INFLUENCIA DE LA GASTRINA
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INFLUENCIA DE LA GASTRINA
SOBRE LA RESPUESTA
INFLAMATORIA E INMUNE
TESIS DOCTORAL
WILFREDO ROMERO ALVARADO
Valencia, 2011
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La Dra. Sara Calatayud Romero y El Dr. Juan Vicente Esplugues Mota,
Catedráticos del Departamento de Farmacología de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Valencia,
HACEN CONSTAR:
Que el trabajo titulado: “Influencia de la gastrina sobre la respuesta inflamatoria e
inmune”, presentado por el Licdo. en Medicina Wilfredo Romero Alvarado para
obtener el grado de doctor, ha sido realizado en este departamento bajo nuestra
dirección.
Valencia, Marzo de 2011
Fdo. Dra. Sara Calatayud Romero Fdo. Dr. Juan Vicente Esplugues Mota
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Dedicado a:
Mi esposa, mi hijo,
MI padre, mi madre, mi hermana,
Mis amigos,
y DIOS todo poderoso.
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Esta tesis doctoral ha sido posible gracias a una beca conjunta de las fundaciones BANCAJA y Juan Esplugues de Valencia, España.
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AGRADECIMIENTOS
Con esta tesis doctoral veo cumplida una de las metas más importantes de mi vida,
y muchas personas han actuado a favor de la realización de esta meta.
Gracias a mis directores de tesis: Juan Vicente Esplugues y Sara Calatayud. Soy
verdaderamente afortunado por haber tenido no solo su guía profesional, sino
también su amistad y apoyo personal.
Juan Vicente: gracias por hacer posible que haya podido cumplir un sueño que veía
casi imposible, tienes la habilidad y calidad humana para producir un drástico giro
positivo en la vida de la mayoría de personas que tienes bajo tu cargo, y tu calidad
profesional y experiencia significan un apoyo importante para la labor investigativa.
Sara: no tengo palabras para agradecerte tu orientación diaria. Esta tesis ha
significado un gran esfuerzo también para ti. Gracias a tu alta calidad académica,
intuición científica y el tiempo que has dedicado en estos 3 años, he podido finalizar
mi tesis en un período tan breve de tiempo. Gracias por la paciencia que has tenido
para enseñarme desde lo más elemental en investigación básica considerando que,
debido a mi formación principalmente clínica, he tenido que partir casi de cero en el
aprendizaje de la metodología necesaria.
Agradezco encarecidamente a las fundaciones BANCAJA y Juan Esplugues
quienes me han proporcionado la beca para poder viajar a España y obtener mi
doctorado. La Fundación BANCAJA dirigida por José Luis Olivas promueve el
desarrollo social en los países que lo necesitan y gracias a esa política es que he
podido formarme en investigación biomédica. Gracias a Valentín Díez, Margarita
Montañés y Miguel Ángel Utrillas quienes se han portado tan receptivos con migo y
me han dado un trato tan cálido. A Don Juan Esplugues (Padre), con quien he
podido tener un trato tan cercano y quien ha estado tan pendiente no solo de que
tenga todo lo necesario, si no que se ha preocupado también por mi situación
personal y me ha aconsejado de forma tan sabia. Don Juan: valoro mucho sus
consejos y los tendré siempre presentes.
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A la Doctora María Isabel Rodríguez, que ha dejado una huella imborrable en las
personas que la han conocido fuera de nuestro país. Esa estela positiva abre
puertas a los que venimos detrás. Una de esas puertas me ha permitido viajar a
Valencia para obtener mi doctorado. Sus gestiones mientras fue rectora de la
Universidad de El Salvador han permitido los contactos necesarios.
A mi Universidad, que me ha apoyado en mi formación desde el principio.
Particularmente a Salvador Jaime, jefe del departamento de Fisiología y
Farmacología quien gracias a la promoción de la investigación en el departamento y
a través de facilitar las gestiones administrativas necesarias me ha apoyado para
completar mi formación. A Fátima de Zúniga, decana de la Facultad de Medicina y
Rufino Quezada Rector de la Universidad de el Salvador, sus políticas enfocadas
en la investigación y el desarrollo académico han hecho posible que haya realizado
esta tesis doctoral.
A mis compañeros de laboratorio. Cada uno me ha enseñado algo, un método, una
técnica, un conocimiento teórico, etc. Todo ello ha contribuido al desarrollo de esta
tesis, eso es muy importante pero sobre todo, recordaré siempre el cariño que me
han dado a mí y mi familia, cada uno en algún momento me ha inyectado ánimos y
palabras de aliento cuando lo he necesitado. Gracias Nade, Ana, Jackie, Haryes,
Carmen, Samu, Dany, Reme, Dolo, Yezabel, Annia, Victor, Milagros, Clara, Natalia,
Miri, Amparo, Chantal, Laura, Cris, Lara, Elena. Los quiero a todos muchísimo.
Un agradecimiento especial a la dirección y el personal del banco de sangre del
Hospital Clínico, quienes han colaborado proporcionándonos las muestras de
sangre necesarias.
A mi familia, que son el motor principal que me impulsa. A mi madre y mi padre que
me han apoyado toda mi vida y han inculcado en mí el deseo de hacer grandes
cosas, gracias por los sacrificios que han hecho para garantizarme siempre
educación. A mi hermana Jennifer que me ha dado su apoyo moral. A mi esposa
Irma y mi hijo Alfredito, que, cuando me he sentido agobiado, su sola presencia me
recarga de energías para levantarme y seguir; principalmente por ustedes hago lo
que hago, son la más grande bendición que DIOS me ha dado. Por último a DIOS,
que hace posibles todas las cosas.
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ABREVIATURAS
ARNm: Ácido ribonucleico mensajero.
CD: Cúmulo de diferenciación.
CCK: Colecistocinina.
CCK-1R: Receptor de Colecistocinina -1.
CCK-2R: Receptor de Colecistocinina -2.
DAG: Diacilglicerol.
EBM-2: “ Endothelial Cell Basal Medium-2” Medio basal para célula endotelial.
ECL: “ Enterochromaphin-like” Células tipo enterocromafín.
EEM: Error estándar de la media.
ERGE: Enfermedad por reflujo gastroesofágico.
FAK: “Focal Adhesion Kinases”, Quinasas de adhesión focal.
FBS: “Fetal bovine Serum” Suero fetal bovino.
FMLP: “ N-formyl-methionine- leucine-phenylalanine”, n-Formil-metionil-leucil-
fenilalanina.
GRP: “Gastrin releasing peptide”, Péptido neurotransmisor liberador de gastrina.
HBSS: “Hank Balanced Salted Solution”, Solución salina balanceada de Hank.
HUVEC: “Human Umbilical Vein Endothelial Cell”, Células endoteliales de vena
umbilical.
(H2O2): Peróxido de hidrógeno.
IBP: Inhibidor de bomba de protones.
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ICAM: “Inter-Cell Adhesion Molecule”, Molécula de adhesión intercelular.
IFN: Interferón.
IHQ: Inmunohistoquímica.
IL: Interleuquina.
iNOS: “Inducible Nitric Oxide Synthase”, Óxido nítrico sintasa inducible
i.p.: Intraperitoneal.
JAK-2: “Janus Kinases-2”, Janus quinasas-2.
JNK: “ c-Jun NH2-terminal Kinases”, Quinasas c-Jun NH2-terminal.
LMSP: Leucocitos mononucleares de sangre periférica.
LPS: Lipopolisacárido.
MAPK: “Mitogen-Activated Protein Kinases” Proteinquinasas activadas por
mitógeno.
MAT: Macrófagos asociados a tumor.
MCP-1: “Monocyte Chemotactic Protein-1”, Proteina quimiotáctica de monocitos-1.
M-CSF: “Macrophages-Colonies Stimulant Factor”, Factor estimulante de
colonias de macrófagos.
MF: Macrófagos.
NF-κB: “Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells” Factor
nuclear de transcripción de reforzador de inmunoglobulina kappa de célula B.
NK: “Natural Killer”, Células Asesinas Naturales.
(O2-): Ión superóxido.
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(-OH-): iones hidroxilo.
PAF: “Platelet-activating Factor”, Factor activador de plaquetas.
PC: Prohormona Convertasa.
PI3K: “Phosphatidylinositol 3-kinases”, Fosfatidil inositol-3 quinasas.
PKC: “ Protein kinases” C, Proteinquinasas C.
PLC: “Phospholipase C”, Fosfolipasa C.
PMA: “Phorbol 12-myristate 13-acetate”.
PMN: Polimorfonucleares.
PYK2: “Proline-rich Tyrosine Kinase 2”, Tirosina rica en prolina.
RIA: Radioinmunoanálisis.
ROS: “ Reactive oxygen species” , Especies reactivas de oxígeno.
RT-PCR: “ Reverse transcription polymerase chain reaction”, Reacción de cadena
de la polimerasa en transcripción reversa.
Src: “Src= Sarcoma”, Proteinquinasas inductoras de sarcoma.
STAT3: “Signal Transducer and Activator of Transcription-3”, Transductor de señal y
activador de la transcripción-3.
TGF-β: “Transforming Growth Factor- β”, Factor de crecimiento transformante-β.
Th 1y2: T “helper” 1 y 2.
TLR: “Toll like Receptor”, Receptor tipo “Toll”.
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TNF: “Tumoral Necrosis Factor”, Factor de necrosis tumoral.
UFC: Unidades fromadoras de colonias.
VCAM: “Vascular Adhesion Molecule”, Molécula de adhesión celular vascular.
v.o.: Vía oral.
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RESUMEN
La gastrina es una hormona digestiva cuya secreción se incrementa en pacientes
con gastritis crónica, generalmente debida a la infección por Helicobacter pylori. Se
ha observado también síntesis ectópica de gastrina en formaciones tumorales,
especialmente en el cáncer gástrico y colónico. Existen evidencias de que la
gastrina pueda modular la función de elementos clave en la respuesta inflamatoria /
inmunitaria, lo que, unido a su secreción anómala en circunstancias en las que
dicha respuesta juega un papel primordial, podría alterar el curso de las mismas.
Nos propusimos profundizar en la caracterización de las acciones pro-inflamatorias
de la gastrina y para ello, hemos analizado sus efectos sobre la interacción
leucocito-endotelio, caracterizado su diana celular, las moléculas de adhesión
implicadas y el tipo leucocitario principalmente afectado. A través de estudios de
microscopía intravital en ratas y de experimentos de interacción leucocito-endotelio
con células humanas in vitro, hemos demostrado que la gastrina induce dicha
interacción y que lo hace mediante la activación del receptor CCK-2 (CCK-2R) en
las células endoteliales, en las que incrementa la expresión de las moléculas de
adhesión P-selectina y VCAM-1. La sobreexpresión de esta última se debe a un
mecanismo transcripcional mediado por la fosfatidil inositol-3 quinasa (PI3K) y
probablemente también la Janus quinasa-2 (JAK-2). Hemos visto que la gastrina, si
bien no activa directamente los leucocitos circulantes, sus acciones sobre el
endotelio o sobre otras estructuras extravasculares, determinan la activación
específica de los leucocitos mononucleares.
Esta preponderancia de la célula mononuclear en nuestros hallazgos, unida a la
detección del receptor CCK-2 en los macrófagos de rata y humanos, nos llevaron al
estudio de los efectos de la gastrina sobre este tipo celular. Demostramos que la
estimulación de estos receptores provocaba activación macrofágica en forma de
liberación de radicales libres de oxígeno. Hemos analizado también la influencia de
la gastrina en macrófagos activados por elementos presentes en la inflamación
causada por Helicobacter pylori (citocinas Th1) o por citocinas antiinflamatorias (IL-
4, IL-10), más propias del ambiente tumoral. Hemos visto que en el primer caso, la
gastrina inhibe la expresión de elementos fundamentales en la presentación de
xv
antígenos y en la inducción de la respuesta Th1 linfocitaria (CD86, IL-12). En el
segundo caso, hemos obtenido respuestas complejas ya que la gastrina ha
provocado respuestas de signo contrario sobre una misma función (expresión de
CD163, secreción de MCP-1) en dependencia de la citocina antiinflamatoria
presente en el medio.
En conclusión, hemos confirmado que la gastrina tiene acciones proinflamatorias en
la rata y que, muy probablemente, éstas son extrapolables al ser humano, en el que
la hormona tiene dos dianas celulares, las células endoteliales y los macrófagos. En
las primeras, la gastrina provoca cambios claramente favorecedores del proceso
inflamatorio, mientras que sus efectos sobre la función macrofágica pueden verse
claramente influenciados por el ambiente en que se encuentren estas células
inflamatorias. Estos hallazgos fundamentan el potencial papel modulador de la
gastrina en los procesos patológicos en los que se incrementa su secreción, y
justifican la continuación de los estudios encaminados a discernir el papel real que
esta hormona juega en los mismos.
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íNDICE
PÁGINA:
I. INTRODUCCIÓN 1
1. LA GASTRINA 2
a. BIOSÍNTESIS 2
b. EFECTOS FISIOLÓGICOS DE LA GASTRINA 4
c. PATRÓN ALTERADO DE SECRECIÓN DE
GASTRINA
7
d. RECEPTORES DE GASTRINA 10
1. Vías de señalización activadas por CCK-2R. 12
2. RESPUESTA INFLAMATORIA 15
a. INTERACCIONES LEUCOCITO-ENDOTELIO 16
b. PAPEL DE LOS MONOCITOS Y MACRÓFAGOS
EN LA INFLAMACIÓN
20
1. Marcadores de superficie 28
2. Citocinas 28
3. Quimiocinas 30
3. GASTRINA Y ENFERMEDAD. ANTECEDENTES DIRECTOS
Y FORMULACIÓN DE HIPÓTESIS
31
xvii
II. OBJETIVOS 34
III. MATERIAL Y MÉTODOS 36
1. MICROSCOPIA INTRAVITAL 37
a. TRATAMIENTOS 39
2. DETECCIÓN DEL RECEPTOR CCK2 POR
INMUNOHISTOQUÍMICA
40
3. CULTIVO CELULAR 41
4. FRACCIONAMIENTO DE LEUCOCITOS MONONUCLEARES
Y POLIMORFONUCLEARES A PARTIR DE SANGRE
PERIFÉRICA
42
5. DERIVACIÓN A MACRÓFAGOS 43
6. INTERACCIÓN LEUCOCITO-ENDOTELIO 43
a. INTERACCIÓN LEUCOCITO-ENDOTELIO
EN CONDICIONES ESTÁTICAS
43
b. INTERACCIÓN LEUCOCITO-ENDOTELIO
EN CONDICIONES DINÁMICAS (CÁMARA
PARALELA DE FLUJO)
44
1. Medición de parámetros 45
2. Tratamientos
45
xviii
7. ESTUDIOS REALIZADOS EN CÉLULAS ENDOTELIALES 47
a. PRUEBA DE VIABILIDAD CELULAR 47
b. DETECCIÓN DE LA UNIÓN DE GASTRINA A
RECEPTORES CCK2 EN HUVEC.
47
c. DETECCIÓN DE MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
EN CÉLULAS ENDOTELIALES
47
1. Citometría de flujo 48
2. Microscopía de fluorescencia (citometría estática) 48
d. DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE
MOLÉCULAS DE ADHESIÓN POR RT-PCR
CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL
48
8. ESTUDIOS REALIZADOS EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA
50
a. DETECCIÓN DE MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
EN LEUCOCITOS DE RATA Y HUMANOS POR
CITOMETRÍA DE FLUJO.
50
9. ESTUDIOS REALIZADOS EN MACRÓFAGOS 51
a. MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA EN
MACRÓFAGOS.
51
1. Producción de radicales libres. 51
2. Detección de CD86 Y CD163 52
3. Detección de citocinas por ELISA 52
xix
10. EXPRESIÓN DE RESULTADOS, ANÁLISIS ESTADÍSTICO, Y
NORMAS DEONTOLÓGICAS
53
IV. RESULTADOS 57
V. DISCUSIÓN 89
VI. CONCLUSIONES 101
VII. BIBLIOGRAFÍA 103
1
I. INTRODUCCIÓN
2
La gastritis crónica es una patología de alta incidencia a nivel mundial. Se trata de
una condición patológica de etiología principalmente autoinmune o infecciosa,
siendo la infección por Helicobacter pylori su causa más común. En países en visas
de desarrollo, el 80% de los individuos pueden estar infectados por esta bacteria a
la edad de 20 años, mientras que la prevalencia en los países industrializados es
del 20-50% (1). La exposición prolongada de los tejidos a procesos inflamatorios
constituye un claro riesgo para el desarrollo de neoplasias y, de hecho, la infección
por Helicobacter determina una predisposición al desarrollo de cáncer gástrico. Por
otro lado, está cada vez más claro que la función de las células inflamatorias que
infiltran el tejido tumoral puede influir de manera sustancial en el devenir del
proceso patológico. Tanto la infección por Helicobacter pylori como diversos
tumores digestivos (gástricos, colónicos, pancreáticos) se asocian a incrementos en
la secreción de la hormona digestiva gastrina. El presente trabajo abordará el
estudio de la influencia de la gastrina en el proceso inflamatorio y analizará las
posibles repercusiones de sus efectos enmarcándolos en dichas patologías.
1. LA GASTRINA
La gastrina es una hormona peptídica descubierta en 1905 por Edkins (2) y aislada
y secuenciada en 1964 por Gregory y Tracy (3). La primera función que se le
reconoció fue la estimulación de la secreción de ácido gástrico. Posteriormente se
descubrió su capacidad para promover la proliferación celular, efecto que, como se
detalla mas adelante, lleva a pensar en la asociación entre gastrina y crecimiento
tumoral.
a. BIOSÍNTESIS
El gen humano de la gastrina se encuentra en el cromosoma 17. Los principales
sitios de síntesis de esta hormona son las células G de la región antro-duodenal. El
primer producto de la expresión génica es un péptido de 101 residuos de
aminoácidos, la preprogastrina (Figura 1). La eliminación del péptido señal por
escisión entre los aminoácidos Ala21 y Ser22 genera progastrina, que va
madurando conforme avanza desde el retículo endoplasmático al aparato de Golgi.
La acción de las enzimas prohormona convertasas (PC) y carboxipeptidasa E sobre
la progastrina genera las Gly-gastrinas (G34-Gly y G17-Gly), que son
3
transformadas en gastrinas maduras (G34 y G17) mediante la amidación del
COOH-terminal por la peptidil-alfa-amidante mono-oxigenasa. Estos péptidos
quedan almacenados en los gránulos secretores en la parte basal de las células G.
El tetrapeptido C-terminal de las gastrinas amidadas es idéntico al de la
colecistocinina (CCK) y es esencial para la activación de sus dos receptores
compartidos (descritos en la sección 1, a, iv) (4).
Este elaborado proceso biosintético constituye una vía secretora regulada que es
característica de células endocrinas, y conduce a la liberación de una mezcla de
péptidos gastrínicos a la sangre. En los seres humanos, se estima que más del
95% de la secreción de gastrina se encuentra en la forma amidada. No obstante,
los genes de la gastrina también pueden expresarse en células no endocrinas. En
concreto, se ha demostrado su síntesis en algunas células tumorales, que
normalmente carecen de vesículas secretoras y presentan escasas enzimas de
procesamiento. Por ello, los productos de la secreción pueden ser en gran parte
péptidos inmaduros (progastrina y Gly-gastrinas). A pesar de que estos péptidos
parcialmente procesados fueron inicialmente vistos como simples precursores
inactivos, ahora se reconoce que tienen sus propias propiedades biológicas. Su
efecto más reconocido es la estimulación del crecimiento de células tumorales (5).
4
FIGURA 1. Diagrama de la estructura inicial del péptido obtenido después de la expresión génica de la gastrina (preprogastrina), sus principales productos y su transformación enzimática (A). Secuencia de aminoácidos correspondiente a la gastrina amidada y ampliada por glicina (B).
b. EFECTOS FISIOLÓGICOS DE LA GASTRINA
Como ya se ha dicho, la principal función que se atribuye a la gastrina es la
estimulación de la secreción de ácido gástrico. De forma fisiológica, la hormona se
libera de las células G antrales en respuesta a la ingesta de alimentos y, más
concretamente, a la presencia de aminoácidos y aminas en el lumen gástrico. Su
liberación también se induce por el péptido neurotransmisor liberador de gastrina
(GRP) que actúa en sus receptores basolaterales en la célula G. Una vez liberada,
se transporta de forma endocrina a la mucosa oxíntica, hacia sus receptores en las
células parietales y las células de tipo enterocromafín (ECL). La unión de la gastrina
a estos receptores activa directamente la secreción de ácido por las células
parietales e induce la liberación de histamina desde las células ECL. La histamina
alcanza las células parietales por difusión paracrina y estimula la secreción ácida
5
mediante la activación de los receptores H2. El ácido luminal ejerce un efecto
contrarregulador sobre la liberación de gastrina, probablemente mediado por la
liberación de somatostatina por las células D (4). Más detalles sobre la regulación
de la liberación de la gastrina pueden verse en la Figura 2.
El efecto trófico de la gastrina sobre la mucosa oxíntica se conoce desde 1969, año
en que dos grupos independientes mostraron su acción proliferativa sobre la
mucosa gástrica en sendos estudios experimentales (6; 7). Estudios más recientes
llevados a cabo en ratones deficientes en el péptido o en su receptor han puesto de
manifiesto su importancia en el mantenimiento de la histología normal y la función
de la mucosa gástrica. Estos ratones mostraron una reducción de la secreción
ácida y atrofia notable debido a una disminución de las células parietales y ECL (8;
9). Aunque los ratones con deficiencia de gastrina también presentaron una
reducción en la tasa de proliferación de la mucosa colónica (10), las gastrinas
amidadas no parecen afectar a la proliferación en el colon humano, donde sus
receptores no están presentes (11).
6
FIGURA 2. A) Interacciones celulares de la mucosa a ntro-pilórica con la mucosa del cuerpo y del fondo gástricos que intervienen en la función de la gastrina. El principal sitio de síntesis de gastrina son las células G de la mucosa antro-pilórica. Con la presencia de alimentos en el estómago, la gastrina es liberada a la circulación y transportada de manera endocrina a su lugar de acción, la mucosa oxíntica. Una vez allí, interactúa con el receptor CCK2 (CCK-2R) sobre las células parietales para estimular la secreción de ácido. También estimula las células enterocromafines (ECL) para liberar histamina, que a continuación, estimulará también la célula parietal y la secreción ácida. La regulación de la expresión de histidina descarboxilasa mediada por la gastrina, con el consecuente aumento de histamina, facilita aún más el proceso. A la derecha se muestra una representación de la glándula. Las células D también están presentes en la mucosa antral y la liberación de somatostatina puede inhibir la secreción del ácido gástrico. B) La gastrina es liberada por exocitosis, una acti vidad modulada por factores endocrinos, paracrinos, neurocrinos y loca les luminales . La célula G es una célula digestiva endocrina clásica con microvellosidades en la superficie luminal que detectan la presencia de alimentos en el estómago La gastrina es liberada a la circulación a partir de los gránulos de secreción a lo largo del borde baso-lateral, en proximidad con los vasos sanguíneos de la mucosa. La somatostatina, que es secretada por las células D en respuesta a la disminución de pH, puede inhibir la acción de la célula G y la secreción de ácido gástrico por difusión local a través del espacio intercelular o por su transporte a través de la circulación local de la mucosa. Por otra parte, el péptido liberador de gastrina (GRP), presente en las fibras neuronales que inervan la mucosa antral, facilita la secreción de gastrina, actuando como un secretagogo.
A B
7
c. PATRÓN ALTERADO DE SECRECIÓN DE GASTRINA
La secreción de gastrina se incrementa de forma muy significativa en pacientes con
gastrinoma, quienes presentan hiperacidez gástrica como parte del síndrome de
Zollinger-Ellison. Sin embargo, esta es una enfermedad relativamente poco
frecuente y la hipergastrinemia se relaciona más habitualmente con condiciones de
hipoacidez gástrica, en las que la retroalimentación negativa de la liberación de
gastrina inducida por el ácido luminal no tiene lugar y las células G la secretan de
forma irrestricta. Este mecanismo explica el aumento de sus niveles séricos en
pacientes con gastritis crónica atrófica o cuando se inhibe farmacológicamente la
secreción de ácido con inhibidores de la bomba de protones o antagonistas de los
receptores de histamina-2 (4).
También se observa hipersecreción de gastrina cuando la mucosa está infectada
por Helicobacter pylori (12-15), bacteria gram negativa que coloniza el epitelio
gástrico de más del 50% de la población mundial y cuya presencia se asocia al
desarrollo de gastritis, úlceras gástricas y duodenales, así como carcinoma gástrico
y linfoma (16). La bacteria puede persistir en el epitelio durante décadas a pesar de
la activación de la respuesta inmune tanto innata como adaptativa. Esta respuesta
del huésped, ineficaz en la eliminación del germen, contribuye sin embargo al daño
tisular que acompaña a la infección (1). La presencia de Helicobacter pylori en la
mucosa puede acompañarse de hipo o hiper-secreción ácida en función del patrón
regional de colonización bacteriana y el grado de atrofia de la mucosa. El aumento
en la secreción de gastrina se produce en paralelo con una disminución de la
somatostatina. Ambos efectos pueden deberse a una acción directa del germen
sobre las células G y D, respectivamente. Sin embargo, en los últimos años, ha
quedado claro que estos patrones de secreción se ven influidos por el proceso
inflamatorio establecido contra el germen. En este sentido, la liberación de gastrina
por cultivos primarios de células G antrales de animales es estimulada por citocinas
proinflamatorias y monocitos activados (17; 18). Algunos estudios han encontrado
una correlación entre gastrinemia y gravedad de la gastritis (19-21), y se sabe que
ocurre hipersecreción de gastrina en animales con gastritis y en ausencia de otros
8
factores, como sobrecrecimiento bacteriano o hipoacidez gástrica, que pudieran
explicar esta desregulación (22). El efecto del Helicobacter sobre la regulación de
la liberación de gastrina está resumido en la Figura 3.
