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2

INDICE

1. INTRODUCCIÓN. 3

2. ANTECEDENTES 5

3. OBJETIVO GENERAL 7

3.1 Objetivos Particulares 7

4. MATERIALES Y MÉTODOS 7

4.1 Ensayos de actividad enzimática 7

4.2 Perfiles de desnaturalización térmica 8

4.3 Espectroscopia de Fluorescencia 8

4.4 Ensayos de apagamiento de la Fluorescencia. 8

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 9

5.1 Ensayos de actividad enzimática 9

5.2 Perfiles de desnaturalización térmica 10

5.3 Espectroscopia de Fluorescencia 12

5.4 Ensayos de apagamiento de la Fluorescencia. 13

6. CONCLUSIONES. 14

7. REFERENCIAS 15

3

1. INTRODUCCIÓN

Las proteínas son polímeros largos de aminoácidos unidos por medio de enlaces

peptídicos y dispuestos en una secuencia lineal. Están compuestas básicamente por

carbono, hidrogeno, oxígeno, nitrógeno y azufre aunque pueden contener fosforo,

hierro, magnesio y cobre. Estas macromoléculas presentan una gran diversidad

estructural y funcional y varían en tamaño desde polipéptidos relativamente pequeños

hasta polímeros enormes de masas moleculares del orden de millones de daltones. Las

proteínas constituyen más del 50% del peso seco de las células, y desempeñan una gran

variedad y cantidad de funciones vitales que derivan principalmente de su estructura

precisa en el espacio y de la estabilidad de ésta en el entorno celular. El vocablo

proteína deriva del griego proteos, que significa “primero o fundamental”. Las proteínas

cuentan con cuatro niveles de organización estructural. Estructura primaria, la cual

describe la secuencia de los residuos de aminoácidos unidos de forma covalente por

enlaces peptídicos. Estructura secundaria se refiere a disposiciones particularmente

estables de los aminoácidos que dan lugar a patrones estructurales repetitivos, como las

hélices y las hojas β. Estructura terciaria representa la manera en cómo la cadena

polipeptídica se curva para formar la estructura estrechamente plegada y compacta de

una proteína globular. Estructura cuaternaria es la disposición espacial de dos o más

cadenas polipeptídicas que poseen algunas proteínas llamadas oligoméricas. [1,2]

Otra función importante de las proteínas es el ser los instrumentos moleculares

mediante los cuales se expresa la información genética, para preservar las características

de los miembros de una especie que les hayan permitido adaptarse a entornos

ambientales muy diversos y en algunos casos extremos, como aquéllos con

temperaturas bajas o elevadas, con alta salinidad o bajo pH.

Cada especie de microorganismo o bacteria tiene temperaturas naturales distintas, de

modo que un microorganismo puede presentar una temperatura óptima superior a la

temperatura máxima de otra, o inferior a la temperatura mínima de una tercera, estos

organismos se determinan extremófilos. Según el rango de temperaturas al que pueden

crecer los distintos microorganismos, se pueden establecer tres tipos principales:

psicrófilos, mesófilos y termófilos. [1-3]

Esta clasificación, está basada con respecto a los organismos mesófilos, los cuales

realizan sus funciones óptimas en un intervalo de temperatura de 25 a 45 °C. Los

psicrófilos se localizan en ambientes de baja temperatura (0 a 20 °C). En contraparte se

encuentran los organismos termófilos adaptados a altas temperaturas (de 45 °C a

mayores de 85 °C ). [4]

Los microorganismos extremófilos han despertado el interés de los

investigadores, debido a sus enzimas, catalizadores biológicos que aceleran las

reacciones químicas de la célula. Las enzimas habituales tienen baja estabilidad a

temperaturas moderadamente altas y dejan de funcionar luego de un corto tiempo, sin

embargo las enzimas de estos organismos empiezan a operar justo en el punto donde las

habituales dejan de funcionar. Existen numerosos procesos industriales que requieren el

uso de catalizadores, tal es el caso de las enzimas que participan en la producción de

edulcorantes, papel, síntesis de detergentes, elaboración de alimentos como pan y vino,

tratamiento de residuos, extracción de petróleo, obtención de biochips y el diagnóstico

de enfermedades. [4-6] La mayoría de las enzimas usadas hasta la fecha se originan de

organismos mesófilos y, a pesar de sus muchas ventajas, el uso de estas enzimas está

