùt cuoán muõi.Caû 2 loã muõi coù theå ñöôïc laáy baèng cuøng 1 que boâng.Caét phaàn ñaàu boâng ñaõ pheát muõi cho vaøo loï chöùa moâitröôøng chuyeân chôû virus, vaën kín naép.

Pheát hoïngLuoàn que boâng vaøo ngoaùy thaønh sau hoïng vaø 2 beânvuøng amiñan, traùnh chaïm vaøo ñaùy löôõi. Caét phaàn ñaàu boâng ñaõ pheát hoïng cho vaøo loï chöùa moâitröôøng chuyeân chôû virus, vaën kín naép.

Phöông phaùp laáy beänh phaåmPhöông phaùp laáy beänh phaåm

7

Dòch hoïng muõi (pharyngeal nasal fluid)Söû duïng bình huùt dòch hoïng muõi.cho vaøo loï chöùa moâi tröôøng chuyeân chôû virus, vaën kín naépÑaây laø loaïi beänh phaåm cho keát quaû nhaïy hôn hôn pheát hoïng / pheát muõi

Dòch khí pheá quaûn (beänh nhaân coù ñaët noäi khí quaûn)Söû duïng bình huùt dòch röõa ñöôøng hoâ haápcho vaøo loï chöùa moâi tröôøng chuyeân chôû virus, vaën kín naép.Laø beänh phaåm cho ñoä nhaïy cao nhaát

Maãu huyeát thanhLaáy 3-5mL maùu tónh maïch cho vaøo loï khoâng coù choáng ñoâng.Phaûi laáy maùu keùp: maùu 1 laáy caøng sôùm caøng toát, maùu 2 laáy caùch 14 – 21 ngaøy.

Phöông phaùp laáy beänh phaåmPhöông phaùp laáy beänh phaåm

8

Beänh phaåm hoâ haáp:

Duøng khaên giaáy hoaëc giaáy veä sinh quaán quanh töøngoáng hoaëc loï BP, Ñaët loï Bp trong 1 tuùi nylon (2 lôùp), buoäc (coät) chaëtbaèng 2 sôïi daây thun khoanh, Cho vaøo 1 hoäp cöùng ñeå traùnh beå vôõ. Caùc que boâng phaûi ñaët trong moâi tröôøng chuyeân chôûvi ruùt, caùc oáng BP luoân luoân phaûi ñaët ñöùng thaúng. Vaän chuyeån BP ngay laäp töùc ñeán phoøng thí nghieämtrong 4oC (phích laïnh).

Coù theå baûo quaûn taïm trong tuû laïnh 4oC trong voøng 48 giôø tröôùc khi chuyeån beänh phaåm ñeán phoøng XN. Neáu caàn baûo quaûn laâu hôn phaûi ñeå ôû –70oC. Chuù yùtraùnh quaù trình ñoâng laïnh/raû ñoâng nhieàu laàn.Khi vaän chuyeån beänh phaåm chuù yù caùc nguyeân taéc an toaøn khi vaän chuyeån beänh phaåm coù khaû naêng laâynhieãm.

Baûo quaûn & vaän chuyeån beänh phaåmBaûo quaûn & vaän chuyeån beänh phaåm

9

Huyeát thanh Sau khi quay ly taâm taùch huyeát thanh coù theå baûo quaûn taïm trong tuûlaïnh 4oC trong voøng 1 tuaàn tröôùc khi chuyeån beänh phaåm ñeán phoøngXN.Neáu khoâng coù ñieàu kieän ly taâm coù theå ñeå trong tuû laïnh 4oC trongvoøng 24 giôø tröôùc khi chuyeån beänh phaåm ñeán phoøng XN baèng tuùinöôùc ñaù.Neáu caàn baûo quaûn huyeát thanh laâu hôn phaûi ñeå ôû -20oC. Khi vaän chuyeån beänh phaåm chuù yù caùc nguyeân taéc an toaøn toång quaùtkhi vaän chuyeån beänh phaåm maùu.

Baûo quaûn & vaän chuyeån beänh phaåmBaûo quaûn & vaän chuyeån beänh phaåm

10

Tuaân thuû tuyeät ñoái quy taéc veà an toaøn sinh hoïc (biosafety)

Söû lyù moïi beänh phaåm nghi coù lieân quan ñeán vieâm phoåi do virus Influenza A/H5, H1_2009 trong:

Class I / II biological safety cabinets

Khi caàn nuoâi caáy virus Influenza A/H5, H1_2009 :

Phoøng BSL3 (Biosafety Level 3 Lab)

Nguyeân taéc söû lyù beänh phaåmNguyeân taéc söû lyù beänh phaåm

11

Kyõ thuaät xeùt nghieäm chaån ñoaùn Influenza A/H1N1/2009

Kyõ thuaät xeùt nghieäm chaån ñoaùn Influenza A/H1N1/2009

12

Coù gì khaùc bieät giöõa virus Influenza A/H1N1 2009 vôùivirus A/H1N1 coå ñieån ?virus A/H5N1 (cuùm gia caàm) ?