9
FIGURA 3. El Helicobacter pylori (HP) provoca hipergastrinemia por más de una vía. A la derecha se representa la inflamación local producida por el Helicobacter en la mucosa gástrica. A la izquierda se indica como los mediadores producidos por la inflamación, el cambio de pH que la bacteria produce y la bacteria misma de forma directa estimulan a la célula G, aumentando la excreción de gastrina, e inhiben a las células D contrarrestando el efecto fisiológico regulador de somatostatina.
La otra entidad patológica en la que se observa secreción anormal de gastrina es el
cáncer. La expresión del péptido y sus precursores, así como la de su receptor y
sus variantes, se ha detectado en múltiples tipos de células cancerígenas dentro y
fuera del sistema gastrointestinal (23). Centrándonos en el tracto digestivo, se ha
tenido especial interés en analizar su relevancia en los procesos cancerosos de
colon, páncreas y territorio gástrico. En este sentido, se ha descrito que la mayoría
de pólipos adenomatosos y tumores colorrectales producen gastrina o sus
precursores (24-30). Hay controversia con respecto al grado de procesamiento del
péptido precursor que se alcanza en esta síntesis ectópica, observándose en
algunos estudios una presencia significativa de gastrina amidada (24) mientras que
en otros se detecta una preponderancia clara de péptidos parcialmente procesados
10
(27). En cualquier caso, dicho proceso determina que muchos de estos pacientes
muestren niveles elevados de gastrina total en plasma (24). De forma análoga, la
mayoría de adenocarcinomas pancreáticos humanos expresan el péptido y sus
receptores y muchos de estos pacientes presentan gastrinemia elevada (31). Con
respecto al cáncer gástrico, se ha mostrado la expresión tanto del péptido como de
su receptor en líneas celulares cancerosas gástricas y en muestras de carcinoma
gástrico, y en ambos casos la hormona estimula el crecimiento celular (32).
d. RECEPTORES DE GASTRINA
Los receptores de gastrina y CCK han sido nombrados de acuerdo a los territorios
donde fueron identificados inicialmente: CCK-A en el tracto alimentario y CCK-B en
el cerebro. Ahora, sin embargo, los términos CCK1 y CCK2, respectivamente, se
aplican más generalmente. El receptor CCK1 (CCK1R) tiene a la CCK sulfatada
como principal ligando de activación, y muestra escasa afinidad por gastrinas o
CCK no sulfatadas. Sin embargo, el receptor CCK2 (CCK-2R) se une a la gastrina y
la CCK con afinidades muy similares y apenas discrimina entre las formas
sulfatadas y no sulfatadas (11). Los CCK-2R son capaces de unirse a las gastrinas
no amidadas, pero con una afinidad de varios órdenes de magnitud inferior a la
observada para los péptidos amidados. Los efectos de estos péptidos están muy
probablemente mediados por otros receptores, si bien no están bien caracterizados
(5).
Los genes de CCK1R y CCK-2R presentan cinco exones. Ambos receptores trans-
membrana presentan los siete segmentos de carácter hidrofóbico característicos de
los receptores acoplados a proteína G. Los CCK-2R son considerados propiamente
los receptores de la gastrina, porque median todos los efectos conocidos de las
gastrinas amidadas, y por tanto, nuestra atención se centrará en ellos.
Se han detectado varias isoformas de CCK-2R, aunque su importancia fisiológica
no es del todo clara. El empalme alternativo del exón 4 del gen del receptor de
CCK2 humano resulta en la transcripción de un receptor de CCK2 que carece de un
bloque de cinco aminoácidos en el tercer bucle intracelular. Una variante del exón-1
que genera una isoforma truncada de CCK-2R sin la terminal N extracelular se ha
observado también en una línea celular de cáncer gástrico. Por último, una nueva
11
variante de empalme de CCK-BR que retiene su cuarto intrón (CCK-2Ri4sv) y
exhibe activación constitutiva (independiente de ligando) se ha detectado en los
cánceres colorectales y de páncreas, pero no en tejidos normales.
Los CCK-2R se encuentran en las células parietales y ECL del estómago, donde la
gastrina ejerce sus funciones mas conocidas. Además, se sabe que existen en el
páncreas, el músculo liso, los adipocitos y las células de la zona glomerulosa
adrenal. En el páncreas la activación de CCK-2R induce liberación de glucagón. No
está clara la importancia de los CCK-2R en la modulación de funciones del músculo
liso gástrico. En los adipocitos, la gastrina parece regular la expresión y secreción
de leptina, y en las células de la zona glomerulosa adrenal podría estimular la
secreción de aldosterona (11).
Llama la atención que el CCK-2R esté presente en elementos clave del sistema
inmune y la respuesta inflamatoria. Okahata et al (33) demostraron, hace más de 20
años, inmunorreactividad a la gastrina en poblaciones puras de leucocitos
polimorfonucleares (PMN) y células mononucleares de sangre periférica humana.
Estudios más recientes han detectado ARNm del CCK-2R en PMN (34) y en células
mononucleares (35) aisladas de sangre periférica humana.
Los CCK-2R se han encontrado también en leucocitos del infiltrado tisular. Su
ARNm se detectó en macrófagos de pulmón en ratas (36), en las células
inmunitarias de la lámina propria gástrica (37) y en PMN del estroma de tumores
colorrectales (38).
Por otro lado, Lefranc et al. detectaron la expresión de mRNA del CCK-2R en el
endotelio vascular (39), interfase entre los leucocitos circulantes y los tejidos
circundantes que juega un papel definitivo en la formación del foco inflamatorio.
La industria farmacéutica ha invertido mucho esfuerzo en el desarrollo de
antagonistas del receptor de gastrina con la finalidad de obtener agentes
terapéuticos de patologías gastrointestinales en las que la secreción de ácido es un
factor contribuyente. Aunque el desarrollo de estos antagonistas como agentes
antisecretores se ha visto desfavorecido por la eficacia y el perfil de seguridad de
los inhibidores de la bomba de protones, contamos con una serie de antagonistas
12
de este tipo que nos resultan útiles en la caracterización de las acciones de la
hormona. El primer agente que mostró su capacidad de inhibir la acción de la
gastrina fue la proglumida, si bien no era un fármaco potente. La 1,4-
benzodiazepina L-365, 260 fue el primer antagonista no peptídico altamente
selectivo y potente. Entre los antagonistas más selectivos obtenidos con
posterioridad está la itriglumida ó CR2945 (40).
1. Vías de señalización activadas por CCK-2R.
La activación del receptor CCK2 puede poner en marcha múltiples vías de
señalización que, en definitiva, son responsables de los efectos biológicos de esta
hormona. Las consecuencias intracelulares de la activación de estos receptores se
han analizado en profundidad en la revisión de Dufresne et al (11). Dichas vías
pueden verse ejemplificadas en la Figura 4 y una lista se ve en la Tabla 1. Aquí
hacemos una breve sinopsis intentando destacar aquellas vías de especial
significación para los efectos que nosotros estudiamos.
Típicamente, la superfamilia de los receptores acoplados a proteína G tienen la
capacidad de inducir una rápida hidrólisis del difosfato de fosfatidilinositol por la
fosfolipasa C (PLC) para generar trifosfato de inositol (IP3) y diacilglicerol (DAG),
que inducen movilización de calcio y estimulan varias isoformas de la
proteinquinasa C (PKC), respectivamente.
La activación de la PLC (41) y la movilización de calcio (42-44) se implican en el
crecimiento celular inducido por gastrina. La activación de la PKC en respuesta a la
activación de receptores CCK2 activa las vías MAPK (“mitogen-activated protein
kinase”) también contribuyentes a su acción proliferativa (45; 46). Se ha descrito la
activación de varias MAPK en respuesta a la gastrina. JNK y p38-MAPK se activan
por acción de la PKC y la Src para inducir proliferación y favorecer la supervivencia
celular (45; 47). También se ha demostrado la implicación de la ERK1/2 no sólo en
la proliferación sino también en la migración celular inducidas por la hormona (48;
49). Por último, la activación de ERK5 media la inducción de ciclooxigenasa-2 (50).
Adicionalmente, la gastrina parece activar la fosfolipasa A2 (51) para generar ácido
araquidónico partiendo de los fosfolípidos de membrana.
13
El receptor CCK2 puede activar también la vía PI3K / AKT (“phosphatidylinositol-3-
kinase / serine/threonine protein kinase AKT o protein kinase B”). Esta ruta se
implica en sus efectos proliferativos y antiapoptóticos, y regula la adhesión y la
migración celulares inducidas por gastrina (52-55)
Aunque raramente se ha asociado la vía JAK/STAT a la señalización de receptores
acoplados a proteína G, evidencias recientes sugieren su implicación en la
regulación de la adhesión celular y en el efecto proliferativo de la gastrina en el
cáncer pancreático (53; 56)
Por último, el receptor CCK2 también puede valerse de las GTPasas pequeñas
(Ras, Rho y CdC42) para inducir proliferación celular (57) y activar el factor de
transcripción NF-κB para estimular la expresión de moléculas proinflamatorias como
la interleuquina – 8 (58).
Resulta interesante resaltar la relevancia de estas vías de señalización en los
efectos que a nosotros nos ocupan, es decir, la inflamación y la respuesta
inmunitaria. Las quimiocinas median sus efectos a través de la activación de la
PLC, PI3K y Src (59). Las MAPK median muchos de los efectos de citocinas
proinflamatorias como el TNFα y la IL-1 (60). La vía JAK/STAT se implica en la
traducción de las señales iniciadas por los receptores de otras citocinas como la IL-
4, la IL-13 o la IL-6 (61; 62). Por último, es indudable el papel de las enzimas
ciclooxigenasa-2 y fosfolipasa A2 o del factor de transcripción NF-κB en la
inflamación.
14
FIGURA 4. Descripción esquemática de las vías de se ñalización que se sabe, son activadas por CCK1R y CCK-2R . Además de las vías de señalización clásicamente activadas por receptores acoplados a proteína G tales como la cascada fosfolipasa C (PLC) / diacylglycerol (DAG) / Ca2+/ protein cinasa C (PKC) o la vía de la de adenilciclasa (AC), los receptores CCK también inducen muchas otras vías de señalización conocidas por ser activadas por receptores de tirosina cinasa: 1) las vias de la proteín cinasa activada por mitógeno (MAPK) incluyendo ERK, JNK, y p38-MAPK; 2) la via de fosfatidilinositol 3 cinasa (PI3K); ó 3) la via de PLC. La activación de tirosina cinasas no receptoras incluyendo Src, JAK2, FAK, y PYK2 es también un acontecimiento temprano en la señalización del receptor de CCK. Estas tirosina cinasas están implicadas particularmente en la cascada contracorriente de las MAPK o las vías de PI3K y en los eventos intracelulares relacionados con la adhesión celular. Finalmente, CCK-2R también son conocidos por inducir la transactivación del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF). Las flechas corresponden a los estímulos positivos. Figura tomada de Dufresne et al (11).
15
TABLA 1. Vías de señalización desencadenadas por la activación de CCK-2R
1) Fosfolipasas: PLC (Isoformas PLC-β y PLC-γ1)
2) Calcio
3) Protein Cinasas C (α,δ,ε,η), D y D2
4) Cinasas activadas por mitógeno: ERK1/2, JNK, p38-MAPK, y ERK5
5) Tirosin cinasas: familia Src
6) Transactivación del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF).
7) Cinasas de lípido: Vía PI 3-cinasa/AKT
8) Cinasa de adhesión focal: p125-FAK
9) Janus Cinasas (JAKs): Vía JAK2/STAT 3
10) GTPasas : Ras, Rho, Rac, y Cdc42
11) Factores de transcripción: NF B, AP-1
2. RESPUESTA INFLAMATORIA
Nuestro estudio pretende analizar la influencia que podría tener la gastrina sobre el
proceso inflamatorio, por lo que es necesario hacer referencia a las características
fundamentales de dicho proceso. La inflamación se caracteriza fundamentalmente
por vasodilatación, aumento de la permeabilidad capilar, coagulación del líquido
intersticial, tumefacción de células tisulares y migración de un gran número de
leucocitos al tejido. La inflamación se produce en respuesta a lesión tisular por
traumatismos, a la presencia de bacterias, o cualquier otro fenómeno que provoque
la activación de células inflamatorias locales como los macrófagos, las células
dendríticas o los mastocitos. Estas células secretan mediadores como la histamina,
las prostaglandinas, diferentes citocinas y quimiocinas que determinan la llamada a
leucocitos circulantes para que invadan el tejido afectado. Para ello ha de haber
una interacción entre estos leucocitos y el endotelio venular, dicha interacción se
explica a continuación. Una vez migrados los leucocitos, ejercen las funciones que
le corresponden según su tipo celular. Más adelante se detallan dichas funciones
haciendo referencia principalmente al macrófago que, según resultados previos
(63), es blanco probable de la gastrina y es el tipo celular dominante en las
inflamaciones crónicas y en los tumores cancerosos.
16
a. INTERACCIONES LEUCOCITO-ENDOTELIO
Los leucocitos son las unidades móviles del sistema inmunológico, su valor real
radica en que la mayoría de ellos se transporta específicamente a zonas de
infección e inflamación intensas, lo que constituye una defensa rápida y potente
frente a microorganismos infecciosos. El ser humano tiene unos 7000 leucocitos /
microlitro de sangre.
En presencia de un estímulo proinflamatorio, se produce la activación de las células
endoteliales y / o leucocitarias y, como consecuencia, cambia el patrón de expresión
de moléculas de adhesión en la superficie de estas células (Tabla 2). La interacción
entre las moléculas de adhesión presentes en el endotelio vascular y sus
correspondientes ligandos en la célula leucocitaria es la que posibilita la
extravasación de leucocitos desde el torrente circulatorio hasta el foco inflamatorio.
Esta interacción está mediada por una cascada secuencial de reacciones
reversibles y transitorias entre estos dos tipos de células que describimos a
continuación (Figura 5).
Inicialmente, los leucocitos sufren una deceleración en su tránsito, proceso que se
conoce con el nombre de “rolling” o rodamiento leucocitario , y que se debe a las
interacciones mediadas por la familia de moléculas de adhesión denominadas
selectinas. La P-selectina y la E-selectina se expresan en el endotelio, mientras que
la L-selectina se localiza en leucocitos. El patrón de expresión y los ligandos
específicos para cada una de ellas se especifica en la Tabla 2.
Si el estímulo inflamatorio persiste, se produce la adhesión firme gracias a la unión
entre las integrinas leucocitarias y las inmunoglobulinas endoteliales. Las moléculas
más importantes en este proceso serían las integrinas α4 (α4β1 y α4β7), las
integrinas β2 (αLβ2, αMβ2, αXβ2) y las inmunoglobulinas ICAM-1, ICAM-2 y VCAM-1
(Tabla 2).
El último paso es la migración leucocitaria a través de las uniones entre células
endoteliales y la membrana basal perivascular. El proceso de transición de
adhesión firme a extravasación requiere la activación leucocitaria. Las integrinas
actúan como moléculas que emiten una señal que hace que los leucocitos se
17
aplanen sobre el endotelio permitiéndoles atravesar las uniones entre células
endoteliales. Entre las moléculas de adhesión implicadas en la extravasación
leucocitaria tienen importancia PECAM-1 (CD31) y el complejo formado por
integrinas β2 (CD11/CD18) / ICAM-1 (64).
Los leucocitos expresan en bajos niveles a las integrinas α2β1, α3β1, α4β1, α5β1,
α6β1, αvβ3 y éstas se unen a un gran número de proteínas de la matriz extracelular
como laminina, fibronectina, vitronectina, etc. Los mecanismos moleculares que
median el paso de leucocitos a través de las uniones entre células endoteliales
activarían los mecanismos que regulan su paso a través de la membrana basal.
Estos mecanismos incluirían la activación y el aumento de la expresión de los
receptores leucocitarios para las proteínas de la matriz extracelular.
Se ha mencionado también un paso intermedio entre adhesión y migración: el
arrastre (“crawling”) leucocitario, a través del cual el leucocito adherido se moviliza
hacia un espacio intercelular para iniciar la migración. Descrito principalmente para
los neutrófilos, se sabe que es mediada principalmente por Mac-1 (65).
18
Figura 5. La activación leucocitaria y endotelial p or mediadores inflamatorios desencadena la expresión / activación de moléculas de adhesión. Dependiendo de la fase en que se encuentre el proceso (rodamiento, adhesión o migración) así se expresarán las respectivas moléculas de adhesión en ambos tipos celulares, y la interacción secuencial entre ellas permite el proceso global de extravasación leucocitaria (figura tomada de Ulbrich et al (66))
Leucocito
Rodamiento
Célula endotel ial
Adhesión
Leucocito
Célula endotelial
Leucocito
Célula endotelial
Migración
19
TABLA 2. Clasificación y características principale s de las moléculas de adhesión (64-66): MOLÉCULA DE ADHESIÓN
(denominaciones menos comunes)
LOCALIZACIÓN EXPRESIÓN LIGANDO FUNCIÓN
FAMILIA DE LAS SELECTINAS
L-selectina Leucocitos Constitutiva
P-selectina, E-selectina,
GlyCAM, MAdCAM
Rolling
P-selectina Células
endoteliales, Plaquetas
Constitutiva/Inducible (Almacenada, se
moviliza a la supeficie al activarse la célula)
L-selectina, PSGL-1,
PSL Rolling
E-selectina Células endoteliales
Inducible (Inducción de su síntesis al activarse
la célula)
L-selectina, CLA, SSEA,
ESL Rolling
FAMILIA DE LAS INTEGRINAS
ααααLß2
(CD11a/CD18, LFA-1) Leucocitos
Constitutiva (Sufre cambio conformacional
al contactar con su ligando)
ICAM-1, ICAM-2 Adherencia, migración
ααααMß2
(CD11b/CD18, Mac-1) Granulocitos,
monocitos
Constitutiva/Inducible (Almacenada, se
moviliza a la supeficie al activarse la célula)
ICAM-1 Adherencia, migración
ααααXß2
(CD11c/CD18, p150,95) Granulocitos,
monocitos
Constitutiva/Inducible (Almacenada, se
moviliza a la supeficie al activarse la célula)
¿? ¿?
αααα4ß1
(CD49d/CD29, VLA-4)
Linfocitos, monocitos, eosinófilos, basófilos.
Constitutiva VCAM, matríz
extracelular Adherencia
αααα4ß7
(CD49d/-) Linfocitos Constitutiva
MAdCAM-1, VCAM-1,
fibronectina Adherencia
SUPERFAMILIA DE LAS INMUNOGLOBULINAS
ICAM-1 Células
endoteliales, monocitos
Constitutiva/Inducible (Su expresión aumenta al activarse la célula)
αLß2, αMß2, Adherencia, migración
ICAM-2 Células endoteliales Constitutiva αLß2 Adherencia, migración
VCAM-1 Células endoteliales
Inducible (Su síntesis aumenta significativamente en
la célula activada)
α4ß1, α4ß7
(con menor afinidad a la
última)
Adherencia, migración, ¿Rolling?
PECAM-1
Células endoteliales, leucocitos, plaquetas
Constitutiva PECAM-1
(homofílico) Adherencia, migración
MAdCAM-1 Células
endoteliales, (intestino)
Constitutiva/Inducible L-selectina,
α4ß7 Adherencia, migración
20
b. PAPEL DE LOS MONOCITOS Y MACRÓFAGOS EN LA
INFLAMACIÓN
Los macrófagos residentes están presentes de forma constitutiva, es decir, en
ausencia de estímulos inflamatorios, en diversos órganos. Juegan un papel
homeostático encargándose de la eliminación de células apoptóticas y sirviendo de
centinelas frente al daño y la infección. Pueden replicar localmente, pero están
diferenciados totalmente, y el ritmo de renovación puede diferir de unos tejidos a
otros. También encontramos diferencias significativas en cuanto a forma y fenotipo
según los distintos órganos (67).
Cuando se pone en marcha una respuesta inflamatoria / inmunológica por la
presencia de daño tisular, infección o tumores, se reclutan nuevos macrófagos. Los
monocitos son la principal fuente de estos macrófagos que van a infiltrar el tejido
afectado. Su diferenciación en macrófagos y su activación depende de la
combinación de citocinas y demás agentes propios de las respuestas inflamatorias /
inmunitarias que encontremos presentes en cada caso. Se ha demostrado que
estas células pueden adquirir infinidad de fenotipos distintos, lo que conlleva un
amplio abanico de funciones. Además, se observa que son células de gran
plasticidad fenotípica, por lo que su función puede evolucionar fácilmente en
respuesta a los cambios que ocurran en el ambiente tisular.
A pesar de, o quizá debido a la complejidad de la función macrofágica, diversos
grupos con gran experiencia en este campo han realizado un esfuerzo
sistematizador que facilite su comprensión. Todas las clasificaciones (Tabla 3)
establecen un patrón de activación clásico (también llamado M1) que se
corresponde con el de los macrófagos como células potentes con capacidad de
fagocitar y presentar antígenos, sintetizar citocinas proinflamatorias y mediadores
tóxicos. Con ello, los macrófagos ejercen su acción bactericida, especialmente
frente a patógenos intracelulares, y luchan contra el tumor. Al mismo tiempo,
contribuyen al daño tisular que acompaña a la infección y a los procesos
autoinmunes. Estos macrófagos son característicos de las respuestas inmunitarias
de tipo “T-helper 1” (Th1) y, de hecho, se consiguen in vitro estimulándolos con
citocinas secretadas por los linfocitos Th1 (IFN γ y TNF-α) y lipopolisacárido
21
bacteriano (LPS). Ellos favorecen a su vez la formación de respuestas inmunitarias
específicas de tipo Th1 mediante la secreción de citocinas como la IL-12 (67-72).
A principios de los años 90 se vio que la interleuquina-4, citocina secretada en las
reacciones inmunitarias de tipo “T-helper 2” (Th2), activaba también los macrófagos
pero con un patrón definitivamente distinto al inducido por el IFN γ. Se le llamó
patrón alternativo de activación o M2. Los macrófagos activados por esta vía
contribuyen a la defensa inmunitaria frente a infecciones helmínticas que,
característicamente, generan respuestas inmunitarias de tipo Th2. Por otro lado,
secretan componentes de la matriz extracelular, por lo que parecen contribuir a la
cicatrización. Al igual que ocurre con los macrófagos activados por la vía clásica,
sus secreciones también afectan la respuesta inmunitaria específica, derivándola en
este caso hacia Th2 al inhibir la liberación de IL2 y favorecer la de IL-10. También
antagonizan la acción de las quimiocinas secretadas por los macrófagos activados
por la vía clásica. Por todo ello, este fenotipo macrofágico reduce la capacidad
defensiva del organismo frente a infecciones víricas, micóticas o protozoarias cuyo
control depende de una respuesta Th1 eficaz. Además, contribuyen a las
reacciones alérgicas crónicas que, como el asma, se caracterizan por la expresión
de citocinas Th2 y, por sus efectos sobre la matriz extracelular, favorecen la fibrosis
(72).
El nombre de activación alternativa se ha utilizado también para calificar el perfil de
activación de los macrófagos en respuesta a otros agentes que, al igual que la IL-4,
favorecen la secreción de IL-10 en detrimento de IL-12. Se consideró este efecto
como definitorio del perfil de activación por su importancia en la orientación de la
respuesta linfocitaria. Posteriormente se vio que los macrófagos activados por estos
agentes, si bien compartían características con los estimulados con IL-4, también
mostraban diferencias significativas, lo que desaconseja agruparlos bajo un mismo
nombre. Ello ha motivado distintos intentos de clasificación (Tabla 3), aunque
ninguno de ellos se ha establecido como definitivo. A continuación se describen
otros dos tipos de activación alternativa haciendo referencia a las diferentes
denominaciones utilizadas en las distintas clasificaciones. La Tabla 4 indica las
fuentes principales de las citocinas inductoras de cada uno de los subtipos.
22
El fenotipo M2b, tipo II o innato se induce en respuesta al acoplamiento de
complejos inmunes al Fc-γR junto a la activación de TLR (“Toll like receptors”). Al
igual que los macrófagos activados por la vía clásica, genera radicales libres y
libera citocinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1 o IL-6. También son buenos
presentadores de antígenos. Sin embargo, y como ya se ha dicho, desactivan la
síntesis de IL-12 y generan cantidades importantes de IL-10. Ello les otorga una
capacidad antiinflamatoria e inclina la respuesta específica hacia Th2. De esta
manera, inducen un perfil tolerogénico que puede prevenir la patogenia asociada a
una activación inmunitaria excesiva pero que también merma la capacidad
defensiva frente a agentes infecciosos (69).