4

restringido debido a su estabilidad limitada en los extremos de la temperatura. Por otra

parte, los extremófilos son una fuente muy grande de enzimas, que demuestran alta

estabilidad bajo condiciones extremas. La comparación entre estructuras atómicas de

grupos de enzimas termófilas y mesófilas, apoyado con las comparaciones masivas de

secuencias en proyectos genómicos, han permitido dilucidar características que se

presentan de manera frecuente en proteínas térmicamente adaptadas: la optimización de

las interacciones electrostáticas carga-carga en la superficie de las proteínas, el

incremento de dipolos en las hélices, las interacciones entre Lys (catión) y anillos

aromáticos (Tyr,Phe y Trp). [7] Se ha observado un incremento de residuos aromáticos

y una menor presencia de residuos lábiles como: cisteínas, asparaginas y glutaminas, así

como un aumento de argininas. Por otra parte se han encontrado alargamientos en

estructuras regulares, acortamiento de las asas, disminución del número y tamaño de

espacios vacios al interior de la estructura, aumento de interacciones hidrofóbicas y

disminución de residuos lábiles. [1,2,7]

Esto ha llevado a buscar nuevas estrategias de estabilización de proteínas, teniendo

como uno de los resultados el incremento de termoestabilidad. La estabilización de

enzimas de organismos mesófilos se ha logrado utilizando dos metodologías distintas:

conocidas como “diseño racional” y la evolución dirigida.

Diseño racional. Involucra una serie de principios a través de los cuales la

termoestabilización de una proteína puede ser alcanzada o incrementada al aplicar

varios de ellos, otorgando cada uno un efecto pequeño pero aditivo. Tales principios

consisten en mutaciones del tipo X→Pro; incrementar la propensidad de las α-hélices

mediante sustituciones Gly→Ala o por estabilización de los macrodipolos de las

hélices; mejorar las interacciones electrostáticas entre residuos cargados superficiales

por la introducción de puentes salinos o redes de puentes salinos y prediciendo

mutaciones termo estabilizantes en base a cálculos de potenciales electrostáticos. [1,2]

Evolución dirigida. Comprende una serie de técnicas experimentales, mediante las

cuales se trata de imitar en una escala de tiempo acelerada, el proceso de selección

natural de una proteína. Esto se puede lograr a través de la combinación de mutagénesis

al azar seguida de un proceso de selección de fácil aplicación. Con frecuencia se emplea

también la técnica de intercambio de fragmentos de DNA (DNA shuffling). [1,2]

Otra característica importante de resaltar es como la catálisis enzimática de

microorganismos adaptados a climas totalmente opuestos se lleva acabo de manera

eficiente y comparativa en los distintos microorganismos. Para dilucidar este

comportamiento de las enzimas, diferentes investigaciones han encontrado que la

relación entre la actividad, flexibilidad y la estabilidad de una proteína representan un

tema central en la adaptación de estas a diferentes entornos [8]. Tal es el caso de las

proteínas de organismos psicrófilos que el disminuir su estabilidad con una mayor

flexibilidad genera un aumento en su actividad en comparación con sus homólogos

mesófilos y termófilos que cuenta con una mayor estabilidad y rigidez.

El aumento en la flexibilidad de una proteína se puede demostrar experimentalmente,

mediante el seguimiento de las tasa de intercambio de hidrogeno por deuterio, o bien

por el apagamiento de la fluorescencia por efecto de la acrilamida. [8-10]

5

2. ANTECEDENTES

La rizobacteria mesofíla Paenibacillus polymyxa habita en el suelo donde actúa como

facilitador biológico y al asociarse con plantas permite el crecimiento y desarrollo de

estas, protegiéndolas de organismos que provocan enfermedades. En Paenibacillus

polymyxa, existen dos β-glucosidasas homologas que pertenecen a la familia 1 de las

glicosil hidrolasas de la clasificación de Henrissat [11], la β-glucosidasa A (βglA) y la

β-glucosidasa B (βglB), ambas proteínas están conformadas por 448 residuos de

aminoácidos y comparten un 47% de identidad en su secuencia, las dos enzimas

presentan diferentes estructuras cuaternarias; la βglA es un octámero mientras que la

βglB es un monómero. La β-glucosidasa B tiene una masa de 52.5 kDa, su estructura ha

sido determinada por difracción de rayos X con una resolución de 2.10 Å [12],

presentando una estructura de barril (β/α)8 con algunas estructuras secundarias

periféricas adicionales, la cual se muestra en la figura 1, su código PDB es 2O9P.