13

ÑIEÅM CHUNG:virus Influenza A/H1N1 2009virus A/H1N1 coå ñieånvirus A/H5N1 (cuùm gia caàm)

Nhoùm cuùm A (type A)

14

Influenza virusType: A và B80-120 nmCác proteins:

PB1, PB2, PA (polymerase)HA: haemagglutininNA: neuraminidaseNP (nucleoprotein), M1, M2 (matrix)NS1, NS2: (nonstructural)

Phân nhóm theo 2 kháng nguyênH (hemagglutination): có 16 nhóm phụ (H1,2,3 gây bệnh ở người)N (neuraminidase) : có 9 nhóm phụ (N1 N2 gây bệnh ở người)

Ñaëc ñieåm virusÑaëc ñieåm virus

15

Influenza A virusesInfluenza A virusesInfluenza A viruses

M2 protein

RNA

Neuraminidase (N1-N9)

Hemagglutinin (H1-H16)

16

ÑIEÅM KHAÙC BIEÄT:virus Influenza A/H1N1 2009virus Influenza A/H1N1 coå ñieån

Cuøng phaân nhoùm H1 nhöngcoù caáu truùc di truyeàn khaùc bieät

Forward primer – Probe – Reverse primer

Human H1

Swine

H

17

Öu ñieåm: khaûo saùt ñöôïc ñaëc ñieåm virus, phaùt hieän taùc nhaân gaây beänh môùiKhoù khaên: ñoøi hoûi phöông tieän kyõ thuaät, thieát bò (BSL 3 ñoái vôùi H5N1, A/H1N1 2009)

Phaân laäp viruses baèng caùch caáy beänh phaåm vaøo phoâi gaø 10 ngaøy tuoåihoaëc moâi tröôøng teá baøo Madin-Darby Canine Kydney cells (MDCK)

Phaân laäpPhaân laäp

18

Test nhanh chæ cho bieát nhieãm cuùm AKhoâng cho bieát phaân tyùp (subtype H?)

Test nhanh tìm khaùng nguyeânTest nhanh tìm khaùng nguyeân

19

Giaù trò aùp duïng cuûa test nhanhGiaù trò aùp duïng cuûa test nhanh

Sensitivity (95%CI) Specificity

Swine A/H1N1/09 51% (35% – 67%) 99%

Seasonal A/H1N1 63% (39% - 82%) 99%

Seasonal A/H3N2 31% (14% - 57%) 99%

Ñaùnh giaù test nhanh QuickVue Influenza A+B (Quidel)Tieâu chuaån vaøng: CDC RT-PCRThöïc hieän töø 20/4 – 30/5/2009, the Naval Health Research Center

(Faix DJ, Sherman SS, Waterman SH. N Engl J Med. 2009 Jun 29)

20

Trình töï ñíchSôïi keùp DNA

Virus

Chuoãi xoaén keùp DNA

Kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû - PCRKyõ thuaät sinh hoïc phaân töû - PCR

21

22

Real time Multiplex rTPCR TaqMan (8 targets/specimen)

Quy trình chẩn đoaùn RT-PCR Influenza tại BVBNĐ Quy trình chẩn đoaùn RT-PCR Influenza tại BVBNĐ

Phết họng / mũi, dịch khí phế quảntrong môi trường vận chuyển virus

Influenza A(target: M gene)

serology

+ paired sera

Additional subtype-specific RT-PCRs

Reference labs

nuôi cấy & chẩn đóan PCR cáctác nhân gây bệnh hô hấp khác

Influenza B(target: M gene)

H1

Pos control = Human RNAs

H1_2009H3 H5 Swine A 2009(target: NP gene)

23

1. Phaùt hieän nhöõng tröôøng hôïp ñaàu tieân / giai ñoaïn dòch chöa lan trong coäng ñoàng.

2. Chaån ñoaùn beänh:Dòch teå hoïcLaâm saøng(phaûi ñöôïc caùch ly chôø keát quaû)

Khi naøo yeâu caàu laøm PCRKhi naøo yeâu caàu laøm PCR

24

Khoâng neân queân caùc xeùt nghieäm vi sinh loaïi tröø caùc nguyeânnhaân gaây nhieãm truøng hoâ haáp khaùc (caáy maùu, caáy ñaøm ñònhlöôïng, caáy dòch röõa khí pheá quaûn, phaùt hieän khaùng nguyeân cuûavieâm phoåi do pheá caàu, tìm vi truøng lao, v.v…)

Khi bieän luaän keát quaû luoân luoân phaûi phoái hôïp vôùi yeáu toá dòch teåhoïc vaø beänh caûnh laâm saøng tröôùc khi ñi ñeán keát luaän sau cuøng. Moät keát quaû PCR aâm tính khoâng loaïi tröø ñöôïc beänh.

Vaán ñeà khaùcVaán ñeà khaùc

25

TRÂN TRỌNG CẢM ƠN