El cuarto y último fenotipo establecido hasta el momento es el fenotipo M2c o de
desactivación, que tiene lugar en respuesta a citocinas antiinflamatorias como la IL-
10 o el TGFß, o a las hormonas glucocorticoideas. Estos macrófagos son pobres
presentadores de antígenos y ellos mismos son fuente de las citocinas
antiinflamatorias que los inducen, como la IL-10 o el TGFß. También antagonizan la
acción de las quimiocinas secretadas por los macrófagos M1 y son muy activos en
la fagocitosis de células apoptóticas. Por tanto, estos macrófagos tienen carácter
antiinflamatorio e intervienen en la normalización del tejido inflamado al ser eficaces
barredores de los restos celulares (67; 70).
En definitiva, los macrófagos pueden expresarse como potentes efectores que
producen importantes cantidades de citocinas proinflamatorias y se encargan de
eliminar microorganismos y células tumorales, también pueden ejercer una función
moderadora de las respuestas inflamatorias y la inmunidad Th1 adaptativa, así
como limpiar los desechos y promover la angiogénesis, la remodelación y
reparación tisular. Es importante tener en cuenta que estos no son compartimentos
estancos ya que in vivo, los fagocitos mononucleares están expuestos a una
multiplicidad de señales y el fenotipo final va a depender de la resultante de todas
ellas. Por ello, la polarización de la función macrofágica debe ser vista como un
marco conceptual simplificado y operacionalmente conveniente, que marca los
extremos, pero que incluye un continuo de estados funcionales intermedios.
23
TABLA 3. Características principales de los diferen tes patrones de activación macrofágica. IFN: Interferón, IL: i nterleuquina, LPS: Lipopolisacárido, ROS: Radicales libres de oxígeno, TGF-β: Factor de crecimiento transformante-β, Th 1y2: T “helper” 1 y 2, TLR: Receptor tipo “Toll”, TNF: Factor de necrosis tumoral.
PATRÓN DE ACTIVACIÓN
Mantovani et al. 2002 (68)5}5} Clásico (M1) Alternativo (M2)
Mosser 2003 (69)8}8} Clásico (M1) Alternativo Tipo II
Gordon et al. 2005 (67)4}4} Clásico (M1) Alternativo Desactivación Innato
Benoit et al. 2008 (70)6}6} Clásico (M1) M2a M2c M2b
Mosser et al. 2008 (71)3}3} Clásico (M1) Cicatrización Regulador
Martinez et al. 2009 (72)1}1} Clásico (M1) Alternativo (M2) Otros
Estimulo polarizador IFNγ + TLR4 IL-4
IL-13
IL-10 Glucocorticoides
TGFß
Complejos inmunes + TLR4
Función principal Activación Th1; muerte de patógenos intracelulares;
defensa del huesped, destrucción tisular
Supresión Th1, activación Th2; muerte y encapsulación de
parásitos, cicatrización de heridas, remodelamiento tisular, fibrosis.
Inmunosupresión Normalización tras la inflamación
Microbicida Inflamación limitada
Inmunotolerancia
Fagocitosis � � (células apoptóticas) �
Endocitosis �
Presentación de antígenos � � � �
Derivan la respuesta específica hacia Th1 Th2 Th2
Citocinas
� IL-12 � IL-6 � TNFα � IL-1ß � IL-15
� IL-10 (� IL-12) IL-1Ra TGFß
Antagoniza quimiocinas inducidas por IFN o LPS
� IL-10 y TGFß (� IL-12) Antagoniza quimiocinas inducidas
por IFN o LPS
� IFNß � IL-6 � TNFα � IL-1ß
Cambia de IL-12 a IL-10
Acción microbicida � � � � ROS
¿?
24
TABLA 4. Citocinas inductoras de distintos tipos ma crofágicos.
IFN: Interferón, , IL: Interleuquina, NK: “Natural Killer”, MF: Macrófagos, Th 1y2: T “helper” 1 y 2, NKT= Celulas que muestran características/receptores de células “NK” y “T”, T reg: “T” reguladora.
CITOCINAS IFNγγγγ IL-4 IL-10 F
UE
NT
E
Inmunidad innata
NK
Basófilos, mastocitos y otros granulocitos
estimulados por chitina NKT MF
MF
Inmunidad específica Linfocitos Th1 Linfocitos Th2
T reg Th2
Linfocitos B
Otras Epitelio Células tumorales
Funciones más conocidas
En macrófagos
- � función microbicida
- � presentación antígenos
En linfocitos T
- diferenciación a Th1
En linfocitos T
- diferenciación a Th2
- � activación por IFN-γ
En macrófagos
- � síntesis citocinas proinflamatorias
- � presentación antígenos
En linfocitos T
- � activación
25
Últimamente se está prestando mucha atención al patrón alternativo de activación
de los macrófagos porque puede tener mucho que ver con el que desarrollan los
macrófagos presentes en los tejidos cancerosos (macrófagos asociados al tumor,
MAT). Los macrófagos constituyen un elemento fundamental de la infiltración
inflamatoria del tumor y su patrón funcional puede verse claramente influenciado
por las secreciones de las células tumorales. Estos macrófagos pueden matar y
fagocitar las células cancerosas, actuar como células presentadoras de antígenos y
evocar así la respuesta inmunitaria específica o, en cambio, presentar un fenotipo
similar al tipo M2 y contribuir a la progresión tumoral mediante la secreción de
factores de crecimiento y angiogénicos e inhibiendo la respuesta inmunitaria
específica (73-75).
Estos macrófagos promotores de la progresión tumoral se han caracterizado
principalmente en el cáncer de ovario y de mama, donde se ha establecido que una
mayor infiltración determina un peor pronóstico (76). La situación en el cáncer
colorrectal está mucho menos definida. Los resultados de los artículos
retrospectivos que han analizado la influencia del grado de infiltración macrofágica
en el progreso de la enfermedad sugieren que una mayor presencia de MAT
conlleva un mejor pronóstico. Se observa una correlación positiva entre la presencia
de macrófagos y la supervivencia tras la resección quirúrgica, lo que además se
acompaña de una menor recurrencia y menor afectación de nódulos linfáticos. El
poder predictivo es aún superior si la reacción inflamatoria se observa en el margen
tumoral (77-79). Por otro lado, se ha observado que las subpoblaciones de
macrófagos citotóxicos y de linfocitos decrecen conforme aumenta el tamaño del
tumor, lo que sugiere que existe una reducida respuesta anti-tumor en los estados
más avanzados de la enfermedad (80). Por tanto, las evidencias de que
disponemos, si bien no nos permiten conocer a fondo el papel que juegan los
macrófagos en el cáncer de colon, sí ponen de manifiesto su relevancia y justifican
el estudio de su función y la valoración de estrategias que los modulen. La función
del macrófago en el cáncer gástrico es bastante desconocida. Encontramos en la
literatura un número muy limitado de artículos que la analizan y que, además,
generan datos contradictorios. Mientras Ohno et al. (81), muestran que la
acumulación de MAT en el tumor proporciona un efecto beneficioso debido a una
mayor citotoxicidad y presentación de antígenos, otro estudio del mismo año
26
sugiere que los pacientes con número elevado de MAT tienen un peor pronóstico
(82). Leung et al (83) mostraron que, si bien el número total de macrófagos no se
correlacionaba con el pronóstico, sí lo hacía la expresión por parte de estos
macrófagos de una quimiocina (CCL18), lo que se asociaba a una mejor evolución.
Obviamente, el perfil funcional se correlaciona con la expresión de moléculas de
superficie y la secreción de quimiocinas, citocinas y mediadores, ya que de esto va
a depender su interacción con otras estructuras químicas o celulares, el patrón de
infiltración leucocitaria y la regulación de la función propia y la de las células del
entorno, tanto estromales como somáticas. Todo ello se ha utilizado para
caracterizar el perfil fenotípico de los macrófagos encontrados en los tejidos o
cultivados y tratados in vitro. La Tabla 5 resume los marcadores más utilizados para
identificar a los macrófagos activados por la vía clásica (M1) o por las vías
alternativas (M2a-c) haciendo referencia a su función principal. Nosotros hemos
seleccionado dos marcadores de superficie (CD86 y CD163), las citocinas IL-12, IL-
10 y TNFα, y la quimiocina MCP-1 en nuestros estudios dedicados a analizar el
posible efecto de la gastrina sobre la función macrofágica. A continuación se
expone una descripción más detallada de estos elementos así como las razones
para su selección.
27
TABLA 5. Principales marcadores de activación clási ca (M1) o por vías alternativas (M2a-c) de los macrófagos
Receptores de membrana
M1 CD80 Proteína que se encuentra en células B activadas, monocitos y macrófagos. Provee una señal coestimuladora necesaria para la activación y supervivencia de las células T.
M1 CD86
Proteina de superficie expresada primariamente en monocitos, macrófagos y células B activadas. Juega un rol importante en la co-estimulación de células T en la respuesta inmunitaria primaria.
M2 Receptores
“Scavenger A y B” Participan en la eliminación de muchas sustancias foráneas y materiales de desecho.
M2 MR (Receptor de
manosa)
Presente principalmente en fagocitos, tiene afinidad por los componentes de manosa presentes en las glucoproteinas y glucolípidos de las paredes celulares microbianos.
M2 CD163 Antígeno expresado en la mayoría de macrófagos tisulares y monocitos de sangre periférica.
Cito cinas de la inmunidad innata
M1 TNF-α
Citocina pro-inflamatoria producida por los macrófagos y los linfocitos T. Actúa principalmente sobre las células endoteliales y los neutrófilos a los que activa. Se encuentra frecuentemente en el ambiente tumoral, donde puede jugar un papel dual.
M1 IL-1
Es producida por los macrófagos, las células endoteliales, y algunas células epiteliales. Entre otros efectos produce activación endotelial promoviendo la inflamación y la coagulación.
M1 IL-12
La producen principalmente los macrófagos y las células dendríticas. Aumentan la actividad citotóxica, actúan sobre los linfocitos T induciendo su diferenciación a TH-1 y estimulando la síntesis de IFN-γ, actúa también sobre los linfocitos NK induciendo la liberación de IFN-γ.
M1 MCP-1 El mcp-1 (CCL2) es una quimiocina que atrae principalmente a monocitos y que se encuentra frecuentemente en el ambiente tumoral, donde puede jugar un papel dual.
M2 IL-10 Es producida por macrófagos y linfocitos T, en los macrófagos y las células dendríticas. Inhibe la síntesis de IL-12 y la expresión de co-estimuladores y de moléculas CPH de la clase II.
M2 IL-1ra Es producida por los macrófagos, las células endoteliales, y algunas células epiteliales. Antagoniza las acciones de la IL-1.
Moléculas efectoras
M1 Radicales libres de
oxígeno Producidos por fagocitos activados, tienen una importante acción citotóxica.
M1 iNOS Oxido nítrico sintasa inducible. Parte de L-argninina para producir oxido nítrico, el cual tiene un papel citotóxico.
M2 Arginasa Enzima que degrada la L-arginina e impide su uso para producir oxido nítrico.
28
1. Marcadores de superficie
El CD86 es una proteína de superficie perteneciente a la superfamilia de las
inmunoglobulinas. Se expresa en células presentadoras de antígeno y es el ligando
de dos proteínas en la superficie de las células T: el CD28 y la proteína 4 asociada
a linfocitos T. Su función más reconocida consiste en la unión a la proteína CD28
del linfocito T en el proceso de presentación de antígenos, constituyendo esta
interacción una señal coestimuladora que contribuye a la activación de la célula
linfocitaria. La unión a la proteína 4 asociada a linfocitos T regula negativamente la
activación del linfocito y disminuye la respuesta inmune. Es expresada
principlamente por macrófagos activados por la vía clásica (M1) (68; 84).
El CD163 Es un miembro de la superfamilia de receptores tipo “scavenger” ricos en
cisteína (SRCR). Los miembros de esta familia son secretadas o se encuentran
anclados a la membrana celular. El CD163 se encuentra principalmente en
monocitos-macrófagos, de forma más patente en los macrófagos residentes y en
los macrófagos presentes en la fase resolutiva de la inflamación y en el proceso de
reparación del daño tisular. Tiene la particularidad de unirse a moléculas
consideradas de desecho. Hay evidencias de que tiene un efecto amortiguador de
la respuesta inflamatoria y se expresa mayoritariamente en macrófagos activados
por la vía alternativa (68; 85).
2. Citocinas
Las citocinas son proteínas de bajo peso molecular producidas por varios tipos
celulares, principalmente del sistema inmune, esenciales en la comunicación
intercelular. Estos mediadores solubles controlan muchas funciones fisiológicas
críticas tales como: diferenciación y maduración celular, inflamación y respuesta
inmune local y sistémica, reparación tisular, hematopoyesis, apoptosis y muchos
otros procesos biológicos. Debido a que muchas de estas citocinas son producidas
por leucocitos y actúan sobre otras poblaciones de leucocitos, estas moléculas se
llaman a veces interleuquinas, aunque el término no debe emplearse para indicar
que las citocinas son sintetizadas o actúan solo sobre leucocitos. A continuación se
detallan las principales características generales de las citocinas que interesan para
el desarrollo del presente trabajo.
29
La interleuquina-10 (IL-10) es una citocina con carácter antiinflamatorio. Es
producida por macrófagos activados, linfocitos y otros tipos celulares no linfocíticos
(ej: queratinocitos, células tumorales). Sus dos actividades principales son inhibir en
los macrófagos la producción de citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1, quimiocinas,
e IL-12) y sus funciones accesorias en la activación de células T. Además, la IL-10
promueve la diferenciación de monocitos a macrófagos maduros y bloquea su
diferenciación a células dendríticas, por lo que puede ser una determinante
importante de la proporción relativa de MAT frente a células dendríticas asociadas a
tumor (86).
La interleuquina-12 (IL-12) es un heterodímero formado por subunidades de 35 kD
(p35) y de 40 kD (p40). La síntesis de p40, que es la biológicamente activa, está
restringida a los fagocitos mononucleares activados y a las células dendríticas. Por
consiguiente, estos tipos celulares son las fuentes principales de IL-12
biológicamente activa. Sus funciones biológicas conocidas son actuar como factor
de diferenciación para las células T CD4+ derivando la respuesta hacia Th1 e
inducir de la síntesis de IFN-γ por las células NK y las células T aumentando su
capacidad citolítica (87).
El factor de necrosis tumoral- αααα (TNFαααα) es el mediador principal de la respuesta
frente a bacterias gram negativas y también puede desempeñar un papel en las
respuestas inmunitarias innatas frente a otros organismos infecciosos. Su principal
fuente celular son los fagocitos mononucleares activados por el LPS y es uno de los
mediadores más importantes de los efectos de esta toxina. El IFN-γ producido por
las células T potencia el estímulo del LPS y, de esta manera, el TNF actúa como
mediador tanto de la inmunidad innata como de la específica. El TNF hace que las
células endoteliales expresen moléculas de adhesión que hacen que los leucocitos
se adhieran a la superficie de la célula endotelial, lo que contribuye a la
acumulación de leucocitos en los focos inflamatorios. Activa los fagocitos
mononucleares y polimorfonucleares para la secreción de quimiocinas y destrucción
de microorganismos. Su producción crónica a concentraciones bajas da lugar a la
remodelación tisular, actuando como factor de angiogénesis y de factor de
30
crecimiento para los fibroblastos. En los casos de sepsis por bacterias
gramnegativas se producen cantidades masivas de TNF, y sus efectos producen
muerte por colapso circulatorio y coagulación intravascular diseminada (88).
El descubrimiento del TNF vino determinado por sus efectos sobre los tumores, lo
que le valió su nombre de factor de necrosis tumoral. Su acción antitumoral es
principalmente debida a su efecto pro-apoptótico sobre algunas células malignas.
Por otro lado, diversos estudios sugieren que el TNF a concentraciones bajas
puede tener un efecto pro-tumoral, y que puede jugar un papel importante en el
desarrollo del cáncer asociado a inflamación crónica (89).
3. Quimiocinas
Las quimiocinas son una familia de citocinas que comparten la capacidad de
estimular la movilidad de los leucocitos (quimioquinesis) y su movimiento dirigido
(quimiotaxis). La quimiocina conocida como MCP-1 (“monocyte chemotactic
factor-1”) o CCL2, es un factor quimiotáctico para los monocitos y nos interesa
particularmente porque se ha visto que los niveles de CCL2 derivado de tumor se
correlacionan con la abundancia de MAT en muchos tipos de adenocarcinomas,
incluidos el de ovario, pulmón, páncreas y gástrico (90).
Trabajos en ratones modificados genéticamente han demostrado que el MCP-1
producido por los tumores y MAT, puede orientar la inmunidad específica en una
dirección Th2, aunque el mecanismo exacto de esta acción no se ha definido.
Experimentos con anticuerpos bloqueantes han proporcionado directa evidencia de
que la secreción de MCP-1 en tumores poco inmunogénicos bloquea la generación
de células T reactivas al tumor (68).
31
3. GASTRINA Y ENFERMEDAD. ANTECEDENTES DIRECTOS Y
FORMULACIÓN DE HIPÓTESIS
Como ya se ha dicho antes, a nosotros nos llamó la atención la presencia del
receptor de gastrina en leucocitos y células endoteliales. Ello nos hizo pensar que la
hormona debía ejercer algún efecto en la función de dichos elementos y por tanto,
afectar la respuesta inflamatoria / inmunitaria. Pensábamos que de ser así, esto
sería relevante en dos cuadros patológicos de gran importancia que aunaban
producción de gastrina y presencia de células inmunitarias: la gastritis inducida por
Helicobacter pylori y el cáncer gástrico / colónico.
El Helicobacter pylori puede provocar desde gastritis crónica asintomática hasta
carcinoma gástrico. La gravedad de la patología gástrica que se desarrolla en cada
caso parece depender del grado de virulencia de la cepa bacteriana y de la
respuesta inmunitaria que origina en el huésped. Con respecto a esta última cabe
decir que la infección activa una respuesta de tipo Th1 (91) que, si bien combate en
cierta medida la infección, no consigue su erradicación. La predominancia Th1 es
también en gran medida responsable de la patología gástrica inducida por la
bacteria. Esto se ha puesto de manifiesto en estudios experimentales en los que se
ha visto que determinadas cepas de ratón (C57BL) que ponen en marcha fuertes
respuestas Th1 frente a Helicobacter, sufren niveles inferiores de colonización pero
ven incrementada la gastritis y la hiperplasia/displasia en comparación con ratones
que presentan respuestas de tipo Th2 (92). Además, la inducción de una respuesta
Th2 en ratones C57BL por coinfección con un parásito helmíntico, reduce la atrofia
gástrica inducida por Helicobacter felis (93), lo que parece explicar lo que se ha
dado en llamar el “enigma africano” (escasa incidencia de adenocarcinoma gástrico
en países con elevada concurrencia de H. pylori y parásitos gastrointestinales).
Según esto, el proceso patológico que derive de la infección depende más de la
respuesta inflamatoria/inmunitaria frente al germen que de la presencia del mismo,
ya que la inflamación crónica es en gran parte responsable de la transformación
neoplásica (94).
32
Se ha analizado si la hipersecreción de gastrina que acompaña a esta circunstancia
es un efecto colateral o si, por el contrario, contribuye al desarrollo de cáncer. Una
relación causal entre los dos elementos se ha establecido exclusivamente en
roedores. La hipergastrinemia continua en ratones transgénicos causó
engrosamiento de la mucosa e hiperplasia multifocal fúndica, con aumento del
índice de proliferación. Este estado hiperproliferativo inicial dio paso a una
progresiva pérdida de células parietales, atrofia gástrica, hiperplasia foveolar,
metaplasia gástrica y carcinoma gástrico en los animales más viejos, procesos
acelerados por la presencia del Helicobacter (95). La relevancia de estos hallazgos
en el cáncer gástrico humano sigue siendo tema de debate (96). La asociación
entre gastrina y cáncer parece más clara en la neoplasia de colon. Como ya se ha
dicho, la mayoría de pólipos adenomatosos y tumores colorrectales producen el
péptido o sus precursores (24-30), y tanto la gastrina madura como las precursoras
estimulan el crecimiento de las células cancerosas de colon. De hecho, se está
ensayando clínicamente una vacuna contra la gastrina como coadyuvante en el
tratamiento de cáncer de colon (97). Cabe resaltar que el estudio de esta posible
asociación entre gastrina y cáncer se ha enfocado tradicionalmente desde la
perspectiva de sus efectos proliferativos, pero hay estudios recientes que sugieren
que esta hormona puede modificar también otras funciones celulares relevantes en
el proceso canceroso como la migración, invasión y apoptosis de las células
epiteliales o la angiogénesis intratumoral (98). A nosotros nos interesa otra vertiente
de la acción de la gastrina, su posible acción inmunomoduladora. Esta podría
afectar la manera en que el organismo lucha contra el Helicobacter pylori y, con ello,
la patología gástrica que deriva de la infección. Ya en el tumor, y según lo expuesto
en secciones anteriores respecto del importante papel que juega el infiltrado
inflamatorio en la progreso de la enfermedad, cualquier efecto de la gastrina
liberada por las células tumorales a este nivel podría influir en su evolución. Aunque
las primeras indicaciones que apuntaban a una posible acción inmunomoduladora
de la gastrina las encontramos veinte años atrás, éste ha sido un campo
escasamente explorado. Como antecedentes directos encontramos los siguientes:
En estudios in vitro se vio que la CCK inducía un efecto quimiotáctico sobre los
mononucleares de sángre periférica que era revertido por antagonistas de los
receptores CCK1 y CCK2 (99). De la Fuente et al observaron esta quimiotaxis junto
33
con una mayor adherencia y una reducción de la capacidad fagocítica en
macrófagos murinos y PMN humanos tratados con gastrina, aunque no se analizó
la participación del CCK-2R en dichas respuestas (100; 101). Además de estos
efectos directos sobre las células sanguíneas, la gastrina parece modular la función
de las células endoteliales humanas induciendo la liberación de la quimiocina IL-8
(39). Estudios in vivo realizados en nuestro laboratorio demuestran que la gastrina
ejerce un efecto proinflamatorio al provocar la interacción entre leucocitos y células
endoteliales en las vénulas mesentéricas de rata a través de la activación de los
receptores CCK2. De esta manera, la hipergastrinemia desarrollada en los animales
en respuesta al tratamiento con un extracto de Helicobacter pylori o al tratamiento
con antisecretores contribuía a la inflamación observada en estos animales (63;
102).
Con respecto a la respuesta inmunitaria específica, la gastrina parece aumentar la
secreción del factor responsable de la expansión clonal linfocitaria (interleuquina 2)
y estimular el crecimiento de linfocitos de sangre periférica (103). Lo mismo ocurre
en varias líneas celulares linfocíticas, en algunas de las cuales se detectó un efecto
promotor autocrino del crecimiento por la gastrina (34). Dos estudios in vivo
muestran cierta relación entre la secreción / función de la gastrina endógena y la
respuesta linfocitaria al Helicobacter, aunque el papel jugado por la hormona dista
mucho de estar claro. Zavros et al establecieron que el tratamiento con
somatostatina, que inhibe significativamente la secreción de gastrina, puede inhibir
la respuesta Th1 inducida por Helicobacter (104). Otro estudio mostró que el
bloqueo conjunto de los receptores CCK2 y H2 en ratones hipergastrinemicos
infectados con Helicobacter felis provocó un cambio hacia una respuesta Th2 e
inhibió el desarrollo de cáncer (105).
Todas estas evidencias sugieren que la gastrina puede modular la función de las
células del sistema inmune y, por ello, su secreción endógena puede afectar al
desarrollo de procesos inflamatorios locales y quizá también de respuestas
inmunitarias específicas. La relevancia del componente inflamatorio/inmunitario en
las enfermedades en que encontramos secreción anómala de gastrina aconseja la
profundización en el conocimiento de sus efectos a este nivel, lo que ha constituído
el objetivo principal de la presente tesis doctoral.
34
II. OBJETIVOS
35
1. Profundizar en el papel de la gastrina endógena en la respuesta
inflamatoria inducida por Helicobacter pylori y los fármacos
antisecretores en la rata (in vivo)
2. Analizar si la acción proinflamatoria de la gastrin a demostrada en
ratas es esperable en el hombre
3. Determinar el mecanismo de acción de la gastrina so bre la
interacción leucocito-endotelio
4. Estudiar el efecto de la gastrina sobre la función macrofágica
36
III. MATERIAL Y MÉTODOS
37
1. MICROSCOPIA INTRAVITAL
Se emplearon ratas macho Sprague-Dawley de 200 – 250 g (Harlan Laboratorios,
Barcelona, España) que fueron mantenidas con alimento estándar (laboratorio
Purina, España) y agua corriente ad libitum, a una temperatura controlada de
21±1ºC y con un régimen de luz de 07:00 – 19:00 h. El día del experimento se
sometieron a ayuno durante 18 horas.