La βglB cataliza la hidrólisis de celobiosa, celodextrinas de mayor grado de

polimerización y otros glicósidos relacionados. El mecanismo de reacción de la enzima

con su sustrato se muestra en la figura 2. Los residuos catalíticos de βglB son E167

que

actúa como donador de protones y E356

que actúa como nucleófilo. [1, 2, 12]

Figura 1. Estructura tridimensional de la enzima β-glucosidasa B de Paenibacillus

polymyxa. En rojo se representan las hojas β, en turquesa las hélices α y en violeta las

estructuras irregulares. Los residuos catalíticos se encuentran en el centro. Código PDB:

2O9P.

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Figura 2. Representación del mecanismo de reacción de la βglB sobre su sustrato.

Para el presente trabajo es preciso hablar de las mutantes V323R y

H62R/N223Y/M319I de la β-glucosidasa B, la primera muestra una baja en su

estabilidad térmica, mientras que la segunda adquirió un aumento en su estabilidad

térmica respecto a la enzima nativa βglB. [7,13]

La mutante V323R se obtuvo por una estrategia de diseño racional, donde se

buscó optimizar la energía electrostática en la superficie de la proteína (Figura 3A).

[1,7]

La triple mutante H62R/N223Y/M319I se obtuvo a partir de un proceso de

intercambio de DNA a partir de un grupo de mutantes termorresistentes sencillas (con

un solo residuo cambiado) obtenidas por evolución dirigida. Figura 3B. [1,13]

En nuestro estudio seguiremos el apagamiento de fluorescencia para dos mutantes

de la enzima β-glucosidasa B, una de las cuales muestra una mejor termorresistencia

que la enzima nativa, mientras que la otra muestra una pobre resistencia a la

temperatura.

A B

Figura 3. (A) Posición del residuo mutado en la βglB, para obtener la mutante de carga.

(B) Posición de los residuos mutados en βglB, para obtener la mutante por evolución

dirigida. Se resaltan en esferas a los residuos de aminoácidos involucrados.

7

3. OBJETIVO GENERAL

Estudiar la movilidad de las mutantes H62R/N223Y/M319I y V323R de la β-

glucosidasa B y su relación con la estabilidad térmica.

3.1 Objetivos Particulares

- Determinar los parámetros cinéticos de las enzimas mutantes

H62R/N223Y/M319I y V323R.

- Obtener los perfiles de desnaturalización térmica por Dicroísmo Circular de las

enzimas mutantes H62R/N223Y/M319I y V323R.

- Determinar la movilidad de ambas mutantes midiendo el apagamiento de su

fluorescencia intrínseca por efecto de la acrilamida.

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Ensayos de actividad enzimática

Los parámetros cinéticos se determinaron a través de mediciones de las velocidades

iníciales de la reacción de hidrólisis catalizada con las enzimas mutantes de la β–

glucosidasa B, usando diferentes concentraciones de p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido,

PNPG, como sustrato; la hidrólisis de este libera nitrofenilo de color amarillo que

seguimos a través del aumento de absorbancia a 400nm. El PNPG se utilizó en un

intervalo de concentraciones de 0.50 mM a 44 mM en buffer de fosfatos 50 mM a pH

7.0. Los ensayos de actividad se realizaron en un espectrofotómetro UV-Visible Hewlett

Packard 8453, que tiene un controlador de temperatura HP 89090A. En los ensayos de

actividad se utilizaron celdas de 1.0 cm de paso óptico, donde se incubó el PNPG en el

amortiguador a 25 ºC. Una vez equilibrada la temperatura, se adicionó el volumen

necesario de enzima concentrada para tener una concentración final de 2.0µg mL-1

. El

volumen final de reacción fue de 1.0 mL. Después se mezcló por inversión el contenido

de la celda y se inició la medición de absorbancia en función del tiempo.

Las velocidades iníciales (v) se expresaron en micromoles de sustrato transformado por

minuto por miligramo de enzima (µmol min-1

mg-1

). Los resultados obtenidos al variar

la concentración de sustrato (S) se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten (1).

4.2 Perfiles de desnaturalización térmica

Los perfiles de desnaturalización térmica para las enzimas mutantes

H62R/N223Y/M319I y V323R se obtuvieron siguiendo su señal de dicroísmo circular.