Tras anestesia con pentobarbital sódico (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, 65
mg/kg, i.p.), se realizó una traqueotomía para mantener una adecuada ventilación
pulmonar y se procedió a canular la arteria carótida para monitorizar la presión
arterial (P.A.M.) mediante un transductor de presión (Spectramed Stathan P-23XL)
conectado a un polígrafo (GRASS RPS7C8B) y la vena yugular para la
administración intravenosa de los diferentes fármacos.
Finalizado este proceso, se realizó una incisión abdominal y se extendió un
segmento del yeyuno medio sobre un pedestal transparente mantenido a 37ºC que
permitió la transiluminación de un área de 2 cm2 de tejido. La ventana seleccionada
del mesenterio expuesto fue continuamente superfundida con una solución tampón
bicarbonatada (NaCl 131.9 mM, KCl 4.7 mM, 7 H2O · MgSO4 1.2 mM, NaHCO3 20
mM a 37ºC y un pH de 7.4) a una velocidad de flujo de 2 ml/min. La preparación se
observó a través de un microscopio intravital ortostático (Nikon Optiphot-2, SMZ1)
equipado con un objetivo 20X (Nikon SLDW) y un ocular 10X. Las imágenes se
proyectaron a través de una cámara de video (Sony SSC-C350P) en un monitor en
color (Sony Trinitron PVM-14N2E) y se grabaron para su posterior análisis
(aumento final, x1300).
Para realizar los experimentos, se seleccionaron vénulas mesentéricas no
ramificadas y cuyo diámetro estuviera entre 25 y 40 µm. El diámetro se medía con
un videocalibrador (Microcirculation Research Institute, Texas A&M University,
College Station, TX). El mesenterio se dejó durante 30 minutos en dichas
condiciones para su estabilización.
38
El número de leucocitos en fase de rodamiento, adheridos y migrados se determinó
posteriormente mediante análisis de las imágenes grabadas.
Un leucocito en fase de rodamiento (“rolling”) es aquél que, por interaccionar con el
endotelio, se mueve a una velocidad inferior a la de los eritrocitos.
El flujo de rodamiento corresponde al número de leucocitos en rodamiento que
cruzan un punto de referencia en el vaso durante un minuto, se expresa como
células/minuto.
La velocidad de rodamiento leucocitario se calcula a partir de la medida del tiempo
requerido por un leucocito para recorrer una distancia de 100 µm del vaso y se
expresa en µm/segundo. Se representa el valor medio obtenido tras la medición de
la velocidad de diez leucocitos en rodamiento.
Se considera que un leucocito está adherido al endotelio venular si permanece
estático durante un periodo igual o superior a 30 segundos, se expresa como nº de
leucocitos /100 µm, el contaje se realiza durante 5 minutos. La migración
leucocitaria se evalúa como número total de leucocitos intersticiales/campo.
La presión arterial sistémica, el diámetro venular, el flujo sanguíneo y el ratio de
cizalla se miden como en trabajos anteriores (63). La velocidad de los eritrocitos
(Vrbc) se mide on-line con el “optical Doppler velocimeter” (Microcirculation
Research Institute). El flujo sanguíneo venular se calcula como el producto de la
velocidad de los eritrocitos y el área seccional, asumiendo que el vaso es un cilindro
geométrico (Vmean = Vrcb x 1.6-1). El ratio de cizalla sobre la pared venular (γ) se
calcula según la definición Newtoniana: γ = 8 x (Vmean Dv-1) s-1, donde Dv es el
diámetro de la vénula.
Al final del experimento se tomó una muestra de sangre portal en tubos con citrato
para la determinación de la gastrinemia por radioinmunoanálisis (RIA) y para el
análisis del patrón de expresión de moléculas de adhesión en leucocitos circulantes
por citometría de flujo (ver sección II.8.a). En algunos casos, el área del mesenterio
seleccionado para el experimento fue extirpada y fijada con paraformaldehído (4%
en PBS, pH 7,4) para su análisis por inmunohistoquímica (IHQ).
39
a. TRATAMIENTOS:
La interacción leucocito-endotelio se ha estudiado en animales que recibieron
tratamientos inductores de hipergastrinemia endógena. En concreto, los estudios se
llevaron a cabo en animales tratados con dosis altas de un inhibidor de la bomba de
protones (omeprazol) combinado o no con un extracto de la bacteria Helicobacter
pylori (HP).
Obtuvimos este extracto de HP a partir de una cepa CagA / VacA (NCTC
11638). Para ello, las bacterias se cultivaron en caldo de Brucella (10-7 UFC / placa)
suplementado con FBS al 5% en una incubadora de dióxido de carbono y a 37 ° C
durante 5 días. Los organismos de HP se recogieron en 1 ml de 0,15 M de NaCl y
se centrifugaron a 3.000 g durante 25 min a 25° C s egún lo anteriormente descrito
(63). El sedimento se resuspendió en un volumen igual de agua destilada estéril,
tras agitarlo durante 45 segundos en el vórtex, se centrifugó a 3.000 g. El
sobrenadante resultante se filtró con ayuda de una malla de nylon (0,2 µm) y
almacenó a -20°C. Los extractos se diluyeron con su ero salino para normalizar el
contenido de proteína total a 100 mg / ml.
Un grupo de ratas se trató durante 14 días con omeprazol (Sigma Chemical, 40
mg/kg/día v.o.) o su vehículo (carboximetilcelulosa 0.2% en suero fisiológico). A otro
grupo de animales, además del omeprazol diario durante 14 días, se le administró
el extracto de HP (1 ml / rata, vía oral) o su vehículo (suero fisiológico) los días 1, 3,
5 y 7 del tratamiento. Algunos de estos animales recibieron proglumida (Sigma
Chemical, 30 mg/kg/día, i.p., 14 días) treinta minutos antes de la administración de
omeprazol u omeprazol+HP. La interacción leucocito-endotelio se evaluó cumplido
el día 14 de tratamiento.
40
TABLA 6. Parámetros hemodinámicos y leucocitarios q ue se determinan con la microscopía intravital.
TIPOS PARÁMETROS UNIDADES
HEMODINÁMICOS
Diámetro venular mm Presión arterial
media mmHg
Ratio de cizalla s-1
LEUCOCITARIOS
Flujo de rodamiento células/minuto Velocidad de rodamiento µm/s
Adhesión leucocitaria células/100 µm Migración
leucocitaria células/campo
2. DETECCIÓN DEL RECEPTOR CCK2 POR INMUNOHISTOQUÍMICA
Se realizaron estudios inmunohistoquímicos en tejido mesentérico y colon de rata,
así como en biopsias colónicas humanas obtenidas de pacientes sujetos a
colonoscopia diagnóstica en el Hospital de Manises.
El tejido mesentérico de la rata se separó de la grasa que lo rodea y se montó en
portas gelatinizados. La preparación se fijó durante 10 minutos con
paraformaldehido al 4% en PBS (pH 7.4), luego se realizaron lavados con PBS y se
sumergió en metanol (-20ºC) durante 5 minutos, tras lo cual, se dejó secar. Las
muestras colónicas de rata y humanas se fijaron con paraformaldehido al 4% y se
montaron en bloques de parafina, tras lo cual se obtuvieron cortes histológicos de 5
µm de grosor.
En el caso del tejido mesentérico, tras la restitución antigénica con alfa-
quimotripsina (1 mg/ml, 37ºC, 20 min) y el bloqueo con BSA al 1% y suero de cabra
al 10% en TBS, la preparacion se incubó durante la noche con un anticuerpo
policlonal de conejo frente al receptor CCK2 (Abcam, Cambridge, Reino Unido;
dilución 1/100, 4ºC). Posteriormente, se incubó con un anticuerpo secundario frente
a IgG de conejo, generado en cabra y conjugado con peroxidasa (Southern Biotech,
41
dilución 1/100, tª ambiente, 2 horas). Finalmente, se realizó el revelado con “DAB
Enhanced Liquid substrate System for Immunohistochemistry” (Sigma Chemical) y
se tiñó con eosina y hematoxilina.
El mismo proceso se siguió para la identificación de macrófagos en el mesenterio.
Para ello, usamos un anticuerpo monoclonal de ratón frente a
macrófagos+granulocitos (OX41, Abcam, dilución 1/400) y un anticuerpo de conejo
frente a IgG de ratón conjugado también con peroxidasa como anticuerpo
secundario. Por ello, en este caso, el bloqueo fue realizado con suero de conejo y
BSA 1%.
Los cortes histológicos de colon de rata y humano se deparafinaron e hidrataron
con xileno y concentraciones decrecientes de etanol, tras lo cual se procedió a la
restitución antigénica con alfa-quimotripsina (1 mg/ml, 37ºC, 15 min) y el bloqueo
con BSA al 1% y suero de caballo al 4% en PBS. Las muestras se incubaron
entonces con el anticuerpo anti-CCK-2R utilizado anteriormente o un anticuerpo
marcador de macrófagos generado en ratón (MAC387, Vector Labs, Peterborough,
Reino Unido). En estos casos utilizamos un anticuerpo secundario de caballo frente
a IgG de conejo y ratón marcado con biotina y seguido de avidina conjugada con
peroxidasa (Vectastain ABC Kit, Vector Labs). Finalmente, se realizó el revelado con
“DAB Enhanced Liquid substrate System for Immunohistochemistry” (Sigma
Chemical) y se tiñó con hematoxilina.
En todos los casos, se realizaron controles de especificidad de la señal siguiendo el
mismo proceso descrito pero omitiendo bien el anticuerpo primario o el secundario
en muestras análogas.
3. CULTIVO CELULAR
Se utilizaron células endoteliales (HUVEC, Human Umbilical Vein Endothelial Cells)
obtenidas de cordones umbilicales frescos (máximo 24 horas, suspendidos en PBS
y mantenidos en hielo) del Hospital Clínico de Valencia. Las células se extrajeron
por tratamiento con colagenasa (Gibco, Grand Island, NY), y se cultivaron en medio
EBM-2 suplementado con suero fetal bovino (2% v/v), hidrocortisona (0,2 µg/mL),
hFGF-B (10 ng/mL), VEGF (0,5 ng/mL), R3-IGF-1 (20 ng/mL), ácido ascórbico (1
42
µg/mL), hEGF (5ng/mL), heparina (22,5 g/mL), penicilina (50 unidades/mL),
estreptomicina (50µg/mL) y fungizona (2,5 µg/mL) (Lonza, Walkersville, Maryland).
Las células se cultivaron y mantuvieron en incubador para cultivo celular (IGO 150,
Jouan) a 37 ºC, en atmósfera húmeda de 95% aire / 5% CO2 (AirLiquide). Todos los
experimentos se realizaron con células de primer pase.
También se utilizaron células monocitarias de la línea celular U937 obtenidas de la
European Collection of Cell Cultures y mantenidas en suspensión con medio RPMI -
1640 (Sigma Aldrich) suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor (5%,
Lonza, Basilea, Suiza), 2 mM de L-glutamato (Sigma Chemical), penicilina (50
unidades/mL) y estreptomicina (50µg/mL). Se realizaron cambios de medio celular
cada tres días.
4. FRACCIONAMIENTO DE LEUCOCITOS MONONUCLEARES Y
POLIMORFONUCLEARES A PARTIR DE SANGRE PERIFÉRICA
Se utilizó sangre periférica obtenida de donantes sanos del Hospital Clínico de
Valencia, tratada con citrato como anticoagulante. Los leucocitos se aislaron por
centrifugación en gradiente de Ficoll (GE Health care, Suecia). Para ello, la sangre
se incubaba con dextrano (3% en suero fisiológico) durante 45 minutos a
temperatura ambiente. El sobrenadante se vertía sobre Ficoll y se centrifugaba
(250g, 25 minutos). Se obtenía así una fase intermedia en forma de halo que
contiene las células mononucleares y un sedimento que contiene los neutrófilos y
eritrocitos. Para obtener los leucocitos mononucleares aislados de sangre periférica
(LMSP) se extraía la fase intermedia y se centrifugaba (10 min, 100g). El pellet se
lavaba con Hank’s Balanced Salt Solution sin Ca2+ ni Mg2+ (HBSS, Lonza, Verviers,
Bélgica) y las células se resuspendían en medio de cultivo RPMI o X-VIVO 15
(Lonza, Verviers, Bélgica) según se fuesen a utilizar en los experimentos de
interacción leucocito-endotelio o se pretendiese obtener macrófagos
respectivamente. Los leucocitos polimorfonucleares se obtenían tras resuspender el
sedimento en solución de lisis (5 min), centrifugar (100g, 5 min) y lavar con HBSS.
Las células se resuspendían finalmente en medio RPMI completo.
43
5. DERIVACIÓN A MACRÓFAGOS
Los LMSP se sembraban en placas de 24 pocillos a razón de 10 millones de células
por pocillo con 0.5ml de medio, se mantenía a 37°C por 30 minutos y se lavaban las
células 2 veces con 0.5 ml de HBSS por pocillo, luego se agregaba a cada pocillo
0.5 ml del mismo medio de cultivo celular. El cultivo se mantenía por 5-7 días a
37°C hasta que las células monocitarias se habían d iferenciado a macrófagos,
cambiando el medio de cultivo cada 2-3 días.
Como medio de cultivo utilizamos inicialmente medio RPMI suplementado con
suero fetal bovino inactivado por calor (5%, Lonza, Basilea, Suiza), 2 mM de L-
glutamato (Sigma Chemical), penicilina (50 unidades/mL) y estreptomicina
(50µg/mL) {455}. Posteriormente, y debido al escaso rendimiento obtenido con este
procedimiento, pasamos a cultivar los monocitos en medio X-VIVO 15
suplementado con suero fetal bovino (1%) reconstituido además con M-CSF
humano recombinante (Peprotech, Londres, Reino Unido, 20 ng/ml) {456}. De
forma paralela, fuimos reduciendo el tiempo de cultivo de 7 a 5 días, ya que
observamos que este tiempo era suficiente para su diferenciación en estas
condiciones y, el postergar su utilización suponía a menudo una pérdida
significativa de células.
6. INTERACCIÓN LEUCOCITO-ENDOTELIO.
a. INTERACCIÓN LEUCOCITO-ENDOTELIO EN
CONDICIONES ESTÁTICAS
Para analizar la adhesión de las células U937 o los leucocitos polimorfonucleares a
las células endoteliales en condiciones estáticas, las células leucocitarias se
incubaron con calceína-AM (20 µM, 20min, 37ºC, Sigma Chemical), compuesto que
emite una señal fluorescente (longitud de onda de excitación: 496 nm; de emisión:
516 nm). Los leucocitos marcados (106 células / ml) se vertieron sobre HUVEC
confluentes sembradas en placa de 24 pocillos y se incubaron durante 1 hora a 37°
C y 5% de CO2. Posteriormente, los leucocitos no adheridos se eliminaron por
medio de exhaustivos lavados.
44
Las células se lisaron con zwittergent (4 mM), y el número de leucocitos adherentes
se determinó mediante la medición de la fluorescencia emitida por el lisado celular
con un lector de placas Fluoroskan Ascent FL (Thermo Labsystems, SN: 374-
17000C, Finlandia). El experimento se realizó en presencia o ausencia de
diferentes concentraciones de gastrina (Sigma Chemical, 10-11 a 10-7 M). Algunos
pocillos se trataron con factor de necrosis tumoral-α (TNF-α, Sigma Chemical St.
Louis, MO 10 ng/ ml, 4 horas) y se utilizaron como control positivo.
En otra serie de experimentos, para establecer las células diana de la gastrina, las
HUVEC y las células U-937 se trataron por separado con las diferentes
concentraciones de gastrina por 1 hora y, tras lavado para retirar el péptido, se
realizaron ensayos de adhesión con células U-937 y HUVEC no tratadas,
respectivamente.
Para determinar el papel del CCK-2R en la adhesión, utilizamos el antagonista
específico del CCK-2R: L-365,260 (ML Laboratories, Liverpool, Reino Unido). Para
lo cual tratamos las HUVEC con gastrina (a las concentraciones ya mencionadas)
en presencia o ausencia del antagonista (10-7M) o de su vehículo (DMSO al
0.001%).
b. INTERACCIÓN LEUCOCITO-ENDOTELIO EN
CONDICIONES DINÁMICAS (CÁMARA PARALELA DE
FLUJO)
Para analizar la interacción leucocito-endotelio in-vitro en condiciones dinámicas,
las células endoteliales se sembraron en cubre-objetos circulares pretratados con
fibronectina. Cuando las células alcanzaron confluencia, fueron tratadas según lo
descrito más adelante. Tras el tratamiento, se lavó el cubre-objetos con HBSS y se
colocó en una cámara paralela de flujo termostatizada a 37°C (Ver figura 1) por la
cual fluían los leucocitos suspendidos en DBPS+albúmina (1 millón de células / ml)
por acción de una bomba de infusión / succión. La velocidad de flujo se estableció
en 0.36 ml / minuto (que corresponde a una tensión de cizalla de 1 dina/cm2). El
flujo de las células leucocitarias y su interacción con la monocapa endotelial se
observó a través de un microscopio (Nikon Eclipse TE 2000-S), equipado con una
videocámara digital (Sony Exwave HAD), que a su vez está conectada a un
45
ordenador donde se visualizan los eventos en tiempo real y se graban las imágenes
(Ver montaje en figura 2). El software utilizado para observar y grabar es Pinacle
Studio. La grabación de los eventos se inició al visualizar la interacción leucocito-
endotelio y se grababan vídeos de 5 minutos.
1. Medición de parámetros:
Las mediciones se realizaron en los vídeos grabados y los parámetros evaluados,
análogos a los descritos para los experimentos in vivo, son los siguientes:
Número de células leucocitarias en rodamiento (“Rol ling”): se contaban las
células leucocitarias en rodamiento sobre 100 µm2 de la monocapa endotelial en 1
minuto. Para ello se disminuyó la velocidad del vídeo a la mitad de la real. El dato
obtenido se expresó como Número de leucocitos en rodamiento / minuto.
Velocidad de leucocitos en rodamiento: se medía el tiempo en segundos que
tardaban 12 leucocitos en rodamiento en recorrer 100 µm. Con este dato se calculó
la velocidad, que se expresó en µm / segundo.
Adhesión: se contaban los leucocitos que se mantenían adheridos a la monocapa
endotelial o que tardaban más de 30 segundos en recorrer una distancia de 100
micrómetros en la totalidad del campo grabado y en un lapso de 5 minutos. Los
resultados se expresaron como Número de leucocitos adheridos / mm2.
2. Tratamientos:
Las células endoteliales cultivadas en los cubre-objetos se incubaron durante 4
horas con vehículo, diferentes concentraciones de gastrina (10-10 M a 10-7 M) o
TNF-α (10 ng/ml), que sirve como control positivo. También se trataron leucocitos
(PMN y monocitos) extraídos de sangre periférica con las mismas concentraciones
de gastrina o PAF 10-7M (Sigma Chemical St. Louis, MO) como control positivo; en
este caso el tratamiento duró 15 minutos.
Para analizar la posible implicación del receptor CCK2 en los efectos inducidos por
la gastrina, las células se trataron con el antagonista L-365,260 (10-7M) o su
vehículo (DMSO al 0.001%) 10 minutos antes de añadir la gastrina (10-7M).
46
A fin de determinar si las moléculas de adhesión endoteliales cuya expresión se vio
afectada por la gastrina en los experimentos de citometría (ver más adelante)
estaban implicadas en las interacciones leucocito-endotelio inducidas por la
hormona, en algunos casos se añadió el correspondiente anticuerpo bloqueante
(Tabla 8, página 51), 30 minutos antes de realizar el experimento en la cámara
paralela de flujo.
47
7. ESTUDIOS REALIZADOS EN CÉLULAS ENDOTELIALES
a. PRUEBA DE VIABILIDAD CELULAR
Hemos utilizado la medición de la respiración celular como parámetro indicativo de
viabilidad de las células endoteliales. Se cuantifica la reducción mitocondrial de
bromuro de 3 - [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolio (MTT) a formazán. Las
HUVEC fueron tratadas con diferentes concentraciones de gastrina (10-9 a 10-7 M,
37°C, 1 ó 4 h), tras lo cual, el medio se reemplazó por medio con MTT (0,2 mg / ml)
y se incubaron por otros 30 minutos. Finalmente, se retiró el medio, se disolvieron
las células en dimetilsulfóxido y la conversión de MTT a formazán se cuantificó por
medición de la densidad óptica a 550 nm con una corrección de longitud de onda de
650 nm.
b. DETECCIÓN DE LA UNIÓN DE GASTRINA A RECEPTORES
CCK2 EN HUVEC.
La interacción entre la gastrina y los receptores CCK2 en HUVEC se analizó por
medición de la unión de un derivado de la gastrina marcado con fluorescencia
[Rodamina verde heptagastrina (RG-7P)]. Las HUVEC se incubaron con RG-7P (10-
7 M) durante 30 minutos en presencia o ausencia de gastrina no marcada (de 10-7 a
10-5 M) o de un antagonista del receptor CCK2 (L-365,260, de 10-8 a 10-6 M). Las
células se lisaron con zwittergent (4 mM), y la medición de la fluorescencia emitida
por el lisado celular se realizó con un lector de placas Fluoroscan Ascent FL
(Thermo Lab Sistems, Finlandia).
c. DETECCIÓN DE MOLÉCULAS DE ADHESIÓN EN CÉLULAS
ENDOTELIALES
Las células endoteliales se incubaron a 37ºC durante diversos periodos de tiempo
con vehículo, estímulos positivos correspondientes a cada molécula o gastrina (10-
11-10-7M). El efecto de dichos tratamientos sobre la expresión de diversas moléculas
de adhesión (P-selectina, E-selectina, ICAM-1, VCAM-1) en la superficie celular se
analizó por dos técnicas diferentes:
48
1. Citometría de flujo:
Las células cultivadas y tratadas en placas de 24 pocillos se fijaron con
paraformaldehído y se mantuvieron durante 20 min con cantidades saturantes (10
µl) de anticuerpos específicos frente a las diferentes moléculas de adhesión
conjugados con FITC (Tabla 8, página 51), tras lo cual, se tripsinizaron. El análisis
se llevó a cabo con un citómetro de flujo EPICS XL-MCL (Coulter electronics).Todos
los experimentos se realizaron por duplicado y se analizaron diez mil eventos por
muestra. Se utilizaron anticuerpos del mismo isotipo y con el mismo fluorocromo,
pero sin ninguna especificidad relevante, como control de la especificidad del
marcaje.
2. Microscopía de fluorescencia (citometría estática)
Las células endoteliales cultivadas y tratadas en placas de 48 pocillos se incubaron
con Hoechst 1 nM para teñir los núcleos celulares, y 5 µl de anticuerpo frente a las
diferentes moléculas de adhesión o de anticuerpo control; todos marcados con
FITC. Tras lavar las células con HBSS, la señal fluorescente emitida por las mismas
se registró mediante un microscopio motorizado (IX81, Olympus) programado para
tomar las imágenes correspondientes a la fluorescencia emitida por Hoescht y por
FITC en 9 campos por pocillo. Las imágenes se analizaron mediante el programa
ScanR, el cual proporciona los valores de intensidad de fluorescencia emitida por
los objetos identificados mediante la tinción nuclear y genera histogramas análogos
a los que proporciona la citometría de flujo.
d. DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS DE
ADHESIÓN POR RT-PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL
HUVEC sembradas en pacas de cultivo de 6 pocillos y con confluencia de 90 a
100% fueron tratadas durante 4 horas con gastrina (10-9-10-7M), TNF-α (20ng/ml) o
vehículo (HBSS). En otro protocolo de tratamiento las HUVEC fueron pretratadas
con LY294002 (10µM, Calbiochem, USA) un inhibidor de PI3K, “Thyrphostin” AG490
(10µM, Sigma Aldrich) un inhibidor de JAK2 o vehículo (DMSO 0,001% o etanol
0,06% respectivamente) por 30 minutos y luego se incubaron con gastrina (10-8 M)
por 4 horas. Al finalizar el tratamiento las células se lavaron con HBSS y se extrajo
49
su ARNm con un equipo RNEASY Mini (Qiagen, Valencia, CA). La síntesis del
correspondiente cDNA y la PCR cuantitativa se llevaron a cabo según lo descrito
anteriormente (106). Se utilizó ciclofilina humana como gen constitutivo para
normalizar los valores obtenidos de la PCR con el cebador de VCAM-1. La
secuencia de los cebadores y las condiciones del procedimiento se detallan en la
tabla siguiente:
TABLA 7. Cebadores utilizados y condiciones en que se realizaron las RT-PCR
Gen diana
Secuencias de los cebadores
(5’-3’)
tann
(ºc)
PCR
ciclos
tamaño
(pb)
rVCAM-1 ttccctagagatccagaaatcgag (s)
gctctgtcactgtaagctgcaag (as) 60 30 72
rCyPA cgtctgcttcgagctgtttg (s)
gtaaaatgcccgcaagtcaa (as) 58 29 415
tann= Tiempo de “annealing”; pb= # de pares de base s; (s)= “sense”; (as)= “antisense”.
50
8. ESTUDIOS REALIZADOS EN LEUCOCITOS DE SANGRE
PERIFÉRICA
a. DETECCIÓN DE MOLÉCULAS DE ADHESIÓN EN
LEUCOCITOS DE RATA Y HUMANOS POR CITOMETRÍA DE
FLUJO.