Los datos de elipticidad se tomaron a 220 nm con una velocidad de barrido de 2 ºC por

minuto en un intervalo de temperaturas de 25 ºC a 75 ºC, con agitación constante. La

celda que contenía las soluciones contaba con 1.0 cm de paso óptico, la concentración

de enzima utilizada fue de 20µg mL-1

en regulador de fosfatos 50mM a pH 7.0, el cual

8

fue desgasificado previamente para cada ensayo. Para medir el cambio de elipticidad se

utilizó un espectropolarímetro JASCO J-715 que cuenta con un controlador de

temperatura tipo Peltier PTC-348WI.

La fracción desnaturalizada (f D) de proteína se calculó por medio de los valores

de elipticidad (θobs) obtenidos a cada temperatura en el barrido, con ayuda de la

ecuación (2).

Donde θN y θD representa a la elipticidad de la forma nativa y desnaturalizada

respectivamente.

4.3 Espectroscopia de Fluorescencia

Se determinaron los espectros de fluorescencia de las enzimas, H62R/N223Y/M319I y

V323R a 25 ºC, variando la concentración de enzima de 100 µg/mL a 20 µg/mL en

amortiguador de fosfatos 50mM, pH 7.0, excitando a una longitud de onda de 295 nm y

registrando la emisión de fluorescencia en un intervalo de 300 a 450 nm. Se utilizó una

celda de 1.0 cm de paso óptico con agitación continua, los espectros se corrigieron con

la señal del amortiguador de fosfatos, 50 mM, pH 7.0. Se utilizó un espectrofluorómetro

ISS K2 (Champaign, IL, USA), que cuenta con un controlador de temperatura tipo

Peltier.

4.4 Ensayos de apagamiento de la Fluorescencia.

Para los ensayos de apagamiento de la fluorescencia intrínseca por efecto de la

acrilamida, se adicionaron alícuotas de 7.0 µL de acrilamida 2.30M variando su

concentración en la celda de 0 a 0.114M. Nuestras enzimas se incubaron en un volumen

inicial de 2.0 mL de amortiguador de fosfatos50 mM a pH 7.0, a una concentración de

50 µg/mL. La concentración de enzima se corrigió por la dilución generada por la

adición de acrilamida. La longitud de onda de excitación fue de 280 nm, mientras que la

emisión de fluorescencia fue registrada a 350 nm. Se utilizó una celda de 1.0 cm de paso

óptico con agitación constante. Los ensayos se realizaron a las temperaturas de 12 ºC,

25 ºC y 38 ºC. Los datos obtenidos del apagamiento de la fluorescencia fueron tratados

de acuerdo a la ecuación de Stern-Volmer.

Donde F0 es la fluorescencia intrínseca en ausencia de acrilamida, F es la intensidad de

fluorescencia a una concentración dada de acrilamida [Q] y KSV es la constante de

Stern-Volmer relacionada con el apagamiento de la fluorescencia por efecto de las

colisiones.

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Figura 4. Ubicación de los residuos de triptófano en la estructura cristalográfica de la

β-glucosidasa B. Se resaltan los 16 residuos de triptófano en color azul.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

5.1 Ensayos de actividad enzimática

En la tabla 1 se muestran los valores obtenidos de los para metros cinéticos kcat y KM así

como el valor de Vmáx y la eficiencia catalítica para las enzimas H62R/N223Y/M319I y

V323R a 25 ºC. Mientras que en la figura 5 se puede apreciar la tendencia promedio de

las velocidades iníciales con las cuales se determinaron las constantes catalíticas para

las enzimas de estudio. La tendencia de las determinaciones describe adecuadamente el

comportamiento del modelo de Michaelis-Menten.

ENZIMA Vmáx (µmol min-1 mg-1)

KM

(mM)

kcat

(s-1

)

kcat/KM

(s-1

M-1

)

H62R/N223Y/M319I 16,6 ± 0,2 0,2 ± 0,0 14,5 ± 0,2 55657 ± 798

V323R 11,1 ± 0,1 4,1 ± 0,2 9,7 ± 0,1 2403 ± 120

Tabla 1. Constantes catalíticas de ambas enzimas, H62R/N223Y/M319I y V323R a 25

ºC. La desviación estándar (± DE) se determinó con las dos repeticiones de cada

experimento.

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Figura 5. Velocidades iníciales de la H62R/N223Y/M319I (O) y la V323R (∆),

obtenidas a diferentes concentraciones de p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (PNPG).

Los ensayos se realizaron en regulador de fosfatos 50mM a pH 7.0 con 2.0µg mL-1

de

enzima en celdas de 1cm de paso óptico a 25 ºC.

5.2 Perfiles de desnaturalización térmica

En el perfil de desnaturalización térmica de la enzima H62R/N223Y/M319I, seguido

por la pérdida de estructura secundaria (θ220), la temperatura que corresponde al 50 %

de la transición del estado nativo al estado desnaturalizado (Tm), muestra un corrimiento

de alrededor de 10 ºC hacia temperaturas mayores con respecto a la V323R, lo que

refleja una diferencia considerable en la termoestabilidad de ambas enzimas (figura 6).

El monitoreo se da en la transición de la enzima nativa a su estado desplegado (N → D).

El proceso de la desnaturalización térmica es un proceso irreversible ya que una vez que

la enzima se encuentra desplegada esta no regresa a su estado nativo ni recupera su

actividad enzimática al enfriarse.

A partir de los datos de elipticidad se calculó la fracción de proteína

desnaturalizada (f D) en función de la temperatura, a la vez que el valor de Tm, que

corresponde al valor de la temperatura cuando f D es igual a 0.5. Figura 7.

11

Figura 6. Desnaturalización térmica de la enzima H62R/N223Y/M319I (∆) y de la

enzima V323R (O). Los dos barridos térmicos se hicieron con una concentración de

20µg mL-1

de enzima y a una velocidad de calentamiento de 2 ºC por minuto en

regulador de fosfatos 50mM pH 7.0, en una celda de 1 cm de paso óptico con agitación

constante.

Figura 7. Fracción de proteína desnaturalizada de la V323R (O) y H62R/N223Y/M319I

(∆), obtenidos a partir de los datos de elipticidad obtenidos en la figura 6. La figura del

recuadro muestra la Tm de ambas mutantes.

12

5.3 Espectroscopia de Fluorescencia

En la figura 8 se muestran los espectros de emisión de fluorescencia intrínseca de ambas

glucosidasas, H62R/N223Y/M319I y V323R. Donde se monitoreo la señal de

fluorescencia que dan los triptófanos (16) presentes en estas enzimas. La concentración

de enzima para los espectros de fluorescencia intrínseca se varió de 20 µg/mL a 100

µg/mL. La figura 9 nos muestra la tendencia que sigue la intensidad de la fluorescencia

a 320 nm con respecto a la concentración de enzima.

Figura 8. Espectros de emisión de fluorescencia intrínseca de la mutante (A) V323R y

de la mutante (B) H62R/N223Y/M319I. Todos los espectros se obtuvieron con una

longitud de onda de excitación de 295 nm, y colectando la emisión 300 nm a 400 nm,

los ensayos se realizaron a las siguientes concentraciones de enzima 100 μg/mL (□), 80

μg/mL (■), 60 μg/mL (∆), 40 μg/mL (▲) y 20 μg/mL (O) en regulador de fosfatos 50

mM pH 7.0 a 25 ºC con agitación continua.

Figura 9. Variación de la intensidad de fluorescencia intrínseca respecto al cambio de

concentración de ambas glucosidasas mutantes. La determinación se hizo a partir de los

espectros de la figura 4.

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5.4 Ensayos de apagamiento de la fluorescencia.

La figura 10 nos muestra los datos obtenidos para el apagamiento de

fluorescencia por efecto de la adición de acrilamida a las distintas temperaturas de

trabajo, las cuales fueron de 12 ºC, 25 ºC y 38 ºC. Se empleó una longitud de onda de

280 nm para la excitación mientras que la emisión de fluorescencia se registró a 350

nm.

Haciendo la comparación de los datos obtenidos a las temperaturas de 12 ºC y 38

ºC (figura 11), se puede observar como la enzima V323R muestra una mayor variación

en el apagamiento de su fluorescencia en comparación con la enzima

H62R/N223Y/M319I.

Figura 10. Apagamiento de la fluorescencia por efecto de la adición de acrilamida a las

temperaturas de 12 ºC (A), 25 ºC (B) y 38 ºC (C). Los datos obtenidos para la V323R se

muestran en (O) y los de la H62R/N223Y/M319I se muestran en (∆). Para los ensayos

se adicionaron alícuotas de 7.0 µL de acrilamida 2.30 M variando la concentración de

esta en la celda de 0 a 0.114 M. Nuestras enzimas se incubaron a una concentración de

50 µg/mL en un volumen inicial de 2.0 mL de amortiguador de fosfatos 50 mM a pH

7.0. La longitud de onda de excitación fue de 280 nm, mientras que la emisión de

fluorescencia fue registrada en 350 nm, Se utilizó una celda de 1.0 cm de paso óptico

con agitación constante.