Por un lado, se analizó la expresión de moléculas de adhesión en leucocitos
procedentes de las muestras sanguíneas de ratas control o tratadas con omeprazol
(40 mg/kg/día, 14 días) obtenidas desde la vena portal al final del experimento de
microscopía intravital. Algunos animales también recibieron proglumida (30
mg/kg/día, 14 días).
El segundo grupo de experimentos se dedicó a evaluar el efecto del tratamiento in
vitro con gastrina sobre la expresión de moléculas de adhesión en leucocitos de
rata. Para ello, muestras de sangre (40 µl) obtenidas de ratas control se incubaron
durante 45 minutos a 37 ° C con vehículo (HBSS), ga strina de 10-9 a 10-11 M, y
controles positivos: N-formil-L-metionil-Lleucyl-L-fenilalanina (FMLP; 10-7 M, Sigma
Aldrich) para los PMN o forbol 12-miristato 13 - acetato (PMA 10-7 M, Sigma Aldrich)
para los monocitos o linfocitos. Las concentraciones de gastrina utilizadas se
corresponden con las que inducen interacción leucocito-endotelio en mesenterio de
rata.
Por último, el análisis de la expresión de moléculas de adhesión de leucocitos
humanos se llevó a cabo en muestras de sangre citratada obtenidas de donantes
sanos del Hospital Clínico de Valencia. Para ello, las muestras de sangre (40 µl) se
transfirieron a tubos de centrífuga de polipropileno y se trataron (15 minutos, 37ºC)
con vehículo, PAF (10-6M), FMLP (10-7M) o gastrina (10-11M a 10-7M).
En todos los casos, las muestras sanguíneas se incubaron durante 30 minutos en
hielo y oscuridad con cantidades saturantes (10 µl) del correspondiente anticuerpo
conjugado con FITC.
51
Las moléculas de adhesión analizadas fueron las siguientes: L-selectina, Mac-1
(CD11b/CD18), la subunidad alfa de las integrinas ß2 (CD11a y CD11c), la
subunidad común de estas integrinas ß2 (CD18) y la cadena alfa 4 de VLA4 (CD49)
(ver tabla 8, página 51). Se utilizaron anticuerpos control para verificar la
especificidad del marcaje. El procesamiento de los glóbulos rojos y la fijación de los
leucocitos se llevó a cabo mediante un procedimiento de lisis automática con el
sistema EPICS TQ-PREP (Coulter Electronics). Los neutrófilos, monocitos y
linfocitos se identificaron a través del análisis "forward- and right-angle light scatter”.
Todos los experimentos se realizaron por duplicado y se analizaron diez mil eventos
por muestra. Dicho análisis se llevó a cabo con un citómetro de flujo EPICS XL-MCL
(Coulter electronics).
9. ESTUDIOS REALIZADOS EN MACRÓFAGOS
a. MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA EN MACRÓFAGOS.
1. Producción de radicales libres.
Los macrófagos obtenidos tras cultivar células mononucleares en medio RPMI
suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor (5%), 2 mM de L-
glutamato (Sigma Chemical), penicilina (50 unidades/mL) y estreptomicina
(50µg/mL) durante 7 días, se trataron con gastrina (10-9 a 10-7 M), en presencia o
ausencia de un antagonista del receptor CCK2 (CR2945, 10-8 M). Treinta minutos
más tarde, se lavaron con PBS y se incubaron durante otros 30 minutos con
hoescht 1nM para teñir los núcleos y dihidroetidio (DHE, Invitrogen, Oregon, 50
µM). El DHE, al entrar en la célula es oxidado por el superóxido a etidio, el cual
emite la fluorescencia a 610 nm, por lo que la intensidad de fluorescencia emitida
es indicativa de la concentración de ion superóxido. Finalmente, se lavaron con
HBSS, se añadió medio RPMI sin rojo fenol (Sigma Aldrich, 500 µl / pocillo) y se
midió la fluorescencia en el microscopio motorizado (IX81, Olympus) de forma
análoga a lo descrito para las células endoteliales (citometría estática).
52
2. Detección de CD86 Y CD163
Los macrófagos obtenidos tras cultivar células mononucleares en medio X-VIVO 15
+ suero fetal bovino 1% + M-CSF (20 ng/ml) durante 6 días, se trataron con el
lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli (serotipo 0111:B4, 100 µg/ml, Sigma) e
interferón-γ (IFNγ, 20 ng/ml, Peprotech) o sus vehículos, y en presencia o ausencia
de gastrina 10-7 M por 24 horas. Al finalizar este periodo, se detectó la expresión de
CD86 por citometría estática. Para ello, los macrófagos se incubaron durante 30
min con hoescht 1nM y un anticuerpo frente a CD86 conjugado con FITC (BD
Bioscience, San José, CA) o anticuerpo control. Tras lavar con HBSS, se añadieron
500 µl de RPMI sin rojo fenol en cada pocillo y se midió la fluorescencia en el
microscopio motorizado.
La detección de CD163 se llevó a cabo en macrófagos obtenidos tras cultivar
células mononucleares en medio X-VIVO 15 + FBS 1% + M-CSF (20 ng/ml) durante
5 días. Dichas células se trataron con interleuquina-4 (IL-4, 20 ng/ml, Peprotech),
interleuquina-10 (IL-10, 10 ng/ml, Peprotech) o sus vehículos y en presencia o
ausencia de gastrina 10-7 M por 24 horas. Utilizamos un anticuerpo frente a CD163
conjugado con ficoeritrina (BD Bioscience, San José, CA) procediendo como en el
caso de la medición de CD86.
3. Detección de citocinas por ELISA
El medio de cultivo de los macrófagos tratados según el apartado anterior, se
centrifugó para eliminar las células en suspensión y se guardó a -25°C para la
posterior detección por ELISA de interleuquina-10 (IL-10), interleuquina-12 (IL-12) y
TNFα, así como de la quimiocina MCP-1. Para ello, se utilizaron los siguientes kits:
Eli-pair IL-10 y Eli-pair IL-12p70 (ambos de Diaclone), y Human TNF-α ELISA
Development Kit y Human MCP-1 ELISA Development Kit (ambos de PeproTech).
Se siguieron los protocolos indicados por el fabricante en cada uno de ellos y la
absorbancia se midió con un Multiscan ascent (Thermo lab sistems, Mod: 354)
utilizando el filtro apropiado en cada caso.
53
10. EXPRESIÓN DE RESULTADOS, ANÁLISIS ESTADÍSTICO, Y
NORMAS DEONTOLÓGICAS
Todos los resultados se han expresado como media aritmética + error estándar de
la media (EEM), para un mínimo de cuatro experimentos realizados. Si no se
indica lo contrario, los resultados han sido analizados mediante el test One-way
ANOVA seguido del test de Newman-Keuls. En algunos casos, se ha aplicado este
mismo test pero ajustado para medidas repetidas. La diferencia entre grupos se ha
considerado significativa cuando P< 0.05.
Todos los experimentos realizados en animales se llevaron a cabo según las
directrices europeas y fueron aprobados por el Comité Ético para la Investigación
Experimental de la Facultad de Medicina de la Universidad de Valencia.
Los cordones umbilicales y las muestras de sangre fueron obtenidos del Hospital
Clínico Universitario de Valencia, mientras las biopsias colónicas se colectaron en el
Hospital de Manises. En todos los casos se procedó según lo establecido en las
normas deontológicas establecidas sobre experimentación humana de Helsinki y
sus actualizaciones posteriores incluyendo el preceptivo consentimiento informado
por parte del voluntario o representante legal.
54
TABLA 8. Anticuerpos utilizados en cada procedimien to.
Procedimiento Anticuerpo utilizado Origen
Interacción leucocitos humanos-endotelio (HUVEC) in-vitro.
Anticuerpo bloqueante de VCAM-1
Bioscience, San José, CA
Anticuerpo bloqueante de P-selectina
R&D Systems.
Detección de moléculas de adhesión endoteliales y leucocitarias
Anti VCAM-1, ICAM-1, P-selectina,E-selectina, L-selectina, CD18, CD11a, CD11b, CD11c, o CD49d conjugados con FITC o PE
Serotech, Burlington, Canadá.
Inmunohistoquímica, deteccción de CCK-2R en macrófagos
Anticuerpo policlonal de conejo anti CCK2
Abcam, Cambridge, Reino Unido
Anticuerpo 2º anti-IG-G de conejo
Southern Biotech
Anticuerpo monoclonal de ratón anti macrófagos-granulocitos [OX41]
Abcam
Anticuerpo monoclonal de ratón anti- macrófagos generado en ratón [MAC387]
Vector Labs, Peterborough, Reino Unido.
Microscopía de fluorescencia en macrófagos
Anticuerpo anti- CD86 conjugado con FITC y Anticuerpo anti- CD163 conjugado con PE
BD, Bioscience, San José, CA
55
FIGURA 6. Montaje de las HUVEC en la cámara de fluj o paralelo. Se muestran las dos placas que conforman la cámara, “A” indica el canal por donde circula la suspensión leucocitaria. La suspensión entra por el tubo de la derecha y sale por el de la izquierda. “B” corresponde al cubreobjetos donde se encuentran sembradas las HUVEC. El canal A se colocará sobre el cubreobjetos. La imagen “C” muestra ambas placas unidas y listas para cerrarse con los tornillos y ponerse en el microscopio. Los cables que se ven en la parte superior de la cámara son los que se conectarán al regulador de temperatura que la mantendrá a 37 ºC.
B
A
C
56
FIGURA 7. Montaje del sistema completo. “A” Se observa la cámara colocada sobre el objetivo del microscopio. “B” Jeringa con suspensión de células mononucleares conectada a la cámara a travésde un tubo. “C” regulador de temperatura conectado a la cámara. “D” bomba de succión conectada a la cámara por el tubo. “E” cámara de video adaptada al objetivo del microscopio y conectada al ordenador. “F” pantalla del ordenador exponiendo en tiempo real los sucesos que registra la cámara.
C
D
E
A
B
F
57
IV. RESULTADOS
58
1. ANÁLISIS DEL EFECTO DEL OMEPRAZOL Y EL EXTRACTO DE H.
PYLORI SOBRE EL PROCESO INFLAMATORIO.
El estudio de las interacciones leucocito-endotelio por microscopía intravital en ratas
tratadas durante 14 días con omeprazol (40 mg / kg v.o.) mostró que dicho
tratamiento incrementa el flujo de leucocitos en rodamiento, disminuye su velocidad,
aumenta el número de leucocitos adheridos y su migración. En todos los casos el
efecto pro-inflamatorio es reducido o revertido por el antagonista de CCK-2R
proglumida. Se observa un efecto pro-inflamatorio similar con la combinación de
omeprazol y extracto de H. pylori, si bien tiende a ser mayor sobre la velocidad de
rodamiento y la adhesión. En este grupo observamos un menor flujo de leucocitos
en rodamiento quizá como consecuencia de la lentitud de su desplazamiento. La
proglumida revierte de forma significativa el incremento en el número de leucocitos
en rodamiento y adheridos, y de forma parcial (no significativa) la ralentización de
las células en rodamiento. Cuando analizamos los datos de migración de los cinco
grupos por ANOVA, se obtiene un valor de p de 0.031 pero el test de Newman-
Keuls no establece diferencias significativas entre los diferentes grupos (Figura 8,
siguiente página). Cabe puntualizar que este test indica significatividad estadística
si se compara el efecto de los dos tratamientos con el control (omeprazol vs control
y omeprazol + HP vs control, p<0.05 en ambos casos, ANOVA+Newman-Keuls), o
si se analiza el efecto de la proglumida sobre cada uno de estos tratamientos
(tratamiento vs control y tratamiento vs proglumida+tratamiento, p<0.05 en ambos
casos, ANOVA+Newman-Keuls). Ninguno de estos tratamiento indujo cambios
significativos en los parámetros hemodinámicos (presión arterial sistémica, diámetro
venular, flujo sanguíneo y ratio de cizalla).
Los animales control mostraron una gastrinemia de 32±3 pg/ml, mientras que las
ratas tratadas con omeparazol u omeprazol combinado con el extracto de HP
presentaron niveles plasmáticos de gastrina de 78±6 y 62±12 pg/ml
respectivamente (p<0.05 vs control en ambos casos).
59
0
25
50
75
100
125
150 (A) Proglumida
Rod
amie
nto
(Nº
leuc
ocito
s/m
inut
o)
+++
***
+++
**
0
25
50
75
100
125 (B)
Vel
ocid
ad d
e ro
dam
ient
o( µµ µµ
m/s
egun
do)
+++
***
***
0
4
8
12 (C)
Ome Ome + HP
Adh
esió
n(N
º le
ucoc
itos/
cam
po)
+++
+++
***
***
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0 (D)
Ome Ome + HP
Mig
raci
ón(N
º le
ucoc
itos/
cam
po)
FIGURA 8. La hipergastrinemia endógena inducida por omeprazol (ome) o la combinación de omeprazol con un extracto de Helicobacter pylori (ome+HP) por 14 días provoca inflamación en el mesenterio de la rata. Medición in-vivo de la interacción entre leucocitos y células endoteliales en venas post-capilares de mesenterio de rata. Los animales se trataron durante 14 días consecutivos con omeprazol (40 mg/kg/día, v.o.) combinado o no con el extracto de HP los días 1, 3, 5 y 7 del tratamiento. Algunos de estos animales se cotrataron con el antagonista del receptor CCK2 proglumida (30 mg/kg/día, i.p., 14 días). Resultados expresados como media + EEM. +++ p < 0.001; ++ p < 0.01 vs vehículo; *** p < 0.001; ** p < 0.01 vs mismo tratamiento en ausencia de proglumida. (D): ANOVA p= 0.0315.
El análisis por citometria de flujo de las moléculas de adhesión en los leucocitos de
los animales tratados con omeprazol durante 14 días, mostró una reducción en la
presencia de L- selectina y un aumento de CD11b, ambos significativos, en
monocitos y linfocitos. Sin embargo, no hubo cambios apreciables en los PMN.
Observamos además que la proglumida revirtió la activación leucocitaria, siendo
esta reversión significativa en el caso de los monocitos (Figura 9, página siguiente).
60
FIGURA 9. La hipergastrinemia endógena provocada po r omeprazol (40 mg/kg/día, v.o., 14 días) provoca activación leucoc itaria en ratas. Se muestra la expresión de L-selectina y CD11b en leucocitos procedentes de los animales en los que se analizó la interacción leucocito-endotelio in vivo (Figura 1). Algunos de estos animales se cotrataron con proglumida (30 mg/kg/día, i.p., 14 días). La expresión de estas moléculas de adhesión se analizó por citometría de flujo en las muestras de sangre portal obtenidas al final del experimento y se representan datos de media de fluorescencia. Resultados expresados como media + EEM. * p <0.05 vs respectivo control; + p <0.05 vs respectivo valor en animales tratados únicamente con omeprazol (RM [“repeated measures”] - ANOVA+Newman keuls).
Al estudiar el efecto sobre la expresión de CD11b del tratamiento in vitro con
gastrina (10-11 a 10-9 M) en sangre de ratas no tratadas, observamos que para
ningún grupo celular leucocitario hubo aumento de la expresión de dicha molécula
(Figura 10).
FIGURA 10. El tratamiento in vitro con gastrina no provoca activación leucocitaria en sangre de rata. Expresión de CD11b en leucocitos de animales control incubados in vitro con diferentes concentraciones de gastrina (de 10-11 a 10-9 M). Se usaron como controles positivos: Formil-metionil-leucil-fenilalanina (FMLP, 10-7 M) o forbol 12-miristato 13 - acetato (PMA, 10-7 M). La expresión de las moléculas de la adhesión fue analizada por citometría de flujo. Los resultados se expresan como porcentaje de los valores de fluorescencia obtenidos en las muestras tratadas con el vehículo.
0
5
10
15
PMN MON LINF
*
+
*
VehículoOmeprazolOme+Progl
L-S
elec
tina
(Flu
ores
cenc
ia m
edia
)
0
10
20
PMN MON LINF
*+
*
CD
11b
(Flu
ores
cenc
ia m
edia
)
LINFOCITOS
0
50
100
150
-11 -10 -9Gastrina (log[M])
PMA
CD
11b
(% v
s co
ntro
l)
MONOCITOS
0
100
200
-11 -10 -9Gastrina (log[M])
PMA
CD
11b
(% v
s co
ntro
l)
PMN
0
50
100
150
-11 -10 -9Gastrina (log[M])
FMLP
CD
11b
(% v
s co
ntro
l)
A B C
61
2. EFECTO DE LA GASTRINA SOBRE LA INTERACCIÓN
LEUCOCITO-ENDOTELIO EN CÉLULAS HUMANAS IN-VITRO EN
CONDICIONES ESTÁTICAS Y DINÁMICAS.
Al estudiar la adhesión de leucocitos a una monocapa de HUVEC en condiciones
estáticas se observó que la gastrina (10-11 a 10-7M) produjo un aumento significativo
de la adhesión de las células monocitarias (U-937) de forma concentración-
dependiente (Figura 11A, ver página siguiente), sin embargo no tuvo efecto sobre la
adhesión de los PMN (Figura 11B). Cuando investigamos el efecto de la gastrina
sobre U-937 y la monocapa de HUVEC por separado, observamos un aumento de
la adhesión al tratar la monocapa de HUVEC (Figura 12ª, ver página 63); hecho que
no se observó cuando se pusieron células U937 tratadas con gastrina sobre
HUVEC no tratadas (Figura 12B).
Los experimentos realizados en condiciones dinámicas en cámara de flujo paralelo
mostraron que el tratamiento de la monocapa de HUVEC con gastrina incrementaba
de forma concentración-dependiente las interacciones de los leucocitos
monucleares con las células endoteliales. Este efecto fue evidenciado por un
aumento significativo del flujo de células en rodamiento y en la adhesión, al tiempo
que una disminución significativa de la velocidad de rodamiento (Figura 13, ver
página 64). El tratamiento de las células mononucleares no produjo variaciones
significativas en los parámetros cuando éstas circulaban sobre HUVEC no tratadas
(Figura 14, ver página 65). Cuando pusimos a circular los PMN sobre HUVEC
tratadas con gastrina (10-7 M) no se observaron cambios significativos en el flujo de
leucocitos en rodamiento (118 ± 61 % vs control), en la velocidad de rodamiento
(122± 14 % vs control) o la adhesión leucocitaria (65± 44 % vs control).
La prueba de transformación de MTT a formazán mostró que el tratamiento de las
HUVEC con gastrina a las concentraciones utilizadas en los experimentos de
interacción leucocito-endotelio durante 1 ó 4 h, no inducía cambios significativos
con respecto a las células tratadas con vehículo, lo que nos indica que la gastrina
no afecta la viabilidad de las células endoteliales. Los valores en porcentaje
respecto al valor obtenido en el grupo control son los siguientes: 101±5 %, 103±4 y
99±2% para las células tratadas con gastrina a las concentraciones de 10-9M,
62
10-8M y 10-7M durante una hora y 100±1%, 100±1% y 100±2 para las células
tratadas con estas mismas concentraciones durante cuatro horas, respectivamente.
FIGURA 11. La gastrina favorece la adhesión de célu las humanas de tipo monocítico (U937) a HUVEC sin afectar la de PMN . Los leucocitos y las HUVEC fueron coincubadas en condiciones estáticas y en presencia de diferentes concentraciones de gastrina o su vehículo durante una hora. Los datos representan el porcentaje del valor obtenido en células tratadas con vehículo y se expresan como media + EEM. * p <0,05 y *** p <0,001 vs el grupo tratado con vehículo (ANOVA + Newman-Keuls).
Adhesión de U937
0
100
200
* ***
Gastrina
*
10-11 10-810-910-10 10-7 M
*
(% v
s co
ntro
l)
Adhesión de PMN humanos
0
100
200
Gastrina10-11 10-810-910-10 10-7 M
(% v
s co
ntro
l)
63
FIGURA 12. El efecto de la gastrina sobre la adhesi ón de mononucleares se debe a una acción sobre HUVEC. Las HUVEC o las células U-937 fueron tratadas por separado con diferentes concentraciones de gastrina o de su vehículo durante una hora y, después de lavado, fueron coincubadas por 30 minutos con U-937 o HUVEC no tratadas respectivamente. Los datos representan el porcentaje del valor obtenido en células tratadas con vehículo y se expresan como media + EEM.* p < 0,05 y **p < 0.01 vs grupo tratado con vehículo (ANOVA+Newman-Keuls).
0
100
200
****
GASTRINA (Tratamiento de HUVEC)
A
10-11 10-810-910-10 10-7 M
*A
dhes
ión
de U
937
(% v
s co
ntro
l)
0
100
200
B
GASTRINA (Tratamiento de U937)
10-11 10-810-910-10 10-7 M
Adh
esió
n de
U93
7(%
vs
cont
rol)
64
FIGURA 13. El tratamiento de HUVEC con gastrina fav orece la interacción entre leucocitos mononucleares y células endotelial es en condiciones dinámicas. La interacción de los leucocitos mononucleares aislados de sangre periférica con la monocapa de HUVEC pretratada con gastrina durante 4h se analizó en condiciones dinámicas en la cámara de flujo paralelo. Los parámetros evaluados corresponden a: (A) flujo de leucocitos en rodamiento, (B) velocidad de los leucocitos en rodamiento y (C) adhesión leucocitaria. Resultados expresados como media + EEM, *p<0.05 y ***p<0.001 vs valor correspondiente en células tratadas con vehículo (RM-ANOVA + Newman-Keuls).
0
100
200
300
400
500
*
***
Vel
ocid
ad d
ero
dam
ient
o(µ
m /
s)
0
100
200*
Rod
amie
nto
(Nº
leuc
ocito
s / m
in)
0
10
20
30
***
***
***
Gastrina10-810-910-10 10-7 M
Adh
esió
n
(Nº
leuc
ocito
s / m
m2 )
65
FIGURA 14. El tratamiento de células mononucleares humanas con gastrina no afecta a su interacción con las células endoteli ales humanas no tratadas. La interacción de los leucocitos mononucleares aislados de sangre periférica, y tratados con las distintas concentraciones de gastrina (15 min), con la monocapa de HUVEC no tratada, se analizó en condiciones dinámicas en la cámara de flujo paralelo. Los parámetros evaluados corresponden a: (A) flujo de leucocitos en rodamiento, (B) velocidad de los leucocitos en rodamiento y (C) adhesión leucocitaria. Resultados expresados como media + EEM.
0
100
200
300
400
Vel
ocid
ad d
ero
dam
ient
o (µ
m /
s)
0
25
50
75
100
Rod
amie
nto
(Nº
leuc
ocito
s / m
in)
Veh0
10
20
30
Gastrina10-810-910-10 10-7 M
Adh
esió
n
(Nº
leuc
ocito
s / m
m2 )
66
3. EFECTO DE LA GASTRINA SOBRE LA EXPRESIÓN DE
MOLÉCULAS DE ADHESIÓN LEUCOCITARIAS HUMANAS.
El tratamiento de las células leucocitarias humanas con gastrina, a las
concentraciones que inducen interacciones leucocito-endotelio, no modificó la
expresión de las moléculas de adhesión analizadas (L-selectina, CD11b, CD11a,
CD11c, CD18, CD49) en monocitos, PMN o linfocitos (Tabla 9, ver página
siguiente).
67
L-Selectina CD18 CD11a CD11b CD11c CD49
L M P L M P L M P L M P L M P L M P
Gastrina log[M]
-9 98±2 104±5 106±13 100±2 101±1 99±1 101±2 102±5 101±1 101±1 102±4 103±4 - 104±2 96±1 90±2 96±3 -
-8 101±1 97±7 113±22 100±2 99±4 101±6 100±2 97±3 99±2 104±5 111±6 107±4 - 102±4 98±2 92±2 98±2 -
-7 98±3 102±7 118±25 99±2 101±2 99±2 98±3 99±1 98±1 96±2 101±3 100±6 - 95±3 97±1 94±3 101±1 -
FMLP (10-7) 106±2 60±27 49±4* 152±6* 159±6* 152±6* 100±1 135±12 120±28 127±7* 174±27* 141±9* - 130±5* 97±8 95±2 102±2 -
PAF (10-6) 102±22 53±11* 15±1* 196±4* 209±5* 196±4* 100±2 163±22* 136±2* 180±28* 283±24* 210±6* - 221±24* 117±6 95±3 104±7 -
TABLA 9. El tratamiento in vitro con gastrina no pr ovoca activación leucocitaria en sangre humana . Expresión de moléculas de adhesión leucocitaria medida por citometría de flujo. Datos expresados en porcentaje respecto del control y expresados como media + EEM.. Gast: Gastrina. FMLP: Formil -metionil-leucil-fenilalanina. PMA: forbol 12-miristato 13 - acetato. L: Linfocitos. M: Monocitos. P: Polimorfonucleares. *p<0.05 respecto al valor correspondiente en células tratadas con vehículo (ANOVA + Newman-Keuls).
68
4. RELEVANCIA DEL CCK-2R ENDOTELIAL EN LOS EFECTOS DE
LA GASTRINA.
Las HUVEC incubadas con RG-7P (10-7 M) mostraron un aumento en la señal
fluorescente, indicativa de la unión de este derivado de la gastrina. La interacción
de la RG-7P con las HUVEC fue inhibida de forma significativa por la presencia de
gastrina no marcada (10-6 a 10-5 M) o del antagonista del receptor CCK-2 L-365,260
(10-7 a 10-6 M) de forma concentración-dependiente en ambos casos (Figura 15).