14

Figura 11. Variación del apagamiento de la emisión de fluorescencia para las enzimas

V323R (o, ●) y H62R/N223Y/M319I (∆, ▲) al agregar alícuotas de acrilamida a 12 ºC

y 38 ºC. Se observa una mayor afectación para la enzima V323R.

6. CONCLUSIONES.

Los parámetros cinéticos (KM; kcat) de las enzimas H62R/N223Y/M319I y V323R

fueron: (0.2 ± 0.0 mM; 14.5 ± 0.2 s-1

) y (4.1 ± 0.2 mM; 9.7 ± 0,1 s-1

) respectivamente.

La enzima H62R/N223Y/M319I muestra un aumento de 10 °C en la Tm respecto a la

V323R, lo que nos habla de su mayor resistencia a la temperatura.

La triple mutante H62R/N223Y/M319I muestra una menor movilidad que la mutante

V323R.

La enzima más termoestable (H62R/N223Y/M319I) muestra entonces una menor

movilidad a temperaturas cercanas a la ambiente (12-38 °C).

15

7. REFERENCIAS

[1] Tesis de Doctorado., Menandro Camarillo Cadena. Nov-2011. “Evaluación

Fisicoquímica de Mutantes Termorresistentes de la β-glucosidasa B de

Paenibacilluspolymyxa”

[2] Tesis de Maestría., Miriam Ordoñez Diaz. (2008). “Diseño de Mutantes

Termorresistentes de la β-Glucosidasa B de Paenibacilluspolymyxa, Empleando

Herramientas de Bioinformática”.

[3] Zubillaga, R. A., García-Hernández, E., Camarillo-Cadena, M., León, M. y

Polaina, J.(2006). Effect of a new ionic pair on the unfolding activation barrier of

β-glucosidase B.Prot Pept Lett. 13:113-118.

[4] Ninfa Ramírez D., José Antonio Serrano R., Horacio Sandoval T. (2006).

Microorganismos extremófilos. Actinomicetos halófilos en México. Revista

Mexicana de Ciencias Farmacéuticas. Vol. 37, numero 003.

[5] Armando Gómez Puyou. (2003). LA COMPLEJIDAD DE LAS PROTEÍNAS:

RELACIÓN ENTRE ESTABILIDAD, FLEXIBILIDAD Y CATÁLISIS. Mensaje

Bioquímico Vol. XXVII.

[6] Jason K. Yano. Y Thomas L. Poulos. (2003). New understandings of

thermostable and peizostable enzymes. CurrOpinBiotechnol. 14:360-365.

[7] Zubillaga, R. A. y Pérez-Hernández, G. (2008). Optimización de interacciones

electrostáticas superficiales como estrategia de termoestabilidad en proteínas., pp.

95-106, eds., El COLEGIO NACIONAL. México.

[8] Tony Collins, Marie-Alice Meuwis, Charles Gerday and Georges Feller. (2003).

Activity, Stability and Flexibility in GlycosidasesFrom Adapted to Extreme

Thermal Environments. J. Mol. Biol. (2003) 328, 419-428.

[9] Murice R. Eftink and Camilo A. Ghiron.Fluorescence Quenching Studies With

Proteins. AnalyticalBiochemistry. 114, 199-227 (1981).

[10] José A. Rodríguez-Martínez, Ricardo J. Solá, Betzaida Castillo, Héctor R.

Cintrón-Colón, Izarys Rivera-Rivera, Gabriel Barletta, KaiGriebenow. Stabilization

of a-Chymotrypsin UponPEGylation Correlates With Reduced Structural

Dynamics.Biotechnol. Bioeng. 2008;101: 1142–1149.

[11] Henrissat, B. y Bairoch, A. (1996). Updating the sequence-based classification

of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316:695-696.

[12] Isorna, P., Polaina, J., Latorre, G, L. Cañada, J. F., González, B., y Sanz, A. J.

(2007).Crystal structures of Paenibacillus polymyxa beta-glucosidase B complexes

reveal the molecular basis of substrate specificity and give new insights into the

catalytic machinery of family I glycosidases. J. Mol. Biol. 371:1204-18.

16

[13] Arrizubieta, M. J. y Polaina, J. (2000). Increased thermal resistance and

modification ofthe catalytic properties of a beta-glucosidase by random mutagenesis

and in vitrorecombination. J. Biol. Chem. 275:28843- 28848.