FIGURA 15. La gastrina interacciona con las HUVEC a través de su receptor CCK2. Señal fluorescente emitida por un derivado de gastrina conjugado con Rhodamina G (G-Rhodamina heptagastrina, Rho-gastrina) unido a HUVEC. Esta unión fue inhibida por el cotratamiento con gastrina no marcada o un antagonista del receptor CCK-2 (L-365,260) de manera concentración-dependiente. Resultados expresados como media + EEM. *** p <0,001 vs respectivo control (RM-ANOVA + Newman-Keuls).
0.000
0.005
0.010
10-7
Gastrina ([M])
Rho-Gastrina (10 -7M)
10-510-6
***
***
10-8
L-365,260 ([M])
10-610-7
*** ***
Fluo
resc
enci
a (
∆∆ ∆∆)
69
El incremento en la adhesión a HUVEC que se observa al tratar las células U937
con distintas concentraciones de gastrina, se redujo de forma significativa en
presencia del antagonista del receptor CCK-2 (L-365,260, 1x10-7M) (Figura 16). De
forma análoga, en los estudios realizados en cámara paralela de flujo, el pre-
tratamiento con este antagonista (L-365,260; 10-7M) previno la acción estimulante
de la gastrina (10-7 M) sobre el flujo y la adhesión de los leucocitos mononucleares
a la monocapa endotelial, al tiempo que incrementó su velocidad de rodamiento
(Figura 17, página siguiente).
FIGURA 16. El efecto de la gastrina sobre la adhesi ón de células humanas de tipo monocítico (U937) a HUVEC está mediado por el receptor CCK2. Las células U937 y las HUVEC se incubaron en condiciones estáticas con diferentes concentraciones de gastrina o su vehículo, y en presencia o ausencia del antagonista L-365,260, durante una hora. Los datos representan el porcentaje del valor obtenido en células tratadas con vehículo y se expresan como media + EEM. * p <0,05 vs valor correspondiente en ausencia de antagonista (t-test).
0
50
100
150
* **
L-365,260 10-7M
Gastrina
10-11 10-810-910-10 10-7 MVeh.
Adh
esió
n de
U93
7(%
vs
cont
rol)
70
FIGURA 17. El incremento en las interacciones entre leucocitos mononucleares y células endoteliales en condiciones dinámicas inducido por gastrina está mediado por el receptor CCK2. La interacción de los leucocitos mononucleares aislados de sangre periférica con la monocapa de HUVEC pretratada con gastrina durante 4h, y en presencia o ausencia del antagonista L-365,260, se analizó en condiciones dinámicas en la cámara de flujo paralelo. Los parámetros evaluados corresponden a: (A) flujo de leucocitos en rodamiento, (B) velocidad de los leucocitos en rodamiento y (C) adhesión leucocitaria. *p<0.05 y ***p<0.001 respecto al valor correspondiente en células tratadas con vehículo, +
p<0.05 y +++ p <0.001 respecto al valor correspondiente en células tratadas con gastrina 10-7M (RM-ANOVA + Newman-Keuls).
0
100
200
300
400
500
***
+
Vel
ocid
ad d
ero
dam
ient
o (µ
m /
s)
0
50
100
150 ***
+++
Rod
amie
nto
(Nº
leuc
ocito
s / m
in)
0
10
20 *
+
Gastrina 10 -7 M
L-365,260
Adh
esio
n
(Nº
leuc
ocito
s / m
m2 )
71
5. RELEVANCIA DE LAS MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
ENDOTELIALES EN LOS EFECTOS DE LA GASTRINA.
El tratamiento de HUVEC por una hora con gastrina (10-9-10-7M) indujo de forma
significativa la expresión de VCAM-1 evaluada por citometría de flujo, mientras que
la expresión de E-selectina e ICAM-1 se mantuvieron inalteradas. La acción
estimulante de la gastrina sobre la expresión de VCAM-1 fue también patente
cuando se estudió en células tratadas con el péptido durante 4 horas (Tabla 10).
MOLÉCULA DE
ADHESIÓN
GASTRINA (log[M])
- -9 -8 -7
VCAM-1 1 Hora de
tratamiento 0.25±0.01 0.28±0.02* 0.31±0.03* 0.31±0.02*
VCAM-1 4 Horas de tratamiento
0.20±0.02 0.26±0.01 0.30±0.02* 0.31±0.01*
ICAM-1 1 Hora de
tratamiento 0.31±0.02 0.30±0.03 0.31±0.03 0.32±0.03
E-Selectina 1 Hora de
tratamiento 0.26±0.01 0.25±0.2 0.26±0.02 0.026±0.01
TABLA 10. El tratamiento de HUVEC con gastrina indu ce específicamente la expresión de VCAM-1 evaluada por citometría de fluj o. Expresión de moléculas de adhesión medida por citometría de flujo en células endoteliales tratadas con vehículo o las distintas concentraciones de gastrina. Los datos muestran el valor medio de fluorescencia y se expresan como media + EEM, * p < 0.05 vs correspondiente grupo tratado con vehículo (ANOVA + Newman-Keuls).
72
Los experimentos de citometría estática revelaron que el tratamiento de HUVEC
con gastrina (10-9 a 10-7 M) por 15 minutos, 4 y 24 horas induce la expresión de P-
selectina (Figura 18, página siguiente). Conforme se prolongaba el tiempo de
tratamiento, el efecto estimulante se hacía evidente con concentraciones menores
de péptido. Así, se obtuvo inducción significativa a los 15 minutos con la
concentración mayor de gastrina, a las 4 horas hubo significatividad con las
concentraciones 10-8 y 10-7 M, y cuando el tratamiento duró 24 horas las 3
concentraciones resultaron significativas.
73
FIGURA 18. El tratamiento de HUVEC con gastrina dur ante 15min, 4h ó 24h incrementa la expresión en superficie de P-selectin a. Las células endoteliales se trataron con vehículo, diferentes concentraciones de gastrina o trombina (Tr, 2 U/ml) durante el tiempo indicado en cada caso y la expresión en superficie de P-selectina se evaluó por citometría estática. Resultados expresados como media + EEM. *p<0.05 vs valor correspondiente en células tratadas con vehículo (RM-ANOVA + Newman-Keuls).
0
500
1000
1500
*
15 min.
P-S
elec
tina
(Flu
ores
cenc
ia m
edia
)
0
500
1000
1500
*
4 h.
*P-S
elec
tina
(Flu
ores
cenc
ia m
edia
)
Veh -9 -8 -7 Tr0
500
1000
1500
*
Gastrina (log[M])
24 h.
**P-S
elec
tina
(Flu
ores
cenc
ia m
edia
)
74
El análisis del efecto del tratamiento con gastrina (10-9-10-7 M, 4 horas) sobre la
expresión de las moléculas de adhesión endoteliales por citometría estática,
confirmó la acción estimulante de la gastrina sobre la expresión de VCAM-1. Como
ocurrió en los experimentos de citometría de flujo, el tratamiento no indujo
respuestas significativas en ICAM-1 y E-Selectina (Figura 19, página siguiente).
75
FIGURA 19. El tratamiento de HUVEC durante 4 horas con gastrina induce específicamente la expresión de VCAM-1. Las células endoteliales se trataron con vehículo, diferentes concentraciones de gastrina o TNF durante 4 horas y la expresión en superficie de las moléculas de adhesión se evaluó por citometría estática. Resultados expresados como media + EEM. * p <0.05 y *** p < 0.001 vs valor correspondiente en células tratadas con vehículo (RM-ANOVA + Newman-Keuls).
0
1000
2000
3000
***
*
7000
10000
VC
AM
-1
(Flu
ores
cenc
ia m
edia
)
Veh -9 -8 -7 TNF0
30000
60000
Gastrina (log[M])
200000300000
ICA
M-1
(Flu
ores
cenc
ia m
edia
)
0
1000
2000
3000100000200000
E-S
elec
tina
(Flu
ores
cenc
ia m
edia
)
76
Cuando se trataron las células endoteliales con las mismas concentraciones de
gastrina (10-9-10-7 M) por 4 horas y se cuantificó el RNAm de VCAM-1 por RT-PCR,
observamos un incremento concentración-dependiente en el mismo (Figura 20).
FIGURA 20. El efecto de la gastrina sobre la expres ión de VCAM-1 en HUVEC se debe a un mecanismo transcripcional. Expresión de ARNm de VCAM-1 en HUVEC medida por RT-PCR. Se presentan los datos de “crossing points” de VCAM-1 normalizados con los “crossing points” de ciclofilina. Resultados expresados como media + EEM, * p <0.05 respecto al valor correspondiente en células tratadas con vehículo, el cual corresponde al 100% (ANOVA + Newman-Keuls).
-9 -8 -70
100
200
300
400
*
Gastrina (log M)
Exp
resi
ón d
e A
RN
m%
del
con
trol
77
Este efecto estimulante no se observó cuando el tratamiento con gastrina (10-8 M)
se realizó en presencia de un inhibidor de PI3K o de JAK-2 (Figura 21), si bien en el
último caso el efecto de la gastrina no alcanza significatividad estadística.
FIGURA 21. El incremento en la expresión de génica VCAM-1 inducido por gastrina en HUVEC implica la vía de la PI3k y proba blemente JAK2. Expresión de ARNm de VCAM-1 en HUVEC medida por RT-PCR (i-PI3K=inhibidor de PI3K, i-JAK2= Inhibidor de JAK2). Se presentan los datos de “crossing points” de VCAM-1 normalizados con los “crossing points” de ciclofilina. Resultados expresados como media + EEM. El valor de las células tratadas con vehículo corresponde al 100%. * p < 0.05 respecto al valor de las correspondientes células tratadas con gastrina (t-test), + p < 0.05 respecto al valor de las correspondientes células tratadas con gastrina (Wilcoxon-test).
0
1
2
3
4
i-PI3k i-JAK2
*
Gastrina 10 -8ME
xpre
sión
de
mR
NA
VC
AM
-1
+
78
El tratamiento de las células endoteliales con un anticuerpo bloqueante frente a P-
selectina redujo de forma significativa el efecto de la gastrina (10-7 M, 4h) sobre el
flujo y la velocidad de rodamiento de los leucocitos mononucleares. El bloqueo de
VCAM-1 con un anticuerpo específico previno la adhesión leucocitaria y revirtió
parcialmente la disminución en la velocidad de rodamiento inducidos por la gastrina
(Figura 22, página siguiente).
79
FIGURA 22. El incremento en las interacciones entre leucocitos mononucleares y células endoteliales en condiciones dinámicas inducido por gastrina está mediado por P-selectina y VCAM-1. La interacción de los leucocitos mononucleares de sangre periférica con la monocapa de HUVEC pretratada con gastrina durante 4h se analizó en condiciones dinámicas en la cámara de flujo paralelo. En algunos casos se añadió anticuerpo bloqueante de P-Selectina o VCAM-1 treinta minutos antes de analizar la interacción leucocito-endotelio. Parámetros evaluados: (A) flujo de leucocitos en rodamiento, (B) velocidad de los leucocitos en rodamiento y (C) adhesión leucocitaria. Resultados expresados como media + EEM, *p<0.05 y ***p<0.001 vs valor correspondiente en células tratadas con vehículo, +p<0.05 y +++ p <0.001 vs valor correspondiente en células tratadas con gastrina 10-7M (RM-ANOVA + Newman-Keuls).
0
100
200
300
400
500
***
++
Ac Anti P-selectina
Ac Anti VCAM-1
Vel
ocid
ad d
ero
dam
ient
o (µ
m /
s)
0
50
100
150 ***
+
Rod
amie
nto
(Nº
leuc
ocito
s / m
in)
0
10
20 *
+
Gastrina 10 -7 MVeh.
Adh
esió
n
(Nº
leuc
ocito
s / m
m2 )
80
6. EL RECEPTOR CCK2 SE ENCUENTRA EN MACRÓFAGOS.
El estudio inmunohistoquímico de la presencia de receptores CCK2 en el
mesenterio de rata mostró una señal positiva en unas células de tamaño grande y
núcleo con tinción intensa por hematoxilina que identificamos, tanto por su
morfología como por la comparación con el resultado obtenido con el anticuerpo
marcador de macrófagos y granulocitos, como macrófagos (Figuras 23 y 24,
páginas siguientes). No observamos señal en los vasos venulares.
Los resultados obtenidos en muestras colónicas de rata y humanas muestran que
las muestras incubadas con el anticuerpo frente al receptor de CKK2R presentan un
patrón de tinción similar al obtenido con el marcador de macrófagos. Esta señal se
obtiene en células aisladas dentro de la lámina propria. Aunque aquí la morfología
es menos clara, el tamaño celular y el paralelismo observado con la tinción de
macrófagos nos hacen concluir que estas células expresan el receptor CCK2. No
obstante, no podemos excluir su presencia en otros tipos celulares.
81
FIGURA 23. El receptor CCK2 se encuentra en macrófa gos de rata. Las imágenes A y B muestran la inmunotinción del receptor CCK2 en mesenterio de rata (C, control negativo; D, marcador de macrófagos; ambos en mesenterio de rata). Los paneles inferiores muestran la imunotinción del receptor CCK2 (E) y del marcador de macrófagos (F) en mucosa colónica de rata. La barra negra corresponde a 20 µm.
A
C
E
D
B
F
82
FIGURA 24. El receptor CCK2 se encuentra en macrófa gos humanos. Las imágenes A y B muestran la inmunotinción del receptor CCK2 en cortes de colon humano. Los paneles C y D muestran la imunotinción del marcador de macrófagos (E, control negativo). La barra negra corresponde a 20 µm.
A
C
E
D
B
83
7. EFECTO DE LA GASTRINA SOBRE EL PATRÓN DE ACTIVAC IÓN
DE MACRÓFAGOS HUMANOS, LIBERACIÓN DE RADICALES
LIBRES.
a. LIBERACIÓN DE RADICALES LIBRES DE OXÍGENO
El tratamiento de los macrófagos humanos con gastrina induce un aumento
significativo de la liberación de radicales libres (O2-) a las tres concentraciones
testadas (10-9, 10-8 y 10-7 M). La adición al medio de cultivo de un antagonista
específico del CCK-2R (CR2945, 10-8M) previene el efecto de la gastrina (10-7 M),
reduciendo la liberación de radicales libres a valores muy cercanos a los
observados en las células tratadas con vehículo (Figura 25).
FIGURA 25. La gastrina incrementa la producción de radicales libres de oxígeno en macrófagos humanos a través de su recept or CCK2. Fluorescencia media (Fl) producida por el dihidroetidio (DHE) al reaccionar con el anión superóxido (O2
-) producido por macrófagos diferenciados a partir de monocitos humanos tratados con diferentes concentraciones gastrina y en presencia o ausencia del un antagonista específico del receptor CCK2 (CR2945). La medición se realizó por citometría estática. Los datos representan el porcentaje del valor obtenido en células tratadas con vehículo y se expresan como media + EEM. * p < 0.05 vs valor correspondiente en células tratadas con vehículo (ANOVA + Newman-Keuls).
-9 -8 -7 -70
50
100
150
***
Gastrina (log[M])
Producción de radicales libres (O 2-)
AntagonistaCCK2R
Flu
ores
cenc
ia(%
vs
cont
rol)
84
b. EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS DE SUPERFICIE Y
LIBERACIÓN DE CITOCINAS.
Cuando estudiamos el efecto de la combinación de LPS (1µg/ml) e IFN-γ (20 ng/ml)
sobre los macrófagos, estas citocinas produjeron un aumento de la expresión de
CD86 y un aumento significativo de la liberación de IL-12, IL-10, TNF-α y MCP-1. Al
combinar este tratamiento de LPS e IFN-γ con gastrina (10-7M) obtuvimos una
reducción significativa de la expresión de CD86 y de la liberación de IL-12. Para el
resto de citocinas medidas (IL-10, TNF-α y MCP-1) no se obtuvieron variaciones
significativas (Figura 26, página siguiente).
85
FIGURA 26. Efecto de la gastrina sobre la expresión de CD86 y la secreción de IL-12, IL-10, TNFαααα y MCP-1 en macrófagos humanos tratados con LPS + I FNγ. Los macrófagos diferenciados a partir de monocitos humanos se trataron con LPS de Escherichia coli (1µg/ml) e interferón- γ (20 ng/ml) y en presencia o ausencia de gastrina (10-7 M) por 24 horas. Al finalizar este periodo, se detectó la expresión de CD86 por citometría estática y la secreción al medio de cultivo de las distintas citocinas/quimiocinas se evaluó por ELISA. Resultados expresados como media + EEM. *p<0.05 vs valor correspondiente en células tratadas con vehículo; +p<0.05 vs valor correspondiente en células tratadas con LPS + IFNγ (RM-ANOVA + Newman-Keuls).
0
5
10
15
Gastrina 10 -7MLPS+IFNγγγγ
MC
P-1
(ng
/ml)
0
5
10
15
LPS + IFNγγγγGastrina 10 -7M
TN
F- αα αα
(ng
/ml)
0
250
500
750
Gastrina 10 -7MLPS+IFNγγγγ
Veh.
IL-1
0 (p
g/m
l)
0
10000
20000
LPS + IFNγγγγ
Gastrina 10 -7M
++
CD
86F
luor
esce
ncia
med
ia,
dife
renc
ia r
espe
cto
deco
ntro
l
0
1
2
3
4
*
+
Veh. Gastrina 10 -7MLPS+IFNγγγγ
IL-1
2 (p
g/m
l)
86
La IL-4 (10 ng/ml) no indujo cambios significativos en la expresión de CD163 o la
liberación de IL-10, IL-12, TNF-α o MCP-1. La adición de gastrina (10-7M) al medio
con IL4 provocó un incremento significativo en la expresión de CD163 y e inhibió,
también de forma significativa la liberación de TNF-α y MCP-1. No se observaron
cambios sobre las interleuquinas IL-10 e IL12 (Figura 27, página siguiente).
87
FIGURA 27. Efecto de la gastrina sobre la expresión de CD163 y la secreción de IL-12, IL-10, TNF αααα y MCP-1 en macrófagos humanos tratados con IL-4. Los macrófagos diferenciados a partir de monocitos humanos se trataron con IL-4 (20 ng/ml) y en presencia o ausencia de gastrina (10-7 M) por 24 horas. Al finalizar este periodo, se detectó la expresión de CD163 por citometría estática y la secreción al medio de cultivo de las distintas citocinas/quimiocinas se evaluó por ELISA. Resultados expresados como media + EEM. +p<0.05 vs valor correspondiente en células tratadas con IL-4 (RM-ANOVA + Newman-Keuls).
0
10000
20000
30000
Gastrina 10 -7 M
IL-4
+
CD
163
Flu
ores
cenc
ia m
edia
,di
fere
ncia
res
pect
o de
lco
ntro
l
0
1
2
3
Veh. Gastrina 10 -7 M
IL-4
IL-1
2 (p
g/m
l)
0
1
2
3
Veh. Gastrina 10 -7 M
IL-4
IL-1
0 (p
g/m
l)
0.0
0.5
1.0
1.5
Veh. Gastrina 10 -7 M
IL-4
+
TN
F- αα αα
(ng
/ml)
0
10
20
30
Veh. Gastrina 10 -7 M
IL-4
+
MC
P-1
(ng
/ml)
88
El tratamiento de los macrófagos con IL-10 (10 ng/ml) no afectó en gran medida la
expresión de CD163, pero combinado con gastrina (10-7M) obtuvimos una inhibición
significativa en la misma. El tratamiento con IL-10 tampoco modificó
significativamente la liberación de citocinas/quimiocinas si bien hubo una tendencia
a la baja en todas ellas. Con respecto a la producción de MCP-1, cabe decir que
este descenso relativo inducido por la IL-10 no ocurre en células co-tratadas con
gastrina, que muestran una secreción semejante a la de los macrófagos tratados
con vehículo. De hecho, un análisis por t-test entre los dos grupos revela
significatividad estadística (figura 28).
FIGURA 28. Efecto de la gastrina sobre la expresión de CD163 y la secreción de IL-12, TNFαααα y MCP-1 en macrófagos humanos tratados con IL-10. Los macrófagos diferenciados a partir de monocitos humanos se trataron con IL-10 (20 ng/ml) y en presencia o ausencia de gastrina (10-7 M) por 24 horas. Al finalizar este periodo, se detectó la expresión de CD163 por citometría estática y la secreción al medio de cultivo de las distintas citocinas/quimiocinas se evaluó por ELISA. Resultados expresados como media + EEM. +p<0.05 vs valor correspondiente en células tratadas con IL-10 (t-test).
0
1000
2000
3000
4000
Gastrina 10 -7 MIL-10
+
CD
163
Flu
ores
cenc
ia m
edia
,di
fere
ncia
res
pect
o de
lco
ntro
l
0.0
2.5
5.0
7.5
Veh. Gastrina 10 -7 MIL-10
IL-1
2 (p
g/m
l)
0.0
0.1
0.2
Veh. Gastrina 10 -7 M
IL-10
TN
F- αα αα
(ng
/ml)
0
1
2
3
4
5
Veh. Gastrina 10 -7 M
IL-10
+
MC
P-1
(ng
/ml)
89
V. DISCUSIÓN
90
La gastrina es una hormona gastrointestinal cuya principal función es la
estimulación de la secreción ácida gástrica. Ejerce además una acción trófica sobre
la porción secretora de ácido de la mucosa del estómago. En condiciones
fisiológicas la gastrina es liberada en respuesta a estímulos como la comida y la
distensión gástrica y actúa sobre los receptores CCK2 localizados en la membrana
basal de la célula parietal para inducir la secreción de ácido. Su secreción se regula
por un mecanismo de retroalimentación negativo mediado por la somatostatina. El
ácido luminal estimula las células D para que liberen esta hormona, la cual ejerce
un efecto inhibitorio sobre las células G que limita la secreción de gastrina y, por
tanto, de ácido. La inhibición farmacológica de la secreción ácida por parte de los
inhibidores de la bomba de protones o los antagonistas del receptor de histamina –
2, desactiva este mecanismo de retroalimentación y, con ello, aumenta de forma
significativa la secreción de gastrina (4). También se observa una liberación
incrementada de gastrina cuando la mucosa está infectada por Helicobacter pylori.
La gastritis crónica inducida por esta bacteria gram negativa se acompaña de
cambios en las poblaciones celulares neuroendocrinas, reduciéndose la densidad
de células D e incrementándose la de células G, lo que provoca una reducción en la
liberación de somatostatina y un incremento en la secreción de gastrina
respectivamente (15). La hipergastrinemia parece ser consecuencia directa del
proceso inflamatorio local (17). De hecho, se ha encontrado una correlación entre
niveles plasmáticos de gastrina y severidad de gastritis (19; 20).
La demostración de la presencia de receptores CCK2 en diversos tipos leucocitarios
y en las células endoteliales motivó el análisis de los efectos de la gastrina en el
proceso inflamatorio y, en un estudio reciente observamos de hecho que la gastrina
exógena ejerce una acción proinflamatoria a través de los receptores CCK2. Se vio
que la superfusión de gastrina sobre las vénulas postcapilares mesentéricas de la
rata inducía incrementos significativos en las interacciones leucocito-endotelio
provocando rodamiento, adhesión y migración leucocitarios. Estos procesos se
bloquearon por dos antagonistas diferentes del receptor CCK2 (proglumida y L-
365,260), mientras que el antagonista del receptor CCK-1, devazepide, no modificó
en forma alguna la acción proinflamatoria de la gastrina. Fue interesante observar
91
que la secreción endógena de la hormona en respuesta al tratamiento con un
extracto de Helicobacter pylori contribuía al proceso inflamatorio iniciado por el
mismo y favorecía la persistencia del infiltrado leucocitario (63).
El presente trabajo muestra que la hipergastrinemia desatada por el tratamiento con
omeprazol también provoca una reacción inflamatoria en el mesenterio de la rata a
través de la activación del receptor CCK2. Se observa una respuesta inflamatoria
completa, con incremento en el rodamiento, la adhesión, y migración leucocitarios
en animales administrados con una dosis alta de omeprazol durante 14 días. El
pretratamiento con proglumida previno estos eventos inflamatorios, lo que nos
indica que están mediados por la gastrina. Con el fin de analizar si los efectos del
tratamiento hiposecretor podían verse potenciados por el agente infeccioso,
tratamos un grupo de animales con la combinación de esta dosis de omeprazol y un
extracto de Helicobacter pylori. Observamos que la respuesta no era muy diferente,
si bien tendía a ser más intensa en los parámetros de adhesión y velocidad de
rodamiento. Aunque en estos animales detectamos un flujo de leucocitos en
rodamiento menor al inducido únicamente por omeprazol, pensamos que esto
puede deberse a la lenta velocidad con que fluyen, indicativa de una importante
activación. Por otro lado, la reversión por proglumida fue menos patente en este
grupo de tratamiento combinado. Los dos grupos presentaron niveles de gastrina
análogos por lo que podemos interpretar que la combinación de ambos tratamientos
añade algún componente al estímulo inflamatorio independiente de la gastrina.
Las interacciones leucocito-endotelio están mediadas por varias moléculas
expresadas en las células endoteliales y los leucocitos. Las selectinas, leucocitarias
y endoteliales, son mediadores fundamentales del rodamiento leucocitario, mientras
que la adhesión y la migración requieren las integrinas leucocitarias y las
inmunoglobulinas endoteliales. La L-selectina está expresada constitutivamente en
la mayoría de los leucocitos, y se elimina rápidamente de la superficie cuando se
produce la activación celular (64-66). Observamos que los monocitos y linfocitos de
animales tratados durante 14 días con omeprazol presentaban un incremento en la
integrina CD11b/CD18 unido a una reducción de L-selectina, mientras que los PMN
no mostraban cambios significativos. Estos resultados nos indicaban cierta
activación de monocitos y linfocitos y confirmaban la presencia de un proceso
92
inflamatorio crónico. Los leucocitos de animales tratados con omeprazol y
proglumida no mostraron ninguna alteración en la expresión de estas moléculas de
adhesión, lo que apunta a la gastrina como factor etiológico de dichas diferencias.
Sin embargo, no observamos cambios en la expresión de estas moléculas en
leucocitos tratados ex vivo con gastrina. Aunque estas células se incubaron con el
péptido por tiempos muy cortos (45 min) comparados con la duración del
tratamiento con omeprazol, seguimos este protocolo porque la respuesta in vivo a la
gastrina exógena se observaba de forma prácticamente inmediata (63). El conjunto
de estos resultados nos hace pensar que la activación leucocitaria observada en los
animales hipergastrinémicos no se debe a un efecto celular directo de la gastrina
sino más bien, parece ser parte de una respuesta completa que se desarrolla in
vivo.
Los eventos inflamatorios que mostramos contrastan con la gran utilidad de los IBP
en el tratamiento de las úlceras gástricas y duodenales. Su valor terapéutico reside
en su gran eficiencia en incrementar el pH luminal, como queda reflejado en el
antiguo axioma de “sin ácido no hay úlcera”. Este potente efecto podría enmascarar
las posibles acciones deletéreas de la gastrina. Nuestros resultados podrían en
cambio explicar el agravamiento del proceso inflamatorio en el cuerpo gástrico de
pacientes tratados con inhibidores de la bomba de protones que ocurre
especialmente en aquellos que son H. pylori positivos (107). La concurrencia de
tratamiento con IBP y presencia de Helicobacter en la mucosa no suele darse en
pacientes ulcerosos, ya que si presentan el germen se les administra tratamiento
erradicador para evitar recidivas. Sin embargo, esta situación puede ser frecuente
en pacientes que reciben tratamiento crónico con IBP para controlar la enfermedad
por reflujo gastroesofágico en los que, normalmente, no se controla dicha infección.
Este efecto deletéreo se ha observado con los IBP y, aun siendo de menor
intensidad, también con los antagonistas H2 (108; 109). Por tanto, este efecto
adverso no se relaciona con el mecanismo molecular de acción de ambos tipos de
fármacos sino con sus efectos hiposecretores y lo mismo ocurre con la respuesta
hipergastrinémica.
Con el fin de analizar si estos efectos de la gastrina pudieran ser relevantes en el
ser humano, realizamos experimentos con leucocitos y células endoteliales
93
humanas in vitro. El presente estudio demuestra por primera vez la capacidad de la
gastrina para inducir la interacción entre leucocitos y células endoteliales de origen
humano. Hemos observado el efecto estimulador de la gastrina en condiciones
estáticas y dinámicas. En el segundo caso, los leucocitos fluyen sobre la superficie
endotelial con una fuerza de cizallamiento similar a la que se observa in vivo (110),
y las interacciones entre leucocitos y la monocapa de células endoteliales
reproducen aquellas que preceden la formación de un foco inflamatorio in vivo, es
decir, el rodamiento y la adhesión leucocitarias, lo que da a los resultados un mayor
significado fisiológico. Hemos visto que la gastrina actúa de forma específica en las
células endoteliales y no en los leucocitos. El pretratamiento de las HUVEC con
gastrina fue suficiente para incrementar el rodamiento y la adhesión de leucocitos
no tratados, mientras que el tratamiento de los leucocitos aislados no modificó su
capacidad para interaccionar con células endoteliales no tratadas, tanto en
condiciones estáticas como dinámicas.
La capacidad del antagonista del receptor CCK2, el fármaco L-365,260, para
prevenir la unión de la gastrina marcada con rhodamina a las HUVEC revela que la
hormona se une a estas células a través de los receptores CCK2, cuya presencia
en células endoteliales se ha demostrado previamente (111). La activación de estos
receptores es responsable del aumento observado en el rodamiento y adhesión
leucocitarias, puesto que dichos efectos se vieron bloqueados por el pretratamiento
con este antagonista. Además, la gastrina incrementó específicamente la expresión
en la superficie de las moléculas de adhesión endoteliales P-selectina y VCAM-1,
sin modificar el patrón de expresión de sus ligandos en leucocitos. El incremento en
VCAM-1 se debe a la estimulación transcripcional, ya que observamos también una
mayor cantidad de ARNm de VCAM-1 en células tratadas con la hormona. El rápido
incremento en la presencia de P-selectina tras el tratamiento (15 minutos) sugiere
que la gastrina provoca su traslocación desde los cuerpos de Weibel-Palade hasta
la superficie celular de las HUVEC. Sin embargo, es probable que se ponga en
marcha un efecto adicional por el que incremente la síntesis de novo de P-selectina,
puesto que la traslocación de esta molécula es normalmente un efecto transitorio y
también se observa una mayor expresión de P-selectina 4 y 24 horas tras el
tratamiento. Los mecanismos moleculares responsables de la liberación de P-
selectina desde los cuerpos de Weibel-Palade no están muy definidos (112); por
94
ello, es difícil inferir los eventos intracelulares que la gastrina pone en marcha para
inducir la expresión rápida en superficie de P-selectina.
La activación del receptor CCK2 puede poner en marcha varias vías de
señalización implicadas en la regulación transcripcional de las moléculas de
adhesión endoteliales, incluyendo las cascadas de la quinasa activada por
mitógenos (ERK 1/2, c-Jun NH2-terminal kinases, p38) y la protein-quinasa C (11).
Estas vías promoverían la síntesis de moléculas de adhesión endoteliales a través
de los factores de transcripción factor nuclear-κB y proteína activadora-1. Sin
embargo, estas cascadas de señalización también provocarían la expresión de
ICAM-1 y E-selectina además de la de VCAM-1, y no inducirían la expresión de P-
selectina (113; 114). Cabe resaltar que los efectos inducidos por la gastrina, que
consisten en aumentar la expresión de P-selectina y VCAM-1 y dejar inalteradas las
de E-selectina e ICAM-1, coinciden con el patrón de activación endotelial inducida
por las citocinas de tipo Th2 IL-4 e IL-13 (115). Ambos mediadores actúan a través
de la vía Jak/STAT para inducir los cambios en la expresión de moléculas de
adhesion antes descritos (116; 117) así como la síntesis de factores quimiotácticos
para LMSP (118). Evidencias recientes sugieren que el receptor CCK2 está
conectado con la vía JAK/STAT (56), y nosotros hemos visto que la gastrina no
consigue incrementar la síntesis de ARNm de VCAM-1 en presencia de un inhibidor
de JAK2, lo que implica esta vía en la acción de la gastrina sobre células
endoteliales. La sobrexpresión de VCAM-1 también se inhibe cuando bloqueamos
la PI3K, vía de señalización que podría también ser responsable de los efectos
angiogénicos de la gastrina recientemente descritos (111; 119). Nuestros
experimentos no nos permiten distinguir si ambas enzimas se activan por vías
independientes o de forma secuencial.
La gastrina estimula de forma específica la interacción de las HUVEC con
leucocitos mononucleares (línea celular monocítica U-937 y LMSP) sin afectar la de
los PMN. Esta selectividad, análoga a la de IL-4 e IL-13 (120), depende
probablemente del patrón de expresión de moléculas de adhesión inducido por la
gastrina. Aunque la P-selectina podría intervenir en el rodamiento de los leucocitos
tanto mononucleares como polimorfonucleares, VCAM-1 se une específicamente a
la α4(1 (CD49d/CD29, VLA-4), una integrina presente en los mononucleares y
95
ausente en los PMN (114). Nuestros estudios funcionales confirman que P-selectina
y VCAM-1 son responsables de las interacciones inducidas por la gastrina, ya que
el bloqueo de dichas moléculas redujo de forma significativa los efectos de la
hormona. El bloqueo de P-selectina fue especialmente efectivo en la reducción del
número de leucocitos en rodamiento y en el incremento de su velocidad, efecto
esperable dado el papel predominante que esta molécula juega en dicho proceso
(121). También observamos una reducción no significativa en la adhesión
leucocitaria, lo que probablemente es consecuencia de la reducción en el
rodamiento (121; 122). El bloqueo de VCAM-1 redujo de forma significativa la
adhesión leucocitaria, y aunque no modificó el número de leucocitos en rodamiento,
sí incrementó su velocidad. Este último efecto puede ser consecuencia del papel
secundario que VCAM-1 tiene en el rodamiento, que es menos importante que el
que juega en la adhesión (123; 124).
Los resultados obtenidos en células humanas muestran cierto paralelismo con la
situación observada en rata, donde veíamos activación de monocitos y ausencia de
efecto en PMN. Desconocemos el mecanismo que lleva a esta activación
leucocitaria si bien sabemos que depende de la acción de la gastrina sobre alguna
estructura que está sólo presente in vivo. No hemos visto el receptor de gastrina en
las vénulas, lo que puede indicar que el patrón de los efectos de la gastrina pueda
ser diferente en las dos especies. También podría deberse a diferencias entre el
endotelio de vasos grandes y pequeños, aunque la demostración de efectos
análogos de la gastrina en HUVEC y células endoteliales microvasculares humanas
de dos territorios distintos, la piel y el útero (111), no argumentan a favor de esta
posibilidad. Por último, no podemos descartar que la ausencia de señal en los
estudios inmunohistoquímicos pueda deberse a problemas técnicos (p.ej. acceso
del anticuerpo). Estos estudios inmunohistoquímicos indican que los macrófagos,
tanto humanos como de rata, presentan el receptor CCK2. El macrófago es un
elemento fundamental en los procesos inflamatorios crónicos, como el inducido por
la infección por Helicobacter pylori. Esta bacteria gram negativa puede provocar
patologías de muy distinta gravedad, lo que depende en gran medida de la
respuesta inmunitaria que origina en el huésped. Esta respuesta defensiva genera
una reacción inflamatoria local crónica que provoca desestructuración tisular e
impone un ambiente que propicia la transformación neoplásica (1). Por otro lado,
96
existe gran interés en analizar la función de los macrófagos porque, siendo también
elementos clave del infiltrado inflamatorio tumoral, su presencia y función parecen
tener una influencia definitiva en el devenir de la enfermedad (75). Por tanto,
encontramos receptores CCK2 en un elemento común a la inflamación crónica y al
cáncer, dos situaciones patológicas ligadas entre sí y que, en el caso de la gastritis
por Helicobacter y el cáncer gástrico / colónico cursan con hipersecreción de
gastrina. Nos interesó por ello conocer si la gastrina puede afectar a la función
macrofágica.
El tratamiento con gastrina incrementó la génesis de radicales libres de
oxígeno (anión superóxido) en macrófagos humanos, y este efecto fue revertido por
el tratamiento con un antagonista de este receptor (CR2945). Estos resultados
indican que el receptor CCK2 macrofágico es funcional y que su activación genera
efectos proinflamatorios, lo que nos animó a profundizar en el estudio de la
influencia de la gastrina sobre la función macrofágica. Como se ha descrito en la
introducción, el macrófago es una célula de gran complejidad funcional puesto que
sirve a fines muy diferentes, incluso contrapuestos, en función del ambiente en que
se ubique. De forma breve diremos que, en medio de respuestas Th1 encontramos
macrófagos muy activos en la lucha contra agentes externos y con gran capacidad
de inducir daño tisular. Acompañando a respuestas Th2 encontramos macrófagos
implicados en la restauración tisular y que pueden inducir fibrosis. Por último, en la
fase de resolución de la inflamación se observan macrófagos antiinflamatorios que
pretenden limpiar la zona inflamada de los restos celulares (72).
La infección por Helicobacter provoca una reacción de tipo Th1, por lo que los
macrófagos presentes en la mucosa gástrica inflamada se corresponderán
principalmente con M1. En el cáncer de colon, diversos trabajos indican que una
mayor infiltración de macrófagos se asocia a un mejor pronóstico. Aunque no se ha
estudiado específicamente, ello haría pensar que, a diferencia de lo que ocurre por
ejemplo en el cáncer de mama, en el cáncer colónico predominan los macrófagos
luchadores contra el tumor o activados por la vía clásica. Sin embargo, y de forma
sorprendente, se ha visto que esta correlación es más importante si los macrófagos
expresan VEGF (“vascular endothelial growth factor”) (125) o CD163 (126), dos
marcadores más propios de la activación alternativa.
97
Con el fin de acercarnos in vitro a la situación de los macrófagos que, in vivo,
encontramos en la mucosa inflamada, hemos tratado estas células con una
combinación de IFNγ y LPS. Se induce con ello su activación por la vía clásica, lo
que se traduce en un incremento en la expresión de la molécula coestimuladora
CD86 y en un aumento de la síntesis de las citocinas IL-12, IL-10 y TNF y de la
quimiocina MCP-1. Para inducir distintos patrones alternativos de activación, hemos
incubado los macrófagos con la citocina de tipo Th2 IL-4 y la citocina
antiinflamatoria IL-10. Aunque, de acuerdo con los datos bibliográficos,
esperábamos ver cambios significativos en los elementos estudiados con estos
tratamientos (68), nosotros no hemos observado ninguna respuesta clara a los
mismos. Pudiera ser que el tratamiento no haya sido lo suficientemente prolongado,
aunque experimentos preliminares con tratamientos más largos (48h) no nos hacen
pensar que este sea el caso. Algunos autores defienden que la activación depende
de la acción secuencial de las citocinas primadoras y el estímulo antigénico
mediado por receptores tipo “toll” (127), ausente en nuestro caso. Por último, la
derivación a macrófagos en presencia de MCSF puede haber determinado de por sí
un perfil alternativo (128) que las citocinas no hayan podido ampliar. La inclusión de
este factor estimulante de colonias en el medio de cultivo vino motivada por el
escaso rendimiento en la obtención de macrófagos a partir de los LMSP de forma
espontánea. En cualquier caso, aun no viendo respuesta directa al tiramiento con
IL-4 o IL-10 y, como se expone a continuación, su presencia en el medio claramente
influye la respuesta a otros agentes, en nuestro caso, la gastrina.
En los macrófagos activados con IFN y LPS, el cotratamiento con gastrina reduce la
expresión de CD86 y la síntesis de IL-12, dejando inalterada la de IL-10. Estos
resultados sugieren que la gastrina podría reducir la capacidad del macrófago para
presentar antígenos e inhibir la estimulación de los linfocitos T y su derivación hacia
Th1. Estos resultados estarían en línea con lo descrito anteriormente en
macrófagos murinos (100). La hormona, sin embargo, no afecta la síntesis de TNF
o de MCP-1. El TNF actúa como mediador tanto de la inmunidad innata como de la
específica. Ejerce un claro papel proinflamatorio induciendo la síntesis de
numerosas citocinas y quimiocinas, activando las células endoteliales para que
expresen moléculas de adhesión que posibiliten la captación de leucocitos hacia el
foco inflamatorio y estimulando la actividad de los propios leucocitos. La quimiocina
98
MCP-1 es un factor esencial en la captación y activación de células monocíticas. La
gastrina podría por tanto ejercer un tono inhibitorio sobre la respuesta linfocitaria sin
modificar la respuesta inflamatoria.
Cuando tratamos los macrófagos con IL-4, los niveles de citocinas observados
fueron análogos a los encontrados en otros estudios siguiendo un protocolo similar
(129). El efecto desactivador de la IL-10 en macrófagos se pone de manifiesto en la
reducción en la secreción de IL-12, TNF y MCP-1 observada en los macrófagos
tratados con esta interleuquina, aunque no alcanzan significatividad posiblemente
por los niveles bajos de secreción.
La gastrina no afecta la síntesis de IL-12 o IL-10 en ninguno de estos dos casos,
aunque parece potenciar la reducción de IL-12 (NS) inducida por IL-10. Sin
embargo, el tratamiento con gastrina incrementa la expresión de CD163 en
presencia de IL-4 y la reduce en macrófagos tratados con IL-10. El CD163 es un
receptor carroñero (“scavenger receptor”) cuya expresión se restringe a las células
del linaje monocitos/macrófago. Lo encontramos en la mayoría de macrófagos
residentes y también se observa en los macrófagos presentes en la fase de
recuperación de la inflamación aguda, en la inflamación crónica y en la fase de
restitución tisular. Aunque su función es bastante desconocida, su sobrexpresión en
respuesta a agentes antiinflamatorios y la reducción que inducen citocinas
proinflamatorias, lo asocia a la supresión inmune y la resolución de la inflamación
(68; 85). Nuestros resultados muestran la capacidad de la gastrina para modular la
expresión de CD163 si bien el efecto es dual, y es difícil siquiera inferir cual puede
ser la repercusión de estos efectos en el estroma tumoral. No obstante y,
considerando la relevancia que dan a la expresión de esta molécula los estudios
realizados en cáncer de colon antes nombrados, cabe tener en consideración su
regulación por parte de la gastrina.
En presencia de IL-4 la gastrina reduce también la síntesis de TNF y MCP-1. De
nuevo observamos que la gastrina puede tener efectos distintos, e incluso
opuestos, en función de las circunstancias ambientales ya que en macrófagos
tratados con IL-10 la hormona tiende a incrementar la secreción de MCP-1, sin
afectar la de TNF. La quimiocina MCP-1 está presente en una gran proporción de
99
tumores, si bien su fuente principal en estos sistemas suelen ser las propias células
cancerosas más que los macrófagos tumorales. Su síntesis local, además de
favorecer la infiltración de células monocitarias, puede inclinar el equilibrio hacia
Th2, favorecer la angiogénesis y producir metaloproteinasas (130). Está
demostrado su papel protumoral en el cáncer de mama, y lo mismo parece ocurrir
en el cáncer gástrico (82) y colónico (131). Por el contrario, hay evidencias de su
función antitumoral en melanoma y cáncer de páncreas (132). Este papel dual se
observa igualmente con el TNF, cuya función es muy compleja, pudiendo afectar
multitud de mecanismos fundamentales en la progresión y la invasividad del tumor
al tiempo que puede provocar necrosis tumoral. Ello ha motivado que se considere
la posibilidad de utilizar a esta citocina como un agente antitumoral a la vez que se
piense en ella como posible diana en el desarrollo de nuevos antineoplásicos (89).
Los efectos de la gastrina tienen una importancia cualitativa más que cuantitativa ya
que la hormona, en el caso de los macrófagos tratados con IL-4, inhibe la secreción
de moléculas que ya de por sí se secretan en muy pequeña cantidad. Sin embargo,
pensamos que el efecto es importante porque denota la habilidad de la gastrina
para modular la secreción de dos mediadores fundamentales en la respuesta
inflamatoria y, más en concreto, en la evolución del proceso tumoral.
Como compendio de los resultados presentados, podemos decir que la gastrina
puede favorecer la inflamación actuando sobre las células endoteliales, en las que
modifica el patrón de expresión de moléculas de adhesión para hacerlas más
reactivas a la adhesión de leucocitos y, por tanto, provocando extravasación e
infiltración leucocitaria. Su efecto parece ir dirigido a la activación y captación
específica de monocitos. Estas células, cuando se extravasan, se transforman en
macrófagos y, ahí de nuevo la gastrina puede encontrar otra diana para afectar el
proceso inflamatorio / inmunitario. Nuestros resultados muestran la capacidad de la
hormona para modular la función macrofágica si bien entendemos que estamos
lejos de conocer en profundidad sus efectos. Lo que sí parece claro es que las
consecuencias de esta modulación pueden verse afectadas en gran medida por el
ambiente en el que se encuentre el macrófago. La gastrina per se incrementa la
formación de radicales libres de oxígeno, lo que puede provocar daño tisular.
Cuando los macrófagos se derivan a M1, como en la respuesta al Helicobacter
pylori, puede reducir la activación de la respuesta inmunitaria específica por parte
100
del macrófago sin alterar la secreción de elementos fundamentales para la
inflamación. La situación es más compleja cuando el macrófago está en presencia
de citocinas propias del final de la inflamación o de respuestas inmunitarias
tolerogénicas como las que pueden encontrarse en el tejido tumoral. Esta cuestión
centra actualmente nuestro interés y el análisis de la situación real de los
macrófagos infiltrados en muestras tumorales humanas y de la influencia que pueda
ejercer a este nivel la gastrina constituye el objetivo más inmediato de nuestra línea
de investigación.
101
VI. CONCLUSIONES
102
1. La gastrina favorece la interacción leucocito-en dotelio, lo que le
otorga carácter pro-inflamatorio. Esta acción de la gastrina se
observa tanto en la rata in vivo, como entre célula s humanas in
vitro, y en ambos casos está mediada por su recepto r CCK2.
2. En células humanas, la diana de la gastrina es l a célula endotelial,
donde induce la expresión en superficie de P-Select ina y, por
activación de PI3K y probablemente de la vía JAK-2, estimula la
transcripción de VCAM-1.
3. Los leucocitos principalmente implicados en las interacciones
leucocito-endotelio inducidas por la gastrina son d e tipo
mononuclear.
4. Los macrófagos humanos expresan el receptor CCK2 , y su
estímulo provoca activación celular.
5. La gastrina modula la activación macrofágica ind ucida por
citocinas pro- y anti-inflamatorias.
103
VII. BIBLIOGRAFÍA
104
1. Suerbaum S and Michetti P. Helicobacter pylori infection. N Engl J Med 347: 1175-1186, 2002.
2. Edkins JS. On the chemical mechanism of gastric secretion. Proc R Soc Lond B Biol Sci 76: 376, 1905.
3. Gregory RA and Tracy HJ. The constitution and properties of two gastrins extracted from hog antral mucosa. Gut 5: 103-114, 1964.
4. Walsh JH. Gastrin. In: Gut Peptides: Biochemistry and Physiology, edited by Walsh JH and Dockray GJ. New York: Raven Press, 1994, p. 75-121.
5. Dockray GJ, Varro A, Dimaline R, Wang T. The gastrins: their production and biological activities. Annu Rev Physiol 63: 119-139, 2001.
6. Johnson LR, Aures D, Hakanson R. Effect of gastrin on the in vivo incorporation of 14C-leucine into protein of the digestive tract. Proc Soc Exp Biol Med 132: 996-998, 1969.
7. Crean GP, Marshall MW, Rumsey RD. Parietal cell hyperplasia induced by the administration of pentagastrin (ICI 50,123) to rats. Gastroenterology 57: 147-155, 1969.
8. Nagata A, Ito M, Iwata N, Kuno J, Takano H, Minowa O, Chihara K, Matsui T, Noda T. G protein-coupled cholecystokinin-B/gastrin receptors are responsible for physiological cell growth of the stomach mucosa in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 11825-11830, 1996.
9. Langhans N, Rindi G, Chiu M, Rehfeld JF, Ardman B, Beinborn M, Kopin AS. Abnormal gastric histology and decreased acid production in cholecystokinin-B/gastrin receptor-deficient mice. Gastroenterology 112: 280-286, 1997.
10. Koh TJ, Goldenring JR, Ito S, Mashimo H, Kopin AS, Varro A, Dockray GJ, Wang TC. Gastrin deficiency results in altered gastric differentiation and decreased colonic proliferation in mice. Gastroenterology 113: 1015-1025, 1997.
11. Dufresne M, Seva C, Fourmy D. Cholecystokinin and gastrin receptors. Physiol Rev 86: 805-847, 2006.
12. Kelly SM, Crampton JR, Hunter JO. Helicobacter-pylori increases gastric antral juxtamucosal pH. Dig Dis Sci 38: 129-131, 1993.
13. Lichtenberger LM, Dial EJ, Romero JJ, Lechago J, Jarboe LA, Wolfe MM. Role of luminal ammonia in the development of gastropathy and hypergastrinemia in the rat. Gastroenterology 108: 320-329, 1995.
105
14. Dial EJ, Hall LR, Romero JJ, Lichtenberger LM. Rats with gastritis have increased sensitivity to the gastrin stimulatory effects of luminal ammonia. Gastroenterology 110: 801-808, 1996.
15. Odum L, Petersen HD, Andersen IB, Hansen BF, Rehfeld JF. Gastrin and somatostatin in Helicobacter-pylori infected antral mucosa. Gut 35: 615-618, 1994.
16. Helicobacter and Cancer Collaborative Group. Gastric cancer and Helicobacter pylori: a combined analysis of 12 case control studies nested within prospective cohorts. Gut 49: 347-353, 2001.
17. Weigert N, Schaffer K, Schusdziarra V, Classen M, Schepp W. Gastrin secretion from primary cultures of rabbit antral G cells: Stimulation by inflammatory cytokines. Gastroenterology 110: 147-154, 1996.
18. Lehmann FS, Golodner EH, Wang JY, Chen MCY, Avedian D, Calam J, Walsh JH, Dubinett S, Soll AH. Mononuclear cells and cytokines stimulate gastrin release from canine antral cells in primary culture. Am J Physiol 270: G783-G788, 1996.
19. Wagner S, Haruma K, Gladziwa U, Soudah B, Gebel M, Bleck J, Schmidt H, Manns M. Helicobacter-pylori infection and serum pepsinogen-A, pepsinogen-C, and gastrin in gastritis and peptic-ulcer - Significance of inflammation and effect of bacterial eradication. Am J Gastroenterol 89: 1211-1218, 1994.
20. Graham DY, Go MF, Lew GM, Genta RM, Rehfeld JF. Helicobacter-pylori infection and exaggerated gastrin-release - Effects of inflammation and progastrin processing. Scand J Gastroenterol 28: 690-694, 1993.
21. Liu Y, Vosmaer GD, Tytgat GN, Xiao SD, Ten Kate FJ. Gastrin (G) cells and somatostatin (D) cells in patients with dyspeptic symptoms: Helicobacter pylori associated and non-associated gastritis. J Clin Pathol 58: 927-931, 2005.
22. Fukui T, Nishio A, Okazaki K, Uza N, Ueno S, Kido M, Inoue S, Kitamura H, Kiriya K, Ohashi S, Asada M, Tamaki H, Matsuura M, Kawasaki K, Suzuki K, Uchida K, Fukui H, Nakase H, Watanabe N, Chiba T. Gastric mucosal hyperplasia via upregulation of gastrin induced by persistent activation of gastric innate immunity in major histocompatibility complex class II deficient mice. Gut 55: 607-615, 2006.
23. Reubi JC. Targeting CCK receptors in human cancers. Curr Top Med Chem 7: 1239-1242, 2007.
24. Ciccotosto GD, McLeish A, Hardy KJ, Shulkes A. Expression, processing, and secretion of gastrin in patients with colorectal carcinoma. Gastroenterology 109: 1142-1153, 1995.
106
25. Finley GG, Koski RA, Melhem MF, Pipas JM, Meisler AI. Expression of the gastrin gene in the normal human colon and colorectal adenocarcinoma. Cancer Res 53: 2919-2926, 1993.
26. Kochman ML, DelValle J, Dickinson CJ, Boland CR. Post-translational processing of gastrin in neoplastic human colonic tissues. Biochem Biophys Res Commun 189: 1165-1169, 1992.
27. Nemeth J, Taylor B, Pauwels S, Varro A, Dockray GJ. Identification of progastrin derived peptides in colorectal carcinoma extracts. Gut 34: 90-95, 1993.
28. Pannequin J, Delaunay N, Buchert M, Surrel F, Bourgaux JF, Ryan J, Boireau S, Coelho J, Pelegrin A, Singh P, Shulkes A, Yim M, Baldwin GS, Pignodel C, Lambeau G, Jay P, Joubert D, Hollande F. Beta-catenin/Tcf-4 inhibition after progastrin targeting reduces growth and drives differentiation of intestinal tumors. Gastroenterology 133: 1554-1568, 2007.
29. Smith AM and Watson SA. Gastrin and gastrin receptor activation: an early event in the adenoma-carcinoma sequence. Gut 47: 820-824, 2000.
30. Yu HG, Tong SL, Ding YM, Ding J, Fang XM, Zhang XF, Liu ZJ, Zhou YH, Liu QS, Luo HS, Yu JP. Enhanced expression of cholecystokinin-2 receptor promotes the progression of colon cancer through activation of focal adhesion kinase. Int J Cancer 119: 2724-2732, 2006.
31. Rengifo-Cam W and Singh P. Role of progastrins and gastrins and their receptors in GI and pancreatic cancers: targets for treatment. Curr Pharm Des 10: 2345-2358, 2004.
32. Rozengurt E and Walsh JH. Gastrin, CCK, signaling, and cancer. Annu Rev Physiol 63: 49-76, 2001.
33. Okahata H, Nishi Y, Muraki K, Sumii K, Miyachi Y, Usui T. Gastrin/cholecystokinin-like immunoreactivity in human blood cells. Life Sci 36: 369-373, 1985.
34. Iwata N, Murayama T, Matsumori Y, Ito M, Nagata A, Taniguchi T, Chihara K, Matsuo Y, Minowada J, Matsui T. Autocrine loop through cholecystokinin-B/gastrin receptors involved in growth of human leukemia cells. Blood 88: 2683-2689, 1996.
35. Schmitz F, Schrader H, Otte JM, Schmitz H, Stuber E, Herzig KH, Schmidt WE. Identification of CCK-B/gastrin receptor splice variants in human peripheral blood mononuclear cells. Regul Pept 101: 25-33, 2001.
107
36. Cong B, Li SJH, Ling YL, Yao YX, Gu ZY, Wang JX, You HY. Expression and cell-specific localization of cholecystokinin receptors in rat lung. World J Gastroenterol 9: 1273-1277, 2003.
37. Mezey E and Palkovits M. Localization of targets for antiulcer drugs in cells of the immune-system. Science 258: 1662-1665, 1992.
38. Schmitz F, Otte JM, Stechele HU, Reimann B, Banasiewicz T, Folsch UR, Schmidt WE, Herzig KH. CCK-B/gastrin receptors in human colorectal cancer. Eur J Clin Invest 31: 812-820, 2001.
39. Lefranc F, Mijatovic T, Mathieu V, Rorive S, Decaestecker C, Debeir O, Brotchi J, Van Ham P, Salmon I, Kiss R. Characterization of gastrin-induced proangiogenic effects in vivo in orthotopic U373 experimental human glioblastomas and in vitro in human umbilical vein endothelial cells. Clin Cancer Res 10: 8250-8265, 2004.
40. Calatayud S, Alvarez A, Victor VM. Gastrin: an acid-releasing, proliferative and immunomodulatory peptide? Mini Rev Med Chem 10: en prensa, 2010.
41. Yassin RR and Little KM. Early signalling mechanism in colonic epithelial cell response to gastrin. Biochem J 311 ( Pt 3): 945-950, 1995.
42. Akagi K, Nagao T, Urushidani T. Correlation between Ca(2+) oscillation and cell proliferation via CCK(B)/gastrin receptor. Biochim Biophys Acta 1452: 243-253, 1999.
43. Sethi T and Rozengurt E. Gastrin stimulates Ca2+ mobilization and clonal growth in small cell lung cancer cells. Cancer Res 52: 6031-6035, 1992.
44. Seufferlein T, Withers DJ, Broad S, Herget T, Walsh JH, Rozengurt E. The human CCKB/gastrin receptor transfected into rat1 fibroblasts mediates activation of MAP kinase, p74raf-1 kinase, and mitogenesis. Cell Growth Differ 6: 383-393, 1995.
45. Dehez S, Daulhac L, Kowalski-Chauvel A, Fourmy D, Pradayrol L, Seva C. Gastrin-induced DNA synthesis requires p38-MAPK activation via PKC/Ca(2+) and Src-dependent mechanisms. FEBS Lett 496: 25-30, 2001.
46. Todisco A, Takeuchi Y, Urumov A, Yamada J, Stepan VM, Yamada T. Molecular mechanisms for the growth factor action of gastrin. Am J Physiol 273: G891-G898, 1997.
47. Dehez S, Bierkamp C, Kowalski-Chauvel A, Daulhac L, Escrieut C, Susini C, Pradayrol L, Fourmy D, Seva C. c-Jun NH(2)-terminal kinase pathway in growth-promoting effect of the G protein-coupled receptor cholecystokinin B receptor: a protein kinase C/Src-dependent-mechanism. Cell Growth Differ 13: 375-385, 2002.
108
48. Noble PJ, Wilde G, White MR, Pennington SR, Dockray GJ, Varro A. Stimulation of gastrin-CCKB receptor promotes migration of gastric AGS cells via multiple paracrine pathways. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 284: G75-G84, 2003.
49. Stepan VM, Dickinson CJ, Del Valle J, Matsushima M, Todisco A. Cell type-specific requirement of the MAPK pathway for the growth factor action of gastrin. Am J Physiol 276: G1363-G1372, 1999.
50. Guo YS, Cheng JZ, Jin GF, Gutkind JS, Hellmich MR, Townsend CM, Jr. Gastrin stimulates cyclooxygenase-2 expression in intestinal epithelial cells through multiple signaling pathways. Evidence for involvement of ERK5 kinase and transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Biol Chem 277: 48755-48763, 2002.
51. Ghrib F, Pyronnet S, Bastie MJ, Fagot-Revurat P, Pradayrol L, Vaysse N. Arachidonic-acid-selective cytosolic phospholipase A2 is involved in gastrin-induced AR4-2J-cell proliferation. Int J Cancer 75: 239-245, 1998.
52. Bierkamp C, Kowalski-Chauvel A, Dehez S, Fourmy D, Pradayrol L, Seva C. Gastrin mediated cholecystokinin-2 receptor activation induces loss of cell adhesion and scattering in epithelial MDCK cells. Oncogene 21: 7656-7670, 2002.
53. Ferrand A, Kowalski-Chauvel A, Bertrand C, Pradayrol L, Fourmy D, Dufresne M, Seva C. Involvement of JAK2 upstream of the PI 3-kinase in cell-cell adhesion regulation by gastrin. Exp Cell Res 301: 128-138, 2004.
54. Harris JC, Clarke PA, Awan A, Jankowski J, Watson SA. An antiapoptotic role for gastrin and the gastrin/CCK-2 receptor in Barrett's esophagus. Cancer Res 64: 1915-1919, 2004.
55. Todisco A, Ramamoorthy S, Witham T, Pausawasdi N, Srinivasan S, Dickinson CJ, Askari FK, Krametter D. Molecular mechanisms for the antiapoptotic action of gastrin. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 280: G298-G307, 2001.
56. Ferrand A, Kowalski-Chauvel A, Bertrand C, Escrieut C, Mathieu A, Portolan G, Pradayrol L, Fourmy D, Dufresne M, Seva C. A novel mechanism for JAK2 activation by a G protein-coupled receptor, the CCK-2R: implication of this signaling pathway in pancreatic tumor models. J Biol Chem 280: 10710-10715, 2005.
57. Stepan V, Ramamoorthy S, Pausawasdi N, Logsdon CD, Askari FK, Todisco A. Role of small GTP binding proteins in the growth-promoting and antiapoptotic actions of gastrin. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 287: G715-G725, 2004.
109
58. Hiraoka S, Miyazaki Y, Kitamura S, Toyota M, Kiyohara T, Shinomura Y, Mukaida N, Matsuzawa Y. Gastrin induces CXC chemokine expression in gastric epithelial cells through activation of NF-kappa B. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 281: G735-G742, 2001.
59. Moser B, Wolf M, Walz A, Loetscher P. Chemokines: multiple levels of leukocyte migration control. Trends Immunol 25: 75-84, 2004.
60. Kaminska B. MAPK signalling pathways as molecular targets for anti-inflammatory therapy--from molecular mechanisms to therapeutic benefits. Biochim Biophys Acta 1754: 253-262, 2005.
61. Ihle JN, Witthuhn BA, Quelle FW, Yamamoto K, Thierfelder WE, Kreider B, Silvennoinen O. Signaling by the cytokine receptor superfamily: JAKs and STATs. Trends Biochem Sci 19: 222-227, 1994.
62. Kuperman DA and Schleimer RP. Interleukin-4, interleukin-13, signal transducer and activator of transcription factor 6, and allergic asthma. Curr Mol Med 8: 384-392, 2008.
63. Alvarez A, Ibiza S, Hernandez C, Alvarez-Barrientos A, Esplugues JV, Calatayud S. Gastrin induces leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and contributes to the inflammation caused by Helicobacter pylori. FASEB J 20: 2396-2398, 2006.
64. Rao RM, Yang L, Garcia-Cardena G, Luscinskas FW. Endothelial-dependent mechanisms of leukocyte recruitment to the vascular wall. Circ Res 101: 234-247, 2007.
65. van Buul JD and Hordijk PL. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24: 824-833, 2004.
66. Ulbrich H, Eriksson EE, Lindbom L. Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease. Trends Pharmacol Sci 24: 640-647, 2003.
67. Gordon S and Taylor PR. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol 5: 953-964, 2005.
68. Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends Immunol 23: 549-555, 2002.
69. Mosser DM. The many faces of macrophage activation. J Leukoc Biol 73: 209-212, 2003.
70. Benoit M, Desnues B, Mege JL. Macrophage polarization in bacterial infections. J Immunol 181: 3733-3739, 2008.
110
71. Mosser DM and Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol 8: 958-969, 2008.
72. Martinez FO, Helming L, Gordon S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annu Rev Immunol 27: 451-483, 2009.
73. Ben Baruch A. Inflammation-associated immune suppression in cancer: the roles played by cytokines, chemokines and additional mediators. Semin Cancer Biol 16: 38-52, 2006.
74. Colombo MP and Mantovani A. Targeting myelomonocytic cells to revert inflammation-dependent cancer promotion. Cancer Res 65: 9113-9116, 2005.
75. Lewis CE and Pollard JW. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res 66: 605-612, 2006.
76. Toomey D, Harmey J, Condron C, Kay E, Bouchier-Hayes D. Phenotyping of immune cell infiltrates in breast and colorectal tumours. Immunol Invest 28: 29-41, 1999.
77. Forssell J, Oberg A, Henriksson ML, Stenling R, Jung A, Palmqvist R. High macrophage infiltration along the tumor front correlates with improved survival in colon cancer. Clin Cancer Res 13: 1472-1479, 2007.
78. Funada Y, Noguchi T, Kikuchi R, Takeno S, Uchida Y, Gabbert HE. Prognostic significance of CD8+ T cell and macrophage peritumoral infiltration in colorectal cancer. Oncol Rep 10: 309-313, 2003.
79. Klintrup K, Makinen JM, Kauppila S, Vare PO, Melkko J, Tuominen H, Tuppurainen K, Makela J, Karttunen TJ, Makinen MJ. Inflammation and prognosis in colorectal cancer. Eur J Cancer 41: 2645-2654, 2005.
80. Sickert D, Aust DE, Langer S, Haupt I, Baretton GB, Dieter P. Characterization of macrophage subpopulations in colon cancer using tissue microarrays. Histopathology 46: 515-521, 2005.
81. Ohno S, Inagawa H, Dhar DK, Fujii T, Ueda S, Tachibana M, Suzuki N, Inoue M, Soma G, Nagasue N. The degree of macrophage infiltration into the cancer cell nest is a significant predictor of survival in gastric cancer patients. Anticancer Res 23: 5015-5022, 2003.
82. Ohta M, Kitadai Y, Tanaka S, Yoshihara M, Yasui W, Mukaida N, Haruma K, Chayama K. Monocyte chemoattractant protein-1 expression correlates with macrophage infiltration and tumor vascularity in human gastric carcinomas. Int J Oncol 22: 773-778, 2003.
111
83. Leung SY, Yuen ST, Chu KM, Mathy JA, Li R, Chan AS, Law S, Wong J, Chen X, So S. Expression profiling identifies chemokine (C-C motif) ligand 18 as an independent prognostic indicator in gastric cancer. Gastroenterology 127: 457-469, 2004.
84. Lehner T. Special regulatory T cell review: The resurgence of the concept of contrasuppression in immunoregulation. Immunology 123: 40-44, 2008.
85. Moestrup SK and Moller HJ. CD163: a regulated hemoglobin scavenger receptor with a role in the anti-inflammatory response. Ann Med 36: 347-354, 2004.
86. Moore KW, de Waal MR, Coffman RL, O'Garra A. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol 19: 683-765, 2001.
87. Cooper AM and Khader SA. IL-12p40: an inherently agonistic cytokine. Trends Immunol 28: 33-38, 2007.
88. Tracey D, Klareskog L, Sasso EH, Salfeld JG, Tak PP. Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehensive review. Pharmacol Ther 117: 244-279, 2008.
89. Balkwill F. Tumour necrosis factor and cancer. Nat Rev Cancer 9: 361-371, 2009.
90. Conti I and Rollins BJ. CCL2 (monocyte chemoattractant protein-1) and cancer. Semin Cancer Biol 14: 149-154, 2004.
91. Mohammadi M, Czinn S, Redline R, Nedrud J. Helicobacter-specific cell-mediated immune responses display a predominant Th1 phenotype and promote a delayed-type hypersensitivity response in the stomachs of mice. J Immunol 156: 4729-4738, 1996.
92. Blaser MJ and Atherton JC. Helicobacter pylori persistence: biology and disease. J Clin Invest 113: 321-333, 2004.
93. Fox JG, Beck P, Dangler CA, Whary MT, Wang TC, Shi HN, Nagler-Anderson C. Concurrent enteric helminth infection modulates inflammation and gastric immune responses and reduces helicobacter-induced gastric atrophy. Nat Med 6: 536-542, 2000.
94. Pinto-Santini D and Salama NR. The biology of Helicobacter pylori infection, a major risk factor for gastric adenocarcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 14: 1853-1858, 2005.
95. Wang TC, Dangler CA, Chen D, Goldenring JR, Koh T, Raychowdhury R, Coffey RJ, Ito S, Varro A, Dockray GJ, Fox JG. Synergistic interaction between hypergastrinemia and Helicobacter infection in a mouse model of gastric cancer. Gastroenterology 118: 36-47, 2000.
112
96. Watson SA, Grabowska AM, El Zaatari M, Takhar A. Gastrin - active participant or bystander in gastric carcinogenesis? Nat Rev Cancer 6: 936-946, 2006.
97. Grabowska AM and Watson SA. Role of gastrin peptides in carcinogenesis. Cancer Lett 257: 1-15, 2007.
98. Dockray G, Dimaline R, Varro A. Gastrin: old hormone, new functions. Pflugers Arch 449: 344-355, 2005.
99. Sacerdote P, Ruff MR, Pert CB. Cholecystokinin and the immune system: receptor-mediated chemotaxis of human and rat monocytes. Peptides 9: 29-34, 1988.
100. DelaFuente M, Drummond J, DelRio M, Carrasco M, Hernanz A. Modulation of murine peritoneal macrophage functions by gastrin. Peptides 17: 219-224, 1996.
101. DelaFuente M, Carrasco M, Hernanz A. Modulation of human neutrophil function in vitro by gastrin. J Endocrinol 153: 475-483, 1997.
102. Alvarez A, Ibiza MS, Andrade MM, Blas-Garcia A, Calatayud S. Gastric antisecretory drugs induce leukocyte-endothelial cell interactions through gastrin release and activation of CCK-2 receptors. J Pharmacol Exp Ther 323: 406-413, 2007.
103. Carrasco M, Hernanz A, DelaFuente M. Effect of cholecystokinin and gastrin on human peripheral blood lymphocyte functions, implication of cyclic AMP and interleukin 2. Regul Pept 70: 135-142, 1997.
104. Zavros Y, Rathinavelu S, Kao JY, Todisco A, Del Valle J, Weinstock JV, Low MJ, Merchant JL. Treatment of Helicobacter gastritis with IL-4 requires somatostatin. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 12944-12949, 2003.
105. Takaishi S, Cui GL, Frederick DM, Carlson JE, Houghton J, Varro A, Dockray GJ, Ge ZM, Whary MT, Rogers AB, Fox JG, Wang TC. Synergistic inhibitory effects of gastrin and histamine receptor antagonists on Helicobacter-induced gastric cancer. Gastroenterology 128: 1965-1983, 2005.
106. Quintana E, Hernandez C, Alvarez-Barrientos A, Esplugues JV, Barrachina MD. Synthesis of nitric oxide in postganglionic myenteric neurons during endotoxemia: implications for gastric motor function in rats. FASEB J 18: 531-533, 2004.
107. Fox JG and Wang TC. Inflammation, atrophy, and gastric cancer. J Clin Invest 117: 60-69, 2007.
113
108. Meining A, Bosseckert H, Caspary WF, Nauert C, Stolte M. H2-receptor antagonists and antacids have an aggravating effect on Helicobacter pylori gastritis in duodenal ulcer patients. Aliment Pharmacol Ther 11: 729-734, 1997.
109. Meining A, Kiel G, Stolte M. Changes in Helicobacter pylori-induced gastritis in the antrum and corpus during and after 12 months of treatment with ranitidine and lansoprazole in patients with duodenal ulcer disease. Aliment Pharmacol Ther 12: 735-740, 1998.
110. Luscinskas FW, Ma S, Nusrat A, Parkos CA, Shaw SK. Leukocyte transendothelial migration: a junctional affair. Semin Immunol 14: 105-113, 2002.
111. Clarke PA, Dickson JH, Harris JC, Grabowska A, Watson SA. Gastrin enhances the angiogenic potential of endothelial cells via modulation of heparin-binding epidermal-like growth factor. Cancer Res 66: 3504-3512, 2006.
112. van Mourik JA, Romani dW, Voorberg J. Biogenesis and exocytosis of Weibel-Palade bodies. Histochem Cell Biol 117: 113-122, 2002.
113. Krieglstein CF and Granger DN. Adhesion molecules and their role in vascular disease. Am J Hypertens 14: 44S-54S, 2001.
114. Petri B, Phillipson M, Kubes P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J Immunol 180: 6439-6446, 2008.
115. Woltmann G, McNulty CA, Dewson G, Symon FA, Wardlaw AJ. Interleukin-13 induces PSGL-1/P-selectin-dependent adhesion of eosinophils, but not neutrophils, to human umbilical vein endothelial cells under flow. Blood 95: 3146-3152, 2000.
116. Khew-Goodall Y, Wadham C, Stein BN, Gamble JR, Vadas MA. Stat6 activation is essential for interleukin-4 induction of P-selectin transcription in human umbilical vein endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 19: 1421-1429, 1999.
117. Schnyder B, Schnyder-Candrian S, Panski A, Bommel H, Heim M, Duschl A, Moser R. Phytochemical inhibition of interleukin-4-activated Stat6 and expression of VCAM-1. Biochem Biophys Res Commun 292: 841-847, 2002.
118. Goebeler M, Schnarr B, Toksoy A, Kunz M, Brocker EB, Duschl A, Gillitzer R. Interleukin-13 selectively induces monocyte chemoattractant protein-1 synthesis and secretion by human endothelial cells. Involvement of IL-4R alpha and Stat6 phosphorylation. Immunology 91: 450-457, 1997.
119. Jiang BH and Liu LZ. PI3K/PTEN signaling in tumorigenesis and angiogenesis. Biochim Biophys Acta 1784: 150-158, 2008.
114
120. Thornhill MH, Kyan-Aung U, Haskard DO. IL-4 increases human endothelial cell adhesiveness for T cells but not for neutrophils. J Immunol 144: 3060-3065, 1990.
121. Kelly M, Hwang JM, Kubes P. Modulating leukocyte recruitment in inflammation. J Allergy Clin Immunol 120: 3-10, 2007.
122. Kansas GS. Selectins and their ligands: current concepts and controversies. Blood 88: 3259-3287, 1996.
123. Alon R, Kassner PD, Carr MW, Finger EB, Hemler ME, Springer TA. The integrin VLA-4 supports tethering and rolling in flow on VCAM-1. J Cell Biol 128: 1243-1253, 1995.
124. Berlin C, Bargatze RF, Campbell JJ, von Andrian UH, Szabo MC, Hasslen SR, Nelson RD, Berg EL, Erlandsen SL, Butcher EC. alpha 4 integrins mediate lymphocyte attachment and rolling under physiologic flow. Cell 80: 413-422, 1995.
125. Khorana AA, Ryan CK, Cox C, Eberly S, Sahasrabudhe DM. Vascular endothelial growth factor, CD68, and epidermal growth factor receptor expression and survival in patients with Stage II and Stage III colon carcinoma: a role for the host response in prognosis. Cancer 97: 960-968, 2003.
126. Nagorsen D, Voigt S, Berg E, Stein H, Thiel E, Loddenkemper C. Tumor-infiltrating macrophages and dendritic cells in human colorectal cancer: relation to local regulatory T cells, systemic T-cell response against tumor-associated antigens and survival. J Transl Med 5: 62, 2007.
127. Gordon S and Martinez FO. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity 32: 593-604, 2010.
128. Solinas G, Germano G, Mantovani A, Allavena P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. J Leukoc Biol 86: 1065-1073, 2009.
129. Lolmede K, Campana L, Vezzoli M, Bosurgi L, Tonlorenzi R, Clementi E, Bianchi ME, Cossu G, Manfredi AA, Brunelli S, Rovere-Querini P. Inflammatory and alternatively activated human macrophages attract vessel-associated stem cells, relying on separate H. J Leukoc Biol 85: 779-787, 2009.
130. Ben Baruch A. The multifaceted roles of chemokines in malignancy. Cancer Metastasis Rev 25: 357-371, 2006.
115
131. Bailey C, Negus R, Morris A, Ziprin P, Goldin R, Allavena P, Peck D, Darzi A. Chemokine expression is associated with the accumulation of tumour associated macrophages (TAMs) and progression in human colorectal cancer. Clin Exp Metastasis 24: 121-130, 2007.
132. O'Hayre M, Salanga CL, Handel TM, Allen SJ. Chemokines and cancer: migration, intracellular signalling and intercellular communication in the microenvironment. Biochem J 409: 635-649, 2008.
